פרוטוקול להערכה סטנדרטית של תפקוד מיקרווסקולרי מערכתית במיקרוסירקולציה עורית אנושית באמצעות דימות ניגודיות בלייזר עם נקודות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית ולא פולשנית להערכת תפקוד מיקרווסקולרי מערכתית במיקרוסירקולציה עורית אנושית, באמצעות הדמיית ניגודיות לייזר בשילוב עם יונטופורזה פרמקולוגית וגירויים פיזיולוגיים להערכת תגובתיות מיקרווסקולרית במחקרים קליניים.

Abstract

הדמיית ניגודיות בלייזר עם נקודות (LSCI) היא טכניקה אופטית ברזולוציה גבוהה ולא פולשנית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת ובשדה מלא של הזרמת דם מיקרווסקולרית. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה סטנדרטית להערכת תפקוד מיקרווסקולרי מערכתית במחזור הדם המיקרו-עורי באמצעות LSCI. מכיוון שהמדידות המתקבלות בטכניקה זו רגישות מאוד למבלבלים סביבתיים ופיזיולוגיים, הפרוטוקול מדגיש נהלי תקינה מחמירים לשיפור השחזוריות והאמינות הניסויית. הפרוטוקול מפרט בקרות סביבתיות חיוניות, כולל ייצוב טמפרטורת החדר ב-23°C ±-1°C, מיקום המשתתפים, הליכי הסתגלות, והפחתת הפרעות חיצוניות במהלך רכישת התמונה. המתודולוגיה משלבת LSCI עם שני תמרונים פרובוקטיביים משלימים להערכת תגובתיות מיקרווסקולרית של העור. היפרמיה תגובתית לאחר חסימה משמשת להערכת תגובתיות מיקרווסקולרית משולבת, בעוד שאתגרים פרמקולוגיים מונעים על ידי יונטופורזה משמשים להערכת תפקוד האנדותל. באופן ספציפי, אצטילכולין ניתן להערכת הרחבת כלי הדם התלויה באנדותליום, וניטרופרוסיד נתרן ניתן להערכת הרחבת כלי דם בלתי תלויה באנדותליום. פרוטוקול ויזואלי שלב אחר שלב זה נועד להקל על אימוץ מתודולוגיות LSCI סטנדרטיות בסביבות מחקר קליני ותרגומי. הגישה יושמה בהצלחה לזיהוי פגיעה מיקרווסקולרית במספר מצבים קליניים, כולל יתר לחץ דם עמיד, סוכרת ומחלת עורקים כליליים. על ידי מתן אפשרות להערכה שחזורית ולא פולשנית של תגובתיות מיקרווסקולרית, מתודולוגיה זו מספקת כלי חשוב לחקר בריאות כלי דם מערכתית, מעקב אחר התקדמות המחלה והערכת יעילות התערבויות המיועדות למיקרווסקולטורה.

Introduction

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת תפקוד ותגובתיות מיקרווסקולרית מערכתית באמצעות הדמיית ניגודיות בלייזר (LSCI) בשילוב עם תמרונים פרובוקטיביים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים. המיקרוסירקולציה, הכוללת כלי דם טרמינליים—עורקיים, נימים וורידיים—קטנים מכ-100 מיקרון^{בקוטר 1}, היא האתר העיקרי להחלפה מטבולית וגורם קריטי לעמידות כלי הדם ההיקפי². תפקוד לקוי באנדותל בכלי דם קטנים אלו לעיתים קרובות מקדים שינויים מקרווסקולריים ומשמש כסמן ביולוגי מוקדם למחלות לב וכלי דם, כולל יתר לחץ דם, סוכרת ומחלת עורקים כליליים³. חשוב לציין שלמרות שפגיעה מיקרווסקולרית תורמת משמעותית לנזק לאיברים קצהיים, היא פועלת יחד עם טרשת עורקים מקרווסקולרית ודלקת כרונית מערכתית בתהליך מחלה רב-גורמי. לכן, הערכה לא פולשנית של תגובתיות מיקרווסקולרית חיונית הן לאבחון מוקדם והן למעקב אחר יעילות טיפולית במחקר תרגומי⁴.

ההיגיון בשימוש במיקרוסירקולציה העור כתחליף לבריאות כלי דם מערכתית טמון בנגישותו ובתפקידו כחלון מייצג לתפקוד האנדותליאלי הגלובלי ^5,6. מסורתית, פלומטריית דופלר בלייזר (LDF) נחשבת לסטנדרט הזהב להערכה עורית לא פולשנית⁷. עם זאת, LDF מוגבל ברזולוציה מרחבית נמוכה מכיוון שהוא מספק מדידות נקודתיות הרגישות מאוד להטרוגניות הטבועה בפרפוזיה בעור⁸. לעומת זאת, LSCI מציע יתרונות משמעותיים בכך שהוא מספק ויזואליזציה מלאה בזמן אמת של פרפוזיה רקמתית^{ברזולוציה} טמפורלית ומרחבית גבוהה. על ידי ניתוח דפוס ההתאבכות הנוצר מפיזור אור הלייזר, LSCI מאפשר הערכה סימולטנית של אזורים וסקולריים מרובים ללא צורך במגע פיזי או צבעים חיצוניים^10,11.

בספרות הרחבה יותר, שילוב LSCI עם פרובוקציות פרמקולוגיות מונעות יונטופורזה, כגון אצטילכולין (ACh) ונתרן ניטרופרוסיד (SNP), אומת כגישה איתנה להערכת מסלולי הרחבת כלי דם התלויים באנדותליום^ובלתי תלויים באנדותליום ^12,13. יתרה מזאת, היפרמיה תגובתית פוסט-אוקלוזייבית (PORH) מספקת הערכה משולבת של תגובתיות מיקרווסקולרית הכוללת מתווכים אנדותליים, עצבים תחושתיים נוירוגניים ותפקוד שריר חלק וסקולרי¹². למרות יתרונותיו, הרגישות הגבוהה של LSCI לשונות סביבתית ופיזיולוגית מחייבת נהלי תקינה מחמירים. פרוטוקול זה מתמודד עם אתגרים אלו על ידי פירוט בקרות סביבתיות קריטיות, כולל ייצוב טמפרטורת החדר ב-23°C ±-1°C ומיקום משתתפים סטנדרטי, לשיפור השחזוריות התוך-נבדקת ובין הנושאים¹⁰. שיטה זו מתאימה לחוקרים קליניים ותרגומיים המחפשים גישה מבוססת מתודולוגית ולא פולשנית לחקר פתופיזיולוגיה מיקרווסקולרית באוכלוסיות מטופלים מגוונות.

Protocol

כל ההליכים בהם השתתפו משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המכון הלאומי לקרדיולוגיה (משרד הבריאות, ברזיל), בהתאם לתקנות הלאומיות (הוועדה הלאומית לאתיקה למחקר – INAEP – בהתאם לחוק מס' 14,874, מאי 2024) ולהצהרת הלסינקי (מתוקנת 2024).

1. הכנת משתתפים ושליטה סביבתית

1. ייצוב סביבת הבדיקה
   1. ייצוב את טמפרטורת חדר הבדיקה (RT; 23°C ±-1°C) באמצעות תרמוסטט ייעודי לשמירה על סביבה תרמית יציבה.
   2. עקבו אחרי ה-RT כל 10 דקות באמצעות מדחום דיגיטלי מכויל (דיוק של ±0.1°C).
      הערה: תפקוד מיקרווסקולרי עורי רגיש מאוד לתנודות טמפרטורה.
2. הכינו את המשתתף לפני ההערכה
   1. הנחו את המשתתפים להימנע מעישון, צריכת קפאין או אלכוהול, וביצוע פעילות גופנית אינטנסיבית במשך 24 שעות לפני ההערכה.
   2. הנחו את המשתתפים לצום לפחות שעתיים לפני ההערכה, תוך מתן אפשרות לשתיית מים.
      הערה: ההימנעות מקפאין ופעילות גופנית אינטנסיבית ממזערת את ההתערבות החיצונית לטונוס הווסקולרי העור. קפאין, כאנטגוניסט לקולטן אדנוזין, ופעילות גופנית, באמצעות השפעות על דחף סימפתטי וויסות חום, יכולים לגרום לשינויים מתמשכים בתגובתיות מיקרווסקולרית שנמשכים מספר שעות^{לאחר החשיפה.}
3. מיקום המשתתף לרכישת תמונה
   1. מקמו את הזרוע הלא-דומיננטית של המשתתף בגובה הלב באמצעות כריות גוף לשמירה על האמה במצב אופקי ויציב.
   2. השתמשו במשטח התחתון של האמה כאתר הערכה.
      הערה: האמה הלא-דומיננטית מצמצמת את השפעת שיקום כלי הדם הצדדי הקשור לפעילויות היומיומיות. האמה הגחונית מספקת מאפיינים אנטומיים מועדפים להדמיה אופטית, כולל צפיפות שיער נמוכה יותר ועובי עור מופחתת, ובכך מצמצמת ארטיפקטים של האות ומשפרת את השחזור של מתן תרופות יונטופורטיות.
4. אפשר ייצוב קרדיווסקולרי
   1. שמרו על המשתתף במנוחה לפחות 20 דקות לפני תחילת הרישום המיקרווסקולרי.
   2. הגביל את המשתתף מלדבר, להזיז את הגפה שנבחנה או להשתמש במכשירים אלקטרוניים במהלך תקופת המנוחה.
      הערה: תקופת הייצוב ממזערת תנודות אוטונומיות וקרדיווסקולריות לפני רכישת בסיס הבסיס.
5. מזעור ארטיפקטים של תנועה
   1. הנח את האמה הלא-דומיננטית של המשתתף על מערכת כריות ואקום.
   2. כוונן את הכרית כדי לשמור על משטח האמה התחתון במצב אופקי יציב לאורך כל תהליך קבלת התמונה.
6. הכין את משטח העור
   1. בחר אתרי עור ללא שיער גלוי לכל המדידות.
   2. הסירו שיער באמצעות קוצן ניתוחי 24 שעות לפני ההערכה בעת הצורך.
      זהירות: אין להשתמש במכונת גילוח להסרת שיער כי גירוי בעור עלול להפריע למדידות מיקרווסקולריות.
7. מדד לחץ דם עורקי
   1. בחר את גודל השרוול בהתאם להיקף הזרוע של המשתתף.
   2. בצע שלוש מדידות לחץ דם רצופות באמצעות מכשיר אוסצילומטרי אוטומטי מכויל עם מרווח של דקה אחת בין המדידות.
   3. השליכו את המדידה הראשונה וחישבו את הממוצע של שתי המדידות האחרונות כדי לקבוע את לחץ העורקים הממוצע (MAP), בהתאם להנחיות הקרדיווסקולריות של ESC/ESH ו-AHA.

2. הגדרת מערכת LSCI ותצורת תוכנה

1. הכינו את מערכת LSCI
   1. הפעל את מערכת ה-LSCI לפחות 10 דקות לפני קבלת התמונה כדי לאפשר ייצוב מקור הלייזר.
   2. בדוק את ייצוב הלייזר באמצעות מד מצב התוכנה לפני תחילת ההקלטה.
2. מיקום ראש הלייזר
   1. מקם את ראש הלייזר ישירות מעל האמה של המשתתף.
   2. כוונו את ראש הלייזר למרחק מדויק של 15 ס"מ מפני שטח העור באמצעות כלי מדידת המרחק שסופק על ידי היצרן (איור 1A)
      הערה: שמירה על מרחק צילום קבוע מבטיחה מיקוד תמונה אופטימלי ושדה ראייה עקבי בין המשתתפים.
3. הגדרת תוכנת הרכישה
   1. השיק את תוכנת רכישת התמונות וצור קובץ מחקר חדש.
   2. הזן את המידע הדמוגרפי של המשתתף ואת ה-MAP שחושב קודם.
      הערה: כלול הוראות הפעלה מפורטות וצילומי מסך מייצגים כחומר משלים במידת הצורך.
4. הגדר את פרמטרי הרכישה
   1. הגדר את קצב הדגימה ל-1 תמונה לשנייה (1 הרץ).
   2. כוון את הרזולוציה המרחבית לכ-0.1 מ"מ לפיקסל עבור אזור רכישת היעד.
      הערה: קצב דגימה של 1 הרץ מספק איזון מתאים בין רזולוציה זמנית ליחס אות לרעש, תוך לכידת קינטיקה היפרמית ופרמקולוגית של תגובה.
5. מזעור הפרעות אור סביבתי
   1. בצע בדיקת רעש רקע או חיסור פריימים כהים בהתאם לדרישות המערכת לפני קבלת התמונה.
   2. העמעם את אורות החדר וחסום את אור השמש החיצוני באמצעות וילונות החשכה בכל ההקלטות כאשר אין אפשרות חיסור במסגרת כהה.
      הערה: תאורה סביבתית סטנדרטית מפחיתה הפרעות אופטיות ומשפרת את שחזור האות.
6. הגדר את אזורי העניין (ROIs)
   1. צרו לפחות שלושה ROI מעגליים של כ-80^{מ"מ 2} במסך התצוגה החיה בתוך תוכנת הרכישה.
   2. מיקום שני ROI מעל אתרי אלקטרודות היון-פורזה ו-ROI אחד מעל אתר הערכת PORH.
   3. הניחו את כל ה-ROI על האמה הוונטרלית כ-5 ס"מ רחוק מהבוסה האנטקוביטלית תוך הימנעות מהורידים שטחיים גלויים.
      הערה: סטנדרטיזציה של אזור ה-ROI ממזערת את השפעת ההטרוגניות המרחבית על פרפוזיה עורית ומפחיתה ארטיפקטים קצוות הקשורים לתאי מתן תרופות.
7. השגת הקלטת פרפוזיה בסיסית
   1. יש לתעד את הדם העור במנוחה ברציפות במשך 5 דקות לפני גירוי כלי דם.
   2. יש לנטר את אות הפרפוזיה בזמן אמת ולאשר את היעדר קפיצות תנועה במהלך רכישת הבסיס.
   3. הגדר יציבות בסיסית כשינוי אות פרפוזיה של <10% במהלך מרווח רציף של שתי דקות.
8. אפשר ניתוח הולכת כלי דם עורית (CVC)
   1. הזן את ה-MAP של המשתתף לתוכנת הרכישה.
   2. הפעל את החישוב האוטומטי של CVC בתוך הגדרות התוכנה.
9. תיעוד נתוני פרפוזיה ומולכה
   1. הגדר את התוכנה לחשב CVC אוטומטית על ידי חלוקת ערכי פרפוזיה בזמן אמת (APU) ב-MAP.
   2. יש להקליט הן יחידות פרפוזיה גולמיות (PU) והן ערכי CVC מחושבים בו-זמנית לאורך כל הפרוטוקול.
      
      הערה: ביטוי פרפוזיה מיקרווסקולרית כ-CVC ממזער את ההשפעה המבלבלת של תנודות מערכתיות בלחץ הדם ומאפשר השוואות אמינות יותר בין משתתפים עם פרופילים המודינמיים שונים.

איור 1. הכנה ניסויית להערכת פרפוזיה מיקרווסקולרית עורית באמצעות דימות ניגודיות בלייזר (LSCI) בשילוב עם יונטופורזה. (א) מערכת ניסוי מייצגת המשמשת להערכת מיקרו-כלי דם עוריים באמצעות הדמיית ניגודיות בלייזר וביונטופורזה של סוכני מרחיבי כלי דם. (B) תגובת הפרפוזיה מיקרווסקולרית מייצגת במהלך מתן יונטופורטי טרנסדרמלי של מינונים מצטברים של אצטילכולין (ACh). (C) תמונה מייצגת של יונטופורזה ACh. (D) תמונה מייצגת של אלקטרודת בקרה המכילה רכב. התוויות מציינות את הרכיבים הבאים: (1) ראש המצלמה; (2) אלקטרודות להעברת תרופות ביונטופורזה; ו-(3) אלקטרודה מפוזרת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. יונטופורזה ופרובוקציה פרמקולוגית

1. הכינו את העור ליונטופורזה
   1. נקו את אתרי העור הגחוני הנבחרים של האמה בעזרת תמיסת מלח ללא אלכוהול או ניקוי עור עדין.
   2. ייבשו בעדינות את העור לפני הנחת האלקטרודה.
      הערה: הימנעו מגירוי מכני מופרז במהלך הכנת העור, משום שהרחבת כלי דם שנגרמה מכנית עלולה להפריע למדידות בסיסיות.
2. מיקום אלקטרודות מתן התרופות
   1. חבר שתי אלקטרודות להעברת תרופות לאתרי העור המוכנים באמצעות דיסקים דביקים דו-צדדיים (איור 1A).
   2. שמרו על מרחק בין האלקטרודות של כ-5 ס"מ כדי למנוע הפרעות זרם חשמלי.
3. הכינו את פתרון ה-ACh
   1. מלאו את תא האלקטרודה הראשון ב-200 מיקרוליטר של תמיסה של 2% ACh המוכנה במי מלח^{של 0.9% 14,15}.
   2. השתמש באלקטרודת ה-ACh להערכת הרחבת כלי הדם התלויה באנדותליום.
      הערה: ריכוז התרופה שנבחר היה מותאם כדי לגרום לתגובה מיקרווסקולרית תלויה במינון חזקה, תוך מזעור גירוי לא ספציפי ותופקטים גלווניים.
4. הכינו את פתרון SNP
   1. מלאו את תא האלקטרודה השני ב-200 מיקרוליטר של תמיסת SNP של 2% המוכנה במי מלח של 0.9%.
   2. השתמש באלקטרודת SNP להערכת הרחבת כלי דם בלתי תלויה באנדותליום.
      אזהרה: SNP רגיש לאור. הגנו על התמיסה מחשיפה לאור באמצעות נייר אלומיניום והשתמשו בתמיסה בתוך 4 שעות מההכנה לשמירה על יציבות פרמקולוגית.
      הערה: ריכוז SNP שנבחר מאפשר התרחבות כלי דם יציבה של המישור תוך מזעור השפעות חשמליות לא ספציפיות.
5. הסרת בועות אוויר כלואות
   1. בדוק את תאי האלקטרודות לאיתור בועות אוויר כלואות לפני חיבור העור.
   2. הסר בועות אוויר נראות לעין על ידי הקשה עדינה על תא האלקטרודות או שימוש בקצה מזרק פלסטיק סטרילי.
      הערה: בועות אוויר עשויות לחסום את זרימת הזרם ולגרום להעברת תרופות לא הומוגנית.
6. מיקום האלקטרודה הייחוס
   1. חבר את האלקטרודה הייחוס (הנייטרלית) במרחק של כ-15 ס"מ פרוקסימלי לאלקטרודות העברת התרופות באמצעות ג'ל מוליך או דבק (איור 1A).
   2. אשר מגע יציב עם האלקטרודה לפני תחילת יונטופורזה.
      הערה: הפרדה מרחבית בין אזורי ההערכה הפרמקולוגית וה-PORH ממזערת אינטראקציות מבלבלות ומונעת חפיפה של התלקחות רפלקסי אקסון מושרה על ידי ACh עם אזור מדידת ה-PORH.
7. חבר את מערכת היון-פורזה
   1. חבר את כל האלקטרודות ליחידת אספקת יונטופורזה לפני היישום הנוכחי.
   2. אשר את קוטביות האלקטרודות לפני תחילת הפרוטוקול (אנודל ל-ACh; קתודי ל-SNP).
      אזהרה: קוטביות אלקטרודות שגוי עלולה לפגוע ביעילות מתן התרופות ולשנות תגובות כלי דם.
8. הפעילו את פרוטוקול הזרם של היון-פורזה
   1. ספק שישה מנות זרם מצטיינות של 30, 60, 90, 120, 150 ו-180 מיקרואמא לשני הסוכנים הפרמקולוגיים.
   2. מרח כל מינון נוכחי במשך 10 שניות.
      הערה: פרוטוקול הזרם ההדרגתי מאפשר בניית עקומת מינון-תגובה ומקל על הערכת רגישות מיקרווסקולרית ותגובות פלטו¹¹. השילוב של אמפליטודות זרם נמוכות והפרקי גירוי קצרים ממזער את הרחבת כלי הדם הגלווניים הלא-ספציפיים.
9. שמור על המרווח בין הגירויים
   1. שמור על מרווח של 60 שניות בין יישומים עוקבים של זרם.
   2. יש לעקוב אחרי אות הפרפוזיה במהלך תקופת הייצוב בין המנות.
      הערה: המרווח שנבחר מאפשר ייצוב התגובה המיקרווסקולרית תוך שמירה על מתן תרופות מקומי ללא השפעות מערכתיות.
10. הקלט את התגובה המיקרווסקולרית
    1. הקלט את אות הפרפוזיה המיקרווסקולרי ברציפות לאורך כל גירויי היון-פורזה.
    2. המשך את ההקלטה לפחות 10 דקות לאחר היישום הסופי כדי ללכוד את תגובת הרמה המקסימלית. תגובה מייצגת התלויה במינון מוצגת באיור 2A.

איור 2. רישומים מייצגים של פרפוזיה מיקרווסקולרית עורית במהלך יונטופורזה והיפרמיה תגובתית לאחר חסימה (PORH). (א) תיעוד מייצג של שטף דם מיקרווסקולרי עורי שהתקבל באמצעות LSCI במהלך יונטופורזה של 2% ACh באמצעות זרמי אנודליה עולים של 30, 60, 90, 120, 150 ו-180 מיקרואמפר לפרקי זמן של 10 שניות בהפרש של דקה אחת. (ב) רישום מייצג שהתקבל במהלך הערכת PORH. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. היפרמיה תגובתית לאחר חסימה (PORH)

1. מיקום השרוול החסימה
   1. מקמו אזיק פנאומטי סטנדרטי (רוחב כ-12 ס"מ) על הזרוע העליונה של אותה איבר ששימש להקלטת LSCI.
   2. הניחו את השרוול הפרוקסימלי לאתר הערכת המיקרווסקולר הנבחר.
2. הגדר את אזור הערכת PORH
   1. צור ROI שלישי באמה הגחונית הסמוכה לאתרי האלקטרודות של היון-פורזה.
   2. מקמו את התשואה בתוך אזור עור ללא טיפול כדי למנוע הפרעות פרמקולוגיות.
      הערה: שמירה על הפרדה מרחבית בין אתרי הגירוי הפרמקולוגי לאזור הערכת PORH כדי לשמור על תגובות וסקולריות עצמאיות.
3. רכוש את רישום קו הבסיס של PORH
   1. רשמו פרפוזיה עורית במנוחה ברציפות במשך 5 דקות לפני סתימת העורק.
   2. עקוב אחרי אות הפרפוזיה הבסיסי כדי לוודא את יציבות האות לפני ניפוח השרוול.
4. השרה של סתימה עורקית
   1. נפחו את השרוול הפנאומטי במהירות בתוך < 5 שניות באמצעות מנפח אוטומטי או נורת ניפוח ידנית.
   2. הגבירו את לחץ השרוול ל-50 מ"מ כספית מעל לחץ הדם הסיסטולי שנמדד קודם לכן על ידי המשתתף.
      אזהרה: אשר סתימה מלאה של העורקים לפני תחילת תקופת החסימה, משום שסתימה לא שלמה עלולה לפגוע בתגובה ההיפרמית.
5. שמירה על תקופת הסגר
   1. שמרו על סתימה רציפה של העורקים למשך בדיוק 3 דקות.
   2. אמת את החסימה המלאה על ידי אישור שהאות של LSCI יורד לרמה ביולוגית אפס (< 10 APU).
      הערה: אות האפס הביולוגי משקף תנועה שארית של תאי דם באופן עצמאי מזרימת דם מכוונת, כולל תנועה בראוניאנית.
6. שחרר את שרוול החסימה
   1. שחרר את לחץ השרוול מידית באמצעות שסתום הפליטה המהירה.
   2. אפשר שיקום מיידי של זרימת הדם כדי להתחיל את התגובה ההיפרמית הריאקטיבית.
7. הקלט את התגובה ההיפרמית
   1. המשך את הקלטת ה-LSCI לפחות 5 דקות לאחר שחרור השרוול.
   2. ללכוד את תגובת הפרפוזיה השיא ואת החזרה לרמות הבסיס. תגובת PORH מייצגת מוצגת באיור 2B.
8. כמת את תגובת ה-PORH
   1. חשב את שיא ה-CVC בתוך תוכנת רכישת התמונה.
   2. חשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) של אות התגובה ההיפרמית באמצעות תוכנת הניתוח.

5. חילוץ נתונים וניתוח סטטיסטי

1. פתח ואמת את הנתונים שנרשמו
   1. פתח את קבצי הרכישה המוקלטים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
   2. ודאו שכל ה-ROIs המוגדרים מראש ממוקמים נכון מעל אתרי המדידה המתאימים.
      הערה: ממקמים מחדש את ה-ROI רק כאשר ארטיפקטים של תנועה או סטיית רכישה פוגעים במיקום המקורי.
2. הגדר את מרווחי הניתוח
   1. זהה את מרווחי הניתוח הספציפיים בגרפי המגמה של הפרפוזיה ו-CVC.
   2. בחר מרווח בסיס רציף של 60 שניות מיד לפני הגירוי הווסקולרי הראשון.
   3. בחר את 30 השניות האחרונות של כל מרווח של 60 שניות לאחר גירוי יונטופורזה כדי ללכוד את תגובת המיקרווסקולר של הרמה.
      הערה: הגדר יציבות בסיסית כמקדם שונות (CV) < 5% באות הפרפוזיה כדי למזער את השפעת תנודות כלי דם וארטיפקטים של תנועה לפני ניתוח הנתונים.
3. זיהוי משתני תגובת PORH
   1. זהה את אות האפס הביולוגי במהלך שלב החסימה העורקית בפרוטוקול ה-PORH.
   2. זהה את ערך השיא של CVC מיד לאחר שחרור השרוול.
4. חשב את ערכי הממוצע של המרווחים
   1. חשב את ערך ה-CVC הממוצע עבור כל מרווח ניתוח מוגדר מראש באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
   2. בדוק את היעדר ארטיפקטים של תנועה לפני אישור הערכים הסופיים המחושבים.
5. ארגן את הנתונים המופקים
   1. ייצוא או תמלל ידנית את ערך ה-PU הגולמי הממוצע וערכי ה-CVC הממוצעים לגיליון אלקטרוני מובנה.
   2. ארגן את מאגר הנתונים לפי קבוצות מחקר וגירויים וסקולריים, כולל אצטילכולין, נתרן ניטרופרוסיד ותגובות PORH.
      הערה: שמרו על שמות קבצים וקודי זיהוי משתתפים עקביים לאורך כל עיבוד הנתונים כדי למזער שגיאות תמלול.
6. חישוב תוצאות וסקולריות משניות
   1. חשב את אחוז העלייה מערכי הפרפוזיה הבסיסית או CVC כדי לקבוע תגובתיות וסקולרית.
   2. חשב את ה-AUC כשנדרש לניתוח נקודת קצה משנית.
7. לבצע ניתוח סטטיסטי
   1. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי.
      הערה: כלול צילומי מסך מייצגים או הוראות זרימת עבודה לניתוחים מבוססי תוכנה כחומר משלים כאשר רלוונטי.
   2. הערכת התפלגות הנתונים
      1. הערכו את נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו-וילק.
      2. מבטא נתונים מבוזרים בדרך כלל כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).
      3. ביטוי נתונים שאינם מבוזרים נורמלית כטווח חציוני ובין רבעונים (IQR).
   3. השוואת תגובות מיקרווסקולריות
      1. השוו מאגרי נתונים של שתי קבוצות באמצעות מבחן t עצמאי כאשר הנחות הנורמליות מתקיימות.
      2. השווה מספר קבוצות באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי.
   4. הגדרת קריטריונים למשמעות סטטיסטית
      1. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-p < 0.05.
      2. לטפל בנתונים חסרים שנגרמו מארכי תנועה באמצעות מחיקה זוגית או החרגה מהניתוח המושפע.
         הערה: יישמו את אותה אסטרטגיית נתונים חסרים באופן עקבי בכל קבוצות המחקר כדי לשמור על שלמות אנליטית.

Results

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מניב קו בסיס יציב ואחריו תגובות מיקרווסקולריות ברורות ומובחנות לכל גירוי וסקולרי. בניסוי טכני מוצלח, ההקלטה הבסיסית מדגימה אות פרפוזיה יציב עם תנודות מינימליות, המוגדרת כ-SD של < 10% מהאות הממוצע. במהלך יונטופורזה של ACh ו-SNP, צפויה עלייה מדורגת ב-APU, המשקפת הרחבת כלי דם התלויה במינון. תגובת PORH מוצלחת מאופיינת בירידה מהירה בפרפוזיה לאפס ביולוגי יציב במהלך חסימת העורקים, ואחריה שיא היפרמי חד מיד לאחר שחרור השרוול, בדרך כלל מגיע לערכים פי כמה מעל רמות הבסיס בנבדקים בריאים. איור 1A ממחיש את המערכת הניסויית ששימשה להערכת מיקרווסקולריות עורית באמצעות LSCI ויונטופורזה. איור 1B–1D מציג תגובות יונטופורזה מייצגות ומיקום האלקטרודות. איור 2A מציג תגובה מיקרווסקולרית מייצגת התלויה במינון במהלך יונטופורזה של ACh, בעוד שאיור 2B מציג תגובת PORH מייצגת.

הקלטות לא אופטימליות או טכניות לא מוצלחות מאופיינות בדרך כלל בחוסר יציבות אות או ארטיפקטים הקשורים לתנועה. קפיצות בתדר גבוה או תנודות בסיסיות פתאומיות בדרך כלל מצביעות על תנועת המשתתפים או ייצוב לא מספק של מערכת התמיכה של ריפוד הוואקום. תגובה מופחתת או היעדרה של הרחבת כלי דם במהלך יונטופורזה אצל משתתף בריא בדרך כלל מצביעה על מגע לקוי בין אלקטרודות לעור או בועות אוויר כלודות בתוך תא האלקטרודות, מה שמוביל לפגיעה בהעברת זרם חשמלי. איור 3 מציג דוגמה מייצגת להקלטה בלתי מתקבלת על הדעת המאופיינת באי-יציבות אותות הקשורה לתנועה.

איור 3. דוגמה מייצגת לרישום פרפוזיה מיקרווסקולרי בלתי מקובל במהלך יונטופורזה. תיעוד מייצג של שטף דם מיקרווסקולרי עורי שהושג באמצעות LSCI במהלך יונטופורזה של ACh, המראה חוסר יציבות באות וארטיפקטים הקשורים לתנועה שאינם מתאימים לניתוח כמותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

אי השגת אפס ביולוגי יציב במהלך שלב חסימת ה-PORH מעיד על סתימה עורקית לא שלמה, הנגרמת בדרך כלל ממיקום לא נכון של השרוול או לחץ נפוח לא מספק בשרוול. בתנאים אלו, התגובה ההיפרמית שלאחר מכן הופכת לחלשה ואינה מתאימה לפרשנות אמינה.

פרוטוקולים שבוצעו בהצלחה יוצרים עקומות פרפוזיה ו-CVC ניתנות לשחזור. הפלטו המקסימלי של CVC שנצפה במהלך יונטופורזה SNP משקף את היכולת הכוללת של הרחבת כלי הדם ושלמות מבנית כלי דם, בעוד שהתגובה המתווכת על ידי ACh משקפת בעיקר תפקוד מיקרווסקולרי תלוי באנדותל. השוואה סטנדרטית של תגובות וסקולריות אלו מאפשרת הבחנה בין דפוסים התואמים לתפקוד מיקרווסקולרי משומר ופגום. פרמטרים מיקרווסקולריים כמותיים מייצגים שהתקבלו מנבדקים צעירים בריאים ומטופלים עם יתר לחץ דם עורקי עמיד מוצגים בטבלה 1.

פרמטר מיקרווסקולרי	יחידה	בקרות צעירות בריאות (n = 25)	מטופלים עם יתר לחץ דם עורקי עמיד (n = 50)	ערך p
CVC בסיסי	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
CVC שיא מושרה על ידי ACh	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
שיא CVC מושרה על ידי SNP	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
פסגת PORH CVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

טבלה 1: פרמטרים מייצגים של תגובתיות מיקרווסקולרית בנבדקים צעירים בריאים ובמטופלים עם יתר לחץ דם עורקי עמיד. הערכים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ערכי p חושבו באמצעות מבחן t עצמאי להשוואות בין קבוצות. קיצורים: ACh, אצטילכולין; SNP, נתרן ניטרופרוסיד; PORH, היפרמיה תגובתית לאחר חסימה; CVC, הולכה וסקולרית עורית; APU, יחידות פרפוזיה שרירותיות. הנתונים מייצגים תוצאות שלא פורסמו ממעבדת המחברים.

Discussion

LSCI מספק גישה סטנדרטית ולא פולשנית להערכת תפקוד מיקרווסקולרי מערכתית ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. בהשוואה ל-LDF, המוגבל למדידות בנקודה אחת ורגיש מאוד להטרוגניות המרחבית של פרפוזיה בעור, LSCI מאפשר דימות שדה מלא והערכה סימולטנית של מספר ROIs מרובים. תכונה זו משפרת משמעותית את שחזור המדידה ומפחיתה את מקדם השונות במחקרים מיקרווסקולריים קליניים. יתרה מזאת, אופיו ללא מגע של LSCI מפחית את הארטיפקטים של לחץ מקומי המקושרים בדרך כלל לטכניקות מבוססות גלשים, ומגביר את התאמתו להערכות חוזרות במחקרים תרגומיים וקליניים.

רכיב קריטי בפרוטוקול זה הוא נרמול נתוני הפרפוזיה ל-MAP לחישוב CVC. מכיוון שפרפוזיה עורית מושפעת מאוד מלחץ הדם המערכתי, פרשנות ה-APU הגולמי בלבד עלולה לגרום לבלבול משמעותי, במיוחד באוכלוסיות עם פרופילים המודינמיים משתנים כמו יתר לחץ דם או דיסליפידמיה. מסיבה זו, הפרוטוקול ממליץ לדווח הן על ערכי PU גולמיים וערכי CVC מנורמלים כדי לשפר את פרשנות תפקוד המיקרווסקולרי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. היבט קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא ייצוב סביבתי ומשתתף קפדני, כולל שליטה בטמפרטורת החדר, מזעור ארטיפקטים של תנועה ומיקום משתתפים סטנדרטי, כולם חיוניים להשגת הקלטות שניתן לשחזר.

יש לקחת בחשבון גם מספר מגבלות של LSCI. הטכניקה מעריכה בעיקר מיקרוסירקולציה עורית שטחית בעומק של כ-0.5–1 מ"מ ולכן ייתכן שלא מייצגת באופן מלא שכבות כלי דם עמוקות יותר. בנוסף, פיגמנטציה של העור והפרעות אור סביבתי יכולים להשפיע על יחס האות לרעש, מה שמחזק את חשיבות הבקרות הסביבתיות המתוארות בפרוטוקול זה. מגבלה נוספת היא השימוש במדידת MAP בסיסית אחת לחישוב CVC לאורך כל התהליך. למרות שלחץ דם מערכתי עשוי להשתנות במהלך תקופת ההקלטה של כ-40 דקות, נמנעה בכוונה מהתנפחות חוזרת של השרוול, משום שמדידות לחץ דם חוזרות עלולות לגרום להפעלה סימפתטית ולתנועות שמפריעות לאות ה-laser speckle. מחקרים עתידיים המשלבים ניטור המודינמי לא פולשני רציף עשויים לשפר עוד יותר את הפרשנות הפיזיולוגית של מדידות הולכת מיקרווסקולרית.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים ייצוב סביבתי, שליטה בתנועה, מיקום האלקטרודות וחסימת עורקים מלאה במהלך PORH. הקלטות בסיס לא יציבות נגרמות בדרך כלל על ידי תנועת המשתתפים או תקופות מנוחה לא מספקות, וניתן למזער אותן על ידי ייצוב מחדש של מערכת כרית הוואקום והארכת תקופת ההסתגלות. תגובות יונטופורטיות קהות לעיתים קרובות מצביעות על מגע לקוי בין אלקטרודות לעור או בועות אוויר כלואות בתוך תא המסירה; מילוי זהיר של תא ומיקום מחדש של אלקטרודות בדרך כלל פותרים בעיות אלו. כישלון להגיע לאפס ביולוגי במהלך שלב החסימה של PORH בדרך כלל משקף חסימה עורקית לא שלמה הנגרמת מנפח לא מספק של השרוול או מיקום שגוי של השרוול. בתנאים אלו, התגובה ההיפרמית שנוצרת הופכת מוחלשת ואינה מתאימה לפרשנות אמינה.

השילוב בין פרובוקציות פיזיולוגיות ופרמקולוגיות מהווה חוזק מרכזי של פרוטוקול זה, שכן גישות אלו בוחנות היבטים משלימים של ויסות מיקרווסקולרי. PORH מספק הערכה פיזיולוגית משולבת של תגובתיות מיקרווסקולרית הכוללת מנגנוני שריר חלק אנדותליאליים, נוירוגניים וכלי דם המופעלים על ידי איסכמיה חולפת ולחץ גזירה¹⁶. לעומת זאת, יונטופורזה מאפשרת הערכה סלקטיבית של מסלולי הרחבת כלי דם תלויים באנדותל ובלתי תלויים באנדותל¹⁵. ACh מעריך הרחבת כלי דם התלויה באנדותליאל, בעוד SNP, תורם ישיר של תחמוצת חנקן, מעריך את תגובתיות השריר החלק הווסקולרי ללא תלות באיתות אנדותליאלי¹⁵. פרשנות השוואתית של תגובות אלו מאפשרת הבחנה בין פגיעה תפקודית באנדותל לבין שיקום מיקרווסקולרי מבני. הבחנה זו רלוונטית במיוחד בהזדקנות, יתר לחץ דם עמיד, סוכרת ומחלות מטבוליות כרוניות, שבהן פגיעה באיתות אנדותליאלי ונדירות מיקרווסקולרית עשויים להתקיים במקביל^.

לסיכום, פרוטוקול LSCI סטנדרטי זה מספק שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית תרגומית להערכה לא פולשנית של בריאות מיקרווסקולרית אנושית. השילוב של יונטופורזה פרמקולוגית עם בדיקות איסכמיה-רפרפוזיה פיזיולוגיות מאפשר אפיון מפורט של תפקוד כלי דם אנדותליים ומבניים, תוך מזעור שונות ניסויית באמצעות תקינה סביבתית והמודינמית קפדנית. בהתחשב ברגישותו לזיהוי תפקוד מיקרווסקולרי מוקדם במגוון הפרעות קרדיווסקולריות ומטבוליות, גישה זו מהווה כלי חשוב למחקר קליני, ניטור אורך והערכה טיפולית ברפואה כלי דם תרגומית.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ציוד
מוניטור BP אוסצילומטרי אוטומטי	Omron Healthcare	HEM-7120	משמש להערכת לחץ עורקי ממוצע בסיסי (MAP) (3 מדידות)
מדחום דיגיטלי מכויל	דלתא OHM	HD2301.0	דיוק ו-plusmn; 0.1° C לניטור טמפרטורת החדר
אלקטרודה מפוזרת (הפניה)	פרימד AB	PF 384	אלקטרודה נייטרלית בעלת שטח פנים גדול
אלקטרודות להעברת תרופות	פרימד AB	PF 383 / LI 611	תאי יונטופורזה לא פולשניים (כ-80 מ"מ מ"ר;)
בקר כוח יונטופורזה	פרימד AB	מערכת אבחון מיקרווסקולרית PeriIont	בקר זרם דו-ערוצי (עד 200 ומיקרו; A)
מערכת הדמיית ניגודיות בלייזר ספקל (LSCI)	פרימד AB	PeriCam PSI NR	מדלמת דם ברזולוציה גבוהה
כרית ואקום באיכות רפואית	AB גרמה	לא זמין	משמש למיקום יציב של האמה בגובה הלב
משאבת ואקום המופעלת ביד אחת	AB גרמה	לא זמין	משמש לפינוי כריות ואקום
מנפח מהיר לשרוול	D.E. Hokanson, Inc.	מנפח מהיר לשרוול E20	משמש לחסימת עורקים סטנדרטית של 3 דקות
<חזקים>חומרים מתכלים וצרכנים< חזקים>
כלוריד אצטילכולין (ACh)	סיגמא-אלדריץ'	A6625	מרחיב כלי דם תלוי אנדותליום הוכן ב-2%
פדים להכנת אלכוהול	בקטון דיקינסון	326895	תחבושות אלכוהול איזופרופיל 70% להכנת עור
מים דה-יוניים	סיגמא-אלדריץ'	38796	משמש לשטיפה סופית של אלקטרודות
נתרן כלוריד (0.9% מלח)	ספק מקומי	לא זמין	ממס להכנת תרופות וניקוי עור
נתרן ניטרופרוסייד (SNP)	סיגמא-אלדריץ'	S0501	מרחיב כלי דם בלתי תלוי באנדותליום הוכן ב-2%
גזה סטרילית	ספק מקומי	לא זמין	משמש לייבוש משטח העור לאחר ניקוי
<חזק>תוכנה
תוכנת ניתוח פרפוזיה	פרימד AB	PIMSoft	תוכנה לרכישת נתוני LSCI וניתוח ROI
תוכנת ניתוח סטטיסטי	תוכנת GraphPad	פריזמה 10	משמש להתאמה של עקומת מינון-תגובה וחישוב שטח מתחת לעקומה (AUC)