הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

ראיות גנטיות, טרנסקריפטומיות וחד-תאיות רב-שלביות מתעדפות את MAP1LC3A מבין הגנים הקשורים לפרופטוזיס בגליובלסטומה

94 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cerebrovascular Neurosurgery, The First People's Hospital of Zhaoqing, 2The National Key Clinical Specialty, Guangdong Provincial Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration, Department of Neuro-oncological Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מסגרת רב-שלבית מעוגנת גנטית, המשלבת רנדומיזציה מנדלית, טרנסקריפטומיקה של גידולים ואנליזות של תא בודד, תיעדב את MAP1LC3A כגן הקשור לפרופטוזיס המקושר לרגישות לגליובלסטומה וכמועמד לאימות ניסיוני עתידי.

תקציר

גליובלסטומה (GBM) נותרת גידול ממאיר אגרסיבי ביותר, והתרומה של גנים הקשורים לפרופטוזיס (ferroptosis) לרגישות למחלה עדיין אינה מובנת במלואה. מסגרת רב-שלבית מעוגנת גנטית יושמה כדי לתעדף גנים הקשורים לפרופטוזיס המשויכים ל-GBM. מבין 483 גנים שנאספו מ-FerrDb V2, ל-315 היו loci של תכונות כמותיות של ביטוי cis (cis-eQTLs) מועמדים ב-eQTLGen, 250 שמרו על לפחות שלושה מכשירים עצמאיים לאחר קיבץ של חוסר שיווי משקל קישור (linkage disequilibrium clumping), ו-226 הניבו הערכות רנדומיזציה מנדלית (Mendelian randomization) תקפות המשוקללות לפי השתלבות השונות ההפוכה (IVW), תוך שימוש במחקר איגום גנומי (GWAS) של GBM שכלל 6,183 מקרים ו-18,169 ביקורות. שלושים ואחד גנים עמדו בקריטריוני הגילוי הראשוניים של P < 0.05 ושיעור גילוי שגוי של Benjamini–Hochberg (BH-FDR) < 0.20, עם הערכות רנדומיזציה מנדלית שקולה בייסיאנית (BWMR) תואמות כיוונית. רנדומיזציה מנדלית בשלב השחזור באמצעות cis-eQTLs של דם מלא מ-GTEx V10 תמכה בארבעה גנים: ATG7, RPTOR, MAP1LC3A, ו-CHMP6. הערכה בשלוש קהלות טרנסקריפטומיות עצמאיות של גידול מול ביקורת הדגימה כי MAP1LC3A היה בעל ביטוי מופחת באופן עקבי ברקמת הגידול והראה הערכה מאוחדת של השפעות רנדומליות משמעותית (log₂ fold change, −1.273; 95% confidence interval, −1.625 to −0.920; false discovery rate = 0.016), בעוד ששלושת הגנים האחרים חסרו תמיכה סטטיסטית דומה בין הקהלות. ניתוח knockout וירטואלי של תאים בודדים בוצע לאחר מכן בתת-קבוצה מאוזנת של מטופלים הכוללת 2,400 תאים ממאירים שנבחרו מתוך 4,916 תאים מתאימים מ-20 גידולי GBM בוגרים מסוג IDH-wild-type. בחמישה ריצות עם זריעה עצמאית, זוהו 3, 15, 4, ו-7 גנים חזקים במורד המסלול עבור ATG7, RPTOR, MAP1LC3A, ו-CHMP6, בהתאמה. קבוצות ההסכמה שהתקבלו כללו 17 גנים ייחודיים, כאשר RND3 היה משותף לכל ארבעת היעדים. ניתוח Gene Ontology הצביע על העשרה של תהליכי הידבקות תאים ותהליכים על פני השטח של התא, בעוד ששום מסלול KEGG או Reactome לא נותר משמעותי לאחר תיקון לבדיקות מרובות. יחד, ממצאים אלו מתעדפים את MAP1LC3A לחקירה ניסויית עתידית, תוך הבחנה בין שיוך גנטי, הלימה של ביטוי בגידול והפרעה חישובית לבין הוכחה חלוטה לקוזליות או למנגנון.

מבוא

גליובלסטומה (GBM) נותרת דוגמה מייצגת לממאירות העמידה לטיפול. למרות סיווג מולקולרי מדויק יותר ויותר וטיפול רב-תחומי, השיפורים העמידים בתוצאות הטיפול בחולים היו מוגבלים1. עבור חולים בכושר רפואי תקין, הניהול הנוכחי כולל כריתה מקסימלית בטוחה, ולאחריה רדיותרפיה עם טיפול נלווה ומשלים ב-temozolomide, משטר טיפולים שנקבע בניסוי אקראי מכריע ונשמר בהנחיות הקליניות העכשוויות1,2. עם זאת, חדירה נרחבת והטרוגניות תאית ומולקולרית רחבה מגבילות את השליטה העמידה במחלה, ורוב החולים חווים בסופו של דבר התקדמות או חזרה של המחלה, שביחס אליהם לא קיים טיפול סטנדרטי יעיל באופן אוניברסלי1,3. פער מתמיד זה בין ההתקדמות באפיון המחלה לבין התוצאות הקליניות מדגיש את הצורך לזהות תלויות מולקולריות רלוונטיות ביולוגית שעשויות להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור GBM.

פרופטוזיס (Ferroptosis) היא צורה של מוות תאי מ 의해-מבוקר התלויה בברזל, המאופיינת בפרוקסידציה בלתי נשלטת של פוספוליפידים ובכישלון של מערכות ההגנה האנטי-חמצוניות התאיות, דבר המבדיל אותה מבחינה מכנית מאפופטוזיס ומתוכניות מוות תאי קנוניות אחרות4,5. תהליך זה רלוונטי במיוחד ל-GBM, שבו שינויים גנטיים ופלסטיות מטבולית מעצבים מחדש את הומיאוסטזיס הברזל, את מאזן החמצון-חיזור (redox balance) ואת מטבוליזם הליפידים. פרופילינג גנומי וליפידומי משולב הדגימו כי מחיקת CDKN2A גורמת להפצה מחדש של חומצות שומן רב-בלתי רוויות הניתנות לחמצון, ובכך יוצרת רגישות לפרופטוזיס התלויה לגנוטיפ במודלים של GBM6. באופן דומה, ניתוחים זוגיים של גידולים ראשוניים וחוזרים זיהו שינויים הקשורים להישחלה ב-GPX4, ACSL4 ורגולטורים אחרים של פרופטוזיס7. נמצא גם כי מודולציה ניסויית של נתיבי הגנה מפני פרופטוזיס משפיעה על התגובה לטמוזולומיד בתאי GBM ובמודלים של קסנוגרפט8. יחד, ממצאים אלו מזהים את הפרופטוזיס כפגיעות טיפולית סבירה ביולוגית ב-GBM. עם זאת, הם משקפים בעיקר קשרים למצב הגידול או תצפיות ניסיוניות תלויות-הקשר, ואינם קובעים האם וריאציה קונסטיטוטיבית בביטוי של גנים הקשורים לפרופטוזיס תורמת לרגישות תורשתית ל-GBM.

מרבית המחקרים בבני אדם שבחנו פרופטוזיס (ferroptosis) בגליומה התבססו על ביטוי דיפרנציאלי, מודלים של הישרדות ואנליזות של סיווג מולקולרי תוך שימוש במאגרי נתונים של TCGA, CGGA ו-GEO9,10. למרות שמחקרים אלו ביססו את הרלוונטיות הפרוגנוסטית של תוכניות שעתוק הקשורות לפרופטוזיס, העיצוב התצפיתי שלהם אינו יכול לקבוע האם ביטוי גנים משתנה תורם לרגישות ל-GBM או שמא הוא מייצג תוצאה של התפתחות הגידול. רנדומיזציה מנדלית ברחבי התסריפטום זיהתה לאחר מכן גנים המוסדרים גנטית ותלויים ברקמה הקשורים לסיכון לגליאומה, בעוד שמחקרים עדכניים יותר המבוססים על לוקוסים של תכונות כמותיות של ביטוי (eQTL) וחלבונים (pQTL) החלו לתעדף מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור GBM11,12. עם זאת, מחקרים קודמים אימצו בדרך כלל גישות רחבות של תסריפטום או גישות מוכוונות למטרות תרופתיות, במקום להעריך סט מקיף ומוגדר מראש של גנים הקשורים לפרופטוזיס. יתרה מכך, מעט מחקרים שילבו מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) גדול ב-GBM עם רנדומיזציה מנדלית בשלב השחזור תוך שימוש במשאב eQTL עצמאי, ולאחריו הערכה על פני מספר קהלות תסריפטומיות של גידול מול ביקורת. הבחנה זו חשובה מכיוון שהבקרה הגנטית של ביטוי גנים משתנה משמעותית בין רקמות, ולא ניתן להניח שאסוציאציות eQTL המופקות מדם משקפות השפעות רגולטוריות בתוך גידולי מוח11,13. לפיכך, נדרשת מסגרת אינטגרטיבית המשלבת אסוציאציה גנטית, רנדומיזציה מנדלית בשלב השחזור, תסריפטומיקה של גידולים בין קהלות וחיזוי תפקודי של תא בודד המופק ממטופל, כדי לזהות גנים הקשורים לפרופטוזיס הנתמכים על ידי קווי ראיות מתכנסים למעורבותם ב-GBM.

מחקר זה בחן האם ביטוי של גנים הקשורים לפרופטוזיס (ferroptosis), המוסדר גנטית, קשור לרגישות ל-GBM. רנדומיזציה מנדלית בשלב הגילוי ובשלב השחזור שולבה עם ניתוחי ביטוי גנים בשלוש קהילות טרנסקריפטומיות עצמאיות של גידול מול ביקורת. גנים שנתמכו בשני שלבי הרנדומיזציה המנדלית הוערכו לאחר מכן בנתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד המופקים מחולים, תוך שימוש בהפרעה וירטואלית (virtual perturbation) כדי לאפיין תגובות שעתוק חזויות בתאים ממאירים. במקום לתעדף גנים אך ורק על בסיס חתימות ביטוי בגידול, מסגרת רב-שלבית זו מינפה תחילה וריאציות גנטיות תורשתיות ולאחר מכן העריכה דפוסי ביטוי רלוונטיים למחלה לצד פרופילים חישוביים של הפרעה ברזולוציית תא. הראיות המכנסות שהתקבלו שימשו לתעדוף של גנים הקשורים לפרופטוזיס לצורך חקירה ניסיונית עתידית ב-GBM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה קיבל פטור מביקורת אתית על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הראשון של העם בז'אוצ'ינג (מספר סימוכין B2026-08-03). המחקר השתמש בנתונים גנטיים וטרנסקריפטומיים ברמת סיכום, שנאספו רטרוספקטיבית והוסרו מהם פרטים מזהים, כולל נתוני גישה מבוקרת שאושרו על ידי ועדת גישה לנתונים מ-EGAD000010001657 ומאגרי נתונים שהתקבלו מ-GEO, eQTLGen ו-GTEx בהתאם לתנאי הגישה והשימוש הרלוונטיים להם. לא גויסו משתתפים חדשים, לא נאספו דגימות ביולוגיות ולא נעשה שימוש בנתונים ברמת משתתף המאפשרים זיהוי. אישור אתי והסכמה מדעת למחקרים המקוריים התקבלו על ידי יצרי הנתונים הרלוונטיים, והנתונים בגישה מבוקרת שימשו בהתאם להסכם הגישה לנתונים הרלוונטי.

מערך המחקר

מחקר זה השתמש במסגרת רב-שלבית כדי לתעדף גנים הקשורים ל-ferroptosis המשפיעים על הרגישות ל-glioblastoma (GBM) ולהעריך את השפעותיהם השעתוקיות הרלוונטיות למחלה (איור 1). ראשית, גנים הקשורים ל-ferroptosis שנאספו מ-FerrDb V2 הוערכו באמצעות רנדומיזציה מנדלית (MR) של שני מדגמים, תוך שימוש בנתוני cis-expression quantitative trait locus (cis-eQTL) ומחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) גדול של GBM. שיטת IVW MR (Inverse-variance weighted) שימשה כשיטת הסינון הראשית, BWMR (Bayesian weighted Mendelian randomization) סיפקה הערכה משלימה של החוסן, ומערך נתוני eQTL עצמאי שימש ל-MR בשלב השחזור. שנית, גנים שנתמכו על ידי הניתוחים הגנטיים הוערכו בשלוש קבוצות טרנסקריפטומיות עצמאיות של גידול מול ביקורת, ולאחריהם ביצוע מטא-אנליזה בין הקבוצות. שלישית, נתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד המופקים מחולים שימשו לביצוע הפרעה גנטית וירטואלית בתאים ממאירים ולזיהוי תגובות שעתוקיות שחזירות במורד השביל. תגובות אלו אופיינו לאחר מכן באמצעות העשרה פונקציונלית ואנליזות של רשתות משותפות. באופן כללי, הניתוחים הגנטיים תוכננו כדי לזהות גנים הקשורים לרגישות ל-GBM, בעוד שהניתוחים הטרנסקריפטומיים וניתוחי התא הבודד העריכו התאמה ביולוגית והגהירו היפותזות לאישור ניסיוני בהמשך.

מקורות נתונים

גנים הקשורים לפרופטוזיס (Ferroptosis) הופקו מ-FerrDb V2, והניבו 483 גנים ייחודיים מקודדי חלבון אנושיים לאחר הרמוניזציה של סמלי הגנים והסרת כפילויות14. סטטיסטיקות סיכום של locus של תכונה כמותית של ביטוי cis (cis-eQTL) מדם מלא מקונסורציום eQTLGen שימשו כסט נתוני החשיפה לשלב הגילוי של רנדומיזציה מנדלית (MR), בעוד שנתוני cis-eQTL מדם מלא מ-GTEx גרסה V10 שימשו כסט נתוני חשיפה עצמאי לשלב השחזור של MR11,15. קשרי תוצאה של GBM הופקו מסטטיסטיקות סיכום של מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) בגישה מבוקרת הזמינות דרך ארכיון הגנום-פנום האירופי, הכוללות 6,183 מקרים ו-18,169 ביקורות ממוצא אירופי16. ביטוי ברמת הרקמה של גנים שתועדפו גנטית הוערך בשלוש קוהורטות עצמאיות מ-Gene Expression Omnibus (GEO): GSE196533, הכוללת 61 דגימות גליומה בדרגה 4 שהגדרות במטא-דאטה המופקד כ-GBM ותשע דגימות מוח שאינן נאו-פסטיות; GSE4290, הכוללת דגימות מוח של GBM ודגימות מוח שאינן גידולים המקורות מאפילפסיה; ו-GSE116520, הכוללת דגימות זוגיות של ליבת הגידול ורקמה סביב הגידול יחד עם ביקורות שאינן נאו-פסטיות17,18,19. נתוני Smart-seq2 המופקים מחולים מ-GSE131928 שימשו לניתוח הפרעה וירטואלית של תאים ממאירים20. מאפייני מערכי הנתונים ותפקידיהם האנליטיים המתאימים מסוכמים ב-טבלה 1. כל הניתוחים בוצעו באמצעות מערכי נתונים שנאספו בעבר ואנונימיים, שעבורם התקבלו אישור אתי והסכמה מדעת במחקרים המקוריים.

בחירת מכשור גנטי והרמוניזציה של נתונים

הכלי המועמדים הוגבלו לאזורי cis-expression quantitative trait loci (cis-eQTLs) הקשורים לביטוי גנים במובהקות רחבת-גנום (P < 5 × 10⁻8). וריאנטים קובצו (clumped) באמצעות פאנל הייחוס האירופאי של פרויקט 1000 Genomes עם סף linkage disequilibrium (LD) של r2 < 0.001 בתוך חלון של 10,000-kb. גנים שנותרו עם פחות משלושה כלים בלתי תלויים לאחר הקיבוץ הוצאו מניתוח ה-Mendelian randomization (MR) הראשוני. בהינתן מטרת הסריקה הגששית, נקבע מראש מינימום של שלושה כלים כדי לשמר גנים עם תמיכה דלילה אך חזקה של cis-eQTL, תוך התרת אומדן IVW רב-כלים. סף זה לווה לקיבוץ LD מחמיר וסינון של F-statistic; אומדנים המבוססים על שלושה או ארבעה כלים בלבד פורשו בזהירות, וניתוחי רגישות בוצעו רק כאשר הדבר היה ישים מתודולוגית. חוזק הכלי הוערך עבור כל וריאנט באמצעות ה-F statistic (F = β2/SE2), כאשר β ו-SE מייצגים את אומדן ההשפעה של ה-cis-eQTL ואת הטעות הסטנדרטית שלו, בהתאמה. וריאנטים עם F < 10 הוצאו כדי למזער הטיות של כלים חלשים21,22. מאגרי הנתונים של החשיפה והתוצאה עברו הרמוניזציה על ידי התאמת אללים של השפעה וכיווני השפעה. וריאנטים כפולים, וריאנטים שלא היו זמינים במאגר ה-GBM GWAS, ווריאנטים עם קידוד אללים שאינו תואם הוצאו. מכיוון שתדירויות של אללי השפעה לא היו זמינות עבור ה-GBM GWAS, וריאנטים פלינדרומיים עם אוריינטציית גדיל מעומבמו הוסרו במקום להיות מושכים. מאותה סיבה, לא בוצע מבחן כיווניות פורמלי של Steiger.

ניתוחי רנדומיזציה מנדלית

הקשר בין ביטוי גנים שנחזה גנטית לבין רגישות ל-GBM הוערך באמצעות רנדומיזציה מנדלית (MR) של שני דגמים. בשלב הגילוי, נכללו רק גנים עם לפחות שלושה מכשירים עצמאיים של לוקוס תכונה כמותית של ביטוי סיס (cis-eQTL), ושיטת השקלול של השונות ההפוכה (IVW) שימשה כגישה האנליטית העיקרית. הערכות האפקט דווחו כיחסי סיכויים (ORs) עם רווחי סמך (CIs) של 95% עבור כל עלייה ביחידה אחת בביטוי הגנים שנחזה גנטית. כדי להתחשב בבדיקות מרובות על פני הגנים שנבדקו, ערכי P של IVW הותאמו באמצעות פרוצדורת Benjamini–Hochberg23. גנים עם P < 0.05 ושיעור גילוי שגוי של Benjamini–Hochberg (BH-FDR) < 0.20 נשמרו כמועמדים למחקר חקירתי. סף FDR מקל יחסית זה נבחר כדי לצמצם את השמעה המוקדמת של גנים בעלי רלוונטיות פוטנציאלית במהלך שלב הגילוי; לפיכך, סטטוס המועמדות פسر בשילוב עם ניתוחים עוקבים ולא כראיה מאששת. רנדומיזציה מנדלית משוקללת בייסיאנית (BWMR) הוחלה לאחר מכן על המועמדים משלב הגילוי תוך שימוש באותם מכשירים מותאמים (harmonized instruments)24. התאמה בין תוצאות ה-IVW וה-BWMR הוערכה על בסיס המובהקות הסטטיסטית וכיוון האפקט. במקומות שבהם מספר המכשירים הזמינים התיר זאת, בוצעו מבחן Q של Cochran, מבחן ה-intercept של MR-Egger, MR-PRESSO וניתוחי leave-one-out כדי להעריך הטרוגניות, פליוטרופיה אופקית, וריאנטים חריגים משפיעים והשפעתם של פולימורפיזמים של נוקליאוטיד בודד (SNPs) בודדים22.

ביצוע של MR בשלב השחזור בוצע באמצעות נתוני cis-eQTL של דם מלא מ-GTEx V10. שיטת יחס Wald יושמה כאשר היה זמין מכשיר (instrument) בודד בלבד, בעוד ששיטת IVW שימשה עבור גנים עם שני מכשירים או יותר. שחזור הוגדר כ- P < 0.05, BH-FDR < 0.20, וכיוון השפעה העולה בקנה אחד עם האומדן התואם משלב הגילוי. מכיוון שספרה של אומדני שחזור מ-GTEx התבססו על מכשיר אחד או שניים בלבד, הם פורשו כראיה תומכת לשחזור ולא כראיה עצמאית לקוזליות.

הערכה טרנסקריפטומית בין-קוהורטלית

ארבעת הגנים שתועדפו על ידי ניתוחי רנדומיזציה מנדלית (MR) בשלבי הגילוי והשכפול נבחנו בשלוש קהלים טרנסקריפטומיים עצמאיים. עבור GSE196533, נתוני ספירה גולמיים של RNA-sequencing נותחו באמצעות DESeq225. גנים עם ספירה הנמוכה מ-10 בכל הדגימות למעט שתיים הוצאו מהניתוח, בעוד שארבעת הגנים המטרות נשמרו ללא קשר לסינון הביטוי. ביטוי דיפרנציאלי הוערך בין 61 דגימות גליומה בדרגה 4 שסומנו כ-GBM במטא-נתונים שהופקדו, לבין תשע דגימות מוח שאינן ניאופלסטיות.

עבור GSE4290, ארבעה דגימות שהיה חסר בהן אבחנה היסטופתולוגית מפורשת הוצאו מהמחקר, מה שהותיר 77 דגימות GBM ו-23 דגימות מוח שאינן גידולים. עצימויות של מערכי מיקרו-מערכים (microarray) שעברו עיבוד הועברו לטרנספורמציית log2, עברו נורמליזציית קוונטילים (quantile-normalized), ונותחו באמצעות מודלים ליניאריים של באייס אמפיריים חסונים (robust empirical Bayes linear models) שיושמו ב-limma26. כאשר מספר גששים (probes) מופים לאותו גן, נבחר הגשש בעל ממוצע הביטוי הגבוה ביותר בכל הדגימות שנכללו, ללא תלות במובהקות הביטוי הדיפרנציאלי.

GSE116520 כלל דגימות זוגיות של ליבת גידול ורקמה סביב-גידולית מ-17 חולים, יחד עם שמונה בקרים לא-ניאופלסטיים. נתוני הביטוי שהופקדו, לאחר טרנספורמציה לוגריתמית ונורמליזציה של קוונטילים, נותחו באמצעות limma. מתאמים בתוך אותו חולה בין דגימות ליבת הגידול לדגימות הסביב-גידוליות טופלו באמצעות חסימה ברמת החולה ופונקציית duplicateCorrelation. ההשוואה בין ליבת הגידול לבקרה הייתה ההשוואה שהוגדרה מראש עבור מטא-אנליזה חוצת-קוהורטות, בעוד שהשוואות סביב-גידוליות והמגמה המסודרת בקרה–סביב-גידולית–ליבת גידול הוערכו בנפרד.

יומן ייחודי למחקר2 שינויי קיפול (fold changes) וטעויות תקן אוגדו באמצעות מודל אפקטים אקראיים של נראות מקסימלית מוגבלת (restricted maximum-likelihood) עם הסקת מסקנות של Hartung–Knapp, כפי שיושם ב-metafor. הטרוגניות בין-מחקרים הוערכה באמצעות סטטיסטיקת Q של Cochran ו-I2ערכי ה-P המאוחדים עבור ארבעת הגנים המטרה הותאמו באמצעות הליך Benjamini–Hochberg. תמיכה טרנסקריפטומית חזקה הוגדרה על ידי שיעור גילוי שגוי (FDR) של מטה-אנליזה. < 0.05, מובהקות FDR ברמת העשייה (cohort-level) לפחות בשני מאגרי נתונים, וכיווני השפעה תואמים בכל שלוש העשיות.

ניתוח נוק-אאוט וירטואלי של תא בודד

נתוני Smart-seq2 ממטופלים מ-GSE131928 שימשו להערכה של ארבעת הגנים ששוחזרו ב-MR בתאים ממאירים. תאים ממאירים של מבוגרים זוהו על פי ההערות שסופקו במחקר המקורי, ומספר שווה של תאים נדגם באופן אקראי מכל מטופל מתאים כדי למזער חוסר איזון בייצוג המטופלים. ביצוע knockout וירטואלי בוצע באמצעות scTenifoldKnk וחזר על עצמו בחמישה ריצות עצמאיות. גנים עם P < 0.05 המתוקן לפי Benjamini–Hochberg בריצה בודדת נחשבו למשמעותיים. גנים במורד המסלול ששוחזרו לפחות בשלוש מתוך חמש הריצות הוגדרו כקבוצת הקונסנס הראשית, בעוד שקריטריון מחמיר יותר של ארבע מתוך חמש שימש לניתוח רגישות. תוצאות אלו פורשו כחיזויים חישוביים של הפרעה שעתוקית ולא כראיה לוויסות מולקולרי ישיר.

העשרה תפקודית וניתוח רשתות משותפות

ניתוח העשרה פונקציונלית בוצע באמצעות גנים במורד ספציפיים למטרה שזוהו באופן הדיר בלפחות שלושה מתוך חמש הרצות של knockout וירטואלי. העשרה של Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ומסלולי Reactome הוערכה באמצעות מבחני היפרגאומטריים חד-צדדיים, כאשר 1,004 הגנים שנכללו בהסקת הרשת שימשו כסט הגנים של הרקע. ערכי P הותאמו בנפרד עבור כל מאגר אנוטציות באמצעות פרוצדורת Benjamini–Hochberg, וערך P מתוקנן של < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

רשת דו-חלקיית (bipartite network) נבנתה כדי לייצג את הקשרים בין ארבעת יעדי הנוק-אאוט (knockout targets) לבין הגנים המשותפים שלהם במורד המסלול (downstream genes). גנים הקשורים למספר יעדים זוהו על בסיס הדרגה (degree) המשותפת שלהם, והחפיפה בין קבוצות גנים ספציפיות ליעד נמדדה באמצעות ספירות חיתוך ומדדי Jaccard. קשרי הרשת מייצגים אסוציאציות בין הפרעות חישוביות הניתנות לשחזור, ואין לפרשם כראיה לאינטראקציות מולקולריות ישירות.

ניתוח סטטיסטי ושחזור

אלא אם צוין אחרת, המבחנים הסטטיסטיים היו דו-צדדיים, והשוואות מרובות נשלטו באמצעות פרוצדורת Benjamini–Hochberg. קריטריונים לסגוליות ספציפיות לניתוח מתוארים בתתי-הפרקים המתאימים. כל הניתוחים בוצעו באמצעות R או Python. פרוצדורות אקראיות השתמשו בזרעים (seeds) שהוגדרו מראש, והקוד האנליטי, גרסאות התוכנה והגדרות הפרמטרים המפורטות נשמרו בארכיון כדי לתמוך בדבקיות (reproducibility). כל מערכי הנתונים נאספו בעבר ועברו דה-אידנטיפיקציה; אישור אתי והסכמה מדעת התקבלו במחקרים המקוריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחירה של גנים הקשורים לפרופטוזיס וכלי גנטיים

בסך הכל התקבלו 483 גנים הקשורים ל-ferroptosis מתוך FerrDb V2 (איור 1). מתוכם, 315 גנים הותאמו למסד הנתונים eQTLGen והיו בעלי לפחות locus אחד של תכונה כמותית של ביטוי cis (cis-eQTL) מועמד. לאחר ביצוע linkage disequilibrium clumping, 250 גנים שמרו על לפחות שלושה כלים (instruments) מועמדים בלתי תלויים. בעקבות חיפוש וריאנטים של תוצאה, הרמוניזציה של אללים ובקרת איכות, 26 גנים הניבו הערכות valid inverse-varia...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה שילב אסוציאציה גנטית, רנדומיזציה מנדלית (MR) בשלב השחזור, טרנסקריפטומיקה של גידולים ומודלים של תאים בודדים המופקים מחולים, במטרה לתעדף גנים הקשורים לפרופטוזיס (ferroptosis) המקושרים לרגישות לגליובלסטומה (GBM). סריקה של 483 גנים נבחרים מול מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) של GBM, שכלל 6,183 מקרי חולי ו-18,169 ביקורות, זיהתה 34 מועמדים בשלב הגילוי, שארבעה מהם — ATG7, RPTOR, MAP1LC3A ו-CHMP6 — נתמכו בניתוח השחזור באמצעות משאב עצמאי של לוקוסים כמותיים של ביטוי (eQTL). הראיות הפכו לסלקטיביות יותר ככל שהניתוחים התקדמו מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים לצוות הגנומיקה של הסרטן ב-The Institute of Cancer Research על מתן הגישה לנתוני הסיכום של ה-GWAS לגליומה באמצעות ה-European Genome-phenome Archive (סט נתונים EGAD00010001657). הפקת הנתונים המקורית נתמכה על ידי Cancer Research UK, כולל קרן Bobby Moore, ה-Wellcome Trust, ו-DJ Fielding Medical Research Trust (C1298/A8362).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BWMRחבילת RBWMRרנדומיזציה מנדלית משוקללת בייסיאנית
DESeq2Bioconductorגרסה 1.46.0ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות רצף RNA (RNA-sequencing)
FerrDb V2FerrDbגרסה 2מקור של 483 גנים נבחרים הקשורים לפרופטוזיס
מערך מיקרו-מערכים של מסה (bulk) של גליובלסטומהNCBI Gene Expression OmnibusGSE4290קוהורט להערכה טרנסקריפטומית
סטטיסטיקות סיכום של GWAS לגליובלסטומהארכיון הגנום-פנום האירופיEGAD00010001657נתוני תוצאים בגישה מבוקרת; 6,183 מקרים ו-18,169 ביקורות
ריצוף RNA של תא בודד בשיטת Smart-seq2 בגלובלסטומה (Glioblastoma)מאגר ביטויי הגנים (Gene Expression Omnibus) של NCBIGSE131928ניתוח וירטואלי של נוק-אאוט (Virtual-knockout) של תאים ממאירים
ריצוף RNA מסוג bulk של גליומה בדרגה 4NCBI Gene Expression OmnibusGSE196533קוהורט להערכה טרנסקריפטומית
סטטיסטיקות סיכום של cis-eQTL של דם מלא מ-GTExפרויקט Genotype-Tissue ExpressionGTEx V10נתוני חשיפה בשלב השכפול
limmaBioconductorגרסה 3.62.2ניתוח ביטוי דיפרנציאלי במערך זעיר (Microarray)
מטפור (metafor)חבילת Rגרסה 4.8-0מטא-אנליזה עם אפקטים אקראיים
RR Foundation for Statistical Computingגרסה 4.4.2סביבת מחשוב סטטיסטי
scTenifoldKnkחבילת Rגרסה 1.0.3ניתוח Knockout וירטואלי ברמת התא הבודד
מערך מיקרו-מערכים (microarray) של גושי רקמה מליבת הגידול ומסביב לגידולNCBI Gene Expression OmnibusGSE116520קוהורט להערכה טרנסקריפטומית
TwoSampleMRחבילת Rגרסה 0.6.29רנדומיזציה מנדלית לשני מדגמים
סטטיסטיקות סיכום של cis-eQTL בדם מלאקונסורציום eQTLGeneQTLGenנתוני חשיפה משלב הגילוי

מקורות

  1. Weller M, et al. EANO guidelines on the diagnosis and treatment of diffuse gliomas of adulthood. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:170-186.
  2. Stupp R, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 2005;352:987-996.
  3. McBain C, et al. Treatment options for progression or recurrence of glioblastoma: a network meta-analysis. Cochrane Database Syst Rev. 2021;5:CD013579.
  4. Dixon SJ, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149:1060-1072.
  5. Stockwell BR, et al. Ferroptosis: A regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease. Cell. 2017;171:273-285.
  6. Minami JK, et al. CDKN2A deletion remodels lipid metabolism, priming glioblastoma for ferroptosis. Cancer Cell. 2023;41:1048-1060.e1049.
  7. Kram H, et al. Glioblastoma relapses show increased markers of vulnerability to ferroptosis. Front Oncol. 2022;12:841418.
  8. Miao Z, et al. A targetable PRR11-DHODH axis drives ferroptosis- and temozolomide-resistance in glioblastoma. Redox Biol. 2024;73:103220.
  9. Liu HJ, et al. Ferroptosis-related gene signature predicts glioma cell death and glioma patient progression. Front Cell Dev Biol. 2020;8:538.
  10. Dong J, et al. Ferroptosis-related gene contributes to immunity, stemness, and predicts prognosis in glioblastoma multiforme. Front Neurol. 2022;13:829926.
  11. Robinson JW, et al. Transcriptome-wide Mendelian randomization study prioritizing novel tissue-dependent genes for glioma susceptibility. Sci Rep. 2021;11:2329.
  12. Zhang H, Wang Z, Qiao X, Wu J, Cheng C. Investigating potential drug targets for the treatment of glioblastoma: a Mendelian randomization study. BMC Cancer. 2025;25:654.
  13. GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369:1318-1330.
  14. Zhou N, et al. FerrDb V2: update of the manually curated database of ferroptosis regulators and ferroptosis-disease associations. Nucleic Acids Res. 2023;51:D571-D582.
  15. Võsa U, et al. Large-scale cis- and trans-eQTL analyses identify thousands of genetic loci and polygenic scores that regulate blood gene expression. Nat Genet. 2021;53:1300-1310.
  16. Melin BS, et al. Genome-wide association study of glioma subtypes identifies specific differences in genetic susceptibility to glioblastoma and non-glioblastoma tumors. Nat Genet. 2017;49:789-794.
  17. Zeng C, et al. Dissection of transcriptomic and epigenetic heterogeneity of grade 4 gliomas: implications for prognosis. Acta Neuropathol Commun. 2023;11:133.
  18. Sun L, et al. Neuronal and glioma-derived stem cell factor induces angiogenesis within the brain. Cancer Cell. 2006;9:287-300.
  19. Kruthika BS, et al. Transcriptome profiling reveals PDZ binding kinase as a novel biomarker in peritumoral brain zone of glioblastoma. J Neurooncol. 2019;141:315-325.
  20. Neftel C, et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 2019;178:835-849.e821.
  21. Burgess S, Thompson SG. Avoiding bias from weak instruments in Mendelian randomization studies. Int J Epidemiol. 2011;40:755-764.
  22. Papadimitriou N, et al. Physical activity and risks of breast and colorectal cancer: a Mendelian randomisation analysis. Nat Commun. 2020;11:597.
  23. Song W, et al. Causal relationship between gut microbiota and lung squamous cell carcinoma: a bidirectional two-sample Mendelian randomization study. Postgrad Med J. 2025;101:526-534.
  24. Zhao J, et al. Bayesian weighted Mendelian randomization for causal inference based on summary statistics. Bioinformatics. 2020;36:1501-1508.
  25. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  26. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43:e47.
  27. Yun D, et al. A novel prognostic signature based on glioma essential ferroptosis-related genes predicts clinical outcomes and indicates treatment in glioma. Front Oncol. 2022;12:897702.
  28. Li R, et al. Identification of candidate genes associated with prognosis in glioblastoma. Front Mol Neurosci. 2022;15:913328.
  29. Bai H, Inoue J, Kawano T, Inazawa J. A transcriptional variant of the LC3A gene is involved in autophagy and frequently inactivated in human cancers. Oncogene. 2012;31:4397-4408.
  30. Hayashima K, Kimura I, Katoh H. Role of ferritinophagy in cystine deprivation-induced cell death in glioblastoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2021;539:56-63.
  31. Wu Y, et al. ALDH1-mediated autophagy sensitizes glioblastoma cells to ferroptosis. Cells. 2022;11:4015.
  32. Carriere A, et al. ERK1/2 phosphorylate Raptor to promote Ras-dependent activation of mTOR complex 1 (mTORC1). J Biol Chem. 2011;286:567-577.
  33. Dai E, Meng L, Kang R, Wang X, Tang D. ESCRT-III-dependent membrane repair blocks ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:415-421.
  34. Comincini S, et al. microRNA-17 regulates the expression of ATG7 and modulates the autophagy process, improving the sensitivity to temozolomide and low-dose ionizing radiation treatments in human glioblastoma cells. Cancer Biol Ther. 2013;14:574-586.
  35. Wang L, et al. Autophagy mediates glucose starvation-induced glioblastoma cell quiescence and chemoresistance through coordinating cell metabolism, cell cycle, and survival. Cell Death Dis. 2018;9:213.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

גנים של פרופטוזיסרגישות לגליובלסטומהרנדומיזציה מנדליתניתוח תאי-יחידקוהורטות טרנסקריפטומיותניתוח eQTLאונטולוגיה של גניםדה-רגולציה בגידולקשר גנטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.