הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיתוף ניסיון על הישרדות ארוכת טווח במודל השתלת כבד חולדה לא עורקי

114 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71650

⸱

22 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University, 2Institute of Organ Donation and Transplantation, Medical College of Qingdao University, 3Organ Transplant Center, Fujian Medical University Union Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מטרת הפרוטוקול המוצג היא לשתף ניסיון כירורגי אופטימלי להקמת מודל השתלת כבד חולדה ללא עורק, תוך התמקדות בשיפורים טכניים שמבטיחים הישרדות ארוכת טווח של בעלי חיים מעבר ל-100 ימים.

תקציר

בהשתלות כבד ניסיוניות, מודל העכברוש הוא התקן הזהב לחקר אימונולוגיה של השתלות ותהליכים מטבוליים; עם זאת, שחזור עורק הכבד העדין במיוחד (~0.5 מ"מ) מהווה אתגר טכני משמעותי. כדי לעקוף זאת, נעשה שימוש נרחב במודל השתלת כבד חולדה (NArLT) הפשוט. למרבה הצער, סיבוכים חמורים במרה — כגון דליפת מרה וכולנגיטיס איסכמית — הנובעים מחוסר עורקים מגבילים לעיתים קרובות את הישרדות המקבלים. מכשול זה מגביל משמעותית את המחקר בנושאים מרכזיים, כולל תאימות חיסונית ארוכת טווח של שתל מארח ודחייה כרונית. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי למודל NArLT המשלב שיפורים טכניים קריטיים להתגבר בהצלחה על פגיעות מרה איסכמיות אלו. שיפורים מרכזיים כוללים שלב אנהפטי מקוצר משמעותית, טכניקת ניתוח מרה ללא מגע, שטיפה יסודית של דרכי המרה ושיטת סטנט פנימית מיטבית. לאחר יישום ההליך המשופר הזה, שיעור ההישרדות של המקבל עלה על 94% במהלך תקופת התצפית בת 100 הימים. בסופו של דבר, פרוטוקול אופטימלי זה מספק פלטפורמה חזקה וניתנת לשחזור גבוה לחקר המנגנונים שמאחורי סבילות להשתלה לטווח ארוך, ובכך תומך בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות ברפואת השתלות.

מבוא

מודל השתלת כבד חולדה משמש כפלטפורמה הניסויית הנפוצה ביותר למחקר השתלות בסיסי. עם זאת, היישום הרחב יותר שלו לעיתים קרובות מוגבל על ידי עקומת למידה תלולה ידועה לשמצה, שיכולה לעכב משמעותית את התקדמות המחקרים הניסיוניים במורד הזרם 1,2. יתרה מזאת, מודלים קונבנציונליים להשתלת כבד חולדה סובלים לעיתים קרובות מהצלחה ניתוחית לא אופטימלית ושיעורי הישרדות נמוכים לטווח הארוך. על ידי ייעול קריטי של ההליכים הכירורגיים, שיפור מדויק בפרטי הניתוח, וביצוע שחזורים וסקולריים ומרה תחת הדמיה ישירה, עקומת הלמידה הקשורה למודל מיקרוכירורגי מורכב זה יכולה להיות מקוצרת משמעותית 3,4. השתלת כבד נותרה הטיפול המרפא היחיד למחלת כבד בשלב סופי, מה שהופך את הקמת מודלים להשתלות כבד בעכברים למשמעותית מאוד למחקר המדעי 5,6.

מודל השתלת כבד עכברוש לא עורקי (NArLT) מציע יתרונות משמעותיים בניתוחים ניסיוניים: הוא עוקף את האתגר הכבד של אנסטומוזה עורקית מיקרווסקולרית, מקצר את זמן הניתוח הכולל ומקצר את משך ההרדמה עבור העכברים. למרות המחסור באספקת דם עורקי, התגובה המרה שנוצרת במודל זה מציעה נקודת מבט ייחודית לחקירת פגיעות מרה איסכמיות. עם זאת, מודלים קונבנציונליים של NArLT קשורים לשיעור גבוה של סיבוכי מרה לאחר ניתוח של עד 30%7, מה שפוגע קשות בהישרדות ארוכת טווח. במודל הקלאסי המסורתי של השתלת כבד עכברוש, שיעור ההישרדות לטווח הארוך של המקבל הוא פחות מ-70%–85%8. כדי להתמודד עם זה, מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי המשתמש בסטנט מרה רך מטופל בהפארין. באמצעות טכניקת ניתוח מרה ללא מגע, כדי למקסם את שימור רשת המיקרווסקולרית הפריבלירית, לצד שטיפת מרה יסודית באמצעות פרפוזיה קרה, גישה זו שואפת להפחית באופן יסודי סיבוכי מרה באמצעות תמיכה פיזיתוהגנה איסכמית, ובסופו של דבר לספק פלטפורמה יציבה וחזקה למעקב אימונולוגי ארוך טווח.

לכן, מקסום שיעורי ההצלחה הפרוצדורליים והארכת הישרדות המקבל הם המטרות העיקריות של כל חדשנות טכנית בהשתלת כבד חולדות. השגת מטרות אלו היא תנאי קריטי להבטחת התקדמות מהירה ובלתי מופרעת של מחקר ניסויי במורד הזרם10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים והניתוחים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של בעלי החיים של אוניברסיטת צ'ינגדאו (מס' 20260301SD5020260401065). עשו כל מאמצים למזער סבל בעלי חיים.

1. הכנה לפני הניתוח

  1. בעלי חיים ניסיוניים
    1. השתמשו בזכרים בוגרים של חולדות ספרג–דולי (SD), בגילאי 8–10 שבועות ומשקל 220–250 גרם, כתורמים. ודאו שמשקל המקבל מעט גדול יותר מזה של התורם, עם הפרש של 50 גרם.
    2. חולדות בית בתנאים מסוימים נטולי פתוגנים בטמפרטורה מבוקרת של 22°C ±-2°C ולחות יחסית של 50% ±-10%.
    3. שמור על מחזור אור/חושך של 12 שעות עם צפיפות כלוב של 2–3 חולדות בכל כלוב.
    4. ספק דיאטה סטנדרטית למכרסמים במעבדה. אפשר לחולדות להסתגל לסביבת המעבדה לפחות שבוע לפני ההתערבות הניתוחית.
    5. חיות צומות במשך 12 שעות לפני הניתוח. לאפשר גישה אד ליביטום למים.
      הערה: צום לפני הניתוח מסייע להפחית את הסיכון לשאיפת המים במהלך ההרדמה ומונע הרחבת קיבה שעלולה לפגוע בתפקוד הנשימה ולחסום את החשיפה לניתוח.
  2. כלים וחומרים כירורגיים
    1. השתמשו בכלים הנדרשים לניתוח השתלה כפי שמוצג באיור 1. רשום את פרטי הצרכנים ששימשו בניתוח בטבלת החומרים.
    2. בחרו מעטפות קטטר אפידורלי 5F ו-6F על ידי התאמת הקוטר החיצוני של הקטטרים לקוטר הפיזיולוגי הפנימי של כלי היעד אצל זכרים חולדות SD במשקל 220–250 גרם.
    3. השתמש במעטפת 5F (כ-1.67 מ"מ) לווריד הפורטלי (PV). השתמשו במעטפת 6F (כ-2.00 מ"מ) לווריד הנוב התחתון (IHIVC) הפנימי.
      הערה: בחרו את גודל הקטטר בהתבסס על שילוב של סטנדרטים אנטומיים והערכה ויזואלית תוך ניתוחית תחת מיקרוסקופ כירורגי. בצע השוואה בזמן אמת בין הקוטר החיצוני של הקטטר לבין הלומן הפנימי של כלי המטרה. התאמה מתאימה מושגת כאשר הקטטר תופס כ-70%–80% מהלומן של כלי הדם, ומאפשר החדרה חלקה מבלי למתוח יתר על המידה את דופן הכלי או להשאיר רפיון מופרז. עבור חולדות SD בטווח המשקל שנקבע, ניתן להשתמש בקוטר כלי הדם האנטומי המוגדר מראש לבחירת גודל ראשוני, שיש לכוונן תוך כדי ניתוח בהתאם לשונות האישית. המפעילים צריכים לקבוע התאמה זו בין כלי דם לקטטר באמצעות הכשרה מיקרוכירורגית קודמת.
    4. עבור חולדות SD בגילאי 8–10 שבועות, בחרו מעטפות קטטר אפידורלי 5F ו-6F כאזיקים ל-PV ול-IHIVC, בהתאמה (איור 2A).
    5. הכינו אזיקים באורך פונקציונלי כולל (גוף צינורית) של 2.0–2.5 מ"מ. שמור על אורך הארכה של 3.0–4.0 מ"מ לטיפול עם מלקחיים.
    6. מהדק את דופן השרוול באמצעות לסתות מלקחי יתוש ליצירת חריץ היקפי הממוקם כ-0.5–1.0 מ"מ מהקצה הפרוקסימלי של השרוול (ראו איור 2A לפרטים). שמור על עומק חריץ של כ-0.1–0.2 מ"מ כדי להקל על קשירת קשרים בטוחה וקיבוע לאחר מכן.
    7. ודאו שהחריץ מונע מחבל האבטחה 7-0 להחליק מפני הקטטר הקשיח.
    8. חתוך קטטר תוך-ורידי של 22G ליצירת סטנט מרה עם קצוות משופעים או משופעים. יש להבטיח אורך של 5–7 מ"מ.
    9. מעדיף אורך סטנט של 7 מ"מ. כוונן את האורך לפי שונות אנטומית באמצעות הרמה האופקית של וריד הקיבה הימני כסימן צורך. הערך את המרחק מהציון הדרך הזה להיילום הכבדי כדי להנחות את בחירת אורך הסטנט.
    10. לקצר את הסטנט (לכ-5–6 מ"מ) אם המרחק המשוער מוגבל או אם יש התנגדות במהלך ההכנסה. ודאו שניתן להכניס כ-2–3 מ"מ מהסטנט לתעלה המרה מבלי להתכופף, להתעקם או לבליטה.
    11. השרה את הסטנט במי מלח הפריטיני (100 IU/mL) בטמפרטורת החדר (23°C ±-2°C). שמרו על הסטנט טבול למשך מינימום של 30 דקות לפני השימוש כדי למנוע קרישה תוך-לומינלית של המרה בעת החדרה ללומן המרה של התורם (איור 2A).
      הערה: הכינו את השרוול לפני הניתוח והשתמשו במלקחיים ליצירת חריצים בדופן השרוול כדי להקל על קשרים וקיבועים לאחר קנולציה מוצלחת. ודאו שקצות הסטנט המרה החתוך אינם חדים מדי כדי למנוע ניקוב בצינור המרה. תחת מיקרוסקופ כירורגי (10×–16× הגדלה), ודאו שהקצה החיתוך נקי וללא קוצים פלסטיים משוננים; אם הקצה נראה כמו מחט, קהה אותו מעט עם מיקרו-מספריים. במהלך המניפולציה, השתמשו רק במיקרו-מלקחיים דקים וללא שיניים כדי להתמודד עם הסנט. הימנעו מהפעלת כוח חיצוני מופרז, כפי שמצוין על ידי השטחה, אובליזציה או עיקול של הלומן של הסטנט; להשליך ולהחליף כל סטנט מעוות, שכן היצרות לומינלית מעלה את הסיכון לסיבוכים מרה לאחר הניתוח.

figure-protocol-1
איור 1. כלי ניתוח המשמשים בתהליך ההשתלה. (א) קערת כליות מפלדת אל-חלד. (ב) מחזיקי מחטים מיקרו. (ג) מיקרו-מספריים. (D) מיקרו-מלקחיים (ישרים ומעוקלים). (ה) קליפים מיקרווסקולריים וקלאמפים קטנים בסגנון יתוש בולדוג. (F) מחזיק מחט סטנדרטי. (ז) מלקחיים המוסטטיים ישרים (מלקחי יתושים). (ח) מהדק כלי דם. (I) מספריים כירורגיים סטנדרטיים. (י) גומייה (עשויה משרוול כפפה ניתוחית סטרילית). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2. אזיקים ניתוחיים מותאמים אישית, סטנט מרה, וחתכים מתוכננים בבטן. (א) הכנת אזיקים וסקולריים ועמוד מרה יחד עם סרגל מילימטר. משמאל לימין: מעטפת קטטר אפידורלית 6F המשמש לשרוול הווריד הנבוב התחתון (IHIVC) של ה-infhepatic, מעטפת 5F המשמשת לשרוול הווריד הפורטלי (PV), וסטנט מרה בקוטר 5–7 מ"מ שנחתך מקטטר תוך-ורידי 22G. (ב) חתך צלב מסומן על בטן העכבר התורם כדי למקסם את החשיפה הכירורגית. (ג) חתך לפרוטומיה אמצעית סטנדרטי המסומן על בטן העכברוש המקבל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. ניתוח תורם

  1. צעדים ראשוניים
    1. הרדימו את העכבר התורם באמצעות 5% איזופלוראן בקצב זרימת אוויר של 1 ליטר לדקה בתא ההשראה. הערכו עומק ההרדמה על ידי אישור היעדר תנועת גפה ספונטנית ורפלקס גמילה.
      הערה: עומק ההרדמה מוערך על ידי התבוננות בהיעדר תנועה ספונטנית של הגפה, היעדר רפלקס גמילה, וקצב הנשימה. כדי להבטיח התקדמות חלקה ובטוחה של הניתוח, פרמטרים אלו נבדקים מחדש בקפדנות במרווחים של 20 דקות לאורך כל ההליך.
    2. ניתן 1% פנטוברביטל (40–45 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך-פריטונלית בבטן התחתונה הימנית, כ-1–2 ס"מ לרוחב לקו האמצע (linea alba) ו-1–2 ס"מ לגולגולת לרצועה המפשעתית הימנית. אשר הרדמה מספקת על ידי צביטת כף הרגל האחורית והבטחת שאין רפלקס גמילה.
    3. מקם את העכבר התורם במצב שכיבה על כרית חימום של 37°C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח.
    4. לגלח את אזור הניתוח של הבטן. חטא את האזור עם פובידון-יוד שלוש פעמים.
  2. הליכים לפני פרפוזיה לכבד
    1. בצע חתך צלב הממשיך עד לתהליך הזיפואיד, למטה לסימפיזיס הערווה, ולרוחב לקו האמצע של בית השחי כדי למקסם את החשיפה של שדה הניתוח (איור 2B).
      הערה: בצע את הלפרוטומיה בשתי שכבות. ראשית חתך את העור והרקמה התת-עורית. לאחר מכן חטפו את הלינאה אלבה עם מלקחיים ובצעו חתך קטן ראשוני כדי לאפשר כניסת אוויר, מה שגורם לאיברים הפנימיים ליפול. הארכי את החתך עם מספריים תוך שמירה על הלהב התחתון במקביל לדופן הבטן כדי למנוע פגיעה באיברים.
    2. עטוף את המעיים בגזה ספוגה במי מלח. הניחו אותם על שדה הניתוח הסטרילי בצד השמאלי של הבטן כדי לחשוף את אזור הניתוח.
      הערה: חיוני לשמור על לחות רציפה של המעי המפורק לאורך כל ההליך כדי למנוע ייבוש איסכמי והיפותרמיה. החזירו את הגז המכסה מדי פעם על ידי מריחת טיפות מלח חמות (37°C) רגילות בערך כל 10–15 דקות, או מיד כאשר הגזה מתחילה להתייבש תחת תאורה כירורגית.
    3. חלק את הרצועה הפלציפורמית. מהדק ומשוך את תהליך הזקפואיד לראש כדי לחשוף את ה-IVC הסופרהפטי (SHIVC) ואת הווריד הפרני התחתון השמאלי.
    4. חלק את הרצועה המשולשת השמאלית. לחבר את הווריד הפרני השמאלי קרוב ל-SHIVC באמצעות 7-0 או 8-0 תפר (איור 3A).
      הערה: בעת קשירת הווריד הפרני התחתון השמאלי, מקם את הקשירה קרוב ל-SHIVC. שימו לב שמחט התפר עלולה בקלות לנקב את הסרעפת ולגרום לפנאומוטורקס; תפר קרוב לכלי הדם.
    5. מומלץ להשתמש באלקטרוקקוטריה לחלוקת כלי דם כדי להשיג המיסטזיס מהיר ולהפחתת זמן הניתוח, ובכך לשפר את העקביות הפרוצדורלית ואת השחזור.
      הערה: אלקטרוקוטריה מסטנדרטית המוסטזיס, מקצרת את זמן הניתוח ומשפרת את השחזוריות בין המפעילים.
    6. הניעו את האונות הזנביות והפפילריות (איור 3B).
    7. השתמש במלקחיים מיקרוסקופיים להסרת שומן ורקמת חיבור מפני השטח של ה-IHIVC.
      הערה: הסר רקמת חיבור עד שדופן כלי הדם נראית חלקה ושקופה. חשיפה מספקת מושגת כאשר ניתן להפעיל מהדקים וסקולריים ללא הפרעה וללא שאריות רקמה שעלולות לפגוע בשרוול או בתפירה.
    8. לחבר את וריד האדרנל הימני בהתאמה ל-IHIVC. בודד את וריד הכליה הימני וקשור אותו בצמוד ל-IHIVC.
    9. המשך לנתח את ה-IHIVC בזנב לרמה ממש מעל וריד הכליה השמאלי (איור 3C).
      הערה: ודא שה-IHIVC יהיה שלדי לחלוטין (הפרדת כלי דם ככל האפשר מרקמת חיבור שונית) במהלך הדיסקציה. זה מקל על הוצאת הכבד והליכי חיבור השרוול הבאים.
    10. הרימו בעדינות את הכבד באמצעות מטוש כותנה. נתח את החיבורים הרצועות בין האונה הכבדית התחתונה הימנית לבין הרטרופריטונאום.
      הערה: זהה את ה-SHIVC ככלי כחול-כחול קצר, רחב, דק בדופן בקוטב הכבד העליון. עצור את הדיסקציה כאשר פני השטח הקדמיים שלו מנוקים וסיבי הסרעפת הסמוכים הופכים לגליים.
    11. עצרו את הניתוח בהגעה ל-SHIVC.
      הערה: לטפל בכבד בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה פרינכימלית. יש לנהל זהירות כדי להגן על ה-IVC במהלך ניתוח רטרופריטוניאלי גולגולתי.
    12. נתח את רקמת החיבור בין ה-PV ל-HA הנכון. בודד את ה-PV.
    13. לחבר את וריד הקיבה הימני (הווריד הפילורי) בהתאמה ל-PV. המשך בכריתה לשורש הווריד הטחול.
    14. חשפו את הכבד הנייד. זהה את רקמת החיבור השומנית הדמוית חבל הטבור הממוקמת משמאל ל-PV, המכסה את צינור המרה המשותף, ואת ה-HA.
    15. בצע חתך בצורת "V" בדופן הקדמית של ה-CBD, במרחק 3–5 מ"מ דיסטלי לפיצול צינור הכבד.
    16. השתמשו במיקרופוספסים כדי להחזיק את סטנט המרה. הכנס את הסטנט כ-3 מ"מ לתוך מסלול המרה תוך שמירה על יישור מקביל לתעלה.
      הערה: קדם את הסטנט בצורה חלקה וללא התנגדות. ודא שאין בליטות צדדיות, זווית או אונטלינג בדפנות התעלות. אם מתרחשת התנגדות או עיוות, יש לסגת וליישר מחדש לפני ההחדרה מחדש.
    17. אבטח את הסטנט עם קשר משי בהיקף 7-0. לחבר את ה-HA בגובה החתך ולחתוך אותו קרוב (איור 3D).
      הערה: הימנע בקפידה מ"שלד" מופרז בעת ניתוח CBD של התורם. שימור רקמת החיבור הפריבילרית, מקלסות העצבים ורשתות מיקרווסקולריות כדי לקדם מחזור דם מוקדם וריפוי מרה לאחר הניתוח. מכיוון שהקצה המרוחק של צינור התורם הוא האזור האיסכמי ביותר, שמור על האתר האנסטומטי קרוב להילום הכבדי כדי למזער את העומס האיסכמי.
  3. פרפוזיה לכבד
    1. חשפו את האאורטה הבטנית. הכנס מחט וריד קרקפת בקוטר 23 (23 גרם) (כ-1 ס"מ) שמחובר למזרק 20 מ"ל מלא בתמיסת קרירה (4°C) של אוניברסיטת ויסקונסין (UW).
      הערה: הכנס את המחט לאאורטה הבטנית בזווית רדודה (15°–20°). אשר כניסה על ידי צפייה בפלאשבק דם עורקי, ואז התקדם מעט ויישר את המחט במקביל לכלי הדם כדי למנוע נקב בדופן האחורית.
    2. הסר אוויר מהמזרק לפני ההזלבה. מהדק וקבע את האאורטה והמחט הבטנית באמצעות מהדק וסקולרי.
      הערה: הוצא את כל האוויר מהמזרק על ידי נקישה כדי להוציא בועות ונוזל עד שנראית טיפה רציפה בקצה המחט. וודא שאין אוויר במרכז המחט לפני הקנולציה.
    3. התחל בהדרגה את הזרימה על ידי לחיצה ידנית על המזרק בקצב יציב של 3–3.5 מ"ל לדקה (איור 3E).
      הערה: אשר מיקום תוך-כלי תקין על ידי צפייה בהחזרת דם בצינורות.
    4. לחתוך את הסרעפת. חשפו במלואם את ה-IVC של בית החזה ואת האאורטה החזה.
    5. מהדקים את ה-IVC של בית החזה במפגשו עם העלייה הימנית, יחד עם האאורטה החזה, באמצעות מהדקים וסקולריים.
    6. חתך את ה-IVC החזה מיד מתחת למהדק כדי לאפשר פליטת פרפוזאט.
      הערה: יש להניח את הקליפס בצורה הגולגולתית האפשרית ולחתוך מתחתיו כדי לשמור על אורך הכלי. התחל מיד בפרפוזיה כדי למנוע קרישה ולשמור על איכות השתל.
    7. המשך את הפרפוזיה בקצב יציב (3–3.5 מ"ל לדקה) לנפח כולל של כ-40 מ"ל.
    8. הפסקת הפרפוזיה כאשר הפרנכימה של הכבד הופכת לחיוורת לחלוטין (צהבהבה-חום) (איור 3F).
      הערה: פרפוזיה מספקת מאושרת כאשר הכבד הופך לחיוור באופן אחיד (צהבהב-חום) והנוזל מה-IHIVC החתוך זורם נקי, ללא שארית דם.
    9. חתך את ה-IHIVC בצמוד לווריד הכליה השמאלי. חתך את ה-PV ברמת וריד הטחול.
      הערה: הימנעו מהזרקה מהירה או בכוח של פרפוזאט כדי למנוע פגיעות באנדותל ובפרנכימלס.
    10. הגדל את החתך הדיאפרגמטי. קצור את השתל הכבד יחד עם הסרעפת המחוברת.
    11. הניחו את השתל בצלחת פטרי סטרילית המכילה תמיסת שימור קרירה של UW.
    12. שמור על השתל בתמיסת UW קרה בטמפרטורה של 4°C. השתלה מלאה תוך שעתיים מנקודת הרכישה.

figure-protocol-3
איור 3. שלבים כירורגיים מרכזיים במהלך תנועת כבד תורם והפרפוזיה במקום. (א) חשיפה וקשירת וריד הפרניקה התחתון השמאלי. (ב) בידוד וחלוקה של ענפי התקשורת בהפטו-וושטי. (ג) ניתוח של IHIVC, המדגים קשירת ורידי האדרנל הימני ושל הכליה הימנית. (ד) הכנסת סטנט המרה המותאם אישית לתעלה המרה המשותפת (CBD) באמצעות טכניקת "ללא מגע" לשימור רקמת החיבור הפריבילרית. (ה) קנולציה של האאורטה הבטנית להתחלת פרפוזיה במקום. (ו) כבד תורם עם פיוו מלא עם מראה חיוור אחיד, מה שמעיד על שטיפת דם מוצלחת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הכנת שתל אקס-ויבו

הערה: יש לבצע את כל הכנת השתל מחוץ לחי על הקרח (איור 4A). שמרו על השתל בתמיסת UW בטמפרטורה של 4°C ±-2°C ועקוב אחרי הטמפרטורה באופן תקופתי כדי להבטיח שמירה מספקת על הקור.

figure-protocol-4
איור 4. הכנה אקס-ויבו של שתל כבד מתורם. (א) שתל הכבד שנקטף הונח בצלחת פטרי סטרילית המכילה תמיסת שימור קרירה של UW, מונחת על קרח מרוסק לשמירה על היפותרמיה. (ב) אזיקת ה-PV של התורם באמצעות הפיכה מעל אזיק מותאם אישית וקיבוע עם קשורה היקפית. (ג) הכנה מושלמת לשרוול ל-PV ו-IHIVC, עם סטנט המרה במקומו. (ד) הכנת ה-IVC העל-כבד (SHIVC) עם תפרים שהונחו בשתי הפינות הצידיות כדי להקל על אנסטומוזה נוספת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. הכנת שרוול PV
    1. אחוז בזנב השרוול ה-PV עם מלקחיים יתושים ואבטח אותו כך שקצה הזנב מופנה כלפי מטה, בניצב לתחתית צלחת הפטרי.
    2. העבר מיקרופוספס דרך הלומן של השרוול. משוך את ה-PV דרך השרוול.
    3. כוון את הקיר הקדמי של ה-PV. כ-3 מ"מ מדופן הכלי מעל הקצה המורחב של זנב השרוול.
    4. אבטח את הכלי הפתוח לדופן החיצונית של השרוול באמצעות קשר משי היקפי בקוטר 7-0 (איור 4B).
      הערה: ודא שהכלי והשרוול מיושרים ללא פיתול או זווית. לאחר הקיבוע יש לשטוף את השרוול הפוטו-וולי בכ-1 מ"ל של תמיסת UW ולאשר את הפטנטיות על ידי תצפית בפליטה מה-SHIVC.
  2. הכנת שרוול IHIVC
    1. הכנת ה-IHIVC והקשירה מתבצעת בשלבים זהים בדיוק כפי שתוארו עבור ה-PV בשלב 3.1. בקצרה, זה כולל גיוס כלי שיט, חיתוך וקיבוע שרוולים בהתאם לאותו פרוטוקול סטנדרטי כדי להבטיח עקביות ניסיונית ושחזוריות. (איור 4C).
      הערה: אשר את השפלות של שרוול IHIVC על ידי צפייה בפליטה חופשית מה-SHIVC לאחר השטיפה.
  3. שטיפת דרכי המרה
    1. שטפו בעדינות את צינור המרה דרך סטנט המרה באמצעות מזרק בנפח 1 מ"ל המכיל 0.5 מ"ל תמיסת UW.
    2. ודאו שלא מתרחשת דליפת נוזלים במהלך השטיפה.
      הערה: היעדר דליפת נוזלים מאשר את שלמות תעלת המרה.
  4. הכנה ל-SHIVC
    1. גזום את ה-SHIVC של השתל הכבד על ידי הסרת הסרעפת שארית.
    2. ודא שה-SHIVC הוא שלד לחלוטין, כפי שמוגדר בשלב 2.2.7.
  5. מיקום התפרים הקבועים
    1. השתמש ב-7-0 או 8-0 תפרים המבוססים על העדפת האופרטור.
      הערה: מבחינת תוצאות ניתוח (כולל פטנטיה אנסטומוטית והישרדות המקבל), שני גדלי התפרים שווים פונקציונלית במודל זה. הבחירה בין השניים יכולה להתבסס לחלוטין על העדפת המפעיל האישית או זמינות המעבדה מבלי להשפיע על השחזוריות של ההליך.
    2. שטחי בעדינות את גזע ה-SHIVC. יש להניח תפרים בפינות הצדדיות השמאלית והימנית על ידי העברת המחט מבפנים לחוץ, כ-1 מ"מ מהקצה (איור 4D).

4. ניתוח המקבל

  1. צעדים ראשוניים
    1. הרדימו את העכברוש המקבל באמצעות אותו פרוטוקול שתואר עבור התורם (שלב 2.1.1).
    2. הניחו את עכבר המקבל על כרית חימום מבוקרת תרמוסטטית בטמפרטורה של 37°C.
    3. הערה: שקלו את העכבר המקבל לפני ההרדמה. ודא שמשקל גופו עולה על משקל התורם בכ-50 גרם.
  2. מוביליזציה של כבד המקבל
    1. בצע לפרוטומיה בקו האמצע.
    2. משוך את דופן הבטן לרוחב באמצעות ארבעה רטרקטורים אלסטיים. מקמו את שני הרטרקטרים העליונים לרוחב השוליים הצלעים הדו-צדדיים ואת שני הרטרקטרים התחתונים לרוחב האזורים המפשעתיים הדו-צדדיים כדי להשיג חשיפה מיטבית.
      הערה: יש להפעיל משיכה מספקת כדי לחשוף את שדה הניתוח תוך הימנעות ממתח מופרז שעלול לגרום לחליפת רקמות או לפגוע בנשימה.
    3. ליגט את וריד הפרניקה התחתון השמאלי (LIPV) באותו אופן כפי שתואר בהליך התורם (ראו שלב 2.2.1).
    4. נתח את הרצועות בין תנוך הכבד השמאלית לרטרופריטונאום. הניעו את האונות הזנביות והפפילריות.
    5. לחלק את הרצועות והענפים המתקשרים בין הוושט לאונה הכבד השמאלית באמצעות אלקטרוקוטריה.
      הערה: מומלץ להשתמש באלקטרוקקוטריה כדי להבטיח המיסטזיס מהיר, לקצרת זמן הניתוח ולשיפור השחזור הפרוצדורלי.
    6. נתח את ה-IHIVC בצורה ישירה עד לרמת הווריד הכלייתי הימני.
    7. בודדו וקשרו בזהירות את וריד האדרנל השמאלי במרחק של כ-2 מ"מ מהמפגש שלו עם ה-IHIVC.
    8. לנהל את האונה התחתונה הימנית של הכבד באותו אופן שתואר בהליך התורם (ראו שלב 2.2.4).
    9. העבר גומייה (עשויה משרוול כפפה ניתוחית סטרילית, באורך של כ-10 ס"מ) לרוחב מאחורי ה-SHIVC.
      הערה: יש להפעיל אחיזה עדינה כדי לחשוף את ה-SHIVC מבלי להגביל את תנועת הנשימה.
    10. השאירו את הגומי במקום לשימוש במהלך החיתוך הבא של ה-SHIVC.
    11. נתח ובודד את ה-PV מההילום הכבדי ועד לרמת ענף הווריד הפילורי.
      הערה: הגבל את הניתוח של ה-PV לאזור האנסטומוטי. שמרו על היובלים הסובבים כדי להפחית טראומה כירורגית.
    12. בודד את ה-HA בהילום הכבד.
    13. לחבר את ה-HA לצד הילום ולחתוך אותו קרוב.
    14. זהה את המפגש של צינורות כבד שמאליים וימניים היוצרות את ה-CBD מתחת להילום הכבד. לחבר את ה-CBD באתר זה באמצעות תפר פרולין 7-0 ולחתוך אותו (איור 5A).
      הערה: יש למזער טראומה כירורגית באזור זה. שמרו על האורך המרבי האפשרי של ה-HA יחד עם רקמת החיבור הפריבלירית, מקלסות העצבים ורשת המיקרווסקולריות כדי להקל על הקמת זרימת דם צדדית מוקדמת.
  3. הפאטקטומיה של המקבל
    1. הניחו קליפסים מיקרווסקולריים כדי לחסום את ראש ה-IHIVC מיד על וריד הכליה הימני.
    2. הניחו קליפס מיקרווסקולרי כדי לחסום את ה-PV ממש מעל המפגש שלו עם הווריד הפילורי.
    3. אשר סתימה מוצלחת של כלי הדם על ידי צפייה בהכהה נראית לעין של הפרנכימת הכבד.
      הערה: יש לאשר סתימה וסקולרית על ידי כהה אחידה (ציאנוזיס) של הכבד, אובדן טורגור פרנכימלי, וקריסת ה-PV.
    4. הכנס מחט וריד קרקפת 23G שמחוברת למזרק של 5 מ"ל לתוך ה-PV.
    5. הזרקו 2 מ"ל תמיסת גלוקוז 5% במשך כ-30 שניות כדי לשטוף דם תוך-כבדי למחזור הדם המערכתית.
      הערה: הזרקו לאט דרך ה-PV ליד הילום הכבדי כדי לשטוף דם תוך-כבדי למחזור הדם המערכתית.
    6. הפעילו אחיזה כלפי מטה על הגומייה כדי לחשוף את ה-SHIVC.
    7. הצמיד את ה-SHIVC באמצעות מהדק וסקולרי (איור 5B).
    8. חתך את ה-IHIVC, PV ו-SHIVC בהתאמה לפרנכימה הכבדית.
    9. הסר את הכבד הטבעי לחלוטין מחלל הבטן.
      הערה: שמרו על שלב האנהפטי בתוך 26 דקות (לא יותר מ-30 דקות). כלי הדם הטרנסקטיים צמודים לכבד כדי לשמור על אורך מספק ולהבטיח גדמי כלי דם חלקים.
  4. השתלת שתל הכבד
    1. שיקום SHIVC
      1. מקם את השתל בכבד בכיוון אנטומי אורטופופי.
      2. השתמשו בתפר 7-0 שהונח מראש בפינה השמאלית כדי להתחיל בתפירה רציפה של הקיר האחורי לכיוון הפינה הימנית.
      3. אבטח את התפר לתפר הקבוע בפינה הימנית.
      4. המשך את התפר לאורך הקיר הקדמי להשלמת האנסטומוזה (איור 6A–6C).
      5. שמרו על מרחק כניסה של 0.5–1.0 מ"מ מקצה הספינה.
      6. שמרו על גובה תפר של 1.0–1.5 מ"מ.
        הערה: שמור על מרווח מחטים וגובה תפרים אחיד כדי להבטיח אנסטומוזה בטוחה וללא מתח.
      7. הדק את התפר אחרי כל תפר כדי למנוע מרווח מת ולשמור על מתיחות מתאימה.
        הערה: לפני השלמת התפירה הקדמית, שטוף את ה-SHIVC בתמיסת UW באמצעות מחט פנימית כדי להוציא שאריות אוויר ולמנוע תסחיף אוויר.
    2. שחזור PV
      1. הניחו תפרי עמידה 7-0 בפינות השמאלית והימנית של גדם ה-PV המקבל.
      2. הפעילו אחיזה תלת-נקודתית ליצירת פתח משולש.
      3. הכנס את ה-PV של התורם עם אזיקים לתוך הלומן.
      4. מאובטח באמצעות רצועת 7-0 הקשורה סביב החריץ ההיקפי (איור 6D–6F).
    3. שחזור IHIVC
      1. שחזר את ה-IHIVC באמצעות אותה טכניקה כמו שחזור PV (ראו שלב 4.4.2) (איור 6G–6I).
    4. ריפרפוזיה
      1. שחרור סדרי כלי דם ברצף על SHIVC, PV ו-IHIVC.
      2. לאשר את ההחזרה המוצלחת על ידי צפייה בשיקום צבע אחיד של השתל ללא גודש, דימום או דליפה (איור 7A).
        הערה: ייצור פעיל של מרה מצינור המרה מעיד על שיקום הפרפוזיה הכבדית ותפקוד השתל המוקדם.
    5. שיקום המרה
      1. בצע חתך רוחבי קטן (חצי מקוטר התעלה) בדופן הקדמית של גזע ה-CBD המקבל.
      2. הכנס את סטנט המרה של התורם כ-3 מ"מ ללומן ה-CBD.
      3. אבטח את הסטנט עם תפר היקפי 7-0 (איור 7B).
        הערה: יש לצפות בנוזל מרה פעיל מהקצה הדיסטלי של סטנט התורם לפני השלמת השחזור. זה מאשר פטנטיות ותפקוד השתל המוקדם.
  5. חימום מחדש של מקבל
    1. שטוף את חלל הפריטונאלי ב-150 מ"ל של תמלח רגיל ב-37°C לפני סגירת הבטן.
      הערה: שלב זה מסיר שאריות דם, משיב את טמפרטורת הגוף ומאפשר בדיקת המוסטזיס באנסטומוזה SHIVC, IHIVC ו-PV.
  6. סגירת בטן וטיפול לאחר הניתוח
    1. סגור את שכבת השרירים הפציאלית באמצעות תפר רציף עם חוט נספג 4-0, תוך קבלת נשיכות של 5 מ"מ במרווחים של 1 ס"מ.
    2. סגור את העור עם תפר רציף עם חוט משי 4-0.
    3. נתנו בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) תת-עורית כל 12 שעות, בסך הכל 2 מנות.
    4. העבר את העכברוש המקבל לכלוב נקי ומבוקר טמפרטורה.
    5. יש לעקוב ברציפות עד להחלמה מלאה מההרדמה וחזרת התנועה הספונטנית הרגילה.

figure-protocol-5
איור 5. שלבים כירורגיים מרכזיים במהלך המוביליזציה של הכבד וההפאטקטומיה. (א) זיהוי וקשירה של ה-CBD של המקבל סמוך לפיצול ההילר. (ב) חשיפה והקפצה צולבת של ה-SHIVC. רצועת גומייה מונחת מאחורי ה-SHIVC כדי לספק אחיזה ולשפר את הוויזואליזציה במהלך ההידוק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-6
איור 6. שלבים כירורגיים מרכזיים לשחזור כלי הדם במהלך השתלת שתל כבד. שחזור ה-SHIVC: (א) יישור באמצעות תפרי פינות, (ב) תפר רציף בקיר האחורי, ו-(ג) השלמת התפרים הקדמיים. שחזור PV באמצעות טכניקת השרוול: (D) אחיזה בשלוש נקודות, (E) הכנסת PV תורם עם אזיק, ו-(F) קשירה שמחזקת את השרוול. שחזור IHIVC באמצעות אותה טכניקת שרוול: (G) חשיפה, (H) הכנסה, ו-(I) קשירה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-7
איור 7. אימות תפקוד השתל, שחזור המרה וההחלמה לאחר הניתוח. (א) הערכת תפקוד השתל המוקדם לאחר רפוזיה, עם פליטת מרה נראית לעין מסטנט המרה של התורם. שחזורי PV ו-IHIVC נראים לעין. (ב) שחזור מרה מושלם עם החדרה וקיבוע של סטנט המרה של התורם לתוך ה-CBD של המקבל. (ג) עכברוש מקבל ייצוגי שמראה החלמה מלאה לאחר הניתוח עם יציבה תקינה ופעילות ספונטנית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להבטיח איכות ניתוחית עקבית ויכולת שחזור במודלים של NArLT, כל ההליכים בוצעו על ידי אותו מיקרומנתח מנוסה. בסך הכל בוצעו 50 השתלות כבד לעכברים במהלך תקופת המחקר. משך הניתוח הממוצע היה כדלקמן: ניתוח תורם היה ממוצע של 25.3 ± 2.6 דקות, הכנת השתל מחוץ לחי בממוצע 13.1 ± 2.1 דקות, ניתוח מקבל בממוצע 43.0 ± 1.6 דקות, והשלב האנהפטי היה ממוצע של 15.7 ± 1.2 דקות.

נמענים שעברו את הליך NArLT האופטימלי הציגו שיעור הישרדות של 94% (47/50) במהלך תקופת תצפית של 100 ימים, כאשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל NArLT הוא אבן יסוד למחקר השתלות ניסיוני בשל הימנעות מאנסטומוזה עורקית מיקרווסקולריתמורכבת 11. עם זאת, שיטות NArLT קונבנציונליות סובלות היסטורית משיעורים גבוהים של סיבוכי מרה — עד 30% — שמגבילים קשות את ההישרדות לטווח ארוך ומקשים על מחקרים אימונולוגיים כרוניים2. המשמעות של השיטה המוצעת טמונה ביכולתה לעקוף פגיעות מרה איסכמיות אלו. במחקר זה, שיעור ההישרדות ל-100 ימים הגיע ל-94%, גבוה יותר משיעורי ההישרדות לטווח קצר שדווחו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82370666), תוכנית המו"פ המרכזית של מחוז שאנדונג, סין (מס' 2025KJHZ016) ופרויקט טכנולוגיית הבריאות של מחוז פוג'יאן (מס' 2023CXA014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-0 תפר נספגאתיקוןW9109Hמשמש לסגירת שכבת השרירים הפציאלית (linea alba)
4-0 תפר משיאתיקוןVCP304Hמשמש לסגירת עור
7-0 או 8-0 תפר / עניבת משיאתיקוןZ1711Eמשמש לקשירת כלי דם (למשל, וריד פרני שמאלי)
קטטר תוך-ורידי 22Gב. בראון4252098Bקיצוץ ל-5– 7 מ"מ עם קצוות משופעים להכנת סטנט מרה
מחט וריד קרקפת 23Gחברת תעשיית הרפואה של שאנדונג צ'ינקאי בע"מ.MDLSSVSמשמש להחדרה לאאורטה הבטנית לצורך פרפוזיה בכבד
בופרנורפיןמכון טיאנג'ין למחקר תרופות, חברת התרופות בע"מ.H12020275ניתנה כמשכך כאבים תת-עוריים לאחר ניתוח
מטלית כותנהAoocn216-236משמש להרמת כבד בעדינות במהלך ניתוח
קרח מרוסקלא זמיןלא זמיןמשמש לשמירת טמפרטורת השתל במהלך הכנת אקס ויבו
רטרקטורים אלסטייםלא זמיןלא זמיןמשמש לכיפוף דופן הבטן במהלך לפרוטומיה
מעטפות קטטר אפידורליותחברת המכשור הרפואי ג'יאנגסו מאיצ'ואנג בע"מ.20173084015גדלים 5F ו-6F; שימש כאזיקים ל-PV ו-IHIVC
גזהCentral Medical Technology Co., Ltd.CH-1001ספוג במי מלח; משמש לכיסוי והגנה על המעיים
תמיסת גלוקוז (5%)חברת התרופות סצ'ואן קלון בע"מ.H20044307משמש לשטיפת דם תוך-כבדי במהלך כריתת כבד של המקבל
הפארין סליןחברת שנזן לייף ביוטכנולוגיה בע"מ.H2012003100 IU/mL; משמש להשריה של עמוד מרה
מחט פנימיתב. בראון4254074Bמשמש לשטיפת SHIVC להסרת אוויר לפני ביצוע אנסטומוזה
איזופלוראןג'ינאן גואנגשנגיואן ביוטכנולוגיה בע"מ.153107015ריכוז 5%; משמש לאינדוקציה להרדמה  
מהדקים מיקרווסקולרייםShanghai Medical Devices Co., Ltd.JCZ200משמש לסתימת כלי דם במהלך ניתוח
מלקחי יתושיםShanghai Medical Devices Co., Ltd.J31010משמש למניפולציה עדינה והכנת אזיקים
סליין נורמלי (0.9%)חברת התרופות סצ'ואן קלון בע"מ.H20044304משמש להשקיה והשריית גזה (37 מעלות; C)
פנטוברביטל (1%)Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.P050000040– 45 מ"ג/ק"ג; משמש להרדמה כירורגית
קטטר ורידי מוכנס היקפית (PIVC)Covidien8888145015השתמשה כדי לשטוף את ה-PV עם האזיקים ולאישור הפטנסי  
פובידון-יודשאנשי טרינדה ביוטכנולוגיה בע"מ.41836054משמש לחיטוי אתר ניתוחי
גומי בנד (מ-Surgical Glove)אנסללא זמיןמשמש למשיכת SHIVC במהלך ניתוח המקבל
Sprague– דולי ראטסחברת הביוטכנולוגיה של חואפוקאנג (בייג'ינג) בע"מ.22001Aעכברים זכרים בוגרים, 8– 10 שבועות, 220– 250 גרם
צלחת פטרי סטרילית (10 ס"מ)שאנדונג אניו ביוטכנולוגיה בע"מ.H905001משמש להחזיק שתל בתמיסת UW במהלך הכנת אקס ויבו
מזרק (20 מ"ל)קבוצת שאנדונג וייגאו למוצרי פולימר רפואיים בע"מ.20163141593משמש לפרפוזיה מבוקרת בכבד (3– 3.5 מ"ל לדקה) 
פתרון שימור UWגשר אל החייםBTL-UW-1Lמתוחזק ב-4&g; C; משמש לזירוי כבד תורם ולשימור שתלים

מקורות

  1. Hirata, M., et al. Stepwise approach for acquisition of microsurgical skills through rat orthotopic liver transplantation experiments. Eur Surg Res. , (2023).
  2. Zhao, H., et al. Revisiting orthotopic rat liver transplant. Exp Clin Transplant. , (2021).
  3. Wu, W., et al. Research progress on anatomy reconstruction of rat orthotopic liver transplantation. Transplant Rev (Orlando). , (2024).
  4. Shi, J. H., Line, P. D., Zhang, S. J., Guo, W. Z. Experimental liver surgery for liver research: update, choice and translation. J Inflamm Res. , (2025).
  5. Engel, B., et al. Molecular signatures discriminating different types of rejection in human liver transplants. J Hepatol. , (2025).
  6. Khatua, C. R., Anirvan, P., Panigrahi, M. K., Singh, S. P. Admission Albumin-Bilirubin Score Is Inferior to MELD, MELD-Na+ and Child-Turcotte-Pugh Score in Predicting Survival in Indian Patients with Alcohol-associated Liver Disease. J Transl Gastroenterol. , (2025).
  7. Yu, H., et al. Low hepatic artery blood flow mediates NET extravasation through the regulation of PIEZO1/SRC signaling to induce biliary complications after liver transplantation. Theranostics. , (2024).
  8. Yang, Z., et al. Prognosis analysis of rat liver transplantation under direct vision of single operator. Transplant Proc. , (2024).
  9. Wang, Z., et al. Liver cold storage and transplantation in the cold-adaptive Daurian ground squirrels. J Vis Exp. , (2025).
  10. Wang, X., MacParland, S. A., Perciani, C. T. Immunological determinants of liver transplant outcomes uncovered by the rat model. Transplantation. , (2021).
  11. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. , (1979).
  12. Yuan, Z., et al. The effect of microcirculation disturbance of peribiliary vascular plexus on hepatic bile duct epithelial cells in rats undergoing liver transplantation and postoperative rejection reduction by nanocarrier mediation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). , (2022).
  13. Zhao, D., et al. Regression of bile duct damage and bile duct proliferation in the non-rearterialized transplanted rat liver is associated with spontaneous graft rearterialization. Hepatology. , (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.