הדמיה אימונופלואורסצנציונית סטנדרטית של ננו-צינורות מנהורים והעברת מיטוכונדריאלים בין אסטרוציטים לנוירונים

סיכום

פרוטוקול זה מתקן שיטות קיבוע (fixation), צביעה והדמיה קונפוקלית להמחשת ננו-צינורות מנהורים והעברת מיטוכונדריה בין אסטרוציטים לנוירונים במבחנה.

תקציר

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים שמווסתים את ייצור האנרגיה, האיתות התאים וההומאוסטזיס המטבולי בתאי עצב. ננו-צינורות מנהורים (TNTs) הם מבנים קברניים דקים המתווכים תקשורת בין-תאית למרחקים ארוכים ומסייעים בהעברת רכיבים תאיים, כולל מיטוכונדריה, בין תאים מחוברים. הדמיה אמינה של TNTs והעברת מיטוכונדריה דורשת טיפול זהיר בדגימות, שכן מבנים אלו שבריריים מאוד ורגישים לתנאי קיבוע, שטיפה והדמיה. פרוטוקול זה מתאר נהלים סטנדרטיים לקיבוץ, צביעה והדמיה קונפוקלית של TNTs באסטרוציטים ובמערכות קוקולטורה של אסטרוציטים–נוירונים. תהליך העבודה כולל צביעת ממברנה ושלד לצורך ויזואליזציה של TNT, תיוג מיטוכונדריאלי למעקב אחר מיקום מיטוכונדריאלי, וצביעה אימונופלואורסצנצית לניתוח קולוקליזציה של Miro1. שלבים קריטיים לשימור מורפולוגיית TNT, כולל שטיפה עדינה וטיפול מוגן מאור, מודגשים לאורך כל ההליך. הפרוטוקול גם מתאר גישות דימות לאפיון TNTs ומיטוכונדריה בתאריכי תאים קבועים. שיטות אלו מספקות מסגרת ניסויית ניתנת לשחזור לחקר יצירת TNT והעברת מיטוכונדריה בין תאי עצב במבחנה.

מבוא

המיטוכונדריה משמשת כמפעלי האנרגיה של התא, ומספקת את האנרגיה הנדרשת לפעילות תאית באמצעות ייצור אדנוזין טריפוספט, ובמקביל ממלאות תפקידים חשובים בהעברת אותות תאיים ובאיזון רדוקס¹. במערכת העצבים, מטבוליטים מיטוכונדריאליים יכולים להגדיל את המורכבות וההתעוררות של תהליכים נוירונים, ובכך לתמוך בצמיחה ובהתפתחות הנוירונים². מיטוכונדריה אינן אברונים סטטיים; הם משנים כל הזמן את המורפולוגיה, המיקום וההתפוצה שלהם כדי להסתגל ללחצים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים ולדרישות מטבוליות³. העברת מיטוכונדריה בין-תאית תורמת לשמירה על הומאוסטזיס רקמתי ומקדמת התפתחות בתנאים פיזיולוגיים, בעוד שבתנאים פתולוגיים היא משתתפת בתיקון נזקים, ויסות חיסון והתקדמות מחלה ^4,5.

תקשורת בין-תאית של חומרים ואנרגיה חיונית לתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הומאוסטזיס תאי, תיקון רקמות וויסות רשתות עצביות. מחקרים עדכניים חשפו מספר מצבי תקשורת בין-תאיים, ביניהם ננו-צינורות מנהורים (TNTs) מהווים אחד המנגנונים הנחקרים ביותר הקשורים להעברת מיטוכונדריה בין-תאית⁶. TNTs הם מבני ממברנה מבוססי F-אקטין, דמויי גשר, עם מורפולוגיה צינורית, בקוטר של 50 עד 200 ננומטר ומגיע עד כמה קוטרי תאים באורך⁷. מחקרים הראו כי TNTs יכולים לשמש כקשרים פיזיים בין תאי עצב וקשורים קשר הדוק להופעת והתקדמות מחלות ניווניות, סרטן מוח והפרעות נוספות. לדוגמה, העברה מיטוכונדריאלית ממיקרוגליה לנוירונים באמצעות TNTs דווחה כמצילה תאי עצב ^8,9.

המחקר הנוכחי על TNTs מתמודד לעיתים קרובות עם מספר אתגרים, כולל השבריריות המבנית של TNTs, שהופכת אותם לרגישים לשבירה ועלולה להשפיע על תוצאות הניסוי; קושי להבחין בין TNTs לפילופודיה או בליטות ממברנה אחרות; ואתגרים הקשורים לכימות מדויק של TNTs בין-תאיים. כדי לשפר את השחזוריות והעקביות של מחקרים הקשורים ל-TNT, נדרשות שיטות סטנדרטיות לשטיפה, קיבוע, צביעה והדמיה של TNTs כדי לאפשר הערכה מדויקת של המבנה וההתפלגות שלהם תוך מזעור השונות הניסויית. גורמים כמו צפיפות התאים לפני הקיבוע, הגנה מאור, עוצמת הכביסה, משך הקיבוע ותנאי צביעה לאחר הקיבוע יכולים כולם להשפיע על המבנה והיציבות של TNTs. במחקר זה אנו מתארים נהלים לטיפול מקדים, צביעה והדמיה קונפוקלית של TNTs ומבני TNT הקשורים למיטוכונדריה במערכות תרבית אסטרוציטים ואסטרוציטים-נוירונים.

פרוטוקול מחקר זה ניתן ליישם בדרך כלל ברוב מסגרות המעבדה. אימות באסטרוציטים ראשוניים ובקו תאי עצב היפוקמפוס של עכבר אישר כי הפרוטוקול מתאים הן לתאי עצב ראשוניים והן לקווי תאים מונצחים. עם זאת, לפרוטוקול הזה עדיין יש מספר מגבלות. מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת רזולוציה מרחבית נמוכה יותר משיטות הדמיה סופר-רזולוציה לוויזואליזציה של TNT, והערכת העברת מיטוכונדריה מבוססת MitoTracker עשויה להיות מושפעת מדליפת צבע והפרעות אותות לא-מיטוכונדריאליות¹⁰.

פרוטוקול

מחקר זה לא כלל נבדקים אנושיים או בעלי חוליות חיים; רק קווי תא מסחריים שהושגו או מבוססים, ולא נדרשה אישור אתי.

1. צביעה ל-TNTs באסטרוציטים

1. זריעת תאים
   1. הזרעים בודדו אסטרוציטים ראשוניים של חולדות במעבר 3 (P3) לתוך צלחות תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ בצפיפות של 5 ×-10-4 תאים לכל צלחת. הוסף 2 מ"ל של תערובת Modified Eagle Medium/Nutrient F-12 (DMEM/F-12) של Dulbecco, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותערובת אנטיביוטית משולשת של 1% (פניצילין G, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B). תרב את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
   2. דגרו את התאים במשך כ-24 שעות עד להתקשרות.
2. טיפול מוקדם וקיבוע
   1. העבר את כלי התרבית לספסל נקי בתנאי אור מוגנים לאחר חיבור התא.
      הערה: מזעור תנועות ורעידות מיותרות במהלך הטיפול כדי לשמור על שלמות ה-TNT.
   2. הסר את מדיום התרבית בעדינות בתנאי תאורה עמומים.
      הערה: יש להימנע מהתייבש מוחלט של פני התא במהלך הסרת המדיום כי TNTs עלולים לקרוס ולהיצמד למצע התרבית.
   3. שטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של מלח מפוזר-פוספט (PBS) ללא יוני סידן ומגנזיום (pH 7.3–7.5). הוסף והסיר את ה-PBS בהדרגה לאורך דופן צלחת התרבית כדי למנוע הפרעה ל-TNT בין-תאית במהלך הכביסה.
   4. הסר את ה-PBS בזהירות.
   5. מקבע את התאים בתמיסה מסחרית של 4% קיבוע תאי רקמה המכילה פאראפורמלדהיד (pH 7.2–7.4) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT; 20°C–25°C) בתנאי אור עמום.
      זהירות: לטפל בתמיסות קיבוע באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ולבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הבטיחות הכימית המוסדיות.
   6. הסר את תמיסת הקיבע.
   7. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
3. חדירות תאים וצביעה פלואורסצנטית
   1. חדיר את התאים עם 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירות Triton X-100 מוכנה לשימוש למשך 20 דקות ב-RT.
      אזהרה: טריטון X-100 עלול לשבש מבני TNT שבריריים. למזער חריפות מופרזת במהלך הפרמיאביליזציה.
   2. הסר את תמיסת החדירה.
   3. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
   4. הכינו את תמיסת הצביעה מיד לפני השימוש. מדלל את צבע צביעת ה-F-actin ב-PBS לריכוז סופי של 1 מיקרומול ושימוש ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) כצבע גרעיני מוכן לשימוש. ערבבו היטב את שתי תמיסות הצביעה לפני השימוש.
      הערה: ניתן להשתמש בתגובות צביעה מבוססי פאלואידינים כחלופה לוויזואליזציה של F-actin.
   5. מערבבים את תמיסות הצביעה של F-actin ו-nuclear ביחס של 1:1 (נפחים שווים) בתנאים מוגנים מאור.
   6. הוסף את תמיסת הכתמים המוכנה למנות התרבית.
   7. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בחושך.
   8. הסר את תמיסת הכתמים.
   9. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS עם 500 מיקרוליטר בכל שטיפה למשך דקה בכל שטיפה.
   10. הוסיפו 1 מ"ל PBS כדי למנוע מהתאים להתייבש במהלך הכנת ההדמיה.
4. הדמיה קונפוקלית
   1. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך של ניקון המצויד בעדשת אובייקטיב ×20. השתמש בגירוי 405 ננומטר ל-DAPI ובעירור 488 ננומטר לצביעת F-actin. צלם תמונות ברזולוציה של 1024 × 1024 פיקסלים בתנאי הגנה מאור ב-RT.
   2. לבצע הערכה איכותית וכימות ידני באמצעות לפחות חמישה שדות ראייה שנבחרו באקראי לכל מדגם. כמת את מספר ה-TNTs ואת מספר התאים החיוביים ל-TNT המכילים TNT אחד או יותר בכל שדה ראייה (איור 1A ו-1B).
      הערה: יש לצלם תמונות מיד לאחר הצביעה כדי למזער אובדן פלואורסצנציה והפרעות מבניות של TNTs.

איור 1: צביעת פלואורסצנציה של ננו-צינורות מנהורים (TNTs) באסטרוציטים. (A) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מייצגות המציגות צביעת גרעיניות ו-F-actin באסטרוציטים שגודלו בכלי תרבית עם תחתית זכוכית. (B) תצוגה מורחבת של האזור הקופסה בלוח A. חצים לבנים מצביעים על מבנים דמויי TNT בין תאים סמוכים. (ג) תמונות מייצגות המראות מבנים דמויי TNT שהופרעו בעקבות טיפול לא תקין בדגימה. (D) תצוגה מורחבת של האזור הקופסה בלוח C. חצים צהובים מצביעים על מבנים דמויי TNT מופרעים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. צביעה להעברת מיטוכונדריאלית מאסטרוציטים לנוירונים באמצעות TNTs

1. זריעת אסטרוציטים וסימון מיטוכונדריה
   1. הזרעים בודדו אסטרוציטים ראשוניים של עכברים במעבר 3 (P3) לתוך צלחות תרבית ברוחב 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בצפיפות של 3 × 10⁴ תאים לכל צלחת. הוסיפו 2 מ"ל של מדיום מלא DMEM/F-12 עם תוספת של 10% FBS ו-1% תערובת אנטיביוטית משולשת (פניצילין G, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B). תרב את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
   2. דגרו את התאים במשך כ-24 שעות עד להתקשרות.
   3. העבר את כלי התרבית לספסל נקי בתנאי אור עמומים לאחר חיבור התא.
      הערה: מזעור תנועות ורעידות מיותרות במהלך הטיפול כדי לשמור על שלמות ה-TNT.
   4. הסר את מדיום התרבית בעדינות בתנאים מוגנים באור. הימנע מהפרעה ל-TNT בזמן הסרה בינונית.
      הערה: יש להימנע מהתייבש מוחלט של פני התא במהלך הסרת המדיום כי TNTs עלולים לקרוס ולהיצמד למצע התרבית.
   5. משחזר 50 מיקרוגרם של צבע MitoTracker ליופיליזציה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"מ ואחסון תמיסת המלאי בטמפרטורה של −20°C. לפני השימוש, מדללים את תמיסת המאגר ב-400 מיקרוליטר של מדיום DMEM/F-12 מלא בתוספת 10% FBS ותערובת אנטיביוטית משולשת של 1% כדי לקבל ריכוז סופי של MitoTracker של 50 מיקרומון.
      אזהרה: להגן על צבעי פלואורסצנט מחשיפה ישירה לאור במהלך ההכנה והליכי הדגירה.
   6. הוסף את תמיסת הצבעה המיטוכונדריאלית למנות התרבית.
   7. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ למשך 30 דקות בתנאי אור מוגנים.
   8. הסר את תמיסת הצביעה המיטוכונדריאלית בתנאים מוגנים מאור.
   9. שטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBS ללא יוני סידן ומגנזיום (pH 7.3–7.5). הוסף והסיר את ה-PBS בהדרגה לאורך דופן צלחת התרבית כדי למנוע הפרעה ל-TNT בין-תאית במהלך הכביסה.
   10. הסר את ה-PBS בזהירות.
2. קוקולטורה בין אסטרוציטים לנוירון
   1. תאי עצב ההיפוקמפוס של העכברים הנציחו את הזרעים במעבר 3 (P3) אל צלחות התרבית המכילות אסטרוציטים בצפיפות של 3 ×-10⁴ תאים לכל צלחת. הוסף תאים בנפח כולל של 2 מ"ל הכולל תערובת 1:1 של DMEM ו-DMEM/F-12 שלם בתוספת 10% FBS ותערובת אנטיביוטיקה משולשת של 1%. הקם את הקוקולטורה באמצעות שיטת מגע ישיר ללא אינסרט טרנסוול. תרב את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
      הערה: הוסף בעדינות תאים נוירונליים כדי למזער הפרעות במבני TNT קיימים.
   2. לשמור על הקוקולטורה במשך 24 שעות בתנאי חממה סטנדרטיים תוך הגנה על דגימות מחשיפה לאור מיותרת במהלך הליכי הטיפול.
3. קיבוע וחדירות
   1. הסר את מדיום התרבית בתנאים מוגנים באור.
   2. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
   3. מקבע את התאים בתמיסת קיבוע של 4% תאי רקמה המכילה פאראפורמלדהיד למשך 30 דקות ב-RT בתנאי אור עמום.
      זהירות: לטפל בתמיסות קיבוע באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ולבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הבטיחות הכימית המוסדיות.
   4. הסר את תמיסת הקיבע.
   5. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
   6. יש לחדור את התאים עם 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירה טריטון X-100 מוכנה לשימוש למשך 20 דקות ב-RT בתנאי אור עמום.
      אזהרה: טריטון X-100 עלול לשבש מבני TNT שבריריים. למזער חריפות מופרזת במהלך הפרמיאביליזציה.
   7. הסר את תמיסת החדירה.
   8. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
4. צביעה והדמיה פלואורסצנטיים
   1. הכינו את תמיסת הצביעה מיד לפני השימוש. לדלל את צבע הצביעה של F-actin ב-PBS לריכוז סופי של 1 מיקרומום ולהשתמש ב-DAPI כצבע גרעיני מוכן לשימוש. ערבבו היטב את תמיסות הצביעה לפני השימוש.
      הערה: ניתן להשתמש בתגובות צביעה מבוססי פאלואידינים כחלופה לוויזואליזציה של F-actin.
   2. מערבבים את תמיסות הצביעה של F-actin וגרעיניות ביחס של 1:1 (נפחים שווים) בתנאים מוגנים באור מיד לפני השימוש.
   3. הוסף את תמיסת הכתמים המוכנה למנות התרבית.
   4. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בחושך.
   5. הסר את תמיסת הכתמים.
   6. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS עם 500 מיקרוליטר בכל שטיפה למשך דקה בכל שטיפה.
   7. הוסיפו 1 מ"ל PBS כדי למנוע מהתאים להתייבש במהלך הכנת ההדמיה.
   8. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך של ניקון המצויד בעדשת אובייקטיב ×20. השתמש בגירוי 405 ננומטר לצביעת DAPI, בגירוי 488 ננומטר לצביעת F-אקטין, ובעירור 665 ננומטר לצביעת MitoTracker. צלם תמונות ברזולוציה של 1024 × 1024 פיקסלים בתנאי הגנה מאור ב-RT.
   9. בצע הערכה איכותנית באמצעות לפחות חמישה שדות ראייה שנבחרו באקראי לכל מדגם. העריך את נוכחותם של מבנים דמויי TNT ואותות פלואורסצנציה הקשורים למיטוכונדריה בתוך חיבורי ממברנה בין-תאיים (איור 2A ו-2B).
      הערה: יש לצלם תמונות מיד לאחר הצביעה כדי למזער אובדן פלואורסצנציה והפרעות מבניות של TNTs.

איור 2: צביעת פלואורסצנציה של מיטוכונדריה ו-TNTs במערכת קוקולטורה של אסטרוציטים-נוירונים. (א) תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות מייצגות המציגות צביעות גרעיניות, מיטוכונדריאליות ו-F-actin באסטרוציטים ונוירונים שגודלו בכלים עם תחתית זכוכית. אסטרוציטים הציגו מורפולוגיות לא סדירות בצורת כוכב או פוליגונל עם תהליכים תאיים מורחבים, בעוד שתאי הנוירונים נראו עגולים או אליפטיים עם הרחבות דקות דמויות נויריטים. (B) תצוגה מורחבת של האזור הסגור בלוח A. חצים לבנים מצביעים על מבנים דמויי TNT הקשורים למיטוכונדריה בין התאים. שתי אוכלוסיות התאים הובחנו בעיקר על פי המורפולוגיה התאית האופיינית להן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. צביעת קולוקליזציה באימונופלואורסצנציה עבור מיטוכונדריה ומירו1 ב-TNTs

1. זריעת אסטרוציטים וסימון מיטוכונדריה
   1. הזרעים בודדו אסטרוציטים ראשוניים של עכברים במעבר 3 (P3) לתוך צלחות תרבית ברוחב 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בצפיפות של 3 × 10⁴ תאים לכל צלחת. הוסיפו 2 מ"ל של מדיום מלא DMEM/F-12 עם תוספת של 10% FBS ו-1% תערובת אנטיביוטית משולשת (פניצילין G, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B). תרב את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
   2. דגרו את התאים במשך כ-24 שעות עד להתקשרות.
   3. העבר את כלי התרבית לספסל נקי בתנאי אור עמומים לאחר חיבור התא.
      הערה: מזעור תנועות ורעידות מיותרות במהלך הטיפול כדי לשמור על שלמות ה-TNT.
   4. הסר את מדיום התרבית בעדינות בתנאים מוגנים באור. הימנע מהפרעה ל-TNT בזמן הסרה בינונית.
      הערה: יש להימנע מהתייבש מוחלט של פני התא במהלך הסרת המדיום כי TNTs עלולים לקרוס ולהיצמד למצע התרבית.
   5. שחזר 50 מיקרוגרם של צבע MitoTracker ליופילי ב-DMSO להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"מ ואחסון תמיסת המלאי בטמפרטורה של −20°C. לפני השימוש, מדללים את תמיסת המאגר ב-400 מיקרוליטר של מדיום DMEM/F-12 מלא בתוספת 10% FBS ותערובת אנטיביוטית משולשת של 1% כדי לקבל ריכוז סופי של MitoTracker של 50 מיקרומון.
      אזהרה: להגן על צבעי פלואורסצנט מחשיפה ישירה לאור במהלך ההכנה והליכי הדגירה.
   6. הוסף את תמיסת הצבעה המיטוכונדריאלית למנות התרבית.
   7. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ למשך 30 דקות בתנאי אור מוגנים.
   8. הסר את תמיסת הצביעה המיטוכונדריאלית בתנאים מוגנים מאור.
   9. שטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBS ללא יוני סידן ומגנזיום (pH 7.3–7.5). הוסף והסיר את ה-PBS בהדרגה לאורך דופן צלחת התרבית כדי למנוע הפרעה ל-TNT בין-תאית במהלך הכביסה.
   10. הסר את ה-PBS בזהירות.
2. קוקולטורה בין אסטרוציטים לנוירון
   1. תאי עצב ההיפוקמפוס של העכברים הנציחו את הזרעים במעבר 3 (P3) אל צלחות התרבית המכילות אסטרוציטים בצפיפות של 3 ×-10⁴ תאים לכל צלחת. הוסף תאים בנפח כולל של 2 מ"ל הכולל תערובת 1:1 של DMEM ו-DMEM/F-12 שלם בתוספת 10% FBS ותערובת אנטיביוטיקה משולשת של 1%. הקם את הקוקולטורה באמצעות שיטת מגע ישיר ללא אינסרט טרנסוול. תרב את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
      הערה: הוסף בעדינות תאים נוירונליים כדי למזער הפרעות במבני TNT קיימים.
   2. לשמור על הקוקולטורה במשך 24 שעות בתנאי חממה סטנדרטיים תוך הגנה על דגימות מחשיפה לאור מיותרת במהלך הליכי הטיפול.
3. קיבוע וחדירות
   1. הסר את מדיום התרבית בתנאים מוגנים באור.
   2. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
   3. קיבעו את התאים בתמיסה מסחרית של 4% קיבוע תאי רקמה המכילה פאראפורמלדהיד (pH 7.2–7.4) למשך 30 דקות ב-RT בתנאי אור עמום.
      זהירות: לטפל בתמיסות קיבוע באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ולבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הבטיחות הכימית המוסדיות.
   4. הסר את תמיסת הקיבע.
   5. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
   6. יש לחדור את התאים עם 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירה טריטון X-100 מוכנה לשימוש למשך 20 דקות ב-RT בתנאי אור עמום.
      אזהרה: טריטון X-100 עלול לשבש מבני TNT שבריריים. למזער חריפות מופרזת במהלך הפרמיאביליזציה.
   7. הסר את תמיסת החדירה.
   8. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
4. חסימה וצביעה באימונופלואורסצנציה
   1. חסום את התאים עם סרום עז 5% למשך שעה אחת ב-RT בתנאי אור עמומים. הכינו את תמיסת החסימה על ידי דילול סרום עזים 1:20 ב-PBS.
   2. הסר את תמיסת החסימה.
   3. מדלל נוגדן אנטי-מירו1 מונוקלונלי בארנב ב-PBS ביחס דילול של 1:100. הוסף את תמיסת הנוגדן הראשונית המדוללת למנות התרבית ודוגר למשך הלילה (12–16 שעות) בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: להגן על דגימות מסומנות פלואורסצנטיות מחשיפה ישירה לאור לאורך כל תהליך הצביעה.
   4. הסר את תמיסת הנוגדנים הראשית.
   5. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS עם 500 מיקרוליטר בכל שטיפה למשך דקה בכל שטיפה.
   6. לדלל את נוגדן IgG המשני הפלואורסצנטי נגד ארנבים ב-PBS ביחס דילול של 1:100. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת לכל צלחת תרבית ודגר במשך שעה בתנאים מוגנים מאור.
      הערה: במחקר הנוכחי לא נכללה בקרה ללא נוגדנים ראשוניים. ניסויים עתידיים צריכים לשלב בקרות אימונופלואורסצנציה מתאימות כדי לאמת עוד יותר את הספציפיות של צביעה.
   7. הסר את תמיסת הנוגדן המשנית הפלואורסצנטית.
5. צביעת נגד פלואורסצנטית והדמיה
   1. הכינו את תמיסת הצביעה מיד לפני השימוש. לדלל את צבע הצביעה של F-actin ב-PBS לריכוז סופי של 1 מיקרומום ולהשתמש ב-DAPI כצבע גרעיני מוכן לשימוש. ערבבו היטב את תמיסות הצביעה לפני השימוש.
      הערה: ניתן להשתמש בתגובות צביעה מבוססי פאלואידינים כחלופה לוויזואליזציה של F-actin.
   2. הוסיפו את תמיסת הצביעה למנות התרבית.
   3. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בחושך.
   4. הסר את תמיסת הכתמים.
   5. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS עם 500 מיקרוליטר בכל שטיפה למשך דקה בכל שטיפה.
   6. הוסיפו 1 מ"ל PBS כדי למנוע מהתאים להתייבש במהלך הכנת ההדמיה.
   7. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך של ניקון המצויד בעדשת אובייקטיב ×20. אסוף תמונות Z-stack באמצעות גודל שלב של 5 מיקרון בטווח הדמיה כולל של 40 מיקרון (8 חתכים אופטיים). השתמש בגירוי 405 ננומטר לצביעת DAPI, בגירוי 488 ננומטר לצביעת F-actin, בגירוי 594 ננומטר לצביעת חיסון ב-Miro1, ובעירור של 665 ננומטר לצביעת MitoTracker. צלם תמונות ברזולוציה של 1024 × 1024 פיקסלים בתנאי הגנה מאור ב-RT.
   8. בצע הערכה איכותנית באמצעות לפחות חמישה שדות ראייה שנבחרו באקראי לכל מדגם. הערכת מבנים דמויי TNT, אותות פלואורסצנציה הקשורים למיטוכונדריה, וקולוקליזציה נראית לעין בין Miro1 לצביעת מיטוכונדריה בתוך חיבורים בין-תאיים של ממברנה (איור 3A–3C).
      הערה: יש לצלם תמונות מיד לאחר הצביעה כדי למזער אובדן פלואורסצנציה והפרעות מבניות של TNTs.

איור 3: צביעת קולוקליזציה של מיטוכונדריה ו-Miro1 ב-TNTs במערכת קוקולטורה של אסטרוציטים-נוירונים. (A) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מייצגות המציגות צביעה גרעינית, מיטוכונדריאלית, Miro1 ו-F-actin באסטרוציטים ונוירונים שגודלו בכלים עם תחתית זכוכית. חצים לבנים מצביעים על אזורים של קולוקליזציה לכאורה בין אותות הקשורים למיטוכונדריה לבין Miro1 בתוך מבנים דמויי TNT. (B) תמונת Z-stack משוחזרת תלת-ממדית המציגה מבנים דמויי TNT שנוצרו בין תאים סמוכים. (ג) שחזור צדדי של אותה תמונת Z-stack המציגה מבנים דמויי TNT המתפרסים בין תאים סמוכים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

בתכנות מונוקולטורה של אסטרוציטים, נצפו בליטות ממברנה דקות המחברות בין תאים סמוכים לאחר צביעת F-אקטין וגרעינית (איור 1A ו-1B). זוהו מספר מבנים דמויי TNT המתפרסים בין אסטרוציטים שכנים, ואסטרוציטים בודדים יצרו לעיתים קרובות קשרים עם מספר תאים סמוכים. שימור מוצלח של מבנים דמויי TNT היה קשור לטיפול עדין במהלך הכביסה והליכי הקיבוע. הפרעה מכנית מופרזת במהלך הסרת או שטיפה של מדיום גרמה לירידה בגילוי ובהפרעה מבנית של חיבורי ממברנה אלו, כפי שמודגם במבנים דמויי TNT שהופרעו לאחר טיפול לא נכון בדגימה (איור 1C ו-1D).

בהכנות קוקולטורה לאסטרוציטים-נוירונים, נצפו אותות פלואורסצנציה הקשורים למיטוכונדריה בתוך מבנים דמויי TNT המחברים בין תאים סמוכים לאחר צביעת MitoTracker ודימות קונפוקלי (איור 2A ו-2B). מבנים אלו הוצגו יחד עם צביעת F-actin וגרעיניים כדי לתמוך בהערכה מורפולוגית של קשרים דמויי TNT. הגנה נכונה לאור ומינימום עוצמת השטיפה שיפרו את שימור אות הפלואורסצנציה ומורפולוגיית TNT במהלך ההכנה להדמיה.

בניסויי קולוקליזציה של אימונופלואורסצנציה, נצפו אותות פלואורסצנציה חופפים התואמים לצביעה הקשורה למיטוכונדריה ולצביעת חיסון Miro1 בתוך מבנים דמויי TNT בהכנות קוקולטורה של אסטרוציטים ונוירונים (איור 3A). תצפיות אלו מצביעות על קשר פוטנציאלי בין Miro1 למיטוכונדריה הממוקמת במבנים דמויי TNT. דימות Z-stack משוחזר בתלת-ממד תמך עוד יותר בנוכחות מבנים דמויי TNT המתפרסים בין תאים סמוכים (איור 3B ו-3C). שימור TNT, עוצמת אות הפלואורסצנציה ואיכות התמונה הושפעו מתנאי קיבוע, חדירות והדמיה.

דיון

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הניסויי שתואר לעיל הוא טיפול מוקדם מוגן מאור לפני הקיבוע (fixation). מבנים דמויי TNT שבריריים מאוד, ושמירה על תנאי הגנה מפני אור לאחר הסרה מהחממה חשובה לשימור עוצמת אות הפלואורסצנציה ושלמות המבנה במהלך הכנת הדגימה. השלב הקריטי השני הוא לבצע שטיפת PBS עם מניפולציה עדינה כדי למזער הפרעות במבנים דמויי TNT הנגרמות על ידי זרימת נוזלים. הקפדה על שיטות טיפול מרכזיות אלו מסייעת לשמור על המורפולוגיה והיציבות של מבנים דמויי TNT ומשפרת את עקביות תוצאות ההדמיה הבאות. שאיפה מופרזת, שטיפה ממושכת או ערבוב נוזלים חזק עלולים להוביל לקריסה או לפיצול של מבנים דמויי TNT במהלך עיבוד הדגימה. בגלל אופיים הדינמי מאוד, TNTs רגישים לאור. פוטוטוקסיות הנגרמת מחשיפה לאור עלולה לגרום להפרעה ל-TNT, מה שמקשה על דמיון מבנים אלה¹¹. לכן, יש לשמור על תנאי הגנה מאור במהלך ניסויים הקשורים ל-TNT.

תנועת מיטוכונדריה תוך-תאית תורמת להתפלגות אנרגיה תאית, במיוחד בנוירונים. מחקרים הראו כי מיטוכונדריה יכולה לנוע לאורך סיבי אקטין ומיקרוטובולים¹². מחקרים עדכניים הראו גם כי TNTs יכולים לפעול כמבני תקשורת בין-תאיים למרחקים ארוכים הקשורים להעברת מיטוכונדריה בין תאי עצב¹³. הגישה המתודולוגית המתוארת במחקר זה מאפשרת הדמיית מבנים דמויי TNT ואותות פלואורסצנציה הקשורים למיטוכונדריה במערכות תרביות תאים עצביות. מחקרים קודמים הראו כי העברת מיטוכונדריה בין-תאית בין תאי עצב עשויה לתרום לתיקון רקמות ולתהליכים נוירופרוטקטיביים בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת פרקינסון ופגיעה איסכמית מוחית^14,15. באמצעות השיטות שתוארו במחקר זה, נצפו מבנים דמויי TNT בין אסטרוציטים ובין אסטרוציטים לנוירונים, יחד עם אותות פלואורסצנציה הקשורים למיטוכונדריה שהיו ממוקמים בתוך מבנים אלו.

כפי שצוין במחקרים קודמים¹⁰, צביעת MitoTracker חשופה לדליפת צבע והעברת אותות לא-מיטוכונדריאליים, מה שעלול להפחית את אמינות הנתונים. כדי להתמודד עם מגבלה זו, מחקרים עתידיים צריכים להשתמש בשיטות חזקות יותר, כגון תיוג מיטוכונדריאלי מקודד גנטית, כדי להשיג תוצאות חד-משמעיות יותר. בתנאים הניסיוניים הנוכחיים, שני סוגי התאים הובחנו בעיקר על בסיס מורפולוגיה תאית, גישה שעשויה להפחית את הספציפיות לזיהוי סוגי תאים. מחקרים עתידיים צריכים לשלב תיוג פלואורסצנטי ספציפי לסוג תא כדי לשפר את דיוק ניתוח הקוקולטורה. Miro1 הוא חלבון מתאם הממוקם בקרום המיטוכונדריה החיצונית והיה מעורב בתהליכי העברה מיטוכונדריאלית בנוירונים^16,17. באמצעות פרוטוקול הקולוקליזציה של אימונופלואורסצנציה שתואר במחקר זה, נצפו אותות פלואורסצנציה חופפים התואמים לצביעה הקשורה למיטוכונדריה ולצביעת חיסון Miro1 במבנים דמויי TNT. תצפיות אלו מצביעות על קשר פוטנציאלי בין Miro1 למיטוכונדריה הממוקמת במבנים דמויי TNT. עם זאת, הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית עשויה להגביל את ההערכה הסופית של הקולוקליזציה המולקולרית בתוך בליטות ממברנה דקות.

ביצענו הדמיית Z-stack כדי לאשר נוכחות של מבנים דמויי TNT בין תאים, ובכך לתמוך באימות מבני של חיבורי הממברנה הללו. בעוד שהפרוטוקול הנוכחי מתאים לרוב הסביבות הניסיוניות, הדמיה קונפוקלית של תאים קבועים עלולה לגרום לאובדן מבנים שבירים דמויי TNT במהלך עיבוד הדגימה בהשוואה להדמיה של תאים חיים, ובכך להגביל את הכימות המדויק של TNT¹⁸. יתרה מזאת, הדמיה של תאים קבועים אינה מאפשרת קביעה חד-משמעית של כיוון העברת המיטוכונדריה, מה שדורש חקירה נוספת במחקרים עתידיים. פרוטוקול זה מספק תהליך ניסויי סטנדרטי לצביעה של מבנים דמויי TNT, אותות הקשורים למיטוכונדריה וחלבונים קשורים במערכות תרבית תאים עצבית. בהשוואה להליכי שטיפה וקיבוע בלתי מבוקרים, הפרוטוקול מדגיש טיפול עדין בדגימות ושימור פלואורסצנציה במהלך הכנת ההדמיה. שיטות אלו עשויות לסייע בשיפור העקביות והשחזור בניסויים במחקרי דימות הקשורים ל-TNT.

לסיכום, מחקר זה מספק פרוטוקול מעבדה מעשי ורחב יישום להערכה איכותנית של TNTs ולחקר העברת מיטוכונדריה דרך מבנים דמויי TNT. עם זאת, שלבי עיבוד דגימות כמו קיבוע ושטיפה עשויים להכניס שונות כמותית בהשוואה לשיטות הדמיה של תאים חיים. יתרה מזאת, מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת רזולוציה מרחבית נמוכה יותר ממיקרוסקופיה סופר-רזולוצוציה, מה שמגביל את האפיון המבני המפורט של TNTs. בנוסף, צביעת מיטוכונדריה מבוססת MitoTracker מושפעת מדליפת צבע והעברת אותות לא ספציפית, דבר שיש לטפל בו במחקרים עתידיים לשיפור הדיוק הניסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1% תערובת אנטיביוטית משולשת	Biosharp	BL142A	מניעת זיהום חיידקי ופטרייתי במהלך תרבות תאים
4% חומר קיבוע תאים רקמות	Solarbio	P1110	חומר קיבוע תאים
נוגדן נגד Miro1	Abcam	AB319154	נוגדן ראשוני נגד Miro1
אסטרוציטים	תאים ראשוניים מבודדים במעבדה	NA	האסטרוציטים בודדו מהקליפת המוח של גורי חולדות SD בגילאי 1–3 ימים. נקבע כי טוהר התאים המבודדים עמד על יותר מ-95% על ידי צביעת GFAP, ונעשה שימוש בתאים במעבר השלישי (P3) לכל הניסויים
תווך תרבות תאים של אסטרוציטים (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM ו-F-12 ערבבו ביחס של 1:1 (v/v), הושלם עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה משולשת
מיקרוסקופ קונפוקלי	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Nikon AX (Nikon Corporation, יפן) בשליטת NIS-Elements (גרסה 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	צבע צביעת גרעינים
DMSO	BioFroxx	1084ML100	ממס המשמש להכנת פתרונות בסיס של צבע פלורסצנטי
צבע צביעת F-actin	Thermo Fisher Scientific	A57243	חומר צביעת F-actin לדמיית מבני ציטו-שלד וננו-צינורות מנהור
סרום בקר עוברי	ExCell Bio	FSD500	מספק חומרים מזינים חיוניים לתרבות תאים
נוגדן משני פלורסצנטי (Goat Anti-Rabbit IgG)	ABclonal	AS039	נוגדן משני לצביעת אימונופלורסנט
צלחת תרבות תאים עם תחתית זכוכית	NEST	801001	צלחת הדמיה למיקרוסקופיה קונפוקלית
סרום עז	Solarbio	210C051	חומר חסימה לצביעת אימונופלורסנט
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	צבע צביעת מיטוכונדריה
נוירונים	Cell Bank of CAS	HT22-GNM47	תאים נוירונים היפוקמפליים עכבריים ממותגים שהוחזקו בתווך DMEM מלא. תאים במעבר השלישי (P3) נאספו ושימשו לניסויים הבאים.
תווך תרבות תאים נוירונים (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM הושלם עם GlutaPlus ונתרן פירובט, ללא HEPES, הושלם עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה משולשת
פוספט-חיץ מאוזן (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	חיץ שטיפה המשמש במהלך קיבוע וצביעה
טריטון X-100	Solarbio	P1080	חומר לחדירת תאים