FTY720 מגביר את הרגישות לדוקסורוביצין בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים

סיכום

פרוטוקול זה מעריך כיצד FTY720 מגביר את הרגישות לדוקסורוביצין בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים על ידי הערכת חיוניות תאים, אפופטוזיס, הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאי, ביטוי נשא פליטת תרופות ומטרה מכנית של קינאז חלבון B/מטרה מכנית של איתות רפמיצין.

תקציר

כימורזיסטנסיות נותרה מחסום מרכזי לטיפול יעיל בלוקמיה מיאלואידית חריפה, בין היתר משום שתאי לוקמיה עמידים מפחיתים חשיפה לתרופות תוך-תאיות ומתחמקים מאפופטוזיס. FTY720, מודולטור קולטני ספינגוזין-1-פוספט, דיווח על פעילות אנטי-רבלרטיבית ורגישות כימותית במספר מודלים של גידולים. עם זאת, האם FTY720 מעלה את הרגישות לדוקסורוביצין בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים לדוקסורוביצין, והאם השפעה זו קשורה לשינויים בנושאי פליטת תרופות ובמטרה מכנית של קינאז חלבון B/מטרה מכנית של איתות רפמיצין, נותר לא מוגדר מספיק. מחקר זה העריך את השפעות FTY720 לבדו ובשילוב עם דוקסורוביצין בקווי תאים של לוקמיה מיאלואידית חריפה של ההורים (HL60 ו-K562) ונגזרותיהם העמידות לדוקסורוביצין (HL60/A ו-K562/A). הקיימות של התאים הוערכה באמצעות בדיקות Cell Counting Kit-8, אפופטוזיס נמדדה באמצעות ציטומטריית זרימה של אנקסין V/פרופידיום יודיד, הצטברות הדוקסורוביצין התוך-תאית נמדדה באמצעות ציטומטריית זרימה, ו-P-גליקופרוטאינ, חלבון 1 הקשור לעמידות רב-תרופתית, קינאז B/מטרה מכנית של חלבוני מסלול רפמיצין, וחלבונים הקשורים לאפופטוזיס נבדקו באמצעות ציטומטריית זרימה ו-Western blotting. FTY720 הראה ציטוטוקסיות תלויה במינון ורגישות מוגברת לדוקסורוביצין בתאי לוקמיה עמידים. הטיפול המשולב הפחית את חיוניות התאים, הגביר את חלקי התאים האפופטוטיים, הגביר את הצטברות הדוקסורוביצין התוך-תאית, והפחית את ביטוי חלבון 1 הקשור ל-P-גליקופרוטאין ועמידות לרב-תרופה. הטיפול ב-FTY720 היה גם קשור להפחתת הפוספורילציה של קינאז חלבון B ולמטרה מכנית של רפמיצין, בעוד שמפעיל קינאז B בחלבון SC79 הפך חלקית את השינויים שנצפו באיתות, בביטוי הנשאים ובאפופטוזיס. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-FTY720 מעלה את הרגישות לדוקסורוביצין בתאי HL60/A ו-K562/A, וכי השפעה זו קשורה להפחתת קינאז חלבון B/מטרה מכנית של איתות רפמיצין, ירידה בביטוי נשאי פליטת תרופות, הגברת הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאית, והגברת אפופטוזיס. מכיוון שמחקר זה הוגבל למודלים של קו תאים במבחנה , נדרש אימות נוסף בדגימות לוקמיה ראשוניות ובמערכות in vivo לפני שניתן להסיק מסקנות טיפוליות.

מבוא

לוקמיה מיאלואידית חריפה היא ממאירות המטולוגית הטרוגנית הנובעת מהטרנספורמציה הממאירה של תאי גזע ומקור דם. זו הצורה הנפוצה ביותר של לוקמיה חריפה במבוגרים ועדיין קשורה להישרדות לקויה לטווח ארוך. למרות שאסטרטגיות הטיפול השתפרו, כימותרפיה אינדוקטיבית המבוססת על ציטרבין בשילוב עם אנתרציקלין נותרה אבן יסוד בטיפול. עם זאת, מטופלים רבים מפתחים עמידות ראשונית או נרכשת, מה שמוביל להישלנות, מחלה עמידה ותוצאות קליניות ירודות ^1,2,3. הבנת המנגנונים שמפחיתים את רגישות הדוקסורוביצין נותרה מטרה חשובה במחקר לוקמיה מיאלואידית חריפה.

עמידות לדוקסורוביצין היא תהליך רב-גורמי. תאי לוקמיה עמידים יכולים להפחית חשיפה לתרופות תוך-תאית באמצעות הגברת הביטוי או הפעילות של נשאי פליטת תרופות הקשרים אדנוזין טריפוספט, כולל P-גליקופרוטאינה, המקודד על ידי תת-משפחה B של קלטות הקשירה לאדנוזין טריפוספט, ו-1 המקושר לעמידות רב-תרופתית, המקודד על ידי תת-משפחת הקסטה C, חבר C 1 1. הפעלה של קינאז חלבון B ומטרה מכנית של איתות ראפמיצין יכולה גם היא לקדם הישרדות תאי לוקמיה, לדכא אפופטוזיס ולתרום לעמידות לטיפול⁵. יחד, מנגנונים אלו מפחיתים את הצטברות הדוקסורוביצין התוך-תאית ומפחיתים את היעילות הציטוטוקסית. מיקוד פרמקולוגי ישיר של מובילים עמידים לתרופות מרובי תרופות היה מאתגר בשל רעילות, יעילות מוגבלת ומנגנוני עמידות מפצה⁶. באופן דומה, מעכבים של קינאז חלבון B ומטרה מכנית של איתות ראפמיצין מתמודדים עם אתגרים תרגומיים הקשורים לרעילות תלויה במינון, יעילות מוגבלת והתאמת מסלול ^7,8.

FTY720, הידוע גם בשם פינגולימוד, הוא מודולטור קולטני ספינגוזין-1-פוספט שאושר על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית לטיפול בטרשת נפוצה וזכה לעניין כגורם אנטי-סרטני פוטנציאלי⁹. מעבר לפעילות האימונומודולטורית שלו, FTY720 הראתה השפעות אנטי-פרוליפרטיביות, פרואפופטוטיות ורגישות לטיפול במספר מודלים פרה-קליניים של גידולים, כולל סרטן הערמונית, קרצינומה הפטותאלולרית, סרטן ריאות, סרטן המעי הגס, מיאלומה נפוצה, סרטן השד, סרטן השחלות, לוקמיה, לימפומה וגליובלסטומה 10,11,12,13,14,15,16^{, 17, 18, 19}. מחקרים קודמים הראו כי FTY720 יכול לשפר את פעילות הדוקסורוביצין בסרטן השד, להעלות את הרגישות לציספלטין בתאי סרטן ריאה לא קטנים עמידים לציספלטין, ולחדש את תאי המלנומה העמידים לציספלטין באמצעות ויסות של אותות 3-קינאאז פוספונוזיטיד 20,21,22. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-FTY720 עשוי להשפיע הן על איתות הישרדות והן על מנגנוני שימור תרופות בתאי סרטן עמידים. עם זאת, האם FTY720 מגביר את הרגישות לדוקסורוביצין בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים לדוקסורוביצין, והאם השפעה זו קשורה לשינויים מתואמים בהצטברות דוקסורוביצין תוך-תאי, ביטוי נשאי נוזל תרופה, אפופטוזיס וקינאז B/מטרה מכנית של איתות רפמיצין, נותר לא מוגדר מספיק.

המחקר הנוכחי נועד לטפל בפער זה באמצעות מודלים של תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים לדוקסורוביצין HL60/A ו-K562/A, יחד עם מקביליהם מצד ההורים. הועלתה השערה ש-FTY720 עשוי להעלות את הרגישות לדוקסורוביצין על ידי הפחתת ביטוי נשאי פליטת תרופות, הגברת הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאי והגברת האפופטוזיס, כאשר קינאז חלבון B/מטרה מכנית של איתות רפמיצין מעורבת כמסלול רגולציה נלווי. להערכת השערה זו, הוערכו חיוניות תאים, ערכי ריכוז מעכבים חצי-מקסימליים, אפופטוזיס, הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאי, ביטוי נשא ושינויים בחלבוני איתות לאחר טיפול ב-FTY720 בלבד או בשילוב עם דוקסורוביצין. מכיוון שכל הניסויים בוצעו במודלים של קווי תאים, הממצאים מפורשים כראיות מכניסטיות במבחנה ולא כהוכחה ישירה ליעילות קלינית.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע באמצעות קווי תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה מבוססת בבני אדם ונגזרות עמידות לדוקסורוביצין. לא היו מעורבים משתתפים אנושיים, בעלי חיים או דגימות ראשוניות שמקורם במטופלים. לכן, לא נדרשו אישור מועצת ביקורת מוסדית למחקר על בני אדם ואישור אתיקה של בעלי חיים. קווי התאים הושגו מהמכון להמטולוגיה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, טיאנג'ין, סין, ונשמרו במכון ההמטולוגיה של פוג'יאן, בית החולים יוניון של אוניברסיטת הרפואה פוג'יאן. זהות התא אושרה על ידי קריוטיפ והערכה מורפולוגית לפני הניסוי, וכל תרביות התאים נבדקו לזיהום במיקופלזמה. הכימיקלים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים ואישור הפנוטיפ העמיד

תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה בבני אדם HL60 ו-K562 ונגזרותיהם העמידות לדוקסורוביצין, HL60/A ו-K562/A, התקבלו מהמכון להמטולוגיה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, טיאנג'ין, סין. התאים גודלו במדיום של מכון רוזוול פארק ממוריאל 1640, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח המכיל 5% פחמן דו-חמצני.

תאי HL60/A נשמרו בתווך שלם המכיל 1 מיקרוגרם/מ"ל דוקסורוביצין, ותאי K562/A נשמרו בתווך שלם המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל דוקסורוביצין לשימור הפנוטיפ העמיד. דוקסורוביצין הוסר מהמדיום של התרבית חודש לפני בדיקות ניסיוניות כדי למנוע השפעות חריפות של בחירת תרופות במהלך בדיקות הטיפול.

לפני הניסויים, הפנוטיפ העמיד אושר מחדש על ידי השוואת ערכי הריכוז המעכבים החצי-מקסימלי של דוקסורוביצין בין תאים הוריים לתאים עמידים. יציבות העמידות לאחר חודש של תרבית ללא תרופות הוערכה על ידי חזרה על בדיקת רגישות לדוקסורוביצין ובחינת ביטוי P-גליקופרוטאין בסיסי וביטוי חלבון 1 הקשור לעמידות מרובת תרופות. תרביות שימשו לניסויים רק כאשר הנגזרות העמידות שמרו על ערכי ריכוז מעכבים חצי-מקסימליים גבוהים יותר של דוקסורוביצין וביטוי נשאי גבוה יותר מאשר המקבילים ההוריים שלהן.

2. הכנת תרופות ועיצוב טיפול

FTY720, דוקסורוביצין ו-SC79 הוכנו כפתרונות מלאי לפי הוראות היצרנים. FTY720 ו-SC79 הוססו בדימתיל סולפוקסיד, ודוקסורוביצין הוכן בממס המומלץ והוגן מאור במהלך הטיפול. תמיסות עבודה דוללו טרי במדיום תרבית מלא לפני הטיפול. הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד נשמר זהה בין קבוצות הטיפול ולא עלה על 0.1%.

קבוצות הביקורת קיבלו את אותו ריכוז סופי של דימתיל סולפוקסיד כמו בקבוצות הטיפול המתאימות. לניסויים בטיפול משולב, 5 מיקרומום FTY720 שימש כריכוז הרגישות. דוקסורוביצין שימש ב-4 מיקרומולר לתאי HL60/A וב-8 מיקרומום לתאי K562/A באפופטוזיס ובבדיקות הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאיות, אלא אם צוין אחרת.

3. מבחן שרייתיות תאים וחישוב ריכוז מעכב חצי-מקסימלי

התאים הוזרעו ללוחות של 96 בארות ב-1 ×-10⁴ תאים בכל באר במדיום מלא של 100 מיקרוליטר. לבדיקות תרופה בודדת FTY720, טופלו תאי HL60, K562, HL60/A ו-K562/A בתאי 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ו-100 מיקרומום FTY720 למשך 48 שעות. לבדיקות רגישות לדוקסורוביצין, תאי HL60/A ו-K562/A טופלו בריכוזים סדרתיים של דוקסורוביצין בנוכחות או בהיעדר 5 מיקרומום FTY720 למשך 48 שעות.

הקיימות של התאים נמדדה באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 בהתאם להוראות היצרן. לאחר הטיפול, נוספה תגובת Cell Counting Kit-8 לכל באר, והצלחת דוגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.

הכדאיות היחסית של התאים חושבה כך: כדאיות תאית יחסית = [(ספיגת בארות מטופלות - ספיגת בארות ריקות) / (ספיגת בארות בקרת רכב - ספיגת בארות ריקות)] × 100%

ערכי ריכוז מעכבים חצי-מקסימליים חושבו באמצעות רגרסיה לא ליניארית עם מודל מינון-תגובה לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים ב-GraphPad Prism, גרסה 9.5. כל ניסוי כלל שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, עם שלושה בארות טכניות לכל תנאי טיפול.

4. ניתוח שילוב תרופות

השפעות FTY720 על רגישות לדוקסורוביצין הוערכו על ידי השוואת קשרי מינון-תגובה בין דוקסורוביצין בנוכחות או בהיעדר FTY720. תאי HL60/A ו-K562/A טופלו בריכוזים סדרתיים של דוקסורוביצין בלבד או בשילוב עם FTY720 במשך 48 שעות.

הכדאיות של התאים הוערכה באמצעות מבחן Cell Counting Kit-8, וערכי ריכוז מעכבים חצי-מקסימליים חושבו באמצעות רגרסיה לא ליניארית עם מודל מינון-תגובה לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים. שינויים ברגישות לדוקסורוביצין פורשו בהתבסס על שינויים בעקומות המינון-תגובה והבדלים בערכי הריכוז המעכבים החצי-מקסימלי בין קבוצות הטיפול.

מכיוון שהניסויים לא תוכננו כמחקר מלא של מטריצת מינון ביחס קבוע, לא בוצע ניתוח אינדקס משולב פורמלי. לכן, התוצאות פורשו כהוכחה לשינוי ברגישות לדוקסורוביצין ולא כסינרגיה פרמקולוגית סופית.

5. ניתוח אפופטוזיס באמצעות אנקסין V וציטומטריית זרימת פרופידיום יודיד

תאי HL60/A ו-K562/A הוזרעו בלוחות 6 בארות ב-4 × 10⁵ תאים למ"ל וטופלו במשך 48 שעות עם רכב, FTY720 בלבד, דוקסורוביצין בלבד, או דוקסורוביצין בשילוב עם FTY720. לטיפול משולב, 5 מיקרומום FTY720 שולב עם 4 מיקרומום דוקסורוביצין בתאי HL60/A או 8 מיקרומום דוקסורוביצין בתאי K562/A.

לאחר הטיפול, נאספו תאים, כולל תאים תלויים בתווך התרבית, ונשטפו פעמיים עם מלח קר עם בופר פוספט. התאים הושעו מחדש בבופר קישור Annexin V בריכוז שהומלץ על ידי יצרן ערכת זיהוי האפופטוזיס. כל דגימה צובעה ב-5 מיקרוליטר אנקסין V-פלואורסאין איזותיוציאנאט או אנקסין V-אלופיקוציאנין ו-5 מיקרוליטר פרופידיום יודיד, ולאחר מכן דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

הדגימות נותחו מיד באמצעות ציטומטריית זרימה. בקרות לא מוצבעות, בקרות צבועות בודדות ובקרות פלואורסצנציה מינוס אחת שימשו לקביעת שערי פיצוי ורבעים. פסולת הושמרה באמצעות פיזור קדמי ופיזור צדדי. תאים אפופטוטיים מוקדמים הוגדרו כתאים חיוביים באנקסין V ותאי פרופידיום יודידים שליליים, ותאי אפופטוטיים מאוחרים או מתים הוגדרו כתאים חיוביים לאנקסין V-חיובי ופרופידיום יודיד חיוביים. אפופטוזיס כולל חושב כסכום חלקי תא אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. לפחות 10,000 אירועים חד-תאיים ברי קיימא נרכשו עבור כל דגימה.

6. בדיקת הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאית

תאי HL60/A ו-K562/A זרעו בלוחות עם 6 בארות ב-4 × 10^תאים למ"ל ותרבתו במהלך הלילה. תאים טופלו לאחר מכן בבקרת כלי רכב, דוקסורוביצין בלבד, או דוקסורוביצין בשילוב עם 5 מיקרומול FTY720. תאי HL60/A טופלו ב-4 מיקרומום דוקסורוביצין, ותאי K562/A טופלו ב-8 מיקרומום דוקסורוביצין. התאים דגרו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוגנו מאור.

לאחר הטיפול, תאים נקטפו ונשטפו פעמיים עם מלח קר עם בופר פוספט כדי להסיר דוקסורוביצין חוץ-תאי. תאים הושהו מחדש בתמיסת מלח מפופר פוספט ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות פלואורסצנציה פנימית של דוקסורוביצין. תאים לא מטופלים שימשו להגדרת אוטופלואורסצנציה ברקע, ותאים שטופלו בדוקסורוביצין שימשו כהתייחסות חיובית לפלואורסצנציה. הצטברות דוקסורוביצין תוך-תאית נמדדה כעוצמת פלואורסצנציה חציונית לאחר פסולת והדרה מצטברת. ערכי עוצמת הפלואורסצנציה החציונית ננורמו לקבוצת הדוקסורוביצין בלבד בכל ניסוי עצמאי.

7. ניתוח ציטומטרי זרימה של P-גליקופרוטאין וביטוי חלבון 1 הקשור לעמידות לרב-תרופתית

תאי HL60/A ו-K562/A הוזרעו ללוחות 6 בארות ב-2 × 10⁶ תאים/מ"ל וטופלו ב-5 מיקרומום FTY720 או בקרת רכב למשך 24 שעות. לאחר הטיפול, התאים נשטפו פעמיים עם מלח קר עם בופר פוספט קרח והוסגרו מחדש בבופר צביעת תאים של 100 מיקרוליטר.

התאים צובקו בנוגדן אנטי-גליקופרוטאין מצורף פיקוריתרין ובנוגדן 1 של אלקסה פלור 647-קונוגט נגד עמידות רב-תרופתית במצב המומלץ על ידי היצרן. נכללו בקרות איזוטיפ תואמות, בקרות לא מוצבעות, בקרות צביעה בודדות ובקרות פלואורסצנציה מינוס אחת לצורך קביעת שער ופיצויים. הדגימות נדגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך, נשטפו פעמיים עם בופר צביעת תאים, והושעו מחדש בבופר צביעה של 500 מיקרוליטר לפני הרכישה.

ציטומטריית זרימה בוצעה באמצעות ציטומטר זרימה BD FACScan. לפחות 10,000 אירועים חד-תאיים ברי קיימא נרכשו עבור כל דגימה. רמות הביטוי של P-גליקופרוטאין וחלבון 1 הקשור לעמידות רב-תרופתית נמדדו כעוצמת פלואורסצנציה חציונית לאחר חיסור אות האיזוטיפ-בקרה המתאים. הערכים המנורמלים הובעו ביחס לקבוצת הרכב-ביקורת בכל ניסוי עצמאי.

8. כימות מערבי וכימות צפוף

לאחר הטיפולים הנדרשים, תאים נאספו ונשטפו פעמיים עם סליין קר עם בופר פוספט. חלבון כולל הופק באמצעות בופר מבחן רדיואימונופרציפיטציה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון חומצה ביצינכונינית.

סך הכל 30 מיקרוגרם חלבון לכל נתיב הופרדו על ידי אלקטרופורזה של סודרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד והועברו לממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן או 5% אלבומין סרום בקר במי מלח טריס-בופר המכיל טווין 20 למשך שעה בטמפרטורת החדר.

הממברנות נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד קינאז חלבון B כולל, קינאז חלבון מזרחן B, מטרה מכנית כוללת של ראפמיצין, מטרה מכנית מזורחנת של רפמיצין, קספאז-3 מפוצל, פוליאמוראז (אדנוזין דיפוספט-ריבוז) פולימראז, P-גליקופרוטאין, חלבון 1 הקשור לעמידות מרובת תרופות, וגליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז. לאחר הכביסה, הממברנות נדגרו עם נוגדנים משניים מתאימים עם פרוקסידאז פרוקסידאז למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות חלבון הוצגו באמצעות זיהוי כימילומינציה משופר.

עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ, גרסה 1.53t. קינאז חלבון מזרחן B נורמל לקינאז חלבון B כולל, והמטרה המכניסטית המזורחנת של ראפמיצין נורמלה ליעד מכני כולל של רפמיצין. P-גליקופרוטאין, חלבון 1 הקשור לעמידות רב-תרופתית, קספאז-3 שמפורק, ופוליפראז פולי (אדנוזין דיפוספט-ריבוז) מנורמל לגליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז. ערכים מנורמליים הובאו לשינויים בקפלים ביחס לקבוצת בקרת הרכב או לקבוצת הדוקסורוביצין בלבד, בהתאם להשוואה. ניתוחי הכתמים המערביים בוצעו באמצעות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. תמונות Western Blot שלא נחתכו הועברו למאגר הנתונים הציבורי או הועלו כקבצים משלימים נוספים.

9. ניסוי חילוץ SC79

כדי לבדוק האם איתות קינאז חלבון B היה קשור להשפעות שנצפו של FTY720, תאי HL60/A ו-K562/A טופלו ב-FTY720 בנוכחות או בהיעדר SC79, מפעיל קינאז חלבון B. התאים טופלו מראש עם 5 מיקרומום FTY720 למשך 12 שעות ואז טופלו ב-30 מיקרומום SC79 או בקרת כלי רכב למשך 12 שעות נוספות.

לאחר הטיפול, הוערכו רמות של קינאז חלבון מזרחן B, מטרה מכנית מזרחנת של רפמיצין, P-גליקופרוטאין וחלבון 1 הקשור לעמידות לרב-תרופתית באמצעות Western blotting. במקביל, האפופטוזיס הוערך באמצעות צביעת אנקסין V ופרופידיום יודיד לאחר טיפול בדוקסורוביצין, FTY720 ו-SC79. השפעות ההצלה פורשו כראיות הקשורות למסלול. מכיוון שלא בוצע ניסוי ביטוי גנטי יתר או הדחה, המסקנות הסיבתיות הוצגו בזהירות.

10. ניתוח סטטיסטי ודיווח נתונים

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism, גרסה 9.5, ו-IBM SPSS Statistics, גרסה 23.0. שכפולים ביולוגיים הוגדרו כניסויים עצמאיים שבוצעו בימים שונים באמצעות תאים שהתרבתו באופן עצמאי. שכפולים טכניים הוגדרו כבארות חוזרות או מדידות חוזרות בתוך אותו ניסוי ביולוגי.

הנתונים הוצגו כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע, אלא אם צוין אחרת. השוואות בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחן t סטודנט דו-זנבי לא מזווג כאשר הנתונים היו מחולקים בערך כרגיל. השוואות בין שלוש קבוצות או יותר נותחו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. ניסויים שכללו שני גורמים בלתי תלויים, כגון ריכוז התרופות ומצב הטיפול, נותחו באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני ואחריו תיקון השוואה מרובה מתאים.

כאשר הנחות נורמליות לא נתמכו, נעשה שימוש במבחנים לא-פרמטריים. ערכי p מדויקים דווחו ככל שניתן. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 לאחר תיקון עבור השוואות מרובות. כל המיתוגים של האיורים ציינו את מספר השכפולים הביולוגיים, את המבחן הסטטיסטי שנעשה בו שימוש, את משמעות פסי השגיאה ואת סף המובהקות. ערכי שכפול ביולוגיים בודדים הוצגו בגרפים של פיזור או בגרפים עמודתיים ככל שניתן.

תוצאות

FTY720 הפחיתה את היכולת של תאי ההורים ותאי לוקמיה מיאלואידית חריפה עמידים לדוקסורוביצין

תאי HL60, K562, HL60/A ו-K562/A נחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של FTY720 (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ו-100 מיקרומון) במשך 48 שעות, וחיוניות התאים נמדדה באמצעות מבחן Cell Counting Kit-8. FTY720 הפחיתה את חיוניות התאים בכל ארבעת קווי התאים באופן תלוי בריכוז (איור 1A). ערכי הריכוז המעכבים החצי-מקסימליים המחושבים היו 17.347 ±-1.549...

דיון

כימורזיסטנסיות נותרה אחד המחסומים המרכזיים לטיפול יעיל בלוקמיה מיאלואידית חריפה. במטופלים שנכשלו להגיב לטיפול ההשראה או מפתחים הישנות לאחר התגובה הראשונית, תאי לוקמיה עמידים יכולים להימשך למרות חשיפה למשטרי ציטרבין ואנתראציקלין, מה שהופך את זיהוי גישות שמגבירות את הרגישות לתרופות לשאלה ניסיונית וקלינית^{חשובה 23}. דוקסורוביצין הוא אנתרציקלין עם פעילות אנטי-גידולית רחבה, אך השימוש הקליני בו מוגבל על ידי רעילות מצטברת ויכולת תאים ממאירים לרכוש מנגנונים שמפחיתים חשיפה ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
6-well tissue culture plates	Corning / Costar	3516 או מקבילה מאושרת במעבדה	משמש לטיפול, אפופטוזיס, הצטברות דוקסורוביצין ותנסויים בביטוי חלבונים.
96-well tissue culture plates	Corning / Costar	3599 או מקבילה מאושרת במעבדה	משמש לבדיקות Cell Counting Kit-8.
Alexa Fluor 647 mouse immunoglobulin G1 isotype control	BioLegend	400130 או מקבילה מאושרת במעבדה	בקרת איזוטיפ עבור צביעת נוגדן המשולבת עם Alexa Fluor 647. השתמש במספר הקטלוג המדויק מהבקבוקון של הריאגנט.
Alexa Fluor 647-conjugated anti-human multidrug resistance-associated protein 1 / ABCC1 antibody	BioLegend	370103	משמש לזיהוי פלואורומטרי של חלבון הקשור לעמידות רבת תרופות 1. יש לאשר את זמינות המוצר מכיוון שחלק מפורמטי ה-MRP1 של BioLegend הופסקו או הוחלפו.
Annexin V apoptosis detection kit with propidium iodide	BioLegend	640914 או מקבילה מאושרת במעבדה	משמש לניתוח אפופטוזיס של אנקסיין V ופרופידיום יודיד על ידי ציטומטריה של זרימה. אם נעשה שימוש ב-Annexin V-allophycocyanin במקום Annexin V-fluorescein isothiocyanate, יש להחליף זאת במספר הקטלוג המדויק של הערכה.
Bicinchoninic acid protein assay kit	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / ספק מאושר	השתמש במספר הקטלוג בפועל	משמש למדידת ריכוז חלבונים.
Carbon dioxide cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / מכשיר מאושר	יש להכניס את הדגם מתוך רשומות המעבדה	שמירה על תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	גילוי קספאז-3 מלא ומפורק על ידי Western blot. אם נעשה שימוש בנוגדן מפורק קספאז-3 ספציפי, יש להחליף אותו במספר הקטלוג המדויק.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	משמש לבדיקות חיוניות תאים וריכוז עכבה חציוני.
Cell staining buffer	BioLegend	420201	משמש לדילול נוגדנים ושטיפה במהלך צביעת ציטומטריה של זרימה.
Cleaved poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase antibody	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	נוגדן Western blot לפולימראז קלבת פולי(אדנוזין דיפוספוריבוז) מפורק.
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	גרסה 1.0 או גרסה מאושרת במעבדה	משמש לניתוח מדד השילוב של Chou-Talalay אם נתוני מינון שילוב מלאים זמינים.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 או מקבילה מאושרת במעבדה	ממס לפתרונות בסיסיים של FTY720 ו-SC79; הריכוז הסופי לא עלה על 0.1%.
Doxorubicin hydrochloride	השתמש בספק בפועל מתוך רשומות הרכש של המעבדה	השתמש במספר הקטלוג ומספר האצווה בפועל	אנתרציקלין המשמש לתחזוקת עמידות ותנסויים בטיפול. ערך זה חייב להתאים לריאגנט המשמש בפועל בניסויים.
Enhanced chemiluminescence substrate	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / ספק מאושר	השתמש במספר הקטלוג בפועל	משמש לגילוי אותות Western blot.
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 או מקבילה מאושרת במעבדה	הוסף למדיום תרבית ב-10%. השתמש בסרום מחום או לא מחום באופן עקבי בכל הניסויים.
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACScan או דגם מכשיר בפועל	משמש לבדיקות אפופטוזיס, הצטברות דוקסורוביצין תוך תאית ובדיקות ביטוי טרנספורטר. רשום את תצורת הלייזר/המסנן בשיטות המשלמות אם זמין.
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences / FlowJo / תוכנה מאושרת במעבדה	גרסה להכנסה מתוך רשומות המעבדה	משמש לפיצוי, גייטינג וניתוח עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת.
FTY720 / fingolimod hydrochloride	השתמש בספק בפועל מתוך רשומות הרכש של המעבדה	השתמש במספר הקטלוג ומספר האצווה בפועל	ריאגנט לטיפול בתרופות. ערך זה חייב להתאים לריאגנט המשמש בפועל בניסויים. אין להחליף באספקה אחרת אלא אם כן הניסוי בוצע עם המוצר הזה.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antibody	Abcam	ab181602	בקרת טעינה ל-Western blot. אשר את ה-RRID מתוך הודעת המוצר לפני ההגשה.
GraphPad Prism	GraphPad Software	גרסה 9.5	משמש לגיבוש עקומת מינון-תגובה, חישוב ריכוז עכבה חציוני ונתוח סטטיסטי.
HL60 human acute myeloid leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	לא ממוס