הליך ירידה במשקל חוזר ליצירת מודל עכבר לפגיעת מוח טראומטית כרונית

סיכום

הוצג פרוטוקול להקמת מודל עכבר חוזר של פגיעות מוח טראומטיות קלות עם ראש סגור, ללימוד המנגנונים שמאחורי התנהגות דכאונית כרונית בהיעדר נגעים מוחיים מבניים גסים.

תקציר

פגיעת מוח טראומטית (TBI) עלולה להוביל לשינויים נוירופתולוגיים מתמשכים ולתוצאות נוירופסיכיאטריות ארוכות טווח. במהלך ההחלמה, חלק משמעותי מהמטופלים מפתחים הפרעות רגשיות, כולל תסמינים דיכאוניים ותלונות הקשורות לשינה, גם כאשר טומוגרפיה ממוחשבת שגרתית או הדמיית תהודה מגנטית אינה מגלה חריגות מבניות ברורות. מודלים ניסיוניים המשחזרים תכונות אלו נדרשים כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס תסמינים נוירופסיכיאטיים פוסט-טראומטיים כרוניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל עכבר חוזר של פגיעת מוח טראומטית קלה עם ראש סגור, ללימוד המנגנונים שמאחורי התנהגות דמוית דיכאון כרוני בהיעדר נגעים מוחיים גסים גלויים הניתנים לזיהוי באמצעות בדיקה מקרוסקופית ו-MRI משוקלל T2. בשיטה זו, הגולגולת השלמה נחשפה ונחשפת לפגיעות חוזרות באמצעות פרמטרים מוגדרים של ירידת משקל במשך חמישה ימים רצופים. בתנאים המתוארים כאן, ההליך גורם לפציעת ראש סגורה ללא שבר גולגולת חמור או חבלה מוקדית מקרוסקופית. לאחר מרווח לאחר הפציעה, העכברים מציגים התנהגויות דמויי-דיכאון אך אינם מראים חריגות מבניות מוקדיות ברורות בבדיקה גסה או בהדמיית תהודה מגנטית משוקללת T2 בתנאים בהם נעשה שימוש במחקר זה. פרוטוקול זה מספק גישה ניסיונית לחקר התנהגות דמוית דיכאון כרוני לאחר פגיעת מוח טראומטית קלה וחזרתית ולהערכת התערבויות טיפוליות אפשריות.

מבוא

עם זאת, מאחר שהפרדיגמה הנוכחית מספקת בעיקר השפעה ליניארית לעכבר קבוע בראש, יש לפרש אותה כמודל rmTBI בראש סגור המותאם לחקר תוצאות רגשיות כרוניות ולא כחיקוי ביומכני ישיר של זעזוע מוח הקשור לספורט או פציעות תנועה קלות." פגיעת מוח טראומטית (TBI) היא כיום אחת הסיבות המובילות לתחלואה ותמותה הקשורה לטראומה, ומטילה נטל רפואי וכלכלי משמעותי על משפחות וחברה ^1,2. ראוי לציין כי נזק למערכת העצבים המרכזית לאחר פגיעת טראומטר אינו חולף; הוא בדרך כלל מתפתח באופן כרוני ופרוגרסיבי. מחקר על פגיעות ראש מוחות גילה שגם 18 שנים לאחר הפציעה, הפעלה מיקרוגליאלית נמשכת, ודלקת נוירו-דלקת כרונית ממושכת ממשיכה לגרום להידרדרות עצבית חמורה³. נתונים אפידמיולוגיים מצביעים על כך שעד 28%–32% מהמטופלים מפתחים הפרעות רגשיות חמורות במהלך שלב^{ההחלמה הממושך הרביעי}. במאמר זה, rmTBI מתייחס לפרדיגמת ההשראה החוזרת של פגיעות מוח טראומטיות קלות, בעוד שהשלב הכרוני שלאחר הפציעה, המאופיין בשינויים התנהגותיים מתמשכים, מכונה כאן פגיעת מוח טראומטית כרונית (c-TBI). המונח c-TBI משמש כאן לתיאור מצב כרוני לאחר פציעה, המאופיין בשינויים התנהגותיים מתמשכים לאחר rmTBI, ולא בפרדיגמת פציעה נפרדת. שימוש זה תואם מבחינה רעיונית את עבודתנו הקודמת שמראה כי פגיעות טראומטיות ניסיוניות יכולות להתפתח כתהליך כרוני מתקדם הקשור לחריגות היסטופתולוגיות והתנהגותיות ארוכות טווח.

תוצאות נוירופסיכיאטריות כרוניות אלו פוגעות קשות באיכות החיים ובתוצאות התפקודיות של המטופלים⁵. עם זאת, הפתוגנזה המדויקת שמאחורי ההפרעות הרגשיות המשניות הללו נותרה חמקמקה, ואפשרויות הטיפול הקליני מוגבלות מאוד. לכן, חקירת המנגנונים של התנהגויות דמויי דיכאון הנגרמות על ידי c-TBI וזיהוי מטרות טיפוליות מדויקות הם בעל צורך קליני דחוף וחשיבות מעשית משמעותית.

כדי להבהיר את המנגנונים הפתולוגיים של TBI, חוקרים פיתחו מודלים שונים של בעלי חיים, ביניהם מודל ההשפעה הקורטיקלית המבוקרת (CCI) הוא כיום אחד הנפוצים ביותר^ב-6,7. CCI מאפשר שליטה מדויקת על פרמטרי הפגיעה ליצירת נגעים מוקדיים שניתנים לשחזור גבוה. עם זאת, גם מודלים של פציעות נוזל-הקשה (FPI) המסורתיים (CCI) וגם פגיעות נוזל-הקשה (FPI) דורשים בדרך כלל קרניוטומיה. גישות אלו שימושיות במיוחד לחקר חבלה מוקדית, אובדן רקמות ותגובות נוירודלקתיות חמורות הקשורות לנגעים, אך הן נוטות לדמות פגיעות ראש פתוחות חמורות, השונות משמעותית מההצגות הקליניות הנפוצות ביותר של פגיעות ראש סגורות קלות, כגון זעזועי מוח הקשורים לספורט ^8,9. חשוב לציין, נמק רקמת המוח, צלקות גליאליות וקוויטציה בשלב מאוחר הנגרמת על ידי קרניוטומיה והפגיעה מציגים שתי מגבלות עיקריות. ראשית, ליקויים מבניים חמורים גורמים לעיתים קרובות לתפקוד מוטורי לקוי, מה שמבלבל ישירות את ההערכה המדויקת של תוצאות התנהגותיות. שנית, אובדן פיזי של רקמה חותך הקרנות עצביות לטווח ארוך. כפי שהודגם במחקרים קודמים שהשתמשו במודל ה-TBI המושר על ידי CCI, עכברים הפגינו חבלות מוקדיות משמעותיות^{במוח 4}. הפרעה מבנית זו פוגעת קשות ביישום טכניקות נוירואנטומיות מתקדמות, כגון מעקב ויראלי, מה שהופך את חקירת התסמינים הפסיכיאטריים והמעגלים העצביים הנלווים לבלתי אפשרי ברובה. בהתאם לכך, אף שמודלים אלו נשארים בעלי ערך למחקרים של פגיעות ראש חמורות או מוקדיות, ייתכן שהם פחות מתאימים כאשר המטרה היא לחקור חריגות רגשיות כרוניות לאחר פגיעה קלה וחוזרת בראש סגור, במיוחד כאשר שמירה על שלמות מבנית חשובה לניתוחים התנהגותיים ומעגליים.

כדי להתגבר על המגבלות של מודלי ה-TBI הפתוחים החמורים שהוזכרו, מחקר זה מפרט פרוטוקול להקמת מודל עכברי פגיעת מוח טראומטית קלה (rmTBI) באמצעות שיטת ירידת משקל על גולגולת חשופה ושלמה ללא קרניוטומיה. פרוטוקול זה משתמש בפרמטרי פגיעה מוגדרים במדויק: גובה נפילה של 25 ס"מ ומשקל של 20 גרם. אתר הפגיעה כוון ל-2 מ"מ משמאל לתפר הסגיטל ו-2 מ"מ אחורי לתפר הקורונלי, תוך שימוש בקצה מתכת מעוקל בקוטר 4 מ"מ כדי להבטיח דיוק ואחידות כוח הפגיעה. יתרה מזאת, התדירות הספציפית של פגיעות חוזרות לאורך חמישה ימים רצופים מבטיחה את יציבות השינויים הפתולוגיים הכרוניים. הערכות מקיפות הכוללות MRI, היסטופתולוגיה ובדיקות התנהגותיות מראות שמודל עכברו זה מפגין התנהגויות דמויות דיכאון משמעותיות תוך שמירה על שלמות מוחית מבנית גסה, ללא חבלות מוקדיות או ליקויים מוטוריים ברורים. פרופיל פנוטיפי זה לוכד תכונות התנהגותיות נבחרות של פגיעות ראש קלות וחוזרות, כולל שינויים נוירופסיכיאטריים למרות שאין חריגות מבניות ברורות בהדמיה שגרתית 10,11,12,13. עם זאת, מאחר שהפרדיגמה הנוכחית מספקת בעיקר השפעה ליניארית לעכבר קבוע בראש, יש לפרש אותה כמודל rmTBI בראש סגור המותאם לחקר תוצאות רגשיות כרוניות ולא כחיקוי ביומכני ישיר של זעזוע מוח הקשור לספורט או פציעות תנועה קלות.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של המכון לבינה מלאכותית, מרכז המדעים הלאומי המקיף של חפיי (אישור מס' IAI2024071004). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. דיאגרמה סכמטית של הפרוטוקול הניסויי מוצגת באיור 1. ניתן להשתמש בציוד מקביל מספקים אחרים, בתנאי שמאפייני הביצועים הקריטיים נשמרו, כגון משקל פגיעה של 20 גרם, גובה נפילה של 25 ס"מ, קוטר קצה הפגיעה 4 מ"מ, אספקת איזופלוראן אמינה, והגדרות MRI הדומות לאלו שבשימוש כאן. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

1. הכינו את החיות.
   1. השתמש בעכברים זכרים C57BL/6N בגיל 8–10 שבועות ומשקלם 20–25 גרם.
   2. לאחסן את העכברים בכלובים מאווררים (IVCs) במתקן ייחודי לבעלי חיים ללא פתוגנים (SPF). ספקו אוכל ומים לפי רצונם ושמרו על מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך תחת טמפרטורה ולחות מבוקרות.
   3. הכניסו את העכברים לחדר המגורים לפני הניסוי ובצעו בדיקות בריאות שגרתיות בהתאם לנהלי טיפול בבעלי חיים מוסדיים.
2. הקצה את הקבוצות.
   1. הקצו את העכברים באקראי לקבוצת הנאיבי, קבוצת שאם וקבוצת c-TBI. החוקרים האחראים על פרשנות MRI, הערכה פתולוגית גסה וניקוד התנהגותי/ניתוח נתונים היו עיוורים לשיבוץ קבוצתי.
   2. רשמו את מספר זיהוי החיה והקצאת הקבוצה לפני מפגש הפציעה הראשון.

2. הכנה לניתוח והרדמה

1. הכינו את כלי הניתוח ומערכת ההרדמה.
   1. הכינו סכין סטרילית עם להב מספר 11, מטליות כותנה סטריליות, מלח פיזיולוגי סטרילי, תמיסת פובידון-יוד 10%, תפר מונופילמנט פוליפרופילן 5-0 בלתי נספג, סרט דבק ומשחה עינית כלורטטרציקלין.
   2. חטא את כלי הניתוח לפני השימוש, הנח אותם על שדה ניתוח נקי, ושמור על טכניקה אספטית לאורך כל ההליך. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה והגנה לעיניים.
   3. הכינו כרית חימום תרמוסטטית ומכוונים אותה ל-37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס.
   4. חבר את תא ההשראה ואת חרוט האף למערכת ההרדמה של גזי בעלי חיים במעבדה.
   5. קבע את קצב זרימת החמצן ל-0.5–1.0 ליטר לדקה והכן את מאיידי האיזופלוראן לאינדוקציה ותחזוקה. לבצע הרדמה באזור מאוורר היטב או להשתמש במערכת איסוף גזי פסולת מאושרת.
2. הכינו את העכבר לניתוח.
   1. ניתן בופרנורפין HCl (0.1 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני) 30 דקות לפני ההרדמה והניתוח בהתאם לפרוטוקול החי המאושר.
   2. הנח את העכבר בתא ההשראה וגרם להרדמה עם איזופלורן. כוון את האידוי ל-3%–5% לאינדוקציה ומנטר את העכבר באופן רציף עד שהרפלקס המתיישר יאבד ותנועת הגפה הספונטנית מפסיקת. אין לעלות על 5% איזופלוראן במהלך האינדוקציה.
   3. העבר את העכבר למסגרת סטריאוטקסית במצב שכיבה ושמור על ההרדמה דרך חרוט אף. הפחת את הגדרת האידוי ל-1%–2% לצורך תחזוקה תוך שמירה על קצב זרימת החמצן של 0.5–1.0 ליטר לדקה.
      1. במהלך ההליך, שמרו על קצב נשימה יציב של כ-60–100 נשימות לדקה. אם קצב הנשימה יורד מתחת ל-60 נשימות לדקה או שהנשימה הופכת רדודה או לא סדירה, יש להפחית מיד את ריכוז האיזופלורן, לספק חימום תומך ולדחות את ההשפעה עד שהנשימה היציבה תחזור. אין לעלות על 2% איזופלורן במהלך התחזוקה.
   4. אשר הרדמה מספקת בהיעדר רפלקס משיכת פדל, אבטח את הראש עם מוטות האוזניים של המסגרת הסטריוטקסית מבלי לפגוע בממברנות הטימפניות (איור 2A), ולשמור על העכבר במצב שכיבה. אם לא ניתן להשיג הרדמה מספקת בטווחי ההשראה והתחזוקה שנקבעו, או אם מתרחש דיכוי נשימתי מופרז, יש להוציא את החיה ממפגש הפציעה הזה.
   5. מרחו משחת עיניים כלורטטרציקלין על שתי העיניים, גילחו את הקרקפת וחיטו את אתר הניתוח בתמיסת פובידון-יוד 10%.

3. הקמת מודל פגיעות מוח טראומטיות קלות וחוזרות

1. חשפו את הגולגולת.
   1. בצע חתך קו אמצע לאורך כ-0.5 ס"מ עד 1 ס"מ, בקרקפת באמצעות סכין סטרילית עם להב מספר 11.
   2. נתח בצורה ישירה את הרקמה התת-עורית והפריאוסטאום עם מלקחיים סטריליים או מטושי כותנה כדי לחשוף את הגולגולת במלואה מבלי לשרוט את פני העצם.
   3. נגב את פני הגולגולת עם מטלית כותנה סטרילית הרטובה במלח פיזיולוגי כדי להמחיש את סימני הגולגולת, כולל ברגמה ותפר הקורונל.
2. הכינו את מכשיר הפגיעה.
   1. התקן קצה מתכת מעוקל בקוטר 4 מ"מ על מכשיר הנפילה החופשית.
   2. הגדר את גובה הנפילה ל-25 ס"מ והשתמש במשקל פגיעה של 20 גרם (איור 2B).
3. תביא את ההשפעה.
   1. זהה את אתר הפגיעה בנקודה 2 מ"מ שמאלה לתפר הסגיטל ו-2 מ"מ אחורי לתפר הקורונלי על פני הגולגולת (איור 2C).
   2. יישר את קצה הפוגע אנכית מעל אתר המטרה, הורידו אותו בעדינות עד שהוא נוגע במשטח הגולגולת, וודאו שהקצה נשאר במרכז ובניצב לגולגולת לפני שחרור המשקל.
   3. שחרר את משקל ה-20 גרם מגובה של 25 ס"מ כדי לספק פגיעה אחת.
   4. לקבוצת התמימים, אין לבצע הרדמה או ניתוח. בקבוצת השאם, יש לתת הרדמה ולבצע חתך בקרקפת, אך לא להשפיע על ההשפעה.
4. תפרו את החתך וספקו טיפול לאחר הניתוח.
   1. הסר את קצה הפגיעה מיד לאחר הפגיעה ובדוק את אתר הניתוח.
   2. סגור את חתך הקרקפת עם תפר מונופילמנט פוליפרופילן לא נספג 5-0 מופרע וחטא את אתר החתך בתמיסת פובידון-יוד של 10%.
   3. הניחו את העכבר על כרית חימום תרמוסטטית בטמפרטורה של 37 מעלות ± 0.5 מעלות צלזיוס, עוקבים אחרי הנשימה עד להתעוררות מלאה ולתנועה חופשית, ואז להחזיר את העכבר לכלוב הבית.
      הערה: ההחלמה מוגדרת על ידי חזרת נשימה ספונטנית סדירה, התאוששות רפלקס המתיישר, ותזוזה ספונטנית. יש לעקוב מיד אחרי דום נשימה חריפה ודימום נראה לעין מיד לאחר כל פגיעה ובמהלך ההחלמה המוקדמת. בעלי חיים שמראים דום נשימה ממושך, דימום נראה, לא מצליחים להחזיר את רפלקס ההתיישרות תוך 10 דקות לאחר הפסקת השימוש באיזופלורן, או לא מצליחים ללכת באופן ספונטני תוך 15 דקות, יש להוציא אותם מההליכים הבאים ולנהל אותם בהתאם לפרוטוקול המאושר לבעלי חיים.
   4. השליך להבים ומחטים משומשים במיכל חדות מאושר. להשליך פסולת בעלי חיים וחומרים מזוהמים בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
5. חזור על הפציעה.
   1. חזור על צעדים 3.1–3.4 כל 24 שעות במשך 5 ימים רצופים כדי לספק סך של 5 פגיעות.
   2. יש לעקוב אחרי משקל הגוף והפעילות באופן רציף לאורך כל תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח. להוציא בעלי חיים מהניתוחים הבאים אם הם מפתחים שבר בגולגולת, דימום נראה, פרכוסים, סיבוב מתמשך או חוסר יכולת להאכיל או לשתות באופן עצמאי.

4. רכישת תמונות תהודה מגנטית

הערה: במחקר זה, ה-MRI בוצע ביום השביעי לאחר הפציעה הסופית. העכברים נסרקו תחת הרדמה איזופלורנית ולא הוקרבו לפני ההדמיה. איסוף רקמות בוצע לאחר הדמיה בהתאם ללוח הניסוי.

1. הכינו את החיה ל-MRI.
   1. הרדימו את העכבר באיזופלוראן והניחו אותו על מיטת בעלי חיים תואמת MRI המצוידת בקונוס אף.
   2. יש לעקוב אחרי הנשימה לאורך כל הסריקה ולשמור על טמפרטורת גוף של 37°C ±-0.5°C.
2. רכוש תמונות משוקללות T2
   1. צלם תמונות על מגנט מוליך-על בנפח 9.4 טון עם קדח של 30 ס"מ ומערכת גרדיאנט עם חוזק שיפוע מרבי של 1000 mT/m וקצב סיבוב מקסימלי של 10000 T/m/s.
   2. השתמש בסליל נפח של 86 מ"מ לשידור בתדר רדיו ובסליל משטח מישורי של 15 מ"מ לקליטת אות.
   3. רכוש תמונות ספין-אקו מהיר מרובות פרוסות ברזולוציה גבוהה במשקל T2 באמצעות הפרמטרים הבאים: זמן חזרה = 3000 מילישניות, זמן הד = 46.34 מילישניות, אורך רכבת הד = 13, רוחב פס מקלט = 220 הרץ/פיקסל, שדה ראייה = 20 × 20 מ"מ², מטריצת רכישה = 208 × 208, עובי פרוסה = 0.5 מ"מ, רווח חתך = 0 מ"מ, ומספר עירורים = 2.
   4. קח 30 פרוסות לכסות את כל המוח. השתמש בזמן רכישה כולל של דקה ו-33 שניות. במחקר הנוכחי, MRI משוקלל T2 שימש רק להערכה איכותנית. לא בוצעה ניתוח MRI כמותי.
      הערה: תמונות MRI נבדקו באופן איכותני על ידי חוקר שהיה עיוור לשיוך קבוצתי.

5. הערכת הנוירופתולוגיה הגסה

1. בצע איסוף רקמות.
   1. הרדימו עמוק את העכבר לפי הפרוטוקול המאושר לבעלי חיים.
   2. פתח את חלל החזה, חשוף את הלב, הכנס מחט פרפוזיה לחדר השמאלי, וחתוך את העלייה הימנית.
   3. פרפיוז עם סליין רגיל, ואז פרפיוז עם 4% פרפורמלדהיד (PFA). בצע את כל הליך הפרפוזיה במכסה אדים כימי מוסמך והימנע מקשר ישיר בעור או עין עם PFA. השלכת רקמות ופסולת נוזלית בהתאם לתקנות פסולת מסוכנת ובטיחות ביולוגית.
   4. אסוף את הגולגולת והמוח השלמים וצלם תמונות מגעילות באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה.
      הערה: הערכה פתולוגית גסה בוצעה על ידי חוקר שהיה עיוור לשיוך קבוצתי.

6. מעקב אחרי משקל הגוף

1. תעד את משקל הגוף.
   1. שקלו כל עכבר לפני מפגש הפציעה הראשון ובימים 1, 3, 7, 14, 21 ו-30 לאחר הפציעה, ורשמו את הערכים כדי להעריך את מצב הבריאות הכללי לאורך זמן.

7. לבצע את מבחן ההליכה-קרן

1. הכינו את המכשיר.
   1. השתמש בקורה עץ אופקית באורך 1 מטר וברוחב 1 ס"מ ותלה אותה 30 ס"מ מעל הקרקע.
2. בדוק קואורדינציה מוטורית.
   1. הנח את העכבר בקצה ההתחלתי של הקורה, אפשר לה לעבור לנקודת הסיום, ורשם את הזמן הנדרש לחצות את הקורה.
   2. בצע את הבדיקה לפני הפציעה ובימים 1, 3, 7, 14, 21 ו-30 לאחר הפציעה.
      הערה: בדיקות התנהגות נקבעו כדי למזער את ההשפעות הנמשכות בין הבדיקות. מכיוון שמבחן תליית הזנב (TST) ומבחן השחייה בכפייה (FST) מעוררי לחץ רב יותר ממבחן השדה הפתוח (OFT), הם בוצעו ראשונים, ואחריהם מבוך OFT ו-Barnes בנקודות זמן מאוחרות יותר. רצף זה נבחר כדי להפחית בלבול פוטנציאלי כתוצאה מההתרגלות קודמת או חשיפה חקרנית חוזרת במהלך הערכות התנהגות מאוחרות יותר.

8. ביצוע מבחן מתלי הזנב

1. הכינו את המכשיר.
   1. בצע את הבדיקה ביום השביעי לאחר הפציעה והניח גליל פלקסיגלס מעל הזנב כדי למנוע טיפוס על הזנב. השתמש בגליל באורך 4 ס"מ עם קוטר חיצוני של 1.6 ס"מ, קוטר פנימי של 1.2 ס"מ ומשקל של 1.6 גרם.
2. תעד את ההתנהגות.
   1. חבר את הזנב לקופסת המתלים עם סרט דבק, ודא שהעכבר לא מגיע לתחתית הקופסה, ותלה את העכבר למשך 3 דקות.
   2. הקלט את כל המפגש עם מצלמה ברזולוציה גבוהה ונתח ידנית את זמן הניידות וזמן חוסר התנועה מהסרטון שהוקלט על ידי צופה עיוור.

9. ביצוע מבחן השחייה הכפויה

1. הכינו את המכשיר.
   1. בצע את הבדיקה ביום ה-10 לאחר הפציעה ומלא גליל שקוף בגובה 25 ס"מ וקוטר 15 ס"מ במים שנשמרו על טמפרטורה של 23–25 מעלות צלזיוס. השתמש בעומק מים שמונע מהזנב והגפיים האחוריות לגעת בתחתית.
2. תעד את ההתנהגות.
   1. שים את העכבר במים למשך 6 דקות וצלם את כל הסשן עם מצלמה ברזולוציה גבוהה.
   2. לנתח ידנית את 4 הדקות האחרונות של ההקלטה על ידי צופה עיוור וכמת את זמן הניידות וזמן חוסר התנועה.
   3. הגדר חוסר תנועה רק כמינימום תנועות הנדרשות כדי לשמור על הראש מעל המים.

10. ביצוע מבחן שדה פתוח

1. הכינו את המכשיר.
   1. בצע את הבדיקה ביום ה-14 לאחר הפציעה בחדר שקט תחת תאורה עקבית. נקודת זמן מאוחרת זו נבחרה כדי לספק הפרדה מהמפגשים הקודמים של TST ו-FST ובכך להפחית את ההעברה הקשורה ללחץ החריף ל-OFT.
   2. השתמש בקופסת שדה פתוח במידות 40 ס"מ × 40 ס"מ × 40 ס"מ.
2. תעד ונתח התנהגות חקרנית.
   1. הנח את העכבר במרכז הזירה ותן לו לחקור בחופשיות במשך 6 דקות.
   2. עקבו אחרי ההתנהגות במשך 6 דקות באמצעות תוכנת מעקב וניתוח התנהגותי. כיולו את מידות הזירה בתוכנה כך שיתאימו למכשיר בגודל 40 ס"מ ×-40 ס"מ וחלק את האולם למעשה לרשת 5 × 5.
   3. הגדר את 16 הריבועים החיצוניים כאזור ההיקפי ואת 9 הריבועים הפנימיים כאזור המרכז. הגדר את צבע החיה כהה יותר מהרקע. לעקוב רק אחרי גוף החיה; אל תעקוב אחרי הראש או הזנב. ללכוד את הרקע ידנית.
   4. השתמש בתוכנה כדי למדוד מהירות ממוצעת, זמן שהייה באזור המרכז, זמן באזור ההיקפי והמרחק הכולל שנעבר לאורך כל תקופת הבדיקה.
   5. נקה ודהר את המכשיר לפני ואחרי כל ניסוי כדי להסיר סימני ריח.

11. ביצוע מבוך בארנס

1. הכינו את המכשיר.
   1. התחילו את הערכת המבוך של בארנס ביום ה-30 לאחר הפציעה.
   2. השתמשו בפלטפורמה עגולה מפלדת אל-חלד בקוטר 1 מטר עם 20 חורים במרווחים שווים.
   3. הניחו את קופסת המילוט מתחת לחור מטרה מסומן, מקמו רמזים ויזואליים סביב המבוך, ושמרו על מיקום חור המטרה קבוע בכל ניסוי.
2. ביצוע שלב האימונים
   1. הפעל רעש לבן של 90 dB כגירוי מגעיל במהלך האימון.
   2. הנח את העכבר מתחת לצילינדר שקוף במרכז הפלטפורמה למשך 120 שניות.
   3. הסר את הצילינדר ותן לעכבר לחקור עד 180 שניות.
   4. הקלט ניסיון מוצלח כאשר כל ארבע הרגליים נכנסות לתיבת הבריחה.
   5. הכוון את העכבר לתיבת הבריחה אם הוא לא מצליח לאתר את היעד בתוך 180 שניות ורשום את ההשהיה כ-180 שניות.
   6. תן לעכבר להישאר בקופסת הבריחה למשך 60 שניות.
   7. חזרו על ניסוי האימון פעם אחת לאחר הפסקה של 4–5 שעות בכל יום אימון והמשיכו באימון במשך 4 ימים רצופים.
3. ביצוע יום המנוחה ושלב הבדיקה
   1. השעה את האימון ליום אחד לאחר שלב האימון.
   2. הנח את העכבר במרכז הפלטפורמה ביום המבחן ואפשר חקירה עד 180 שניות.
   3. כוון את קוטר המבוך ל-100 ס"מ לכיול קנה מידה, וודא שזירת המעקב ממוקמת במרכז פריים הווידאו. הגדר את צבע החיה כהה יותר מהרקע. לעקוב רק אחרי גוף החיה; אל תעקוב אחרי הראש או הזנב. ללכוד את הרקע ידנית.
   4. רשמו את ההשהיה בכניסה לתיבת הבריחה, מהירות ממוצעת והמרחק הכולל שנעבר במהלך סשן הבדיקה של 180 שניות באמצעות תוכנת מעקב וניתוח התנהגותי. הגדר את אזור הבריחה בתוכנה לפי מיקום חור היעד המוגדר לפני הניתוח.

12. ניתוח נתונים

1. הכינו את מערך הנתונים.
   1. אסוף את נתוני ההתנהגות, ההדמיה ומשקל הגוף בתוכנה סטטיסטית וגרפית.
   2. ביטוי הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
2. בצע ניתוח סטטיסטי.
   1. נתחו נתוני משקל גוף אורך והליכה בקרן במחקר זה באמצעות מודל השפעות מעורבות ליניאריות עם קבוצה, זמן והאינטראקציה שלהם כאפקטים קבועים ובעלי חיים כאפקט אקראי, ולאחר מכן מבחני השוואה מרובים לאחר הוק כאשר רלוונטי.
   2. ניתחו תוצאות TST, FST, OFT ו-Barnes Maze באמצעות ANOVA חד-כיווני רגיל עבור נתונים המפוזרים תקינה עם שונות הומוגנית, ואחריהם מבחן פוסט-הוק של טוקי כאשר ה-ANOVA הכולל היה משמעותי. לנתונים לא פרמטריים, השתמשו במבחן Kruskal-Wallis ואחריו במבחן הפוסט-הוק של Dunn.
   3. דווח על ערכי p. מדויקים כאשר זמינים, יחד עם סטטיסטיקת המבחן, דרגות חופש ומדד גודל אפקט (R² עבור ANOVA חד-כיווני). לגזור את כל ערכי ה-p המדווחים מהבדיקות הסטטיסטיות שצוינו לעיל ולבצע את כל הניתוחים בתוכנת הסטטיסטיקה והגרפים.
   4. קבע מובהקות סטטיסטית בעמוד < 0.05.

תוצאות

הדמיה והערכה נוירופתולוגית של עכברים עם c-TBI

כדי להעריך את מצב הבריאות הכללי והתפקוד המוטורי הבסיסי של בעלי החיים, נבדקו משקל הגוף והביצועים בהליכה בקרן בהתאם לציר הזמן המוצג באיור 1. הבדלים בקבוצות לאורך זמן נותחו באמצעות מודל ליניארי של השפעות מעורבות עם השפעה אקראית של בעלי חיים. לפני המודלים, לא היו הבדלים סטטיסטיים במשקל הגוף בין הקבוצות (איור 4A). לאחר המודלים, משקל הגוף הכולל ...

דיון

מחקר זה מפרט פרוטוקול ניסויי סטנדרטי להקמת מודל עכבר טראומטי קל (rmTBI) החוזר על עצמו באמצעות שיטת ירידה במשקל בנפילה חופשית חוזרת. על ידי אבטחת העכבר החשוף לגולגולת במכשיר סטריאוטקסי ויישום פגיעות חוזרות בקואורדינטות מוגדרות באמצעות משקל של 20 גרם שנפל מגובה של 25 ס"מ במשך חמישה ימים רצופים, נוצר פנוטיפ התנהגותי המאופיין בהתנהגות דמוית דיכאון כרוני ללא שבר גולגולת או חבלה מוקדית גסה במוח. המאפיין המרכזי של מודל זה הוא הופעה חוזרת של התנהגויות דמויי דיכאון בתקופה שלאחר הפציעה לאחר פגיעות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	סגירת פצע
מכשיר הרדמה	RWD Life Science	R550	בניית מודלים של בעלי חיים
תוכנת מעקב התנהגותי ANY-maze	Stoelting	גרסה 7	תוכנת התנהגות
Barnes maze	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	תוכנת התנהגות
Biorender	BioRender	https://biorender.com	תוכנת ציור מחקר מדעי
בּוּפְּרֵנוֹרְפִּיִן	Sigma-Aldrich	Y0001108	שיכוך כאבים לאחר ניתוח
מכונת גילוח חשמלית	AUX	AUX-C5-1	הסרת שיער לפני הניתוח
מבחן שחייה כפויה	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	תוכנת התנהגות
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	תוכנת סטטיסטיקה
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	בניית מודלים של בעלי חיים
עכברים	Charles river	C57/6N	חיות ניסוי
מבחן שדה פתוח	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	תוכנת התנהגות
משחה עיניים	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	מניעת ייבוש הקרנית בהרדמה
פָּרָפּוֹרָמָלְדִיהִיד (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	חדירה וקיבוע רקמות
תמיסת פוספט באפ (PBS)	Biosharp	BL1425A	חדירה ושטיפת רקמות
תמיסת פּוֹבִידוֹן-יוד, 10%	Beyotime	27883-25g	חיטוי עור לפני ניתוח
מערכת הדמיה מגנטית קלינית	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	תוכנת הדמיה
להב מחטחית מס' 11	Jinhuan Medical	K3-11	חתך עור במהלך ניתוח
ידית מחטחית	Jinhuan Medical	K6-10	משמש עם להב מחטחית מס' 11
מכשיר סטריאוטקסיס	RWD Life Science	68025	בניית מודלים של בעלי חיים
גזה סטרילית	HYNAUT	BK05	בקרת דימום וניקוי כירורגי
מבחן השעיית זנב	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	תוכנת התנהגות
מכשיר פגיעת משקל	RWD Life Science	68093	בניית מודלים של בעלי חיים