מאמר שיטה

מערכת רפורטר אדנו-ויראלית מבוססת פיברובלסטים, המונחית על ידי הפרומוטור של קולגן סוג I אלפא 1 של העכבר, לסריקת תרופות אנטי-פיברוטיות

66 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71678

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר פיתוח של מערכת דשייר (reporter system) אדנו-ויראלית המבוססת על פיברובלסטים, המונחית על ידי פרומוטור של קולגן מסוג I של עכבר, כדי לאפשר ניטור לאורכי זמן של הפעלת פיברובלסטים ולהקל על סריקה במיעוט גבוה של תרכובות אנטי-פיברוטיות.

תקציר

פיברוזיס של הלב, המאופיין בהפעלה חריגה של פיברובלסטים ובהשקעה מוגברת של מטריצה חוץ-תאית, סובל ממחסור בטיפולים ספציפיים למטרה, בעיקר בשל היעדר פלטפורמות סריקה in vitro ארוכות טווח, ניתנות להרחבה ולא הרסניות. בדיקות נקודת-סיום מסורתיות ומודלים של תאי גזע הדורשים משאבים רבים מונעים מטבעם ניטור בזמן אמת של התקדמות הפיברוזיס. כדי להתגבר על מגבלות אלו, פרוטוקול זה מתאר את היצירה, האופטימיזציה והתיקוף של מערכת דוחה (reporter) פלואורסצנטית של mCherry המונעת על ידי פרומוטור של קולגן מסוג I אלפא 1 של עכבר (Col1a1) באמצעות אדנווירוס (Ad-mCol1a1p-mCherry) בפיברובלסטים מסוג NIH/3T3. מפורטים השלבים הקריטיים לאריזה של אדנווירוס רקומביננטי, אופטימיזציה של התהליך הטרנסדוקטיבי (ריבוי זיהום - multiplicity of infection) כדי למזער ציטוטוקסיות, והקמת מודל פיברוזיס חסון המושרה על ידי גורם גדילה טרנספורמטורי בטא (TGF-β). על ידי מעקיפת הצורך בקיבוע תאים, מערכת זו מאפשרת ניטור ישיר וארוך טווח של שעתוק קולגן בתאים חיים. הספציפיות והמהימנות של המודל תוקפו באופן פרמקולוגי באמצעות מעכב של קולטן TGF-β מסוג I (ALK5) בשם SB431542, כאשר תוצאות פלואורסצנטיות נמצאו במתאם עם סממנים פיברוטיים אנדוגניים שנכמרו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR) ובדיקת ELISA. בסופו של דבר, פלטפורמה יעילה זו מבחינה כלכלית מספקת כלי נגיש לסריקה בפריסה רחבה (high-throughput) של חומרים אנטי-פיברוטיים חדשים, ובכך מאיצה את המחקר הקרדיווסקולרי התרגומי.

מבוא

ניהול פיברוזיס לבבי מציב אתגרים קליניים משמעותיים. מצב זה, המאופיין בהפעלה חריגה של פיברובלסטים שקטים למיופיברובלסטים ובהשקעה מוגברת של מטריצה חוץ-תאית (ECM), מייצג נתיב סופי בלתי הפיך המשותף לאי-ספיקת לב, אוטם שריר הלב ומחלות קרדיווסקולריות אחרות1,2,3. עם זאת, אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות מתמודדות עם מגבלות משמעותיות. התערבויות קונבנציונליות — כגון דיורטיקה, חוסמי β ומעכבי מערכת הרנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון — מקלות בעיקר על עקה המודינמית סיסטמית וממזערות הפעלה נוירוהומורלית4,5,6,7. טיפולים אלו אינם מצליחים להכווין באופן ישיר להפעלת פיברובלסטים או לעצור השקעה מתמשכת של קולגן. יתרה מכך, למרות ששרשראות סיגנלינג כגון נתיב ה-TGF-β/Smad, עקה חמצונית ותכנות מחדש מטבולי מניעות פתולוגיה זו, תרגום תובנות אלו לטיפולים אנטי-פיברוטיים בעלי השפעה ישירה נותר מאתגר בשל רעילות סיסטמית ומנגנוני הובלה לא ספציפיים8,9,10. לפיכך, קיים צורך דחוף בטיפולים אנטי-פיברוטיים חדשניים וספציפיים למטרה. צוואר בקבוק תרגומי מרכזי הוא המחסור במערכות הערכה פונקציונליות המסוגלות לדווח באופן רגיש ודינמי על הפעלת פיברובלסטים. מודלים ניסיוניים מסורתיים מראים מגבלות משמעותיות המונעות סריקה פרמקולוגית יעילה11,12. בעוד שמודלים של בעלי חיים in vivo משחזרים רמודלינג לבבי גלובלי, הם סובלים מהבדלים בין-מיניים, לוחות זמנים ניסיוניים ממושכים, עלויות גבוהות ותפוקה נמוכה11.

כדי להתגבר על מכשולים אלה, הופיעו פלטפורמות סינון in vitro שונות; עם זאת, נותרו פגמים מתודולוגיים קריטיים. בדיקות אימונופלורסצנציה בעלות תוכן גבוה דורשות קיבוע תאים הרסני ועיבוד ממושך, ובכך מספקות רק תמונת מצב סטטית במקום ללכוד את הקינטיקה בזמן אמת של הפעלת פיברובלסטים. באופן דומה, פלטפורמות המשלבות ניטור עכבה (impedance) ללא סימון עם ספקטרומטריית מסות (MS/MS) סובלות מחוסר ספציפיות ומכושר התרחבות נמוך, שכן ירידה בעכבה הנגרמת מרעילות תאית כללית עלולה להתבלבל בקלות עם יעילות אנטי-פיברוטית אמיתית. יתרה מכך, מערכות דורגניות המהונדסות בשיטת clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), המשתמשות בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) למעקב אחר סממני שלד התא (למשל, alpha-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2), מציבות חסמי תרגום משמעותיים13. מודלים אלה המבוססים על iPSC הם יקרים באופן בלתי סביר, תובעניים מבחינה טכנית ואינם נגישים במידה רבה לסינון שגרתי בספיקות גבוהה. בנוסף, הסתמכות על סממני שלד התא כגון α-SMA עשויה שלא לשקף במדויק את נקודת הסיום הפתולוגית, שכן ביטוים אינו נמצא במתאם הדוק עם הפרשה פונקציונלית והשקעה מוגברת של ECM14. לפיכך, מערכות אלו אינן מספיקות כדי למפות לאורך זמן תגובות תאיות בשלב מוקדם להתערבויות פרמקולוגיות.

בניגוד לכך, פרוטוקול זה מתאר מערכת של דורש תפקודי אורך (longitudinal functional reporter) המונחית על ידי מקדם הקולגן מסוג I אלפא 1 (Col1a1), במטרה לבסס פלטפורמה עמידה ולא הרסנית לניטור של הפעלת פיברובלסטים. מכיוון שקולגן מסוג I הוא רכיב ה-ECM הדומיננטי המופקד במהלך עיצוב מחדש של הלב, זיהוי ההפעלה התעתקתית של הגן המקודד לו, Col1a1, משמש כקריאה ישירה ורלוונטית פתולוגית להפעלת פיברובלסטים. מודל זה, המבוסס על מקדם Col1a1, מאפשר ניטור רציף ברמה המולקולרית של תהליכים פיברוטיים, ומספק פלטפורמה רגישה, ארוכת טווח וכמותית המותאמת לסריקת תרופות מבוססת מנגנון.

פרוטוקול

אנו מאשרים כי כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות. מאחר שמחקר זה השתמש באופן בלעדי בקו תאי פיברובלאסטים של עוברי עכבר NIH Swiss המוכר (NIH/3T3) ובמערכת הדוחה mCol1a1p-mCherry, ולא כלל בעלי חוליות, עוברי בעלי חיים או נבדקים אנושיים, לא נדרש אישור אתי מוועדה למסירת ניסויים (IRB) עבור הפרוצדורות המתוארות במאמר זה.

כל ההליכים שכללו וקטורים אדנו-וירוסים רקומביננטיים בוצעו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות ולנהלי רמה 2 של בטיחות ביולוגית (BSL-2). טיפול בנגיפים, טרנסדוקציה, אחסון וסילוק פסולת בוצעו באמצעות מבתרי בטיחות ביולוגית מאושרים וציוד מגן אישי מתאים. פסולת נוזלית המכילה חומר אדנו-וירוסי עברה דה-קונטמינציה באמצעות תמיסת אקונומיקה שהוכנה טרי לפני הסילוק, ומוצרי צריכה מזוהמים עברו עיקור באוטוקלאב בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות הביולוגית המוסדיים. שפיכות מקריות חוטרו באופן מיידי באמצעות חומרי חיטוי נגיפיים מאושרים, בהתאם לנהלי התגובה לשפיכות של המוסד.

1. סקירה כללית של זרימת העבודה הניסויית

  1. ייצור עכבר Col1a1 אדנווירוס רקומביננטי מונע על ידי פרומוטור כפי שמתואר בשלב 2.
  2. בצע אופטימיזציה של תנאי התעתוק הוויראלי (viral transduction) בתאי פיברובלסט NIH/3T3 כפי שמתואר בשלב 3.
  3. הקמת מערכת המגיבה ל-TGF-β in vitro מודל רבאי (reporter) של פיברוזיס כפי שמתואר בשלב 4.
  4. יש לתקף את יציבות המודל, הספציפיות והשחזור הביולוגי באמצעות גירוי של TGF-β התלוי בזמן ובמינון, כפי שמתואר בשלב 4.
  5. בצע עיכוב פרמקולוגי באמצעות SB431542 כפי שמתואר בשלב 5.
  6. בצע ניתוחי ELISA (סבסוב חיסוני קשור לאנזים) ו-qPCR (תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת) במורד הזרם כפי שמתואר בשלב 5.
    הערה: עיין ב- איור 1A לסקירה סכמטית של תזרים העבודה הניסויי. עיין ב- טבלת חומרים עבור מכשור ניסויי וריאגנטים.

דיאגרמת רפורטר אדנו-ויראלי mCol1a1p-mCherry; PCR, שיבוט פלסמיד, תהליך סינון פיברובלסטים.
איור 1תהליך ההקמה והתיקוף של ה-mCol1a1p-mCherry מערכת דיווח אדנו-ויראלית בפיברובלסטים. (A) סקירה סכמטית של בניית ה-m של הנגיף האדנו-וירוס (AdV)Col1a1p-mCherry מערכת דיווח וסבב העבודה הניסויי לתיקוף מודל בפיברובלסטים מסוג NIH/3T3. סבב העבודה כולל שיבוט פרומוטור, הרכבת אדנווירוס רקומביננטי, אריזה ויראלית בתאי HEK293, אופטימיזציה של ריבוי זיהום (MOI), וסריקת פלואורסצנציה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) בשלב הבא.Bתמונות פלואורסצנציה מייצגות של פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 שהודבקו ב-Ad-mCol1a1p-mCherry אדנווירוס בריכוזי MOI של 0, 1, 10, 100 ו-1000. הגרעינים נצבעו ב-Hoechst 33342 (כחול), ו- mCherry פלואורסצנציה (אדום) מעידה על Col1a1 פעילות הפרומוטור. עוצמת הפלואורסצנציה כומתה באמצעות דימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ונורמלה למספר הגרעינים. MOI של 100 נבחר לניסויים הבאים על בסיס ביטוי חזק והומוגני של הדגיש (reporter), עם שינויים מורפולוגיים מינימליים. סרג קנה מידה = 200 µmאיור זה נוצר באמצעות BioRender.com עם רישיונות מאושרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. בנייה, אריזה והגברה של אדנו-וירוס עם פרומוטור של mCol1a1

  1. בניית הווקטור האדנו-ויראלי הרקומיננטי
    1. שבט את פרגמנט הפרומוטור של Col1a1 בעכבר באורך 2354 bp (קוординаטות גנומיות: chr11:94824779–94827132; 83+ עד 2271- bp ביחס לאתר תחילת השעתוק [TSS]) במעלה הזרם של הגן המדווח mCherry אל תוך ווקטור השאטל האדנו-ויראלי pDC315.
      הערה: הרצף המלא של פרומוטור Col1a1 ומפת הפלסמיד המפורטת של pDC315-mCol1a1p-mCherry מופיעים בקובץ משלים 1 ובאיור משלים 1.
    2. בצע ליניאריזציה לווקטור pDC315 באמצעות BamHI ו-KpnI. הגבר את המקטע המוכנס של הפרומוטור באמצעות פריימרים המכילים זרועות הומוגיה של 15–25 bp.
      הערה: השתמש באסטרטגיית שיבוט חסרת תפרים (seamless cloning) המבוססת על רקומבינציה הומולוגית כדי להקל על רקומבינציה in vitro.
    3. אמת את הפלסמיד שהתקבל באמצעות סריקת PCR וריצוף סנגר.
      הערה: בדוק בקפידה את רצף נקודת החיבור בין הפרומוטור למדווח כדי להבטיח שאין הסטות מסגרת (frameshifts) או קודוני עצירה מוקדמים.
    4. ייצר את האדנו-וירוס הרקומיננטי באמצעות מערכת AdMax באמצעות רקומבינציה תוך-תאית המתווכת על ידי Cre.
      הערה: פלסמיד השלדה pBHGloxΔE1,3Cre מכיל גנום Ad5 שאינו משוכפל עם מחיקות של E1/E3 וקסטת ביטוי של Cre recombinase המקלה על רקומבינציה ספציפית לאתר עם אתר loxP בווקטור השאטל.
    5. בצע טרנספקציה משותפת (Co-transfection) לתאי HEK293 עם ווקטור השאטל המאומת pDC315-mCol1a1p-mCherry ופלסמיד השלדה האדנו-ויראלי pBHGloxΔE1,3Cre.
  2. אריזה והגברה של האדנו-וירוס
    1. שמר תאי HEK293 במצע Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) מתוסף ב-10% סרום בקר עוברי (FBS). השתמש בתאים בעברי מעבר נמוך (<20 מעברים) עבור אריזה אדנו-ויראלית.
    2. זריע תאי HEK293 ב-30%–40% התמסרות (confluence) 24 שעות לפני הטרנספקציה, כדי להגיע ל-50%–60% התמסרות בזמן הטרנספקציה.
    3. בצע טרנספקציה משותפת לתאי HEK293 עם 5 µg של פלסמיד השאטל ו-5 µg של פלסמיד העזר pBHGloxΔE1,3Cre באמצעות סוכן הטרנספקציה Lipofectamine 2000.
      הערה: שמור על יחס DNA-לסוכן של 1:1 (סה"כ 10 µg DNA ל-10 µL סוכן טרנספקציה).
    4. תרבת את התאים שעברו טרנספקציה ב-37°C עם 5% CO₂ ועקב אחריהם מדי יום כדי לזהות אפקטים ציטופתים.
      הערה: הופעת CPE ראשונית עשויה לדרוש 7–14 ימים. אם המצע הופך לחומצי (צהוב), בצע החלפה עדינה של חצי מהמצע מבלי להפריע לתאים.
    5. קצור את התאים ואת העלמיום כאשר נצפה CPE טיפוסי, המתאפיין בעיגול והתכווצות של התאים, ולפחות 50% מהתאים ניתקו ממשטח התרבית.
      הערה: שלב זה מושג בדרך כלל 10–15 ימים לאחר הטרנספקציה.
    6. בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה על ידי הקפאת הדגימות ב-70°C- למשך 30 דקות והפשרתן באמבט מים ב-37°C.
    7. בצע ערבול בורטקס (Vortex) לתמיחה למשך 30 שניות לאחר כל שלב הפשרה כדי להקל על ליזיס התאים.
      הערה: הימנע מדגירה ממושכת ב-37°C במהלך ההפשרה כדי לשמור על יציבות הווירוס.
    8. הכן דילולים סדרתיים פי 10 של הליזיס הויראלי (10−1 עד 10−13) באמצעות DMEM מלא. הוסף 90 µL מכל דילול ויראלי לתאי HEK293 שנזרעו בלוחות 96 באריות, תוך שימוש ב-10 באריות חזרתיות לכל דילול.
      הערה: תיתור ויראלי של ≥1 × 109 PFU/mL הוגדר כנקודת סיום הגברה מספקת לצורך טהרה בהמשך.
    9. בצע הבהרה ל-10 mL של ליזיס ויראלי גולמי באמצעות מסנן 0.45 µm להסרת פסד תאי.
    10. טפל בליזיס המובהר עם נוקלאזה Benzonase (במינון 10 U/mL) ב-37°C למשך 30 דקות.
    11. טהר את האדנו-וירוס הרקומיננטי באמצעות ערכת Adeno-X Virus Purification Kit לפי הוראות היצרן.
      הערה: ערבב את הליזיס עם בופר דילול 1× לפני הטענה על מסנן הטהרה שהגיע לשיווי משקל. שטוף את המסנן עם בופר שטיפה (Wash Buffer) 1× והשג את הווירוס המטוהר באמצעות 3 mL בופר אלוציה (Elution Buffer) 1×.
    12. דגור את הלוחות למשך 10 ימים והערך אפקטים ציטופתים (CPE) תחת מיקרוסקופ אור. דרג CPE חיובי על סמך עיגול וניתוק אופייניים של התאים. חשב את התיתור הויראלי הזיהומי באמצעות שיטת Spearman–Karber על סמך דירוג ה-CPE.
      הערה: ודא שמלאי הווירוס הסופי מגיע לפחות ל-1 × 1011 PFU/mL עבור יישומים בהמשך.
    13. חלק את האדנו-וירוס המטוהר לאליקוואט (aliquots) ושמור את מלאי הווירוס ב-80°C-.
      הערה: שמור אליקוואטים של אדנו-וירוס מטוהר ב-80°C- לשימור ארוך טווח. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים כדי לשמור על זיהומיות הווירוס.

3. תרבית תאים ואופטימיזציה של תנאי ההדבקה הוויראלית

  1. יש לתחזק פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 במצע DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) המועשר ב-10% FBS וב-1% פניצילין-סטרפטומייצין.
    הערה: השתמשו בתאים שבין מעברים 3 ל-8 שהגיעו ל-70%–80% התלכדות (confluence) בבקבוק המקור כדי להבטיח מצב תאי עקבי.
  2. זריעה של פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 לתוך פלטות של 384 בארות בריכוז של 4 × 103 תאים לבאר ב- 40 µL מצע גידול מלא.
  3. דגרו את התאים ב- 37°C עם 5% CO₂ למשך 12 שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים וכניסה לשלב הצמיחה הלוגריתמי.
    הערה: כדי למזער פיזור תאים לא אחיד ואפקטי שוליים, יש להמתין עם הפלטות בטמפרטורת החדר למשך 20–30 דקות לפני הדגירה. יש למלא את הבארים החיצוניות ביותר בתמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS) סטרילית או במים סטריליים.
  4. הדביקו את התאים באדנווירוס הרקומביננטי בריבויים של זיהום (MOIs) בטווח שבין 1 ל-1,000, לצד ביקורת של תאים שאינם מזוהמים.
    הערה: חשב את נפח האדנו-וירוס הדרוש באמצעות הנוסחה הבאה:

    נוסחת העומס הוויראלי V=N×MOI/T, משוואה מתמטית למחקר ואנליזה של וירולוגיה.
    כאן, V הוא נפח מלאי האדנו-וירוס (מ"ל), N הוא מספר התאים שנזרעו בכל באר (4 × 103), MOI הוא ריבוי ההדבקה הרצוי, ו-T הוא הטיטר הנגיפי הזיהומי (PFU/mL). למלאי הנגיפי ששימש במחקר זה היה טיטר זיהומי של 1 × 1011 PFU/mL, כפי שנקבע בשיטת Spearman–Karber המתוארת בשלב 2.2.12.
  5. יש לוודא שנפח מלאי הנגיף (viral stock) שנוסף אינו עולה על 10% מהנפח הכולל של הבאר.
    הערה: נפחים מוגברים של מלאי נגיפיים עלולים לשנות את ה-pH של המצע ולגרום לציטוטוקסיות לא ספציפית.
  6. החלף את המצע המכיל את הנגיף ב- 40 µL מצע גידול מלא וטרי 24 שעות לאחר ההדבקה.
    הערה: השתמשו ב-DMEM/F12 מועשר ב-10% FBS וב-1% פניצילין-סטרפטומייצין, בהתאם לשלב 3.1.
  7. בצע החלפת מצע באמצעות מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים במהירות נמוכה, או על ידי הצמדה זהירה של קצות פיפטות רב-ערוציות לדופן העליונה של כל באר בזווית.
    הערה: יש להימנע משאיבה סטנדרטית בוואקום בעת טיפול בפלטות בעלות 384 בארות כדי למזער ניתוק תאים.
  8. הגדירו את ה-MOI האופטימלי כמינון הווירוס הנמוך ביותר המניב תוצאה נראיתה לעין והומוגנית mCherry פלואורסצנציה, תוך שמירה על מורפולוגיה של תאים ומספרי גרעינים הדומים לאלו של תאי ביקורת שאינם מזוהמים.
    הערה: יש להעריך את ביטוי הרפורטר באמצעות ספירת גרעינים שנצבעו ב-Hoechst והדמיה פלואורסצנטית. התאים צריכים לשמור על המורפולוגיה האופיינית להם בצורת כישור (spindle-shaped) ללא עיגול או ניתוק. MOIs גבוהים מדי עלולים להשרות ביטוי בסיסי mCherry הפעלה באמצעות תגובות למעכה תאית. תוצאות פלואורסצנציה מייצגות בריכוזים שונים של MOIs מוצגות ב- איור 1B.
  9. בחר את ה-MOI האופטימלי עבור כל הניסויים הבאים.
    הערה: במחקר זה, נבחר MOI של 100 עבור הניסויים הבאים.

4. הערכת יציבות המודל באמצעות גירוי TGF-β

  1. הדביקו פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 באדנווירוס רקומביננטי ב-MOI אופטימלי של 100, כפי שנקבע בשלב 3.9.
  2. בצעו הרעבת סרום לפיברובלסטים ב-DMEM/F12 המכיל 0.2% FBS למשך 12 שעות לפני הגירוי ב-TGF-β.
    הערה: הרעבת הסרום בוצעה כדי לסנכרן את התאים ולמזער את ההפעלה הבסיסית של מקדם Col1a1.
  3. הכינו תמיסת סטוק של TGF-β אנושי רקומביננטי בריכוז 100 µg/mL באמצעות 4 mM HCl המכיל 0.1% albumin של בקר (BSA).
    הערה: חלקו את תמיסת הסטוק של TGF-β לנפחים קטנים ואחסנו ב-−80°C כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
  4. טפלו בתאים במדרג ריכוזים של TGF-β בטווח של 0–40 ng/mL בשישה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות.
    הערה: תנאי ה-0 ng/mL שימש כקבוצת ביקורת לא מעוררת.
  5. דגרו את התאים המגורים ב-37°C עם 5% CO₂ למשך 24, 48 או 72 שעות. השתמשו בלוחיות מקבילות נפרדות עבור כל נקודת זמן של הדמיה כדי למזער פוטוטוקסיות מצטברת.
  6. צבעו את התאים בתמיסת Hoechst 33342 בריכוז עבודה סופי של 2.5 µg/mL למשך 15 דקות לפני ההדמיה.
    הערה: הכינו את תמיסת הצביעה על ידי דילול תמיסת הסטוק של Hoechst 33342 בריכוז 10 mg/mL ביחס של 1:4,000 ב-PBS סטרילי. בצעו את הצביעה בתנאים מוגנים מאור כדי למזער פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית).
  7. השיגו תמונות פלואורסצנציה באמצעות מערכת הדמיה בתוכן גבוה (high-content imaging system) המצוידת בעדשה יבשה 10×.
  8. צלמו חמישה שדות שאינם חופפים לכל באר בפורמט של לוח 384-באער עבור כל תנאי ניסוי.
    הערה: שמרו על הגדרות הדמיה זהות בכל קבוצות הניסוי כדי להבטיח השוائية. השתמשו במיקוד אוטומטי מבוסס לייזר ושמרו על תנאי בקרה סביבתיים ב-37°C עם 5% CO₂ במהלך הדמיה של תאים חיים.
  9. השיגו תמונות פלואורסצנציה של mCherry באמצעות עירור של 561 nm, מסנן פליטה Bandpass 600/52 (BP600/52) וזמן חשיפה של 200 ms.
  10. השיגו תמונות פלואורסצנציה של Hoechst באמצעות עירור של 405 nm, מסנן פליטה BP445/45 וזמן חשיפה של 30 ms.
    הערה: הגדירו את הגבֶר (gain) של המצלמה ל-1.0 והשיגו את כל התמונות ברזולוציה מלאה של המצלמה באמצעות binning של 1 × 1 כדי לשמור על גילוי פלואורסצנציה ליניארי ולמקסם את הרזולוציה המרחבית.
  11. נתחו את התמונות שהושגו באמצעות תוכנת ניתוח התמונות CellPathfinder.
  12. זהו גרעינים בערוץ ה-Hoechst כאובייקטים ראשוניים באמצעות קוטר גרעין ייחוס של 20 µm וטווח שטח של 20–400 µm2.
  13. הגדירו אזורי עניין (ROIs) ציטופלזמיים בערוץ ה-mCherry על ידי הרחבה מגבול הגרעין תוך שימוש בקוטר תא ייחוס של 60 µm.
    הערה: החילו מסנן "Exclude Edge" במהלך הסגמנטציה כדי להסיר תאים חלקיים הנוגעים לגבולות התמונה.
  14. חשבו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת עבור כל תא שזוהה וקבעו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת לבאר מכל חמשת השדות שצולמו.

5. תיקוף של מהימנות המודל באמצעות ELISA ותגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (Quantitative Real-Time PCR)

  1. הדביקו פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 באדנווירוס רקומביננטי ב-MOI אופטימלי של 100, כפי שמתואר בשלב 3.9.
  2. בצעו טיפול מקדים בתאים עם SB431542 למשך 30–60 דקות לפני הגירוי ב-TGF-β.
    הערה: הכינו תמיסת מלאי של SB431542 בריכוז 20 mM בתוך dimethyl sulfoxide (DMSO) ואחסנו את האליקוטיות ב-−20°C.
  3. טפלו בתאים ב-10 ng/mL TGF-β וב-SB431542 בריכוזים סופיים של 1, 5, 10 ו-15 µM. כללו קבוצת ביקורת vehicle המכילה 0.1% (v/v) DMSO ללא טיפול ב-SB431542.
    הערה: שמרו על ריכוז DMSO סופי של 0.1% (v/v) בכל קבוצות הטיפול.
  4. הכינו את תמיסת העבודה של TGF-β באמצעות שיטת דילול דו-שלבית.
    הערה: דללו את תמיסת המלאי של TGF-β בריכוז 100 µg/mL (שהוכנה ב-4 mM HCl המכיל 0.1% BSA) ביחס של 1:100 ב-PBS סטרילי לפני דילול נוסף לתוך מצע גידול מלא כדי להגיע לריכוז עבודה סופי של 10 ng/mL.
  5. דגרו את התאים המטופלים בלוחות 6-בארים למשך 24 שעות ב-37°C עם 5% CO₂.
  6. אספו 2 mL של עליית תרבית מכל באר לצורך אנליזת ELISA.
  7. סובבו את העליות שנאספו בצנטריפוגה ב-1,000 × g למשך 5 דקות ב-4°C כדי להסיר שאריות תאים.
  8. חלקו את העליות המזוככות לאליקוטיות ואחסנו אותן ב-−80°C עד לאנליזת ה-ELISA.
    הערה: ניתן לאחסן עליות מזוככות ב-−80°C לפני אנליזת ה-ELISA.
  9. שטפו בעדינות את התאים הדבקים ב-PBS קר מהקרח לאחר הסרת העליות.
  10. הוסיפו 1 mL של ריאגנט TRIzol ישירות לכל באר כדי ללייס את התאים.
    הערה: ביצעו פיפטור של הליזאט מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה לפני העברת הדגימות למבחנות מיקרוצנטריפוגה. ניתן לאחסן ליזאטים של RNA ב-−80°C לפני מיצוי ה-RNA.
  11. מצאו RNA כולל מהליזאטים לצורך אנליזת תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR).
  12. בצעו שעתוק הפוך באמצעות 1 µg של RNA כולל.
    הערה: בצעו את השעתוק ההפוך תחת תנאי התגובה הבאים: 25°C למשך 10 דקות, 42°C למשך 15 דקות, ו-85°C למשך 2 דקות.
  13. בצעו qPCR כמותי באמצעות PerfectStart Green qPCR SuperMix. הכינו כל תגובה בנפח סופי של 20 µL המכיל 5 µL של תבנית DNA משלים (cDNA).
  14. הריצו את תגובות ה-qPCR בתנאי מחזורים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-94°C למשך 30 שניות, ולאחריה 40 מחזורים של 94°C למשך 5 שניות, 60°C למשך 15 שניות, ו-72°C למשך 10 שניות.
    הערה: בצעו אנליזת עקומת התכה (melting-curve) לאחר ההגברה כדי לאשר את ספציפיות המוצר.
  15. נרמלו את ביטוי הגן Col1a1 אל מול 18S rRNA כביקורת פנימית.
    הערה: כל רצפי הפריימרים מופיעים ב-Supplementary Table 1.
  16. כמתו את רמות חלבון Collagen I המופרש בעליות המזוככות באמצעות ELISA לפי הוראות היצרן. טווח עקומת הסטנדרטים עבור בדיקת ELISA לקולגן מסוג I של עכבר הוא 0.78–50 ng/mL, עם רגישות זיהוי של 0.37 ng/mL.
  17. נתחו את כל הסטנדרטים והדגימות בכפילויות טכניות ומדדו את הצפיפות האופטית (OD) ב-450 nm באמצעות קורא מיקרופלט.
    הערה: השתמשו בעליות מזוככות ללא דילול כדי למקסם את רגישות הבדיקה לזיהוי Col1a1 מופרש.

תוצאות

סקמטית כללית של הבנייה והאריזה של ה-mCol1a1p-mCherry אדנווירוס רקומביננטי מוצג ב- איור 1Aהעכבר Col1a1 הפרומוטר שוכפל במעלה הזרם של ה- mCherry גן דורש (reporter gene) ושולב לתוך וקטור אדנו-וירוס, ולאחר מכן בוצעו אריזה וירוסית והגברה בתאי HEK293. תזרים העבודה ממחיש שלבים ניסיוניים מרכזיים, הכוללים הדבקה וירוסית, גרייה פיברוטית, התערבות פרמקולוגית וקריאת אות המבוססת על פלואורסצנציה. סכמה זו מספקת מסגרת חזותית ליישום מערכת הדיווח ותומכת בפירוש ניסויי תיקוף התפקוד העוקבים.

כדי לקבוע את התנאים האופטימליים להדבקה נגיפית, פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 הודבקו באדנו-וירוס mCol1a1p-mCherry בטווח של MOIs שונים. כפי שמוצג ב-איור 1B, עוצמת הפלואורסצנציה של mCherry עלתה עם העלייה ב-MOI. ב-MOIs נמוכים, ביטוי הרפורטר היה חלש והטרוגני, מה שייצג תנאי תת-אופטימלי לאנליזה כמותית. ב-MOIs גבוהים, התאים הראו מורפולוגיה משתנה, כולל עיגול והתנתקות, המעידים על השפעות ציטוטוקסיות. MOI של 100 הניב פלואורסצנציה חזקה והומוגנית תוך שמירה על מורפולוגיית התאים, ולכן נבחר כתנאי האופטימלי לניסויים הבאים.

ב-MOI האופטימלי, פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 עוברו גירוי בריכוזים עולים של TGF-β. פלואורסצנציית הדיווח נמדדה בנקודות זמן של 24, 48 ו-72 שעות לאחר הגירוי. כפי שמוצג ב-איור 2A–C, עוצמת הפלואורסצנציה של mCherry עלתה באופן תלוי ריכוז בכל נקודות הזמן. עוצמת האות עלתה בהדרגה בין 24 ל-72 שעות, מה שמעיד על תגובה תלוית זמן. תוצאות אלה מייצגות תוצאה חיובית, המצביעה על כך שמערכת הדיווח מגיבה באופן לונגיטודי וניתן לשחזור לגירוי פיברוטי.

תמונות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראות את השפעות TGF-β על עוצמת ה-mCherry של התאים, בתוספת תוצאות בגרף עמודות.
איור 2הפעלה תלויית-זמן ותלויית-מינון של ה-mCol1a1p-mCherry מדווח באמצעות גירוי של גורם גדילה טרנספורמטיבי בטא (TGF-β). פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 שהודבקו ב-Ad-mCol1a1p-mCherry עוררו עם ריכוזים עולים של TGF-β את האדנו-וירוס ב-MOI המיטבי. תמונות פלואורסצנציה מייצגות וניתוחים כמותיים תואמים של mCherry פעילות הרפורטר מוצגת לאחר 24 שעות (A), 48 שעות (B), ו-72 שעות (C) לאחר גירוי. mCherry פלורסצנציה (אדומה) משקפת Col1a1 פעילות פרומוטור, וגרעיני התאים נצבעו בצביעה נגדית באמצעות Hoechst 33342 (כחול). עוצמת הפלואורסצנציה נקבת באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה (high-content imaging) ונורמלה למספר הגרעינים. הנתונים מוצגים כממוצע ± טעות תקנית של הממוצע (SEM) משישה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות לכל תנאי. השוואות סטטיסטיות בוצעו ביחס לקבוצת הביקורת שלא טופלה, באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. פרמטרי ההדמיה נשמרו קבועים בכל התנאים הניסויים. סרגי קנה מידה = 200 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להעריך את ספציפיות המסלול, פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 טופלו במעכב של קולטן TGF‑β מסוג I (ALK5), SB431542, תחת גרייה של TGF-β. כפי שמוצג ב-איור 3A–C, SB431542 הפחית את עוצמת הפלואורסצנציה של mCherry באופן תלוי מינון. עיכוב של פעילות הדגיש (reporter) נצפה בכל נקודות הזמן שנבדקו, כאשר נצפתה דיכוי רבה יותר בריכוזי מעכב גבוהים יותר. תוצאות אלו מייצגות תוצאה חיובית, המצביעה על כך שהפעלת הדגיש תלויה באותות של TGF-β וניתנת לוויסות פרמקולוגי.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, mCherry, Hoechst, בדיקת TGF-β+SB43 למשך 24-72 שעות, ניתוח עוצמה, גרפים.
איור 3SB431542 מעכב את ההפעלה של m המושרה על ידי TGF-βCol1a1p-mCherry את השגריר באופן התלוי בזמן ובמינון. פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 שהודבקו ב-Ad-mCol1a1p-mCherry אדנו-וירוסים עוררו באמצעות TGF-β (10 ng/mL) בנוכחות ריכוזים עולים של SB431542, מעכב של הקולטן מסוג I של גורם הצמיחה המעבד בטא (ALK5) (0, 1, 5, 10, ו- 15 µM; מסומן בקיצור כ-SB43 בלוחות האיור). תמונות פלואורסצנציה מייצגות וניתוחים כמותיים תואמים מוצגים בנקודת זמן של 24 שעות (A), 48 שעות (B), ו-72 שעות (C) לאחר טיפול. mCherry פלוורסצנציה (אדומה) משקפת Col1a1 פעילות פרומוטר, והגרעינים נצבעו בצביעה נגדית ב-Hoechst 33342 (כחול). עוצמת הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות דימיון בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ונורמלה למספר הגרעינים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM משש חזרות ביולוגיות עצמאיות לכל תנאי. השוואות סטטיסטיות בוצעו ביחס לקבוצה שטופלה ב-TGF-β באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. פרמטרי הדימיון נשמרו קבועים בכל התנאים הניסויים. סרגל קנה מידה = 200 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להעריך האם פעילות הרפורטר משקפת תגובות פיברוטיות אנדוגניות, נותחו פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 תחת תנאי הדבקה, סטימולציה ועכבה אופטימליים. זרימת העבודה הניסויית ששימשה לתיקוף מערכת הרפורטר מסוכמת באיור 4A. סממנים הקשורים לפיברוזיס נמדדו ברמות החלבון וה-mRNA. כפי שמוצג באיור 4B–C, בדיקת ELISA הדגימה הפרשה מוגברת של חלבונים הקשורים לפיברוזיס בעקבות סטימולציה של TGF-β, אשר פחתה לאחר טיפול ב-SB431542. באופן עקבי, RT-qPCR הראה שינויים תואמים בביטוי של גנים הקשורים לפיברוזיס, כולל Col1a1. ההתאמה בין קריאת הפלואורסצנציה, הפרשת החלבונים וביטוי הגנים מהווה תוצאת תיקוף חיובית, המעידה על כך שמערכת הרפורטר משקפת הפעלה פיברוטית תחת תנאים אלו.

תהליך עבודה ניסיוני לתיקוף המודל. ELISA, אנליזת RT-qPCR של mRNA של Col1a1, הפרשת קולגן.
איור 4תיקוף ה-mCol1a1p-mCherry מערכת דגמי (reporter system) באמצעות תגבּור שרשרת פולימראז כמותי עם שעתוק הפוך (RT-qPCR) ומסיי (ELISA). (A) סכמה כללית של זרימת העבודה הניסוית לתיקוף מערכת השגריר (reporter-system). פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 עוררו באמצעות TGF-β (בריכוז של 10 ng/mL) וטופלו בריכוזים עולים של מעכב קולטני TGF-β, SB431542 (SB43). ליזאטים של תאים ונוזלי על של תרבית נאספו לצורך אנליזות המשך. (Bניתוח כמותי של Col1a1 ביטוי mRNA (RNA שליח) שנקבע באמצעות RT-qPCR תחת גרייה של TGF-β לאורך מדרג ריכוזים של SB431542. יחסי Col1a1 רמות ביטוי ה-mRNA נורמלו לפי RNA ריבוזומלי 18S‏ (18S rRNA) ובוטאו כשינוי הפי (fold change) ביחס לקבוצת הביקורת שלא טופלה.C) כימות רמות קולגן מסוג I מופרש בתעלילי תרבית תאים באמצעות ELISA, תחת אותם תנאים ניסיוניים כפי שמוצג בפאנל B. ריכוזי קולגן מסוג I מבוטאים ב-ng/mL. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM משש חזרות ביולוגיות עצמאיות לכל תנאי. השוואות סטטיסטיות בוצעו ביחס לקבוצה שטופלה ב-TGF-β באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני, ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ נלווה 1. רצף הנוקלאוטידים המלא של מקטע הפרומוטר של Col1a1 בעכבר ששימש לבניית וקטור הדגימה האדנו-ויראלי. אזור הפרומוטר באורך 2354 bp תואם לקואורדינטות גנומיות chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) ומתחבל בין −2271 ל-+83 bp ביחס ל-TSS. מקטע הפרומוטר שובש במעלה הזרם של הגן המדווח mCherry בווקטור המעבורת pDC315 ליצירת מערכת הדגימה האדנו-ויראלית הרקומביננטית.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית S1. רצפי פריימרים ששימשו לניתוח RT-qPCR. רצפי הפריימרים הקדמיים (Forward) וההפוכים (Reverse) עבור Col1a1 והגן הפנימי למשאלת ייחוס 18S rRNA רשומים בכיוון 5′–3′.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S1. מפת הפלסמיד של וקטור המעבר האדנו-ויראלי pDC315-mCol1a1p-mCherry. מקטע מקדם Col1a1 של עכבר באורך 2354 bp הוכנס במעלה הזרם של הגן המדווח mCherry באמצעות אסטרטגיית שיבוט חלקה (seamless cloning) מבוססת רקומבינציה הומולוגית, לצורך יצירת מבנה הדווח האדנו-ויראלי הרקומביננטי.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

פיברוזיס לבבי תורם להתקדמות של אי-ספיקת לב, ופיתוחן של תרפיה אנטי-פיברוטית יעילה מוגבל עקב המחסור בפלטפורמות סריקה ארוכות טווח2,13. שיטות קונבנציונליות להערכת יעילות אנטי-פיברוטית, כולל Western blotting, RT-qPCR וצביעה אימונופלואורסצנטית, מסתמכות על מדידות של נקודת סיום הדורשות ליזיס או קיבוע של התאים. גישות אלו מונעות ניטור בזמן אמת של התקדמות הפיברוזיס בתאים חיים ומגבילות את יישומיותן לניתוחים ארוכי טווח ובסריקה רחבה (high-throughput). בנוסף, יצירת קווי תאי רפורטר יציבים באמצעות טרנספקציית פלסמידים או אינטגרציה לנטיויראלית מוגבלת לעיתים קרובות בשל יעילות טרנספקציה נמוכה בפיברובלסטים, שונות הקשורה לאינטגרציה גנומית אקראית, והשתקה הדרגתית של ביטוי הרפורטר לאורך מעברים רצופים15.

בעוד שוקטורים לנטיביריאליים משמשים לעיתים קרובות להחדרת גנים בפיברובלסטים מסוג NIH/3T3, במחקר שלנו השתמשנו במערכת דוחות אדנוביריאלית כדי לשמר את הנאמנות הפיזיולוגית של הפיברובלסטים. לנטיבירוסים משתלבים באופן קבוע בגנום המארח, דבר הכרוך בסיכון מולדה למוטגנזה של השתלה שעלולה לשבש בטעות רשתות איתות אנדוגניות – חשש קריטי בעת הערכת קסקדות מורכבות כמו פיברוגנזה המושרה על ידי TGF-β. לעומת זאת, וקטורים אדנוביריאליים נשארים אפיסומליים, ובכך מבטיחים את שלמות הגנום. יתרה מכך, מעקיף של תהליך הברירה האנטיביוטית הממושך הנדרש לקווי תאים לנטיביריאליים יציבים מונע שינויים פנוטיפיים מושריים מהטיפול, ומאפשר ביטוי זמני מהיר, חסון ויעיל מאוד המתאים לסריקה בthroughput גבוה.

כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה, מערכת דוחה (reporter) אדנו-ויראלית של mCherry המונחית על ידי פרומוטר mCol1a1 מספקת שיטה לניטור הפעלת פיברובלסטים in vitro. המערכת משלבת הובלה אדנו-ויראלית עם הפרומוטר Col1a1 של עכבר, המהווה סמן שעתוק הקשור להפעלת פיברובלסטים ולהשקעת ECM16. קישור של פעילות פרומוטר Col1a1 לדוחה פלואורסצנטית מאפשר ויזואליזציה וכימות של תגובות שעתוק פיברוטיות בתאים חיים. הפלואורסצנציה של הדוחה עולה בעקבות גירוי ב-TGF-β בנקודות זמן מרובות, מה שמשקף את ההתקדמות האורכית של הפעלת הפיברובלסטים. עיכוב של פעילות הדוחה על ידי מעכב ALK5, SB431542, מעיד על בקרה תלוית-מסלול. ההתאמה בין הפלואורסצנציה של הדוחה לבין ביטוי גנים וחלבונים אנדוגניים הקשורים לפיברוזיס, כפי שנמדד על ידי RT-qPCR ו-ELISA, תומכת בשימוש בשיטה זו לניטור תגובות פיברוטיות בתנאים אלו.

מחקרים אחרונים השתמשו בתאי לב המופקים מ-iPSC בשילוב עם הפרעה גנטית מבוססת CRISPR-Cas9 לצורך סריקת תרופות וגילוי מטרות טיפוליות11,13. לדוגמה, פיברובלסטים של הלב המופקים מ-iPSC עם רפורטר פלואורסצנטי שעבר הנדסה באמצעות CRISPR יושמו בגישות של סריקת תרכובות בקנה מידה רחב11,17. למרות ששיטות אלו מספקות דיוק גנטי גבוה, הן כרוכות בלוחות זמנים ממושכים של דיפרנציאציה, מורכבות טכנית, שונות בין סדרות (batch-to-batch variability) ועלות ניסויית מוגברת13,18. להשוואה, פלטפורמת הרפורטר האדנו-ויראלית המתוארת כאן מאפשרת יישום מהיר יותר ללא עריכה גנומית או דיפרנציאציה ממושכת של תאים. גישות אלו עשויות לשמש באופן משלים, כאשר מערכת הרפורטר mCol1a1p-mCherry תשמש ככלי סריקה ראשוני, ומודלים מבוססי iPSC ייושמו לצורך תיקוף (validation) עוקב11.

מערכת הדיווח mCol1a1p-mCherry המתוארת כאן מספקת שיטה לסריקת תרכובות מועמדות, כולל מודולטורים מטבוליים ומוצרים טבעיים, במודל מבוסס פיברובלסטים. כדי להבטיח את השחזור של פרוטוקול זה, יש להקדיש תשומת לב למספר שלבים קריטיים ולשיקולי פתרון בעיות. ראשית, טוהר התחליל האדנו-ויראלי הוא חיוני. שימוש בליסאטים ויראליים לא מטוהרים עלול להחדיר שרירי תאי מאכסן ומרכיבים ציטוטוקסיים, מה שיוביל להשפעות לא ספציפיות בפיברובלסטים מסוג NIH/3T3 ויטשטש את קריאת הדיווח. יתרה מכך, כדי להבטיח שחזור קפדני ועקביות בין סדרות עבור יישומי סריקה המשכיים, כל התחליל הויראלי עבר טיהור סטנדרטי וכומת במדויק באמצעות בדיקת דילול סופית. על ידי החלת ריבוי זיהום (MOI) מוגדר במדויק, המבוסס על טיטרים ויראליים פונקציונליים (PFU/mL) ולא על כמויות נפחית, הצלחנו לנטרל שונות בין סדרות, ובכך להגדיר סטנדרט לתגובת הדיווח בכל ההרצות הניסיוניות העצמאיות. שנית, במהלך אופטימיזציה של MOI זה, חשוב לוודא שנפח התמצית הויראלית לא יעלה על 10% מנפח התרבית הכולל. עודף של באפר ויראלי עלול לשנות את ה-pH והאוסמולריות של מצע התרבית, מה שעלול להשריץ תגובות מאמץ תאיות ללא קשר לגירוי של TGF-β.

בנוסף, טיפול בפלטות בעלות 384 בארות לצורך דימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) מציב אתגרים טכניים. פיברובלסטים מסוג NIH/3T3 נוטים להתנתק במהלך שלבי החלפת המצע והשטיפה. טיפול עדין בנוזלים, כגון שימוש במערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים עם מהירויות חלוקה נמוכות או הצמדת קצות הפ pipette לדפנות הבארות, עשוי להפחית את אובדן התאים. כדי למזער את ההפעלה הבסיסית של מקדם Col1a1 ולשפר את יחס האות לרעש, ניתן להשתמש בהרעבת סרום למשך 12–24 h לפני גירוי ב-TGF-β. במהלך דימות רציף של תאים חיים בנקודות זמן מרובות (למשל 24, 48 ו-72 h), יש למזער את הפוטוטוקסיות המצטברת ואת השפעות קישור ה-DNA הנובעות מצביעת Hoechst חוזרת, וזאת על ידי אופטימיזציה של תנאי החשיפה או שימוש בפלטות ניסוי מקבילות עבור כל נקודת זמן19.

יש להביא בחשבון מספר מגבלות של שיטה זו. ראשית, המערכת מבוססת על קו תאים של פיברובלסטים מומימליים ואינה מייצגת באופן מלא את ההטרוגניות התאית של פיברובלסטים לבביים in vivo. שנית, הרפורטר משקף אקטיבציה תעתוקית של Col1a1 ואינו לוכד רגולציה פוסט-תעתוקית או הבשלה של המטריצה החוץ-תאית. התאמות עתידיות עשויות לכלול שימוש בפיברובלסטים לבביים ראשוניים, מערכות של תרבית משותפת (co-culture) או מודלים תלת-ממדיים כדי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מערכת רפורטר אדנו-ויראלית המונעת על ידי מקדם של Col1a1 לניטור אקטיבציה של פיברובלסטים. השיטה משלבת הובלה ויראלית, מודולציה פרמקולוגית ובדיקות מולקולריות משלימות כדי לאפשר ניתוח אורך (longitudinal) ולא הורס בתאים חיים. גישה זו עשויה להיות מיושמת לסריקת תרכובות ולמחקר של תהליכי איתות פיברוטיים תחת תנאי in vitro מבוקרים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (32371158 עבור H.X.), National Key R&תוכנית #38;D (מספר 2023YFA1800902 ל-H.X.), "Tianchi Talent" תוכנית, פרויקט פתוח של המעבדה המרכזית הלאומית להומוסטזיס ועיצוב מחדש של כלי דם (אוניברסיטת בקינג) (202404 עבור R.Z; 202403 עבור Y.M.W.), פרויקט פתוח של המעבדה המרכזית למחלות אנדמיות ואתניות בשינג'יאנג, משרד החינוך (אוניברסיטת בקינג) (KF202404 עבור H.X.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרו-פלטה בעלת תחתית זכוכית ו-384 בארותCellvis, ארה"בP384-1.5H-Nפלטה בעלת 384 בארות עם תחתית זכוכית, המשמשת לזריעת תאים, הדבקה נגיפית, צביעה ודימוי פלואורסצנטי.
פלסמיד שלד אדנו-ויראליMicrobix, קנדהpBHGloxΔE1,3Creפלסמיד המשמש ליצירת הגנום האדנו-ויראלי הרקומביננטי באורכו המלא.
וקטור מעבורת אדנו-ויראלי: pDC315-mCol1a1p-mCherryGeneChem, סיןשירות מותאם אישיתוקטור מעבור (shuttle vector) אדנו-ויראלי רקומביננטי המכיל את מקדם Col1a1 של עכבר באורך 2354 bp המניע ביטוי של mCherry.
נוקלאז BenzonaseMerck Millipore, USA70664-3אנדונוקלאז המשמש במהלך טיהור אדנו-וירוסים להסרה של חומצות גרעין מזוהמות.
קבינה לבטיחות ביולוגית (Class II)Esco Lifesciences Group, סינגפורAC2-4S1מטריאת בטיחות ביולוגית מאושרת המשמשת לטיפול באדנו-וירוסים רקומביננטיים ולפרוצדורות של תרביות תאים סטריליות.
מצע לתרבית תאים (DMEM/F12 מלא)HyClone, USA12800-017מצע גידול מלא המשמש לתחזוקת תאי NIH/3T3 ו-HEK293.
תוכנה לניתוח תמונות CellPathfinderYokogawa Electric Corporation, יפןגרסה 3.08.01תוכנה לניתוח תמונות המשמשת לכימות פלואורסצנציה אוטומטי ולסגמנטציה של תאים.
מערכת לסריקה בעלת תוכן גבוה CellVoyager CV8000Yokogawa Electric Corporation, יפןCV8000מערכת דימוי בעלת תוכן גבוה (High-content imaging system) המשמשת לרכישת פלואורסצנציה של mCherry ו-Hoechst.
פחמן חד-חמצאי2 אינקובטור לתרביות תאיםThermo Fisher Scientific, USA3111אינקובטור עם לחות נשמרת בטמפרטורה של 37 מעלות °C עם 5% CO2 לתרבית תאי יונקים.
דימטיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-Aldrich, USAD2650הממס המשמש להכנת SB431542.
דולבקו’מצע איגל משופר/תערובת חומרי תזונה F-12 (DMEM/F-12)Servicebio, סיןG4610מצע תרבית בסיסי המשמש עבור פיברובלסטים מסוג NIH/3T3.
סרום עוברי של בקר (FBS)אוזביאן, אוסטרליהVS500Tתוסף סרום המשמש בריכוז של 10% (נפח/נפח) להכנת מצע גידול מלא.
צבע פלואורסצנטי Hoechst 33342Invitrogen, USAH3570צבע גרעין המשמש לדימות פלואורסצנטי ולנורמליזציה של ספירת גרעינים.
תאי HEK293ATCC, ארה"בCRL-1573קו תאים לאריזה המשמש להפקה והגברה של אדנו-וירוס.
TGF- רקומביננטי אנושיβ1MedChemExpress, סיןHY-P78214ציטוקין המשמש להשראה של הפעלה פיברוטית בפיברובלסטים מסוג NIH/3T3.
תוכנה לרכישת תמונותYokogawa Electric Corporation, יפןגרסה 3.08.01.03תוכנה המשמשת לרכישה אוטומטית של תמונות פלואורסצנציה ולשליטה במיקרוסקופ.
סוכן טרנספקציה מבוסס ליפידיםInvitrogen, USA11668-019ס reagent לטרנספקציה המשמש להחדרה של פלסמיד אדנו-ויראלי לתאי HEK293.
מבחנות מיקרו-צנטריפוגהAxygen, USAMCT-150-Cמבחנות המשמשות לאחסון ליסאט RNA ולעיבוד דגימות.
קורא מיקרו-פלטותTecan, שווייץניצוץקורא פלטות מיקרו רב-מצבים (Multimode microplate reader) המשמש למדידות בליעה ב-ELISA.
ערכה לבדיקת ELISA של קולגן מסוג I בעכבריםMeike Biotechnology, סיןMK6778Aערכת ELISA המשמשת לכימות קולגן מסוג I מופרס בתוספי תרבית.
פיברובלסטים של עכבר מסוג NIH/3T3Procell Life Science, סיןCL-0171קו תאי פיברובלסטים של עכבר ששימש להקמה ותיקוף של מודל רפורטר.
אנזים הגבלה PacINew England Biolabs, USAR0547Sאנזים הגבלה המשמש לליניאריזציה של פלסמיד אדנו-ויראלי.
פניצילין–תמיסת סטרהפטומייציןGibco, ארה"ב15140-122תמיסת אנטיביוטיקה בתוספת של 1% (נפח/נפח) למניעת זיהום בקטריאלי.
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen Biotech, סיןAQ602תערובת מאסטר (master mix) ל-qPCR מבוססת SYBR Green המשמשת לניתוח PCR כמותי.
סריפוסאלט מאוזן פוספט (PBS)Servicebio, סיןG4202בופר המשמש לשטיפת תאים ולהכנת ריאגנטים.
וקטור מעבורה (Shuttle Vector) pDC315-EGFPGeneChem, סיןלא רלוונטיוקטור מעבורת אדנו-ויראלי הורה ששימש לבניית פלסמיד דגלים.
מערכת qPCRApplied Biosystems, USAQuantStudio 5מערכת PCR בזמן אמת המשמשת לניתוח כמותי של ביטוי גנים.
אנזימי הגבלה (BamHI ו-KpnI)Abclonal, סיןRK21101, RK21104אנזימי הגבלה המשמשים ללינאריזציה של וקטור מעבורה (shuttle-vector).
ערכת שכתוב הפוךTransGen Biotech, סיןAT311ערכה לשעתוק הפוך המשמשת לסינתזת cDNA לפני RT-qPCR.
ריאגנט לליזיס של RNAInvitrogen, USA15596026ריאגנט המשמש להפקה של RNA כולל מתאי תרבית.
SB431542MedChemExpress, סין301836-41-9TGF-β מעכב קולטן מסוג I המשמש לניסויי עיכוב פרמקולוגיים.
שירות ריצוף סנגר/ריאגנטיםShanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., סיןשירות מותאם אישיתשירות רצף/ריאגנטים ששימשו לאימות רצף הפלסמיד.
פיפטות סרולוגיותCorning, ארה"ב4488פיפטות סטריליות המשמשות לטיפול בנוזלים במהלך הליכי תרבית תאים.
מעגל תרמי T30LongGene Scientific Instruments, סיןT30מעגל תרמי (Thermal cycler) המשמש לשעתוק הפוך ולהגברה באמצעות PCR.
תמיסת Trypsin-EDTAGibco, ארה"ב25200-056ריאגנט לפירוק תאים המשמש להעברה שגרתית של תאים.
ערכה לניקוי נגיפיםTakara Bio USA631533ערכה המשמשת לניקוי אדנו-וירוס רקומביננטי.
מקלחת מיםShanghai Yiheng Scientific Instruments, סיןHWS-12אמבט מים בבקרה תרמית המשמש במהלך הקפאת אדנו-וירוסים–מחזורי הפשרה.

מקורות

  1. Frangogiannis NG. Cardiac fibrosis. Cardiovasc Res. 2021;117(6):1450–1488.
  2. Ghazal R, et al. Cardiac fibrosis in the multi-omics era: implications for heart failure. Circ Res. 2025;136(7):773–802.
  3. Kurose H. Cardiac fibrosis and fibroblasts. Cells. 2021;10(7):1716.
  4. Heidenreich PA, et al. 2022 AHA/ACC/HFSA guideline for the management of heart failure. J Am Coll Cardiol. 2022;79(17):e263–e421.
  5. Fang L, et al. A clinical perspective of anti-fibrotic therapies for cardiovascular disease. Front Pharmacol. 2017;8:186.
  6. Khalid A, et al. Breaking new ground in heart failure management: novel therapies and future frontiers. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1643971.
  7. González A, et al. New targets to treat the structural remodeling of the myocardium. J Am Coll Cardiol. 2011;58(18):1833–1843.
  8. Tuleta I, et al. Fibroblast-specific TGF-β signaling mediates cardiac dysfunction, fibrosis, and hypertrophy in obese diabetic mice. Cardiovasc Res. 2024;120(16):2047–2063.
  9. Li C, et al. Mechanism of action of non-coding RNAs and traditional Chinese medicine in myocardial fibrosis: focus on the TGF-β/Smad signaling pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1092148.
  10. Vistnes M. Hitting the target: challenges and opportunities for TGF-β inhibition for the treatment of cardiac fibrosis. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(3):267.
  11. Cardona-Timoner M, et al. Dressed in collagen: 2D and 3D cardiac fibrosis models. Int J Mol Sci. 2025;26(7):3038.
  12. Garvin AM, et al. Primary cardiac fibroblast cell culture: methodological considerations for physiologically relevant conditions. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2023;325(4):H869–H881.
  13. Zhang H, et al. Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target. Cell. 2024;187(25):7143–7163.e22.
  14. Bollong MJ, et al. Small molecule-mediated inhibition of myofibroblast transdifferentiation for the treatment of fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(18):4679–4684.
  15. Stepanenko AA, et al. Transient and stable vector transfection: pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutat Res Rev Mutat Res. 2017;773:91–103.
  16. Tallquist MD. Cardiac fibroblast diversity. Annu Rev Physiol. 2020;82:63–78.
  17. Hofbauer P, et al. Modeling acute myocardial infarction and cardiac fibrosis using human induced pluripotent stem cell-derived multicellular heart organoids. Nat Commun. 2024;15:308.
  18. Li Q, et al. Human iPSC-based modeling of central nervous system disorders for drug discovery. Int J Mol Sci. 2021;22(3):1203.
  19. Icha J, et al. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 2017;39(8):1700003.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TGF BetamCherryHigh Throughput ScreeningRT PCR
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.