הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תגובת שרשרת היברידיזציה FISH באונה האופטית המתפתחת של דרוזופילה

243 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71681

⸱

17 ביולי 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים לביצוע היברידיזציה פלואורסצנטית במיקום (HCR-FISH) באונות האופטיות של זחל Drosophila melanogaster . הנהלים לתכנון גשושים, היברידיזציה, הגברה והרכבת רקמות מפורטים כדי להקל על המחשה של האונה האופטית המתפתחת.

תקציר

הבנת ההתפתחות העצבית דורשת אפיון מדויק של מתי והיכן גנים מתבטאים בדיוק. טכניקות כמו היברידיזציה במקום מאפשרות זמן רב המחשה של ביטוי גנים ברקמות מתפתחות. למרות שהיברידיזציה במקום נפוצה בעוברי Drosophila melanogaster , יישומה בפיתוח מערכות ראייה מוגבל בשל מספר אתגרים טכניים. לדוגמה, גשושים ארוכים לעיתים קרובות חודרים בצורה לקויה לאונה האופטית, ופרוטוקולים התלויים בדיווחים קטליטיים מפיזים, כמו פרוקסידאז חזרת, לעיתים מניבים יחס אות לרעש נמוך בהכנות שלמותמות. היברידיזציה פלואורסצנטית במיקום (HCR-FISH) מתגברת על רבות מהמגבלות הללו ומאפשרת זיהוי אותות עמיד יותר. כמו ב-FISH קונבנציונליים, מונומרים של גלאי DNA מתפרצים לרצפי RNA בתוך הרקמות. ב-HCR-FISH, לעומת זאת, גלאי מגבר מצומדים פלואורסצנטיים יוצרים מבנים יציבים עם סיכת שיער שמפעילים פולימריזציה של מונומרים נוספים, ובכך מגבירים את עוצמת האות. השימוש במערכות גלאי מרובות מאפשר גם שימוש באוליגונוקלאוטידים קצרים יותר (~45 נאטון, לעומת עד 1,000 NT בדגימות FISH קונבנציונליות), משפר את חדירת הפרוב ויוצר צביעה אחידה יותר בדגימות שלמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול HCR-FISH המותאם לאונה האופטית של זחל הדרוזופילה . הפרוטוקול מתאים גישות קיימות ל-HCR-FISH על ידי אופטימיזציה של תנאי קיבוע והגדלת ריכוזי הגלאי והסיכות הראש לשיפור עוצמת האות וחדירת הרקמות. מסופקות רשימות מגיבים ונהלים שלבים. יישומים פוטנציאליים בנוירוביולוגיה התפתחותית מוצגים גם כן, כולל הדמיית נוירונים שזה עתה נולדו, ואפיון דפוסי ביטוי גנים במקרים שבהם שיטות קונבנציונליות, כגון חלבונים מסומנים אנדוגנית או צביעת נוגדנים, אינן מספקות מידע מספק.

מבוא

הבנת האופן שבו המוח מורכב דורשת זיהוי הן את מגוון סוגי התאים הקיימים והן את הרפרטואר הגנטי המובע בתוך כל סוג תא1. התקדמות אחרונה בריצוף RNA חד-תאי אפשרה לחוקרים להתמודד עם שאלות אלו ברזולוציהגבוהה 2. עם זאת, גישות רבות של תא יחיד אינן שומרות על מידע מרחבי, ודורשות ניסויים נוספים למיפוי אשכולות מסוג תאים שעתוק למיקומם במוח המתפתח.

מערכות ביטוי גנים בינאריות כמו GAL4-UAS יכולות לספק מידע מיקום אך אינן כמותיות3. בנוסף, עיכובים בין ביטוי גנים לזיהוי מדווח עלולים לטשטש דפוסי ביטוי פיזיולוגיים רלוונטיים בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים. צביעת חיסון היא גישה נפוצה נוספת לקביעת דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמה4. עם זאת, חלבונים המופרשים לעיתים קרובות מפוזרים וקשים למיקום מדויק.

גישות סימון נוקלאוטידים, כגון היברידיזציה במקום (ISH), שימשו גם הן באופן נרחב לקבלת מידע מרחבי על ביטוי גנים5. ב-ISH, אוליגונוקלאוטידים מסומנים ב-DNA נקשרים לרצפי RNA משלימים הפוכים המעניינים. שיטות ISH מוקדמות השתמשו בגלאי DNA מסומניםרדיו 6, בעוד שפרוטוקולים מאוחרים יותר כללו תוויות בטוחות יותר כמו דיגוקסיגנין, פלואורסאין ורודמין 7,8,9. מדענים התאימו במהירות את ISH לשימוש ב-Drosophila melanogaster, שם הוא יושם לאפיון ארגון כרומוזומי הפוליטן ולמיפוי דפוסי ביטוי של גנים עם פער כמו גיבן בעוברים שלמים10,11.

למרות השימושיות הנרחבת שלו, מספר מגבלות טכניות הקשו על אימוץ ISH בתכשירים עבים יותר עם הרכבה שלמה, כמו האונה האופטית של הזחל. פרוטוקולים רבים בשטח הסתמכו על מדווחים קטליטיים מפיזים, כגון פרוקסידאז חזרת, שלעיתים קרובות הוביל ליחסי אות לרעש נמוכים12. בנוסף, גישות רבות השתמשו בגשושים ארוכים שכוונו לרצפים בודדים לשיפור הספציפיות. למרות שהן יעילות בעוברי דרוזופילה וכרומוזומים פוליטניים, גשושיות ארוכות חודרות בצורה לקויה למוח הזחל ולעיתים מייצרות סימון לא אחיד 10,11,13.

פיתוח ISH פלואורסצנטי חד-מולקולי (smFISH) והיברידיזציה של תגובת שרשרת היברידיזציה בהיברידיזציה במיקום (HCR-FISH) פתרורבות מהמגבלות הללו. באמצעות מערכות של גשושים קצרים המסודרים על פני אזור גן יחיד, smFISH מפחית את אורך הגשוש הממוצע מכ-1,000 NT לכ-40 NT16. זה משפר משמעותית את חדירת הגשוש תוך שמירה על עוצמת אות חזקה. HCR-FISH משפר עוד יותר את יחסי האות לרעש באמצעות גשושי מגבר פלואורסצנטיים שמגדילים את דיוק המיקום ומגבירים את פלט האות. חשוב לציין ששלב ההגברה הזה נראה כמתרחב באופן ליניארי עם ריכוז התמלול, ומאפשר מדידה כמותית של רמות ביטוי גנים17.

HCR-FISH מתחיל עם גשושי יוזם המשלימים את רצף היעד. אוליגונוקלאוטידים לא מסומנים ב-DNA מכילים רצף יוזם חד-גדילי שנקשר לתחום הקלט של גלאי מגבר H1 המסומן פלואורסצנטית. מגברי H1 מאמצים מבנה חד ששומר על חוסר פעילות קטליטית עד להיקשר לרצף היוזמים. בעת הקישור, מגבר H1 נפתח וחושף רצף שמתחבר לגלאי שותף, H2. אינטראקציה זו פותחת את סיכת השיער H2, ומאפשרת לו לקשור גלאי H1 נוסף (איור 1)15. מחזורים חוזרים של קישור H1/H2 יוצרים פולימר יציב שמגביר את אות הפלואורסצנציה תוך הפחתת רעש רקע. מכיוון שכל רצף יוזם ייחודי לזוג H1/H2 מתאים, ניתן להשתמש במספר גשושים עם רצפי יוזמים ופלואורופורים שונים בו-זמנית כדי לסימון מספר גנים באותו דגימה.

figure-introduction-1
איור 1: ייצוג גרפי של זרימת העבודה של HCR-FISH. גשושי DNA המכילים רצפי יוזמים מתפרצים לתמלול RNA מטרה. סיכות השיער של מגברי DNA המתויגות פלואורסצנטי נקשרות לרצף היוזם ועוברות פולימריזציה רציפה ליצירת שרשראות הגברה דו-גדיליות יציבות. הצמדת פלואורופור ישירה משפרת את הגברת האות ואת יחס האות לרעש. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

שיפורים אחרונים ב-HCR-FISH הגדילו עוד יותר את השימושיות שלו. עיצוב פרוב Split Initiative משפר את הספציפיות של המגבר, ונוגדנים משניים המצורפים למפעילי HCR מאפשרים אימונוהיסטוכימיה ו-HCR-FISH18 בו-זמנית. בנוסף, אפשרויות פלואורופור מורחבות מאפשרות כיום דימות מרובה של עד 10 גנים בו-זמנית19,20.

למרות שניסויי הוכחת היתכנות ראשוניים ל-HCR-FISH בוצעו בדגי זברה (Danio rerio), השיטה זכתה לשימוש נרחב במערכות רבות, במיוחד באורגניזמים שאינם מודלים שבהם נוגדנים יקרים אואינם זמינים. סינתזת גלאי מציעה גם חלופה מהירה יותר ליצירת נוגדנים, שיכולה לדרוש חודשים של פיתוח. כתוצאה מכך, HCR-FISH מספקת גישה מהירה לאימות גנים מועמדים שזוהו באמצעות מערכי נתוני ריצוף RNA חד-תאי21. אפילו באורגניזמים גנטיים מבוססים, HCR-FISH מספק שיטה חשובה למיפוי מרחבי של נוירונים שזה עתה נולדו כאשר מדווחי GAL4 או אימונוהיסטוכימיה אינם מצליחים לתייג כראוי אוכלוסיות תאים ספציפיות.

מאמר זה מתאר פרוטוקול HCR-FISH המותאם לאונה האופטית של זחל השלב השלישי Drosophila. הפרוטוקול מתאים שיטות שפורסמו בעבר באורגניזמים אחרים לשימוש במערכת הראייה של דרוזופילה 22. תנאי קיבוע המשמשים בדרך כלל לאימונוהיסטוכימיה של דרוזופילה היו מותאמים ליישומי FISH. ריכוזי הפרובים והסיכות השיער הוגדלו כדי לשפר את עוצמת האות וחדירת הרקמות. צינורות PCR שימשו במקום לוחות נקודתיים כדי להפחית את צריכת התגובות ולפשט את הטיפול בדגימות רקמה קטנות. בנוסף, זמני השטיפה וההיברידיזציה קוצרו כדי להתאים לגודל הקטן יותר של מוח הדרוזופילה ביחס למערכות חרקים אחרות המשמשות בדרך כלל ל-HCR-FISH.

יישומים מייצגים מראים כיצד גישה זו יכולה לספק מידע מיקום לאוכלוסיות נוירונים ספציפיות במהלך ההתפתחות. ניסויים אלו מראים כי תמלילים מסוימים, כמו תמלילים פתאומיים, ניתנים לזיהוי מוקדם יותר עם HCR-FISH מאשר עם צביעת נוגדנים או קווי דיווח. אתגרים פוטנציאליים, אסטרטגיות פתרון תקלות ויישומים של HCR-FISH לחקר התפתחות מערכת הראייה בדרוזופילה נדונים גם הם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי Drosophila melanogaster בוצעו בהתאם להנחיות של City College of New York, אוניברסיטת קולומביה ואוניברסיטת ניו יורק לטיפול ושימוש באורגניזמים מחקריים. כלי המחקר המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכינו בופרים

הערה: הכינו את כל המגבים בצינורות נטולי נוקלאז באמצעות קצות סינון.
הערה: לבש כפפות לאורך כל ההליך. נקה משטחי עבודה עם תמיסת ניקוי RNase לפני שמתחילים.

  1. הכינו פתרונות ללא נוקלאז
    1. הכינו 1x PBS-T על ידי דילול 20x PBS, טריטון X-100 וגליצין במים ללא נוקלאז לריכוזים סופיים של 1x PBS, 1% (v/v) טריטון X-100, ו-1 mM גליצין.
    2. הכינו 5x SSCT על ידי דילול 20x SSC ו-Tween-20 במים נטולי נוקלאז להכנת 5x SSC המכילים 0.1% (v/v) Tween-20.
    3. דילל 20x PBS במים ללא נוקלאז כדי להכין 1x PBS.

2. גשושי עיצוב

  1. כדי לעצב פרובים באופן מסחרי, בחרו את האיזופורם המעניין עבור המין הרלוונטי והזמינו את הפרובים התואמים למגבר הרצוי באמצעות ממשק האינטרנט של הספק.
    הערה: כימיסטיות ורצפי יוזמים מסחריים של HCR הם קנייניים ומוגנים בפטנט על ידי Molecular Instruments.
    1. שנו את אזור היעד בממשק האינטרנט אם רוצים זיהוי ספציפי לתמלול או לפני mRNA.
    2. הזמין כ-20 בדיקות עבור תמלילים מובעים. השתמש עד 40 גשושים לתמלולים בעלי שכיח נמוך בתכשירים של דרוזופילה שלמה.
      הערה: הזמינו אוליגואים מיוחדים לתמלולים קצרים יותר שמאפשרים פחות אתרי קשירת פרוב.
  2. כדי לעצב את הגשושים ידנית, יש להוריד את רצף ה-FASTA עבור תמלול היעד. קבע אם לכוון לאיזופורם יחיד או לכל האיזופורמים של הגן.
    הערה: תעדף אקסונים מהווים או איזופורמים מבוטאים מאוד שזוהו ממאגרי ריצוף RNA כדי לשפר את האות.
    1. אם מעצבים גשושים לזיהוי קדם-mRNA, יש לתכנן גשושים החוצים צמתים בין אינטרונים לאקסונים. גשושי עיצוב החוצים צמתים לחיבור כדי לזהות תמלולים בוגרים. השתמשו בגלאים אינטרוניים כדי לזהות תעתיקים מתפתחים בתוך הגרעינים.
      הערה: גשושי האנטרוניים עשויים שלא להתמקד עם תמלילי ציטופלזמה בוגרים ועלולים לדרוש סמנים נוספים לזיהוי תאים.
    2. קבע את גודל סט הגששים. השתמש במינימום של כ-5 גשושים לתמלולים קצרים כאשר לא ניתן לתכנן סטים גדולים יותר. השתמש ב-20 גשושים ליישומים סטנדרטיים וכ-40 גלאים לרגישות מיטבית בדגימות מלאות18,23.
    3. אם אתה מתכנן פרובים משלך, השתמש ברצפים של 25nt מופרדים על ידי מרווח של 2bp והוסף רצפי מפוצלים לקצה של 5' של כל אוליגו.
      הערה: למרות שרצפי יוזם מפוצלים מהדור הראשון זמינים לציבור, רצפי יוזמים מסחריים מהדור הבא הם קנייניים18.
    4. כשאתה מעצב את הגשושים שלך, תאמת את רצפי הגשושים. ודא שלגלאים בכל סט יש טמפרטורות התכה דומות. תאשר 100% זהות בין הגשושים.
      הערה: הימנעו מאזורים עשירים ב-G חזקים ושמרו על תכולת GC דומה בין גשושים24. למזער רצפים חוזרים ולהעריך קישור מחוץ למטרה באמצעות BLAST25.
    5. השתמש בתוכנות עיצוב גשוש זמינות לציבור כאשר מתאים26,27.
      הערה: כלי עיצוב בקוד פתוח עשויים שלא לשחזר את הביצועים האופטימליים של צינורות עיצוב פרובים מסחריים.

3. ניתוח, תיקון ופרה-היברידיזציה של המוח

  1. בופר היברידיזציה עם גלאי קדם-חימום ל-37 מעלות צלזיוס.
    אזהרה: בופר ההיברידיזציה לבדיקה מכיל פורממיד. החזיקו אותו מתחת למכסה אדים כימי תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים.
  2. מדלל כל גלש בריכוז סופי של 1 מיקרומול באמצעות מים מזוקקים ללא נוקלאז.
  3. אליקווט כ-250 מיקרוליטר של PBS ללא נוקלאז על צלחת ניתוח.
  4. העבר זחל נודד בשלב שלישי ל-PBS באמצעות מלקחיים. החזק את הבטן עם זוג מלקחיים אחד ואחז בווים הפה עם זוג שני. משכו את קרסי הפה מהגוף כדי לבודד את המוח וחבל העצבים הגחוני (VNC).
  5. הסר גופי שומן ובלוטות רוק תוך שמירה על ה-VNC. העבר מוחות מנותחים לצינור המכיל 600 מיקרוליטר של PBS קר ללא נוקלאז.
    הערה: השאירו את האונות האופטיות טבולות לאורך כל הניתוח כדי למנוע ייבוש רקמות.
  6. חזור על הניתוח עד שנאספו כ-6 אונות אופטיות. כריתה מלאה תוך 20 דקות כדי למזער את התדרדרות הרקמה.
  7. מוסיפים 200 מיקרולטר של 16% פאראפורמלדהיד (PFA) כדי להגיע לריכוז סופי של 4% PFA. הפוך את הצינור בעדינות לערבוב ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    אזהרה: PFA הוא רעיל ומוטגני. לשלוט מתחת למכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות.
  8. הסר מקבע מהדגימות והפקיד פסולת כימית מיועדת. שטוף דגימות שלוש פעמים עם 600 מיקרוליטר של PBS קר ללא נוקלאז, תוך שימוש בצלחת ניתוח ללכידת תמיסות הכביסה.
    הערה: בדקו תמיסות שטיפה לאיבוד רקמות ושחזרו מוחות שהוסטו תחת מיקרוסקופ ניתוח.
  9. העבר מוחות לצינור PCR המכיל 100 מיקרוליטר של בופר היברידיזציה Probe מחומם מראש.
    ערבבו בעדינות על ידי לחיצה על הצינור ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ודא שהמוח נשאר שקוע ואינו נדבק לדפנות הצינורות.

4. היברידיזציה של גשושים

  1. הכינו פתרון גלאי של 4 ננומטר על ידי הוספת 0.4 pmol מכל קבוצת גלאי ל-Probe Hybridization Buffer לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.
    הערה: הגדילו את ריכוז הגשוש עד 16 ננומטר אם עוצמת האות נמוכה בצביעות ההתחלתיות.
  2. הסר את בופר ההיברידיזציה מבלי להפריע לרקמה. הוסף תמיסת גלאי מדוללת לכל דגימה.
  3. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על נוטאטור למשך 16–24 שעות.

5. הגברת אות הגשוש

  1. הביא את בופר ההגברה לטמפרטורת החדר. הכינו כ-200 מיקרוליטר של בופר הגברה לכל דגימה.
  2. איזון בופר שטיפה. Warm Probe Wash Buffer ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבטיית מים.
    אזהרה: Probe Wash Buffer מכיל פורממיד. הידית מתחת למכסה אדים כימי.
  3. הסר את תמיסת הגלאי ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C לשימוש חוזר.
    הערה: השתמש שוב בתמיסות גלאי עד שעוצמת הצביעה יורדת.
  4. דגימות שטיפה ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-Probe Wash Buffer מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטוף דגימות פעמיים במשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר 5x SSCT.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של בופר הגברה ללא סיכות חדות. דגרו 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. חממו תרמוסייקלר ל-95 מעלות צלזיוס. הוסף 2 מיקרוליטר מכל קת סיכת שיער של 3 מיקרומטר לצינורות PCR נפרדים. הכינו צינור אחד לכל מין סיכת שיער.
    הערה: הגבר את ריכוז המגבר אם צביעה גורמת לפונקטות דלילות או יחס אות לרעש נמוך.
  7. דגרו סיכות שיער בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. הגנו על הצינורות מאור ודגרו בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.
  8. הכינו תמיסת הגברה. משלבים סיכות שיער בבופר הגברה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לכל דגימה.
  9. הסר את בופר ההגברה מדגימות. הוסף בופר הגברה המכיל סיכות שיער.
    דגרו לילה בטמפרטורת החדר על נוטאטור מוגן מאור (עטוף בנייר כסף).
  10. הסר את תמיסת ההגברה. שטוף דגימות פעמיים במשך 5 דקות ב-150 מיקרוליטר של 5x SSCT. שטוף דגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות ב-150 מיקרוליטר של 5x SSCT על נוטאטור. בצע שתי שטיפות קצרות ב-PBS ללא נוקלאז להסרת חומר ניקוי.

6. הרכבת מוחות להדמיה

  1. הדביקו מדבקת מרווח תמונה על מחסנית זכוכית. לחץ בעדינות עם הקצה התחתון של מלקחיים כדי להסיר בועות אוויר כלואות.
  2. חצו את המוח דרך חוט העצב הוונטרלי באמצעות מלקחיים.
  3. הנח את המוח במרכז המרווח היטב. כיוון את הרקמה לרוחב כאשר האונה האופטית פונה כלפי מעלה.
  4. הוסף מדיום הרכבה מספיק של אנטיפייד (כ-25 מיקרוליטר) כדי למלא את הבאר מבלי להכניס בועות אוויר. פזר את מדיום ההרכבה באופן שווה באמצעות מלקחיים.
  5. הניחו כיסוי מעל הדגימה ואטמו עם לק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבור מדענים החוקרים נוירוביולוגיה התפתחותית, HCR-FISH מספקת שיטה חזקה להמחשת דפוסי ביטוי גנים וקביעת מיקומים מרחביים של נוירונים מתפתחים באונה האופטית של דרוזופילה .

באונה האופטית של דרוזופילה (איור 2A), נוירונים בתוך נוירופיל המדולה נוצרים מתאי גזע עצביים (נוירובלסטים) שמקורם בנורואפיתל בעל דפוס מרחבי הנקרא מרכז ההתרבות החיצוני (OPC) (איור 2B)28. נוירובלסטים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מתאר התאמה של HCR-FISH לשימוש באונה האופטית של זחל Drosophila melanogaster . שיטות היברידיזציה מקומיות קונבנציונליות לעיתים קרובות מתפקדות בצורה גרועה ברקמת מוח הזחל השלמה בשל חדירה מוגבלת של הגשוש ועוצמת אות נמוכה. הפרוטוקול המוצג כאן מייעל מספר שלבים קריטיים לשיפור איכות הכתם באונה האופטית המתפתחת. תנאי קיבוע המשמשים בדרך כלל לאימונוהיסטוכימיה של דרוזופילה הותאמו לשימור מורפולוגיית הרקמות תוך שמירה על שלמות ה-RNA. ריכוזי גלאים ומגברים מוגברים שיפרו את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לקלוד דספלן על הגישה למכשירי HCR-FISH של Molecular Instruments ול-dpp-GAL4; UAS-סטינגר ליילינג. המחברים מודים גם לאניש אצ'אריה והארי צ'וי מ-Molecular Instruments על המשוב הטכני והדיונים בנוגע ליישום HCR-FISH. פרוטוקול זה הותאם מתודולוגיות HCR-FISH שפורסמו בעבר ולא פורסמו, שפותחו על ידי מג יאנגר22, האנטר וויטבק, בוגדן סיריבריאניקוב, אמנדה אראוחו גומס פריירה, ין-צ'ונג צ'ן ויאנקיקי זנג. בוגדן סיריבריאניקוב נתמך על ידי תוכנית מדעי הגבול האנושי (LT000010/2020-L). ג'ניפר מאלין נתמכה על ידי EY032269 מענק R00 של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404לא חל
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633לא חל
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15Dלא חל
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291לא חל
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880לא חל
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332לא חל
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626לא חל
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349לא חל
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553לא חל
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660לא חל
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198לא חל
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277לא חל
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136לא חל
ForcepsDumont#5 or #55sלא חל
Glass slidesVWR16005-106לא חל
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGלא חל
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH Kitלא חל
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH Kitלא חל
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH Kitלא חל
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180לא חל
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937לא חל
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100לא חל
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710רעיל
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)לא חל
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400לא חל
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714לא חל
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780לא חל
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))

מקורות

  1. Zeng H, Sanes JR. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nat Rev Neurosci. 2017;18(9):530-46.
  2. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 2015;161(5):1202-14.
  3. Brand AH, Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 1993;118(2):401-15.
  4. Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950;91(1):1-13.
  5. Pardue ML, Gall JG. Chromosomal localization of mouse satellite DNA. Science. 1970;168(3937):1356-8.
  6. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969;63(2):378-85.
  7. Singer RH, Ward DC. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ. hybridization with a biotinylated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79(23):7331-5.
  8. Bauman JG, Wiegant J, Borst P, van Duijn P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ. hybridization of fluorochrome-labelled RNA. Exp Cell Res. 1980;128(2):485-90.
  9. Herrington CS, Burns J, Graham AK, Evans M, McGee JO. Interphase cytogenetics using biotin- and digoxigenin-labelled probes. I. Relative sensitivity of both reporter molecules for detection of HPV16 in CaSki cells. J Clin Pathol. 1989;42(6):592-600.
  10. Tautz D, Pfeifle C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila. embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 1989;98(2):81-5.
  11. Rudkin GT, Stollar BD. High-resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ. by indirect immunofluorescence. Nature. 1977;265(5593):472-3.
  12. van de Corput MP, Dirks RW, van Gijlswijk RP, van de Rijke FM, Raap AK. Fluorescence in situ. hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 1998;110(4):431-7.
  13. Schröder C, Tautz D, Seifert E, Jäckle H. Differential regulation of the two transcripts from the Drosophila. gap segmentation gene hunchback. EMBO J. 1988;7(9):2881-7.
  14. Dirks RM, Pierce NA. Triggered amplification by hybridization chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(43):15275-8.
  15. Choi HMT, Chang JY, Trinh LA, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA. Programmable in situ. amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 2010;28(11):1208-12.
  16. Femino AM, Fay FS, Fogarty K, Singer RH. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 1998;280(5363):585-90.
  17. Trivedi V, Choi HMT, Fraser SE, Pierce NA. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 2018;145(1):dev156869.
  18. Choi HMT, Schwarzkopf M, Fornace ME, Acharya A, Artavanis G, Stegmaier J, et al. Third-generation in situ. hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 2018;145(12):dev165753.
  19. Schulte SJ, Fornace ME, Hall JK, Shin GJ, Pierce NA. HCR spectral imaging: 10-plex, quantitative, high-resolution RNA and protein imaging in highly autofluorescent samples. Development. 2024;151(4):dev202159.
  20. Schwarzkopf M, Liu MC, Schulte SJ, Ives R, Husain N, Choi HMT, et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ. hybridization. Development. 2021;148(22):dev199847.
  21. Ferreira AAG, Cordoba S, Rajesh R, Choi BJ, Desplan C. A developmental single-cell atlas of the Drosophila. visual system glia reveals cell type diversification and subcellular mRNA compartmentalization. bioRxiv. 2023. Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.06.552169v2
  22. Herre M, Goldman OV, Lu TC, Caballero-Vidal G, Qi Y, Gilbert ZN, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-23.e28.
  23. Olivares-Abril J, Joha J, Lee JY, Davis I. Optimization of hybridization chain reaction for imaging single RNA molecules in Drosophila. larvae. Fly (Austin). 2024;18(1):2409968.
  24. Burge S, Parkinson GN, Hazel P, Todd AK, Neidle S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Res. 2006;34(19):5402-15.
  25. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3):403-10.
  26. Lovely AM, Duerr TJ, Stein DF, Mun ET, Monaghan JR. Hybridization chain reaction fluorescence in situ. hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2023;2562:109-22.
  27. Kuehn E, Clausen DS, Null RW, Metzger BM, Willis AD, Ozpolat BD. Segment number threshold determines juvenile onset of germline cluster expansion in Platynereis dumerilii. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2022;338(4):225-40.
  28. Hofbauer A, Campos-Ortega JA. Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila. melanogaster. Roux Arch Dev Biol. 1990;198(5):264-74.
  29. Li X, Erclik T, Bertet C, Chen Z, Voutev R, Venkatesh S, et al. Temporal patterning of Drosophila. medulla neuroblasts controls neural fates. Nature. 2013;498(7455):456-62.
  30. Hasegawa E, Kitada Y, Kaido M, Takayama R, Awasaki T, Tabata T, et al. Concentric zones, cell migration and neuronal circuits in the Drosophila. visual center. Development. 2011;138(5):983-93.
  31. Suzuki T, Kaido M, Takayama R, Sato M. A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila. visual center. Dev Biol. 2013;380(1):12-24.
  32. Zhu H, Zhao SD, Ray A, Zhang Y, Li X. A comprehensive temporal patterning gene network in Drosophila. medulla neuroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 2022;13(1):1247.
  33. Konstantinides N, Holguera I, Rossi AM, Escobar A, Dudragne L, Chen YC, et al. A complete temporal transcription factor series in the fly visual system. Nature. 2022;604(7905):316-22.
  34. Konstantinides N, Kapuralin K, Fadil C, Barboza L, Satija R, Desplan C. Phenotypic convergence: distinct transcription factors regulate common terminal features. Cell. 2018;174(3):622-35.e13.
  35. Garcia-Alonso L, VanBerkum MF, Grenningloh G, Schuster C, Goodman CS. Fasciclin II controls proneural gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(23):10501-5.
  36. Simon F, Holguera I, Chen YC, Malin J, Valentino P, Njoo-Deplante C, et al. Spatial, temporal and Notch determination of terminal selector expression controls neuronal cell fate in the Drosophila. optic lobe. Nat Neurosci. 2026;29(5):1068-78.
  37. Malin JA, Chen YC, Simon F, Keefer E, Desplan C. Spatial patterning controls neuron numbers in the Drosophila. visual system. Dev Cell. 2024;59(9):1132-45.e6.
  38. Pinto-Teixeira F, Koo C, Rossi AM, Neriec N, Bertet C, Li X, et al. Development of concurrent retinotopic maps in the fly motion detection circuit. Cell. 2018;173(2):485-98.
  39. Erclik T, Li X, Courgeon M, Bertet C, Chen Z, Baumert R, et al. Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity. Nature. 2017;541(7637):365-70.
  40. Özel MN, Simon F, Jafari S, Holguera I, Chen YC, Benhra N, et al. Neuronal diversity and convergence in a visual system developmental atlas. Nature. 2021;589(7840):88-95.
  41. Marques GS, Teles-Reis J, Konstantinides N, Brito PH, Homem CCF. Asynchronous transcription and translation of neurotransmitter-related genes characterize the initial stages of neuronal maturation in Drosophila. PLoS Biol. 2023;21(5):e3002115.
  42. Pan Y, Rauskolb C, Irvine KD. Near-infrared nuclear markers for Drosophila. imaging. microPublication Biol. 2022;2022. Available from: https://www.micropublication.org/journals/biology/micropub-biology-000639

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדעי המוחגיליון 233גיליון 233ערך ריקגיליוןHCR-FISHמערכת חזותיתהתפתחות עצביתזיהוי RNA רב-ערוציצביעה של דגימה שלמה
תגובת שרשרת היברידיזציה FISH באונה האופטית המתפתחת של דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.