מאמר שיטה

פלטפורמת הפעלה ננו-מגנטית לסטימולציה מכנית מרחוק ובשליטה של תאי שוואן עם דימיון קונפוקלי בזמן אמת

21 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג פלטפורמה להפעלה ננו-מגנטית תואמת מיקרוסקופ, המשלבת ננו-חלקיקים סופרה-פרמגנטיים פלואורסצנטיים, אלקטרומגנט מכויל ודימוי קונפוקלי בזמן אמת, כדי להמריץ מרחוק ובאופן נשלט תאי Schwann ולנטר באופן דינמי את תגובותיהם למכנו-סנסוריות.

תקציר

כוחות מכניים מווסתים באופן קריטי את ההתנהגות התאית, אך שיטות רבות קיימות לגירוי מכני מסתמכות על מגע פיזי ישיר או על סביבות חוץ-תאיות מהנדסות באופן מלאכותי, ובכך מגבילות את הגמישות שלהן במחקרי תאים חיים דינמיים. כאן, אנו מציגים פלטפורמה של ננו-הפעלה מגנטית לגירוי מכני מרחוק, ללא מגע ובשליטה של תאי שוואן (Schwann cells) in vitro. מערך משולב זה מאפשר גירוי מגנטי מרחוק ודימוי תאים חיים מסונכרן באותו סשן ניסיוני. כתב יד זה מתאר את הכנתם של ננו-חלקיקים סופרה-פרמגנטיים פלואורסצנטיים (SPIONs), ואופציונלית, SPIONs פונקציונליים המכוונים לאקטין (f-SPIONs), את בנייתו וכיולו של התקן גירוי אלקטרומגנטי תואם מיקרוסקופ, את הערכת הכוחות המגנטיים ברמת החלקיק הבודד והתא הבודד, ואת השילוב של הפעלה מגנטית עם דימוי קונפוקלי בזמן אמת. תאי שוואן הם תאי גליה בעלי רגישות מכנית גבוהה הממלאים תפקידים חיוניים בפיתוח, בתחזוקה ובתיקון של עצבים פריפריים. ניטור בזמן אמת של תגובותיהם לגירוי מכני הוא קריטי להבנת האופן שבו כוחות מכניים משפיעים על ארגון השלד התאי והתנהגות התאים. פלטפורמה זו מספקת זרימת עבודה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה המכנית של תאי שוואן, וניתן להתאימה לסוגי תאים אחרים המגיבים מכנית ולמערכות רב-תאיות.

מבוא

רמזים מכניים מווסתים מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל היצמדות, נדידה, שגשוג, התמיינות ופלסטיות פנוטיפית1,2,3. מחקרים במכנוביוֹלוגיה הראו כי הן נוירונים והן תאי גליאה מפגינים רגישות מכנית ותגובתיות בולטות לאורך ההתפתחות4,5,6,7. כדי לבחון כיצד תאים חשים ומגיבים לכוח, פותחו מספר גישות ניסיוניות, כולל מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM), שאיבה באמצעות מיקרופיפטה, פינצטה אופטית, מערכות תרבית מבוססות מתיחה ופלטפורמות מיקרופלואידיות8,9,10,11,12. טכניקות אלו קידמו משמעותית את חקר התעתוק המכני (mechanotransduction). עם זאת, רבות מהן דורשות מגע פיזי ישיר עם התאים או תלויות בסביבות מכניות מלאכותיות שהוגדרו מראש, מה שהופך אותן לפחות מתאימות לגירוי מרחוק, שניתן לשלוט בו באופן דינמי ובאופן התואם לדימות.

העברת כוחות באמצעות חלקיקים ננומגנטיים מציעה אסטרטגיה חלופית לגירוי מכני מרחוק13,14,15,16,17,18. מכיוון שרוב הרקמות הביולוגיות מראות פגיעות מגנטית נמוכה, שדות מגנטיים המופעלים חיצונית יכולים לחדור לדגימות ביולוגיות ללא מגע ישיר ולהשפיע באופן סלקטיבי על חלקיקים בעלי תגובה מגנטית שהוכנסו לתאים או לרקמות. בנוכחות מדרג שדה מגנטי, חלקיקים אלו חווים כוחות כיווניים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור הפרעות מכניות ברמה הסוב-צלולרית, התאית או הרקמתית8,9. גישה זו היא אטרקטיבית מכיוון שהיא אינה דורשת מגע, ניתנת לכיוונון, תואמת לדימות של תאים חיים, וניתנת להרחבה למערכות ביולוגיות מורכבות יותר.

תאי שוואן הם תאי גליליה רגישים מאוד למכניקה19,20, הממלאים תפקידים קריטיים בפיתוח, בתחזוקה ובתיקון של עצבים פריפריאליים21,22. תצפית דינמית על תגובותיהם של תאי שוואן לגירוי פיזי היא חיונית להבנת האופן שבו כוח מווסת את ארגון השלד התאי ואת התנהגות התא. עם זאת, מערכות רבות להפעלת כוח קונבנציונליות אינן תואמות בקלות למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה בזמן אמת. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו פלטפורמה של ננו-הפעלה מגנטית המשלבת חלקיקי סופר-מגנטיים פלואורסצנטיים (f-SPIONs) המכוונים לשלד האקטין, התקן אלקטרומגנטי בהתאמה אישית התואם לבמה של מיקרוסקופ קונפוקאלי, ומסגרת כמותית להערכת כוח. מערך משולב זה מאפשר גירוי מגנטי מרחוק ודימוי של תאים חיים באופן מסונכרן באותו סשן ניסויי.

תהליך העבודה המתואר כאן כולל הכנה של סופר-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים (SPIONs), פונקציונליזציה אופציונלית מבוססת פאלואידין להכוון לאקטין ליצירת f-SPIONs, אפיון של הננו-חלקיקים, בניית התקן אלקטרומגנטי וכיול השדה, הערכת הכוח המגנטי, וגירוי מגנטי משולב עם דימוי קונפוקאלי בזמן אמת. למרות שהפלטפורמה עברה אופטימיזציה עבור תאי שוואן, היא עשויה לספק מסגרת מעשית למחקרים דומים במערכות חיים אחרות המגיבות למאמצים מכניים.

פרוטוקול

הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה השתמשו בשורת תאי שוואן של חולדה מבוססת (RSC96) ולא כללו משתתפים אנושיים או בעלי חיים חיים. מחקר זה נערך כחלק מפרויקט מחקר רחב יותר הכולל ניסויי בעלי חיים, אשר אושר על ידי ועדת רפואת בעלי חיים ואתיקה של בית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין (מספר אישור 2022-0045).

1. הכנת סופר-חלקיקים מגנטיים פלואורסצנטיים

  1. סינתזה של ננו-חלקיקי Fe₃O₄ מצופים בחומצה אולאית.
    הערה: ננו-חלקיקי Fe₃O₄ מצופים בחומצה אולאית סונתזו באמצעות פירוק תרמי כפי שתואר בעבר20,23.
    1. הוסיפו 2 mmol של Fe(acac)₃, 6 mmol של חומצה אולאית, 6 mmol של אולאילאמין ו-5 mmol של 1,2-hexadecanediol ל-20 mL של benzyl ether בבקרא תגובה.
    2. ערבבו את התערובת תחת אטמוספרת חנקן למשך 15 min עד לקבלת תמיסת קדם-חומר (precursor) הומוגנית.
    3. חממו את התערובת ל-200 °C בקצב של 20 °C/min.
    4. שמרו על התגובה ב-200 °C למשך 30 min.
    5. העלו את הטמפרטורה ל-265 °C ובצעו ריפלקס לתערובת למשך 30 min.
    6. הניחו לתערובת התגובה להתקרר באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
    7. אספו את ננו-חלקיקי ה-Fe₃O₄ באמצעות הפרדה מגנטית.
    8. שטפו את הננו-חלקיקים 3 פעמים עם אתנול.
    9. פזרו מחדש את הננו-חלקיקים המטוהרים בטולואן.
  2. הרכבת סופר-חלקיקי Fe₃O₄·Cy3.5.
    הערה: סופר-חלקיקי Fe₃O₄·Cy3.5 הוכנו כפי שתואר בעבר20,24,25.
    1. פזרו 28 mg של ננו-חלקיקי Fe₃O₄ מצופים בחומצה אולאית ב-4 mL של טולואן בבקרא עגולה בעלת שלושה פיות בנפח 50 mL.
    2. הכינו פאזה מימית המכילה 12.5 mg של sodium dodecyl sulfate ו-3 mg של Cyanine 3.5 (Cy 3.5) ב-12.5 mL של מים.
    3. שלבו את ת сусפנזיית ננו-חלקיקי ה-Fe₃O₄ בטולואן (28 mg ב-4 mL; 7 mg/mL) עם התמיסה המימית של פ surfactant/צבע כדי ליצור מיקרו-אמולסיה של שמן במים.
    4. ערבבו היטב עד לקבלת אמולסיה יציבה.
    5. חממו את הבקרא העגולה בעלת שלושת הפיות ל-60 °C וערבבו ברציפות במהירות של 300 rpm למשך 6 h.
      הערה: אין צורך בהליך של אידוי בוואקום או אידוי סיבובי.
    6. אדו את הטולואן תחת התנאים שתוארו לעיל כדי להשריע אגרגציה של ננו-חלקיקי ה-Fe₃O₄. באמצעות פיפטת העברה חד-פעמית, העבירו מנה קטנה (aliquot) של התמיסה לשפופרת מבחנה והניחו לה לעמוד. היעדר הפרדה בין הפאזות מעיד על כך שהטולואן הוסר לחלוטין.
    7. העבירו את סספנזיית סופר-חלקיקי ה-Fe₃O₄·Cy3.5 לשפופרות צנטריפוגה של 15 mL. צנטריפגו במהירות של 2,370 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הסופר-חלקיקים, והשליכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet).
    8. פזרו מחדש את המשקע במים דה-יוניים אולטרה-טהורים וצנטריפגו שוב ב-2,370 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון וחזרו על הליך השטיפה שלוש פעמים כדי להסיר שאריות של צבע Cy3.5 חופשי ושל sodium dodecyl sulfate.
  3. ציפוי הסופר-חלקיקים בפולידופמין (PDA).
    הערה: סופר-חלקיקים מצופים בפולידופמין הוכנו כפי שתואר בעבר20,26.
    1. צנטריפגו את סספנזיית סופר-חלקיקי ה-Fe₃O₄·Cy3.5 ב-2,370 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר, והשליכו את הנוזל העליון.
    2. פזרו מחדש את המשקע בבופר Tris בריכוז 10 mM (pH 8.5).
    3. הוסיפו 26 mg של מונומר דופמין לסספנזיה.
    4. ערבבו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 3 h תחת תנאים בסיסיים.
    5. צנטריפגו את הסספנזיה ב-2,370 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר.
    6. הסירו את הנוזל העליון ופזרו מחדש את המשקע במים אולטרה-טהורים כדי לקבל חלקיקי Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
  4. במידת הצורך, בצעו פונקציונליזציה לחלקיקים באמצעות phalloidin-Alexa Fluor 350.
    הערה: הסופר-חלקיקים עברו פונקציונליזציה של הפני השטח באמצעות phalloidin-Alexa Fluor 350 זמין מסחרית20.
    1. הכינו 5 mL של תמיסה מימית המכילה 100 units של phalloidin-Alexa Fluor 350.
    2. הוסיפו 200 µL של סספנזיית Fe₃O₄·Cy3.5@PDA המכילה 2 mg של חלקיקים לתמיסה.
    3. ערבבו את התערובת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 24 h.
    4. צנטריפגו את התערובת ב-2,370 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר.
    5. השליכו את הנוזל העליון ופזרו מחדש את המשקע במים דה-יוניים.
    6. אחסנו את פורמולציית ה-Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) הסופית מוגנת מאור עד לשימוש.

2. אפיון הננו-חלקיקים

  1. קבעו את המורפולוגיה ואת הגודל.
    1. הכינו דגימות ננו-חלקיקים עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) או מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת ברזולוציה גבוהה (HRTEM) בהתאם לדרישות המכשיר.
    2. רכשו תמונות כדי לקבוע את המורפולוגיה הכללית של החלקיקים, את מבנה הליבה-מעטפת ואת הקוטר הממוצע (איור 1).
    3. הכינו תרחיפי ננו-חלקיקים מימי עבור פיזור אור דינמי (DLS).
    4. מדוד את הקוטר ההידרודינמי ואת מדד הפולידיספרסיות (PDI).
    5. השוו בין תוצאות המיקרוסקופיה האלקטרונית לבין תוצאות ה-DLS כדי להעריך את אחידות הפורמולציה ואת ההתנהגות הקולואידית.
  2. קבעו את התכונות המגנטיות.
    1. הכינו דגימות ננו-חלקיקים מיובשות או מרוכזות המתאימות לניתוח באמצעות התקן התداخل קוונטי מולי-על (SQUID).
    2. הקליטו עקומות היסטרזיס מגנטית בטמפרטורה של 300 K.
    3. קבעו את המגנטיזציה ברוויה, את השאריתיות ואת הכורסיווית.
    4. יש לאשר כי החלקיקים מראים התנהגות סופר-פרה-מגנטית עם רמאננס (שרידי מגנטיות) וקוהרסיביות (כוח דחייה) זניחים.
  3. קביעת תכונות פלואורסצנציה.
    1. הכינו תרחיף f-SPION במים דה-יוניים ultrapure והעבירו את התרחיף לקובית קוורץ (quartz cuvette).
    2. הקליטו ספקטרומי פוטולומינסנציה באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה.
    3. וודאו כי האות הפלואורסצנטי נותר ניתן לגילוי לאחר השטיפה והריסספנסיה (resuspension).
  4. בצע תיקוף של הלוקליזציה המשויכת לאקטין בעת שימוש בניסוח המכוון.
    1. השג תאי RSC96.
      הערה: תאי RSC96 ששימשו במחקר זה, שורת תאי שוואן של חולדה שעברה טרנספורמציה ספונטנית אשר הוקמה באמצעות תרבית ארוכת טווח של תאי שוואן ראשוניים של חולדה, התקבלו מבנק התאים של האקדמיה הסינית למדעים, שנגחאי, סין (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) ונמצאו שליליים לזיהום במיקופלסמה ובפטריות. נעשה שימוש בתאים במעברים 3–10.
    2. תרבתו את התאים במצע Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסת פניסילין-סטרפტომייצין (100 U/mL פניסילין ו- 100 µg/mL סטרפטומייסין (streptomycin)).
    3. זריעה של תאי RSC96 בצפיפות של 1 × 105 תאים לכל צלחת מיקרוסקופיה לתרבית תאים של 35 מ"מ, ושבתו אותם למשך 24 שעות ב- 37 °C באטמוספירה לחית המכילה 5% CO₂ כדי לאפשר היצמדות של תאים.
    4. שאבו את מצע התרבית הקיים, שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS), והוסיפו מצע תרבית מלא המכיל 15 µg/mL f-SPIONs. דגרו את התאים עם f-SPIONs למשך 12 שעות.
    5. שאבו את מצע התרבית ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS קר (בטמפרטורת קרח) המכיל 1 mM deferoxamine, כדי להסיר באופן יסודי חלקיקים שלא הופנמו.
    6. רכשו תמונות קונפוקאליות להערכת ההתפלגות התוך-תאית של החלקיקים. הגדירו את פרמטרי הדמיון לחור סיכה (pinhole) של 1 יחידת איירי (AU) ולצעד-Z (z-step) של 0.43 µm לקבלת חתכים אופטיים ברזולוציה גבוהה של המבנים התו-תאיים.
    7. בחן האם החלקיקים מראים העשרה באזורים תאיים הקשורים לאקטין.

3. בנייה וכיול של מכשיר הגירוי האלקטרומגנטי (איור 2)

  1. הרכבת המכשיר האלקטרומגנטי.
    1. בנו מערכת סלילים אלקטרומגנטית קומפקטית המותאמת לגודל במת המיקרוסקופ הקונפוקלי ותא התאים החיים (איור 2A,B).
    2. חברו את הסליל לספק כוח שניתן לשליטה או למקור זרם חיצוני.
    3. בצעו סימולציה נומרית של סביבת השדה המגנטי בעל הגרדיאנט באמצעות COMSOL Multiphysics 4.3b (איור 2C,D).
    4. אשרו כי האלקטרומגנט מייצר את השדה המגנטי בעל הגרדיאנט (GMF) המתאים תחת זרמי כניסה שונים (איור 2G).
  2. מדידת צפיפות השטף המגנטי וכיול השדה המגנטי בעל הגרדיאנט.
    1. מקמו את האלקטרומגנט לצד כלי השקיעה, כאשר קצה הקוטב מופנה למרכז הכלי וממוקם במרחק 1 mm מהדופן החיצונית של הכלי (איור 2E,F).
    2. שמרו על תצורה גיאומטרית יחסית זו בין האלקטרומגנט לכלי השקיעה במהלך כל ניסויי הדימוי והסטימולציה של כוח מגנטי בתאים חיים שיבואו בהמשך.
    3. השתמשו במד גאוס דיגיטלי למדידת צפיפות השטף המגנטי במיקומים שנקבעו מראש בתוך אזור הסטימולציה, תוך שימוש ברשת המיקום בתחתית כלי השקיעה כייחוס מרחבי.
    4. חשבו את גרדיאנט השדה המקומי על סמך השינוי המרחבי בצפיפות השטף המגנטי.
    5. כיילו ואששו את גרדיאנט השדה המגנטי שסומולל נומרית באמצעות ערכי גרדיאנט השדה המגנטי שנמדדו וחושבו ניסויית.

4. הערכת הכוחות המגנטיים המופעלים על ידי הפלטפורמה.

  1. הגדרת מודל הערכת הכוח.
    1. השתמש במשוואת הכוח עבור ננו-חלקיקים מגנטיים בשדה מגנטי לא אחיד27,28:
      משוואת שיווי משקל סטטי, F=(m·∇)B, על אינטראקציית שדה מגנטי, לשימוש לימודי.
    2. תחת הנחה של התיישרות סופר-פרה-מגנטית עם השדה המופעל, פשט את המשוואה ל
      משוואת כוח מגנטי \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\); נוסחה למחקר שדה מגנטי.
      כאשר:
      F הוא הכוח הננו-מגנטי
      m הוא מומנט הדיפול המגנטי
      משוואת Nabla B, סמל חדוש וקטורי, ממחיש שטף מגנטי בדיאגרמה פיזיקלית. הוא הגרדיאנט של השדה המגנטי
      dB/dr הוא הגרדיאנט של השדה המגנטי (T/m) הנוצר על ידי התקן המתאים ליצירת שדה מגנטי.
    3. השתמש בגרדיאנט השדה שנמדד מהמכשיר המכויל בכל החישובים.
  2. הערכת הכוח הפועל על ננו-חלקיק בודד.
    1. קבע את ממדי החלקיקים הממוצעים מתמונות HRTEM.
    2. חשב את נפח הליבה המגנטית בהנחה של גיאומטריה כדורית.
    3. הערך את הנפח המגנטי הספציפי של Fe₃O₄ בהתבסס על הפракציה המגנטית של הליבה.
    4. חשב את מומנט הדיפול המגנטי לפי נוסחה לחישוב מסה כימית \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\), משוואה לסטוכיומטריה.
      כאשר:
      Mm מייצג את המגנטיזציה המסית של ה-f-SPIONs (16 A·m2/kg) תחת עוצמת השדה הנתונה;
      ρ היא הצפיפות של Fe₃O₄ (5.24 g/cm3).
      ​V הוא נפח הליבה המגנטית של Fe₃O₄ בתוך כל f-SPION (5.89 × 10⁻17 cm3).
    5. הכפל את מומנט הדיפול בגרדיאנט השדה שנמדד כדי להעריך את הכוח הפועל על ננו-חלקיק בודד (משוואת כוח שיווי משקל סטטי Ff-SPION; סמל; שימוש לימודי.).
  3. הערכת ספיגת ננו-חלקיקים לתא שוואן (Schwann cell) בודד.
    1. זרע תאי שוואן RSC96 בריכוז של 5 × 105 תאים לכל באר בצלחות מיקרוסקופיות לתרבית תאים של 35 מ"מ.
    2. דגור את התאים למשך 24 שעות בתנאי תרבית סטנדרטיים.
    3. החלף את המצע במצע טרי המכיל 15 µg/mL f-SPIONs.
    4. דגור את התאים למשך 12 שעות נוספות.
    5. שטוף את התאים פעמיים עם תמיסת סליין מוגברת פוספט (PBS) קרה במיסב קרח, המכילה 1 mM deferoxamine.
    6. אסוף וספור את התאים.
    7. מדוד את תכולת הברזל התוך-תאית באמצעות ספקטרוסקופיית פליטה אטומית עם פלסמה מצומדת השראית (ICP-AES).
    8. חשב את מספר החלקיקים שהופנמו לכל תא על ידי חלוקת מסת הברזל הממוצעת לתא במסת הברזל לכל חלקיק משוואה לספיגה תאית של SPIONs (n_cell^f-SPIONs) במחקר דימוי רפואי..
  4. הערכת הכוח המועבר לתא שוואן בודד.
    1. חשב את הכוח ברמת התא לפי
      משוואת שיווי משקל סטטי, F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION, נוסחה; ניתוח מאזן כוחות.
      כאשר:
      משוואת כוח שיווי משקל סטטי Ff-SPION; סמל; שימוש לימודי. הוא הכוח המגנטי המופעל על f-SPION בודד.
      משוואת ריכוז SPION, \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \), סימון מדעי, דיאגרמה. הוא מספר ה-f-SPIONs שהופנמו לכל תא.
      Fcell הוא הכוח המגנטי המופעל על תא בודד.
    2. דווח על הערך שהתקבל ככוח המגנטי המשוער המועבר לתא שוואן בודד (Fcell).
    3. ציין בבירור כי הערך הוא הערכה מבוססת-מודל ולא מדידה ישירה של כוח תוך-תאי.

5. שילוב של גירוי מגנטי עם דימיון במיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר (CLSM) בזמן אמת

  1. העמיסו תאי שוואן (Schwann cells) בננו-חלקיקים מגנטיים.
    1. זריו תאי שוואן (Schwann cells) בצלחות תרבית ibidi התואמות לדימיון או בתאי תרבית מיקרופלואידיים.
    2. אפשרו לתאים להיקשר ולהשתקם.
    3. החליפו את המצע הקיים במצע תרבית טרי המכיל 15 µg/mL f-SPIONs.
    4. דגרו את התאים למשך 12 שעות כדי לאפשר טעינה של f-SPION.
    5. יש לבחון את מורפולוגיית התאים לפני ההמשך.
  2. הסר חלקיקים שלא עברו הפנמה.
    1. הסר את המצע המכיל את הננו-חלקיקים.
    2. שטפו את התאים פעמיים עם PBS המכיל 1 mM deferoxamine.
    3. החליפו את תמיסת השטיפה במצע תאים חיים המתאים לדימוי.
    4. יש לאשר כי הרקע של חלקיקים חוץ-תאיים נמוך לפני ביצוע הדמיה.
  3. שלבו את התקן האלקטרומגנטי עם מערכת הדימות ה-CLSM.
    1. הרכיבו את האלקטרומגנט עם תא תרבית התאים החיים, תוך מיקום האלקטרומגנט במיקומו המכויל מראש.
    2. הניחו את תא גידול התאים החיים המורכב על השולחן של המיקרוסקופ הקונפוקאלי (איור 3). ודאו שצלחת התרבית ממוקמת בתוך אזור הגירוי היעיל (איור 3A).
    3. הפעילו את האלקטרומגנט בהתאם לפרמטרים שהוגדרו מראש, ואשרו חשיפה יעילה לשדה מגנטי בעל מדרג (gradient) באזור צלחת התרבית (איור 3B).
    4. וודאו שהעדשה האובייקטיבית יכולה להגיע למישור המוקד ללא הפרעות.
    5. יש לוודא כי המכשיר אינו חוסם את מיקום העדשה או את תנועת השולחן.
    6. בהתחשב בחום הנוצר במהלך פעולת האלקטרומגנט, יש להתאים את הגדרות הטמפרטורה של רכיבי תא התאים החיים בהתאם לתנאי התרבית האופטימליים שנקבעו מראש, כדי להבטיח סביבה פנימית של 37 °C ו-5% CO₂ (איור 3C).
    7. יש לוודא כי המערכת כולה פועלת באופן תקין ויציב.
  4. סידן (Ca) תפקודי2דימות בתאים חיים.
    1. דגרו את התאים עם תמיסת Krebs–Ringer’s (pH 7.4) המכילה 3 µM Fluo-4 AM ו-0.1% Pluronic F-127 ב- 37 °C למשך 30 דקות.
    2. לאחר הדגירה, יש לשטוף את התרביות פעמיים ב-PBS ולהעביר אותן לפלטפורמת דימות תאים חיים של מערכת ה-CLSM לצורך דימות (איור 4A).
    3. באמצעות סריג המיקום בתחתית צלחת התרבית של ibidi, דגמו תמונות של חמישה מיקומים שהוגדרו מראש.
    4. חלקו כל שדה הדמיה באופן שווה ל-25 אזורים ובחרו 0–3 תאים מכל אזור לצורך כימות פלואורסצנציה, בהתאם לצפיפות התאים בפועל באותו אזור.
    5. הגדירו את המתאר המלא של תא בודד כאתר העניין (ROI), ועקבו אחר תגובת הסידן המושרית מגנטית על ידי ניתוח שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה (ΔF) בתוך ה-ROI.
    6. חשב את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה כ-ΔF = (Fגירוי - F0). יש לשקול שינוי בעוצמת הפלואורסצנציה לפני ואחרי הגירוי (ΔF/F0העולה על 10% כאירוע תגובת סידן.
      הערה: Fבלתי מעורר מייצג את עוצמת הפלואורסצנציה לפני גירוי בכוח מגנטי, F0 מייצג את עוצמת הפלואורסצנציה הבסיסית, ו-Fגירוי מייצג את עוצמת הפלואורסצנציה המעוררת לאחר גרייה בכוח מגנטי.
    7. עבור תיקון רקע, החסר את עוצמת פלואורסצנציית הרקע הממוצעת שנמדדה באזור נטול תאים מערך עוצמת הפלואורסצנציה של כל ROI.
    8. בצעו שלושה ניסויים עצמאיים, כאשר בכל ניסוי נכללת צחנה אחת לתרבית.
  5. בצעו דימות במרווחי זמן (time-lapse imaging) והחילו גירוי מגנטי במהלך הדימות.
    1. הגדירו את פרמטרי הדמיית ה-time-lapse באופן הבא: מרווח רכישה של 2.1 שניות לכל פריים, משך רכישה כולל של 650 שניות, והדמיית חיתוך אופטי (optical-section imaging) סטנדרטית ברזולוציה גבוהה באמצעות 1 AU.
    2. במהלך דימוי תאי, רכשו תמונות ברצף למשך 50 שניות ללא הזנת זרם, כדי להקליט את עוצמת הפלואורסצנציה של הסידן התוך-תאי בהיעדר גירוי של כוח מגנטי (Fלא מעורר) (איור 2H ו- איור 4B).
    3. נרמלו את עוצמת הפלואורסצנציה שנרשמה במהלך 50 השניות הראשונות והגדירו אותה כעוצמת פלואורסצנציה בסיסית (F₀)0).
    4. לאחר מכן, גרף זרם קבוע של 3.0 A לאלקטרומגנט, ובכך חשף תאי שוואן (Schwann cells) הטעונים ננו-חלקיקים מגנטיים לשדה מגנטי מדורג של 3.25 T/m, ובכך הכפף אותם לגירוי באמצעות כוח מגנטי. המשך את הדמיית ה-time-lapse למשך 10 דקות כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנציה של הסידן התוך-תאי במהלך הגירוי הכוח המגנטי (Fגירוי) (איור 2H ו- איור 4C).
    5. חשב כמותית את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה כ-ΔF/F0 (איור 4D,ה).
  6. בצע ניתוח סטטיסטי ונתח את ה-Ca2נתוני פלואורסצנציה⁺.
    1. עבור כל תא, חשבו את ערך החציון של ΔF/F₀ לאורך סדרת הזמנים המנותחת, והשתמשו בערך זה כערך ה-Ca ברמת התא2מדד תגובה ⁺.
    2. בצעו שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל תנאי ניסיוני, כאשר בכל ניסוי תהיה צלחת תרבית אחת לכל תנאי. איחדו את התאים שנותחו בשלושת הניסויים העצמאיים לצורך הצגה תיאורית, ודווחו על n כמספר התאים הכולל שנותחו בכל קבוצה.
    3. העריכו את הנורמליות של נתוני ה-ΔF/F₀ ברמת התא באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (Kolmogorov-Smirnov).
    4. מכיוון שה-Ca2במידה ונתוני תגובת הפלואורסצנציה אינם בעלי התפלגות נורמלית, הציגו את הנתונים כחציונה וטווח בין-רבעוני (IQR).
    5. נתחו הבדלים בין קבוצות באמצעות מבחן פרידמן (Friedman) לא פרמטרי, ולאחריו מבחני וילקוקסון לדירוג סימנים (Wilcoxon signed-rank tests) להשוואות זוגיות, כפי שדווח בעבר.
    6. שקול P < 0.05 כדי לציין מובהקות סטטיסטית.

תוצאות

מיקרוסקופיית אלקטרונים חולפת ברזולוציה גבוהה (HRTEM) הראתה כי לניסוח הסופי של הננוחלקיקים היה גרעין מגנטי מצובל ומעטפת חיצונית לאחר מודולציית השטח (איור 1). ל-f-SPIONs הסופיים היה קוטר כולל ממוצע של 63.36 ± 16.65 nm, עם גרעין מגנטי עשיר ב-Fe₃O₄ בקוטר של כ-56.60 ± 6.19 nm ומעטפת חיצונית המורכבת מפולי-דופמין ו-phalloidin-Alexa Fluor 350 בעובי ממוצע של כ-5.79 ± 1.36 nm. תוצאות אלו אישרו את הבנייה המוצלחת של ארכיטקטורת סופר-חלקיק המתאימה להפעלה מגנטית ולויזואליזציה מבוססת פלואורסצנציה.

ניתוח היסטרזיס מגנטי הראה כי החלקיקים הפגינו התנהגות סופר-פאראמגנטית בולטת, עם שארית מגנטיות (remanence) וכריה (coercivity) זניחות. תחת שדה מגנטי מופעל של 10,000 Oe (1.0 T), מגנטזציית הרוויה שלהם הגיעה לכ-35 A·m2/kg (איור 5). בהיעדר מדרג שדה מגנטי, f-SPIONs הפגינו יכולת פיזור טובה בתווך מימי (איור 6A). בעת חשיפה למדרג שדה מגנטי, f-SPIONs הדגימו תגובה מגנטית רגישה (איור 6B). ניתוח פלואורסצנציה אישר עוד כי החלקיקים שמרו על יכולת גילוי אופטית לאחר הסינתזה והשינוי של פני השטח (איור 7).

מכשיר הגירוי האלקטרומגנטי שולב בהצלחה במערכת הדימוי של תאים חיים (איור 3). כיול השדה המגנטי הראה כי המכשיר ייצר שדה מגנטי בעל מדרג יציב לרוחב אזור תרבית התאים (איור 2E,F), עם שדה מגנטי בעל מדרג in vitro של כ-3.25 T/m תחת התצורה הניסיונית הנוכחית (איור 2G).

דימוי קונפוקאלי הדגים טעינה יעילה של הננו-חלקיקים המגנטיים הפלואורסצנטיים לתוך תאי שוואן (איור 7). לאחר שטיפה, אות הפלואורסצנציה נותר קשור בעיקר לתאים ולא לחלקיקים חופשיים במדיום. עבור הפורמולציה המכוונת לאקטין, דימוי קונפוקאלי הראה בנוסף העשרה של החלקיקים באזורים תאיים הקשורים לאקטין.

דימוי קונפוקאלי בשיטת Time-lapse הדגים שניתן לבצע גרייה מגנטית ודימוי של תאים חיים בתוך אותו תהליך עבודה ניסויי, תוך שמירה על גישה אופטית יציבה לתאים לאורך תקופת הגרייה (איור 2H ו-איור 4A).

סיכום כמותי קישר באופן נוסף בין תכנון הננו-חלקיקים, כיול המכשיר והטעינה התאית. תחת שדה מגנטי עם גראדיאנט in vitro של 3.25 T/m, כוח המגנט הפועל על f-SPION בודד נאמד לכ-1.59 × 10-5 pN. בהתבסס על כימות ברזל תוך-תאי, כל תא Schwann מסוג RSC96 הפנים כ-9.30 ± 2.88 × 103 חלקיקים, מה שמתבסס על כוח מגנטי כולל מוערך של כ-0.15 ± 0.05 pN לתא.

בהשוואה לפלואורסצנציה הבסיסית, תחת גירוי מגנטי המתווך על ידי f-SPIONs, תאי RSC96 הראו דינמיקת Ca2+ פעילה ועלייה משמעותית באותות פלואורסצנציה של Ca2+ (איור 4D). ניתוח כמותי של אותות הפלואורסצנציה של Ca2+ גילה כי השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה של Ca2+ (ΔF/F0) בתוך תאי RSC96 בקבוצת הגירוי המגנטי (62.96 [35.07–91.67]) היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת הנורמלית (-5.74 [-15.66–1.20]), בקבוצת הביקורת של f-SPIONs (-16.70 [-22.02–-12.00]), ובקבוצת הביקורת של השדה המגנטי המדורג (-12.90 [-21.24–-6.97]) (איור 4E).

מבנה ננו-חלקיקים בתמונות TEM; ניתוח במיקרוסקופיה אלקטרונית המראה פירוט של ננו-חלקיקים בצבולים.
איור 1: מורפולוגיה ומבנה ליבה-מעטפת של f-SPIONs באמצעות HRTEM. (A) ה-f-SPIONs הם כדורי ומציגים מבנה ליבה-מעטפת טיפוסי, עם ליבה מגנטית פנימית המורכבת מננו-חלקיקי Fe₃O₄ ו-Cy3.5. (B) המעטפת החיצונית מורכבת מ-PDA ו-phalloidin-Alexa Fluor 350. התמונות בלוח B מראות תצפיות מוגדלות מייצגות של האזורים המסומנים בריבוע אדום בלוח A, כאשר הקווים והחצים הלבנים מצביעים על עובי המעטפת שנמדד. סרגל המقياس בלוח B מייצג 10 nm. בוצעו שלוש מדידות עצמאיות, ובסך הכל נותחו 680 ננו-חלקיקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמה של התקן אלקטרומגנטי עם חוט נחושת וליבת ברזל; סימולציות של שדה מגנטי; גרף של השדה.
איור 2: בנייה, כיול והפעלה של האלקטרומגנט המותאם אישית לגירוי מגנטי של תאים חיים. (A,B) סליל האלקטרומגנט נכרך סביב ליבת ברזל באמצעות חוט נחושת מצופה לכה בעובי 1.1 mm, עם סך של 410 ליפופים. לסליל היה קוטר חיצוני של 60 mm, קוטר פנימי של 20 mm, אורך של 110 mm, והתנגדות לזרם ישר של כ-1.2 Ω. קצה הקוטב מדד 13.0 mm × 12.0 mm × 3.0 mm (אורך × רוחב × גובה) ויוצר מ-1J50 permalloy. (C,D) זרם הכניסה המקסימלי של האלקטרומגנט לא עלה על 3 A. בזרם כניסה של 3 A, נוצר גרדיאנט שדה מגנטי של כ-6.7 T/m בקרבת קצה הקוטב. (E,F) התפלגות גרדיאנט השדה המגנטי בתוך צלחת התרבית בקרבת קצה הקוטב בזרם כניסה של 3 A. גרדיאנט שדה מגנטי סטטי ממוצע של כ-3.25 T/m נוצר לאורך אזור הדימוי התאי. (G) גרדיאנטים של שדה מגנטי שנוצרו על ידי האלקטרומגנט בזרמי כניסה שונים של 1 A, 2 A ו-3 A. (H) פרוטוקול לדימוי time-lapse של תאים חיים, הפעלת זרם וחשיפה לגרדיאנט שדה מגנטי במחקר זה. תמונות time-lapse נרכשו ברצף למשך 50 s ללא הזנת זרם. לאחר מכן הופעל זרם קבוע ורציף של 3.0 A, ודימוי ה-time-lapse נמשך למשך 10 min. DC: זרם ישר. GMF: גרדיאנט שדה מגנטי. פאנלים E, F ו-G הותאמו באישור מ-Liu et al.20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

תא תרבית תאים חיים עם דימוי CLSM, אלקטרומגנט, מחממים והסדר זרם ישר.
איור 3: שילוב האלקטרומגנט בתוך תא תרבית התאים החיים. (A) אלקטרומגנט קומפקטי בהתאמה אישית הממוקם במיקום מכויל בתוך תא תרבית התאים החיים, לחשיפה לשדה מגנטי במדרג באזור צלחת תרבית התאים. (B) מערך משולב של מערכת הדימוי CLSM, פלטפורמת הנעת ננו-מגנטית ומספק כוח חיצוני של זרם ישר. (C) אופטימיזציה של הגדרות הטמפרטורה עבור הרכיבים הבודדים של תא תרבית התאים מבטיחה טמפרטורה יציבה בתוך צלחת התרבית במהלך פעולת האלקטרומגנט. (D) פרמטרי הגדרת טמפרטורה עבור הרכיבים הבודדים של תא תרבית התאים. CLSM: confocal laser scanning microscopy. PV: ערך נמדד. SV: ערך מכוון. Top Heater: טמפרטורת מחמם המכסה העליון. Stage heater: טמפרטורת חימום של בסיס המיקרוסקופ ותחתית תא התרבית. Bath heater: טמפרטורת אמבט המים. Lens heater: טמפרטורת מחמם עדשת העדשה. Temp sensor: טמפרטורה בפועל שנמדדה על ידי גשש הטמפרטורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת הפעלה ננו-מגנטית; f-SPIONs, יוני סידן, מיקרוסקופיית DIC, תוצאות פלואורסצנציה.
איור 4תמונות מייצגות של תגובות סידן בתאי שוואן תחת גירוי של כוח מגנטי. (A) תהליך עבודה משולב עבור סטימולציה מגנטית ודימוי Ca2+ בתאים חיים2+ דימוי בפלטפורמת הננו-הפעלה המגנטית.B) רמת סידן בסיסית (Baseline Ca)2+ תמונת פלואורסצנציה שצולמה לפני גרייה מגנטית (Fללא גירוי). (C) Ca2+ תמונת פלואורסצנציה שצולמה לאחר גירוי מגנטי (Fגירוי), המראה את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה (ΔF). (D) מדידת סידן (Ca) ברזולוציית זמן2+ עקבות אות שנされていたה לפני ואחרי גירוי מגנטי.ה) ניתוח כמותי והשוואה של שינויים ב-Ca2+ פלוורסצנציה (ΔF/F₀) בין הקבוצות הניסיוניות השונות. DIC: ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. Fללא גירוי: עוצמת הפלואורסצנציה לפני גירוי בכוח מגנטי. F0: עוצמת הפלואורסצנציה הבסיסית. Fגירויעוצמת הפלואורסצנציה שהושרה לאחר גירוי בכוח מגנטי. ΔF: השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה. "Normal" מייצג את קבוצת הביקורת הנורמלית, "f-SPIONs+GMF" מייצג את קבוצת ההפעלה הננו-מגנטית, "f-SPIONs" מייצג את קבוצת הביקורת של f-SPIONs, ו-"GMF" מייצג את קבוצת הביקורת של השדה המגנטי המדורג. בוצעו שלושה ניסויים עצמאיים, כאשר בכל ניסוי נעשה שימוש בצלחת תרבית אחת לכל תנאי ניסויי. עבור כל תא, ערך ה-ΔF/F₀ החציוני לאורך סדרת הזמנים המנותחת שימש כמדד התגובה ברמת התא. הנתונים מוצגים כחציון וטווח בין-רבעוני (IQR), ו-n מציין את המספר הכולל של התאים שנותחו בשלושת הניסויים העצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן פרידמן (Friedman test) ולאחריו מבחן הדרגות חתום של וילקוקסון (Wilcoxon signed-rank test), כפי שדווח בעבר על ידי Liu et al. הנתונים הכמותיים בפאנל E הותאמו באישור מ-Liu et al.20. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גרפים של מגנטיזציה לעומת שדה, לולאת היסטרזיס ב-300K, ניתוח תכונות מגנטיות, תרשים.
איור 5: תכונות סופר-פרה-מגנטיות של f-SPIONs. (A) לולאת היסטרזיס מגנטית של f-SPIONs, המראה התנהגות סופר-פרה-מגנטית טיפוסית. (B) תצוגה מוגדלת של לולאת ההיסטרזיס בקרבת שדה מגנטי אפס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניסוי שדה מגנטי: סליל עם מבחנה. השפעת הפעלה/כיבוי של GMF על הפיזור (PDI: 0.16).
איור 6פיזוריות מימית ותגובתיות לשדה מגנטי מדורג של f-SPIONs. (Aבהיעדר שדה מגנטי עם מדרג, ה-f-SPIONs נותרים מפוזרים היטב בתוך התווך המימי.B) עם הפעלת השדה המגנטי בעל המדרג, ה-f-SPIONs נעים במהירות ונצברים לאורך כיוון מדרג השדה. GMF: שדה מגנטי בעל מדרג. PDI: מדד פולידיספרסיות. החץ מצביע על כיוון השדה המגנטי בעל המדרג. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דימוי תאים עם ננו-חלקיקי Fe3O4; מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראה מיזוג של DIC, Cy3.5 ו-phalloidin.
איור 7: דימוי פלואורסצנטי ב-CLSM של הפנמנה (internalization) של f-SPIONs בתאי שוואן (Schwann cells). (A) דימוי CLSM של תאי שוואן לאחר דגירה משותפת עם f-SPIONs (15 µg/mL) למשך 12 h ושטיפה לאחר מכן (pinhole = 1 AU; z-step = 0.43 µm), המראה מורפולוגיה תאית שנשמרה ורקע מינימלי של חלקיקים חוץ-תאיים. (B) פלואורסצנציה אדומה שזוהתה בערוץ Cy3.5 (Ex/Em: 561–568/607 nm), המעידה על נוכחותם של f-SPIONs מסומני Cy3.5 בתוך תאי שוואן. (C) פלואורסצנציה כחולה שזוהתה בערוץ Alexa Fluor 350 (Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm), התומכת בשילוב מוצלח של מודול הפונקציונליזציה של phalloidin-Alexa Fluor 350. (D) תמונה ממוזגת המראה חפיפה מרחבית משמעותית בין אותות הפלואורסצנציה האדום והכחול, התואמת לבנייה מוצלחת של סופר-חלקיקים מגנטיים-פלואורסצנטיים. DIC: ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ננוחלקיקי תחמוצת ברזל מוכרים רבות כננו-חומרים מגנטיים בעלי תאימות ביולוגית נוחה. כחומרי ניגוד נפוצים לבדיקות דימות בתהודה מגנטית, ננוחלקיקי Fe₃O₄ סופר-פרמגנטיים יושמו באופן נרחב באבחון דימויי קליני29,30. במחקר האחרון של הקבוצה שלנו20, הוכח כי f-SPIONs מראים ציטוטוקסיות נמוכה ביותר ובטיחות ביולוגית מצוינת. פלטפורמת ההפעלה הננו-מגנטית, שנבנתה תוך שימוש ב-f-SPIONs כמפעילים מכניים בשילוב עם אלקטרומגנט שניתן לשליטה, הפעילה ביעילות את הדינמיקה של השלד התאי בתאי Schwann, גרמה לפתיחת תעלת היונים Piezo1 הרגישה למכניקה, עוררה זרימה של Ca2⁺ דרך הקרום, ובעקבות זאת קידמה "תכנות מחדש" של ביטוי גנים ושינויים פנוטיפיים בתאים20.

מספר שלבים חשובים במיוחד ליישום מוצלח של פלטפורמה זו. השלב הקריטי הראשון הוא הכנת הננו-חלקיקים. החלקיקים חייבים להישאר מפוזרים היטב, בעלי תגובה מגנטית וניתנים לזיהוי אופטי לאחר הסינתזה והשינוי של פני השטח. אגרגציה בכל שלב עלולה להפחית את העקביות של הספיגה התאית, לשנות את התכונות המגנטיות האפקטיביות ולפגוע באיכות הדימוי של תאים חיים.

השלב הקריטי השני הוא הליך הטעינה התאית והשטיפה. ריכוז הננו-חלקיקים וזמן האינקובציה חייבים להיות מספיקים כדי להשיג טעינה תוך-תאית ניתנת לזיהוי, מבלי לגרום להצטברות חוץ-תאית מוגברת או לפגוע במורפולוגיה של התאים. הסרה יסודית של חלקיקים שאינם מופנמים ואלו הקשורים לממברנה היא חיונית, במיוחד כאשר משתמשים בדימיון פלואורסצנטי להערכת לוקליזציה תוך-תאית. שטיפה לא מספקת עלולה להוביל לפרשנות שגויה של דפוסי הלוקליזציה ואף לעוות את הערכות הכוח ברמת התא.

השלב הקריטי השלישי הוא היישור הגאומטרי של מכשיר הגירוי המגנטי ביחס לדגימה. מכיוון שהכוח המגנטי תלוי ישירות במדרג השדה המקומי, המיקום היחסי של הסליל האלקטרומגנטי ומישור הדגימה חייב להישאר עקבי עם תצורת הכיול. אפילו שינויים קטנים במרחק או ביישור בין הסליל לדגימה עלולים לשנות את תנאי הגירוי האפקטיביים.

ניתן להתאים את הפלטפורמה בהתאם לשאלה הביולוגית הנדונה. כאשר טעינה מגנטית והפעלת כוח כלליות מספיקות, ניתן להשתמש בחלקיקי-על פלואורסצנטיים מצופים ב-PDA (SPIONs) ללא פונקציונליזציה למטרת התמרת אקטין. כאשר נדרש מיקום תת-תאי בקרבת אזורים עשירים באקטין, ניתן להשתמש במקום זאת בפורמולציה עם פונקציונליזציה של פאלוידין (f-SPIONs). מודולריות זו מהווה יתרון מעשי של הפלטפורמה.

לטכניקה הנוכחית מספר מגבלות. ראשית, מספר החלקיקים המגנטיים שנספגו לתא, כפי שחושב, מייצג ערך ממוצע של האוכלוסייה, בעוד שטעינת חלקיקים ברמת התא הבודד מראה בהכרח הטרוגניות. שנית, ערכי הכוח המגנטי המדווחים במחקר זה הם הערכות מבוססות מודל ולא מדידות ישירות של עומסים מכניים תוך-תאיים. שלישית, פרוטוקול זה תוכנן ופותח בעיקר עבור תאי Schwann שגודלו בתנאי דימוי in vitro. במערכות תרבית תאים תלת-ממדיות צפופות וברקמות, עשוי להידרש אופטימיזציה משמעותית, מכיוון שספיגת ננו-חלקיקים, התפלגותם התוך-תאית, הנגישות האופטית והצימוד המכני עשויים להיות שונים מאלו של תרביות דו-ממדיות. לבסוף, האסטרטגיה האופציונלית למיקוד באקטין מעלה את הסבירות ללוקליזציה של חלקיקים באזורים הקשורים לאקטין, אך אינה מבטיחה מיקוד אחיד או ספציפי של כל המבנים העשירים באקטין בתוך תאים חיים.

למרות מגבלות אלו, פלטפורמת הננו-הפעלה המגנטית הנוכחית מציעה מספר יתרונות מתודולוגיים מובהקים לעומת טכניקות קיימות להפעלת כוחות. לדוגמה, מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) מאפשרת הפעלת כוח מקומית מדויקת, אך דורשת מגע מכני ישיר עם המטרה ולא תמיד ניתנת לשילוב קל עם דימוי תאים חיים לטווח ארוך8. מערכות מבוססות מתיחה ותשתיות הנדסיות יכולות לספק רמזים מכניים ברמת אוכלוסיית התאים, אך הן מסתמכות על ממשקי חומרים שהוגדרו מראש ואינן מתאימות להפעלת כוחות תאיים מרחוק10. פינצטות אופטיות מספקות רזולוציה מרחבית גבוהה להפעלת כוח, אך טומנות בחובן סיכון לנזק רקמתי הנגרם מהלייזר8. שיטות מבוססות מיקרו-פיפט פשוטות יחסית לתפעול, אך בעלות תפוקה ורזולוציית כוח נמוכות יחסית12. מערכות מיקרו-פלואידיות יתרוניות ליצירת מיקרו-סביבות מכניות ספציפיות, כגון מאמץ גזירה ולחץ נוזלים, אך ניצבות בפני אתגרים טכניים בשחזור סביבות תאיות מורכבות ובשילוב של מספר מצבי גירוי מכני11. בניגוד לכך, הפלטפורמה הנוכחית משלבת גירוי מרחוק ללא מגע, הפעלה מגנטית נשלטת, מעקב אחר חלקיקים מבוסס פלואורסצנציה, ותאימות ישירה לדימוי קונפוקאלי בזמן אמת בתוך זרימת עבודה אחת.

ניתן להתאים את אותה אסטרטגיה כללית לסוגי תאים אחרים המגיבים באופן מכני ולמודלים ביולוגיים מורכבים יותר. ייתכן כי היא תהיה ניתנת להרחבה למערכות רב-תאיות צפופות יותר, כגון אורגנואידים עצביים, ציסטות אפיתליאליות, או אפיתליה דמוית כליה של כלב (MDCK). בהגדרות אלו, יידרש אופטימיזציה נוספת עבור חדירת חלקיקים, התפלגות חלקיקים והערכת כוחות בדגימות תלת-ממדיות המצומדות מכנית. למרות אתגרים אלה, סבב העבודה הנוכחי מספק בסיס מעשי לפיתוח רחב יותר של אסטרטגיות גירוי מגנטו-מכניות במערכות חיות.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (מספרי מענק 82571677 ו-82001304 עבור Y.W.), התוכנית המיוחדת לכישרונות רפואיים ובריאות במחוז ג'ילין (מספר מענק JLSRCZX2025-134 עבור Y.W.), ופרויקט תוכנית בית'ון של אוניברסיטת ג'ילין (מספר מענק 2024B19 עבור Y.W.). המחברים מודים לפקולטה לכימיה, אוניברסיטת ג'ילין (המעבדה הממשלתית מרכזית למבנה וחומרים סופרא-מולקולריים), ולמכון צ'אנגצ'ון לכימיה יישומית של האקדמיה הסינית למדעים, על הסיוע בתכנון, סינתזה ואפיון של ננו-חומרים. המחברים מודים גם למכון לרפואה תרגומית בבית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין על הסיוע בדימוי CLSM.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-הקסדקנדיולSigma-Aldrich213748בדרגה טכנית, 90%; משמש בסינתזה של פירוק תרמי
ibidi בגודל 35 מ"מ µ-צלחות פטריibidi80156משמש לתרביות של תאי שוואן (Schwann cells) ולדימות
בנזיל אתרSigma-Aldrich10801498%; ממס עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים
מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקליNikonAXR (Ti2-E)משמש לדימות תאים חיים ודימות פלואורסצנציה 
אלקטרומגנט מותאם אישיתבנייה מותאמת אישיתלא רלוונטיאלקטרומגנט חד-קוטבי קומפקטי ליצירת שדות מגנטיים בעלי מדרגה (גרדיאנט) במודלים של in vitro 
חומצה קרבוקסילית של Cyanine3.5Duofluor Inc.D10128צבע פלואורסצנטי המשמש עבור Fe3O4·הרכבת סופר-חלקיקים של Cy3.5; משקל מולקולרי 593.20; אחסון ב-20 °C, מוגן מאור 
מלח דפרוקסמין מזילאט (Deferoxamine mesylate salt)Sigma-AldrichD9533סוכן קילוטי ברזל המשמש להסרה של ברזל שאינו מופנם ושל ברזל הקשור לממברנה
מד-גאוס דיגיטלימגנטי רחבWT103משמש למדידת צפיפות שטף מגנטי ולכיול השדה המגנטי בעל הגרדיאנט הנוצר על ידי האלקטרומגנט המותאם אישית
דופמין הידרוכלורידSigma-AldrichH8502≥98% (TLC); משמש לציפוי פולידופמין
מכשיר לפיזור אור דינמיMalvern InstrumentsZetasizer Nano-ZSמשמש למדידת קוטר הידרודינמי ו-PDI 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201אינדיקטור סידן המשמש לזיהוי Ca בתאי חיים2+ דימות
ספקטרופוטומטר פלואורסצנציהShimadzuRF-6000משמש לאפיון פוטולומינצנציה 
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר ברזולוציה גבוההJEOLJEM-F200משמש לדימוי HRTEM של מורפולוגיית הננו-חלקיקים והליבה–מבנה קליפה 
ספקטרומטר פליטה אטומית בבס פלזמה עם השראה (ICP-AES)PerkinElmerOptima 3300 DVמשמש לכימות ברזל תוך-תאי
ברזל(III) אצטילאצטונאט, Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097%; חומר מקדים עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים
אינקובטור לשולחן מיקרוסקופ לתאי חייםTOKAI HITTENP&CO2משמש לדימות קונפוקאלי של תאים חיים במהלך גרייה מגנטית 
חומצה אולאיתSigma-AldrichO1008≥99% (GC); ליגנד פני שטח עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים
אולאילאמיןSigma-AldrichO7805דרגת טכנית, 70%; ליגנד עבור סינתזה של ננוחלקיקים
פאלואידין–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281ריאגנט פונקציונליזציה אופציונלי למטרת קישור לאקטין 
Pluronic F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MPמשמש להקל על טעינת Fluo-4 AM עבור מדידת Ca בתאים חיים2+ דימות
ספק כוח רגולטורי DC ניתן לתכנותטונגמןeTM-L605SPL (60 V, 5 A)משמש להזנת האלקטרומגנט המותאם אישית ליצירת שדה מגנטי עם גרדיאנט במערכת in vitro
תאי שוואן RSC96בנק התאים של האקדמיה הסינית למדעיםלא רלוונטיקו תאי שוואן ממקור חולדה 
סודיום דודציל סולפטור (SDS)Sigma-Aldrich436143ריאגנט ACS, ≥99.0%; חומר פעיל שטח למיקרואמולסיה של שמן במים
מגנטומטר SQUIDQuantum Design Inc.MPMS-XLמשמש למדידת היסטרזיס מגנטית ב-300 K 
טולואןSigma-Aldrich244511ללא מים, 99.8%; ממס להרכבת על-חלקיקים (superparticle assembly)
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM)FEIEP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwinמשמש לתצפית על אולטרה-מבנה של רקמות תאיות ועצביות 

מקורות

  1. Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
  2. Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
  3. Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
  4. Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
  5. Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
  6. Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
  7. Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
  8. Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
  9. Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
  10. Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
  11. Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
  12. Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
  13. Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
  14. Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
  15. Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
  16. Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
  17. Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
  18. Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
  19. Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
  20. Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
  21. Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
  22. Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
  23. Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
  24. Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
  25. Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
  26. Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
  27. Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
  28. Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
  29. Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
  30. Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.