פרוטוקול זה מציג פלטפורמה להפעלה ננו-מגנטית תואמת מיקרוסקופ, המשלבת ננו-חלקיקים סופרה-פרמגנטיים פלואורסצנטיים, אלקטרומגנט מכויל ודימוי קונפוקלי בזמן אמת, כדי להמריץ מרחוק ובאופן נשלט תאי Schwann ולנטר באופן דינמי את תגובותיהם למכנו-סנסוריות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה מציג פלטפורמה להפעלה ננו-מגנטית תואמת מיקרוסקופ, המשלבת ננו-חלקיקים סופרה-פרמגנטיים פלואורסצנטיים, אלקטרומגנט מכויל ודימוי קונפוקלי בזמן אמת, כדי להמריץ מרחוק ובאופן נשלט תאי Schwann ולנטר באופן דינמי את תגובותיהם למכנו-סנסוריות.
כוחות מכניים מווסתים באופן קריטי את ההתנהגות התאית, אך שיטות רבות קיימות לגירוי מכני מסתמכות על מגע פיזי ישיר או על סביבות חוץ-תאיות מהנדסות באופן מלאכותי, ובכך מגבילות את הגמישות שלהן במחקרי תאים חיים דינמיים. כאן, אנו מציגים פלטפורמה של ננו-הפעלה מגנטית לגירוי מכני מרחוק, ללא מגע ובשליטה של תאי שוואן (Schwann cells) in vitro. מערך משולב זה מאפשר גירוי מגנטי מרחוק ודימוי תאים חיים מסונכרן באותו סשן ניסיוני. כתב יד זה מתאר את הכנתם של ננו-חלקיקים סופרה-פרמגנטיים פלואורסצנטיים (SPIONs), ואופציונלית, SPIONs פונקציונליים המכוונים לאקטין (f-SPIONs), את בנייתו וכיולו של התקן גירוי אלקטרומגנטי תואם מיקרוסקופ, את הערכת הכוחות המגנטיים ברמת החלקיק הבודד והתא הבודד, ואת השילוב של הפעלה מגנטית עם דימוי קונפוקלי בזמן אמת. תאי שוואן הם תאי גליה בעלי רגישות מכנית גבוהה הממלאים תפקידים חיוניים בפיתוח, בתחזוקה ובתיקון של עצבים פריפריים. ניטור בזמן אמת של תגובותיהם לגירוי מכני הוא קריטי להבנת האופן שבו כוחות מכניים משפיעים על ארגון השלד התאי והתנהגות התאים. פלטפורמה זו מספקת זרימת עבודה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה המכנית של תאי שוואן, וניתן להתאימה לסוגי תאים אחרים המגיבים מכנית ולמערכות רב-תאיות.
רמזים מכניים מווסתים מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל היצמדות, נדידה, שגשוג, התמיינות ופלסטיות פנוטיפית1,2,3. מחקרים במכנוביוֹלוגיה הראו כי הן נוירונים והן תאי גליאה מפגינים רגישות מכנית ותגובתיות בולטות לאורך ההתפתחות4,5,6,7. כדי לבחון כיצד תאים חשים ומגיבים לכוח, פותחו מספר גישות ניסיוניות, כולל מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM), שאיבה באמצעות מיקרופיפטה, פינצטה אופטית, מערכות תרבית מבוססות מתיחה ופלטפורמות מיקרופלואידיות8,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה השתמשו בקו תאי שוואן של חולדה מבוסס (RSC96) ולא כללו משתתפים אנושיים או בעלי חיים חיים. מחקר זה נערך כחלק מפרויקט מחקר רחב יותר הכולל ניסויים בבעלי חיים, אשר אושר על ידי ועדת רווחת בעלי החיים והאתיקה של בית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין (מספר אישור 2022-0045).
1. הכנת סופר-חלקיקים מגנטיים פלורסצנטיים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת ברזולוציה גבוהה (HRTEM) הראתה כי לפורמולציית הננוחלקיקים הסופית היה ליבה מגנטית מצובבת ומעטפת חיצונית לאחר שינוי פני השטח (איור 1). ל-f-SPIONs הסופיים היה קוטר כולל ממוצע של 63.36 ± 16.65 nm, עם ליבה מגנטית עשירה ב-Fe₃O₄ בקוטר של כ-56.60 ± 6.19 nm ומעטפת חיצונית המורכבת מפולידופמין ו-phalloidin-Alexa Fluor 350 בעובי ממוצע של כ-5.79 ± 1.36 nm. תוצאות אלו אישרו את הבנייה המוצלחת של ארכיטקטורת סופר-חלקיק המתאימה להפעלה מגנטית ולהדמיה מבוססת פלואורסצנציה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ננוחלקיקי תחמוצת ברזל מוכרים רבות כננו-חומרים מגנטיים בעלי תאימות ביולוגית נוחה. כחומרי ניגוד נפוצים לבדיקות דימות בתהודה מגנטית, ננוחלקיקי Fe₃O₄ סופר-פרמגנטיים יושמו באופן נרחב באבחון דימויי קליני29,30. במחקר האחרון של הקבוצה שלנו20, הוכח כי f-SPIONs מראים ציטוטוקסיות נמוכה ביותר ובטיחות ביולוגית מצוינת. פלטפורמת ההפעלה הננו-מגנטית, שנבנתה תוך שימוש ב-f-SPIONs כמפעילים מכניים בשילוב עם אלקטרומגנט שניתן לשליטה, הפעילה ביעילות את הדינמיקה ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (מספרי מענק 82571677 ו-82001304 עבור Y.W.), התוכנית המיוחדת לכישרונות רפואיים ובריאות במחוז ג'ילין (מספר מענק JLSRCZX2025-134 עבור Y.W.), ופרויקט תוכנית בית'ון של אוניברסיטת ג'ילין (מספר מענק 2024B19 עבור Y.W.). המחברים מודים לפקולטה לכימיה, אוניברסיטת ג'ילין (המעבדה הממשלתית מרכזית למבנה וחומרים סופרא-מולקולריים), ולמכון צ'אנגצ'ון לכימיה יישומית של האקדמיה הסינית למדעים, על הסיוע בתכנון, סינתזה ואפיון של ננו-חומרים. המחברים מודים גם למכון לרפואה תרגומית בבית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין על הסיוע בדימוי CLSM.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2-הקסדקנדיול | Sigma-Aldrich | 213748 | בדרגה טכנית, 90%; משמש בסינתזה של פירוק תרמי |
| ibidi בגודל 35 מ"מ µ-צלחות פטרי | ibidi | 80156 | משמש לתרביות של תאי שוואן (Schwann cells) ולדימות |
| בנזיל אתר | Sigma-Aldrich | 108014 | 98%; ממס עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים |
| מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקלי | Nikon | AXR (Ti2-E) | משמש לדימות תאים חיים ודימות פלואורסצנציה |
| אלקטרומגנט מותאם אישית | בנייה מותאמת אישית | לא רלוונטי | אלקטרומגנט חד-קוטבי קומפקטי ליצירת שדות מגנטיים בעלי מדרגה (גרדיאנט) במודלים של in vitro |
| חומצה קרבוקסילית של Cyanine3.5 | Duofluor Inc. | D10128 | צבע פלואורסצנטי המשמש עבור Fe3O4·הרכבת סופר-חלקיקים של Cy3.5; משקל מולקולרי 593.20; אחסון ב-20 °C, מוגן מאור |
| מלח דפרוקסמין מזילאט (Deferoxamine mesylate salt) | Sigma-Aldrich | D9533 | סוכן קילוטי ברזל המשמש להסרה של ברזל שאינו מופנם ושל ברזל הקשור לממברנה |
| מד-גאוס דיגיטלי | מגנטי רחב | WT103 | משמש למדידת צפיפות שטף מגנטי ולכיול השדה המגנטי בעל הגרדיאנט הנוצר על ידי האלקטרומגנט המותאם אישית |
| דופמין הידרוכלוריד | Sigma-Aldrich | H8502 | ≥98% (TLC); משמש לציפוי פולידופמין |
| מכשיר לפיזור אור דינמי | Malvern Instruments | Zetasizer Nano-ZS | משמש למדידת קוטר הידרודינמי ו-PDI |
| Fluo-4 AM | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | F14201 | אינדיקטור סידן המשמש לזיהוי Ca בתאי חיים2+ דימות |
| ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה | Shimadzu | RF-6000 | משמש לאפיון פוטולומינצנציה |
| מיקרוסקופ אלקטרונים חודר ברזולוציה גבוהה | JEOL | JEM-F200 | משמש לדימוי HRTEM של מורפולוגיית הננו-חלקיקים והליבה–מבנה קליפה |
| ספקטרומטר פליטה אטומית בבס פלזמה עם השראה (ICP-AES) | PerkinElmer | Optima 3300 DV | משמש לכימות ברזל תוך-תאי |
| ברזל(III) אצטילאצטונאט, Fe(acac)3 | Sigma-Aldrich | F300 | 97%; חומר מקדים עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים |
| אינקובטור לשולחן מיקרוסקופ לתאי חיים | TOKAI HIT | TENP&CO2 | משמש לדימות קונפוקאלי של תאים חיים במהלך גרייה מגנטית |
| חומצה אולאית | Sigma-Aldrich | O1008 | ≥99% (GC); ליגנד פני שטח עבור Fe3O4 סינתזה של ננוחלקיקים |
| אולאילאמין | Sigma-Aldrich | O7805 | דרגת טכנית, 70%; ליגנד עבור סינתזה של ננוחלקיקים |
| פאלואידין–Alexa Fluor 350 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A22281 | ריאגנט פונקציונליזציה אופציונלי למטרת קישור לאקטין |
| Pluronic F-127 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | P3000MP | משמש להקל על טעינת Fluo-4 AM עבור מדידת Ca בתאים חיים2+ דימות |
| ספק כוח רגולטורי DC ניתן לתכנות | טונגמן | eTM-L605SPL (60 V, 5 A) | משמש להזנת האלקטרומגנט המותאם אישית ליצירת שדה מגנטי עם גרדיאנט במערכת in vitro |
| תאי שוואן RSC96 | בנק התאים של האקדמיה הסינית למדעים | לא רלוונטי | קו תאי שוואן ממקור חולדה |
| סודיום דודציל סולפטור (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | ריאגנט ACS, ≥99.0%; חומר פעיל שטח למיקרואמולסיה של שמן במים |
| מגנטומטר SQUID | Quantum Design Inc. | MPMS-XL | משמש למדידת היסטרזיס מגנטית ב-300 K |
| טולואן | Sigma-Aldrich | 244511 | ללא מים, 99.8%; ממס להרכבת על-חלקיקים (superparticle assembly) |
| מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) | FEI | EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin | משמש לתצפית על אולטרה-מבנה של רקמות תאיות ועצביות |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב