מאמר שיטה

בדיקת תרבית משותפת מבוססת תמונה בזמן אמת לכימות הריגה אפופטוטית המתווכת על ידי לימפוציטים חודרי גידול של אורגנואידים של גידולים המופקים מחולה

128 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71688

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטת דימוי של תאים חיים המבוססת על תמונות, לצורך כימות ציטוטוקסיות המתווכת על ידי לימפוציטים חודרי גידול (TIL) נגד אורגנואידים של גידולים המופקים מחולים, ובכך מאפשר ניתוח קינטי בזמן אמת של אפופטוזיס לצורך פרופיל חיסוני תפקודי והערכה של טיפולים אימונו-מודולטוריים.

תקציר

הבנת היכולת התפקודית של לימפוציטים חודרי גידול (TILs) לזהות ולהשמיד תאי גידול אוטולוגיים היא מרכזית לקידום אימונותרפיה מותאמת אישית. מטרתו של פרוטוקול זה היא לספק שיטת דימוי של תאים חיים מבוססת תמונה, המודדת בזמן אמת הריגה אפופטוטית תלוית-caspase-3 המתווכת על ידי TILs נגד אורגנואידים של גידולים המופקים מחולה (PDTOs). שיטה זו משלבת הליכים מבוססים לבידוד והתרחבה של PDTOs ו-TILs עם מערכת תרבית משותפת תלת-ממדית סטנדרטית וזיהוי אפופטוזה אוטומטי מבוסס פלואורסצנציה.

אורגנואידים של גידול נזרעים בלוחות 96 בארות התואמים לדימות ומסומנים בסמן גידול אדום, בעוד שתאי TIL שהורחבו מתווספים ביחסי אפקטור-מטרה (effector-to-target) מוגדרים בנוכחות מצע פלורסצנטי ירוק המופעל על ידי caspase-3. תרביות משותפות מדוימות מדי 4 h באמצעות מערכת לניתוח תאים חיים כדי ללכוד ערוצי ניגודיות פאזה (phase-contrast) ופלורסצנציה כפולה. ניתוח תמונות כמותי מזהה מבני גידול חיוביים לאדום ומחשב את הפרופורציה של אובייקטי גידול אפוטוטיים חיוביים כפולים לאדום/ירוק לאורך זמן. חזרות טכניות וביולוגיות מתאימות נכללות, יחד עם קו בסיס, אפוप्टוזיס ספונטני, ובקרות הרג שליליות וחיוביות כדי להבטיח את דיוק הבדיקה.

על ידי שימור ההטרוגניות של הגידול בתוך המבנה התלת-ממדי של ה-PDTOs, תוך מתן אפשרות לכימות לאורך זמן, פרוטוקול זה מספק מערכת רלוונטית פיזיולוגית לאפיון תפקודי של אינטראקציות בין גידול לתאי TIL הספציפיים למטופל, ולבחינת חומרים אימונומודולטוריים המגבירים את החסינות נגד הגידול.

מבוא

האימונותרפיה של הסרטן עברה טרנספורמציה בעקבות פיתוחם של מעכבי נקודות בקרה חיסוניות (ICIs) המכוונים למסלולי PD-1/PD-L1 (protein 1/programmed death-ligand 1) ו-CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), אשר מחזקים תגובות אנטי-גידוליות אנדוגניות המתווכות על ידי תאי T בסוגים מרובים של גידוליים מוצקים1,2,3. למרות תגובות עמידות בתת-קבוצה של חולים, רובם אינם משיגים תועלת קלינית משמעותית, וסממנים ביולוגיים (biomarkers) חזויים ומאומתים לזיהוי פרוספקטיבי של המגיבים נותרו צורך שטרם נענה. לכן, בדיקות תפקודיות המודדות באופן ישיר הריגה של גידולים המתווכת על ידי תאי T הן כלים קריטיים לגילוי סממנים ביולוגיים ולהערכה פרה-קלינית של שילובים טיפוליים שנועדו להגביר תגובות חיסוניות ציטוטוקסיות.

בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות, כולל שחרור של chromium-51, כימות של lactate dehydrogenase (LDH), ובדיקות חיוניות מבוססות ATP עם פליטה של אור כגון CellTiter-Glo, נמצאות בשימוש נרחב לכימות הריגה בתיווך מערכת החיסון, אך הן מייצרות מדידות כוללות בנקודת זמן אחת, שחסרות רזולוציה מרחבית וזמנית4,5,6. באופן דומה, בדיקות הריגה מבוססות flow cytometry בנקודת סיום מכמתות מוות תאי בנקודת זמן קבועה ואינן מתאימות לפורמטים של תרביות תלת-ממדיות. בנוסף, שורות תאי גידול דו-ממדיות, הנמצאות בשימוש נרחב בבדיקות אלו, אינן משחזרות באופן מלא את ההטרוגניות הפנימית של גידולים ראשוניים מחוליים.

אורגנואידים של גידולים ממקור חולה (PDTOs) הפכו לפלטפורמת ex vivo רלוונטית מבחינה קלינית, המשמרת באופן נאמן יותר את השינויים הגנומיים, ההטרוגניות התאית ופנוטיפי התגובה לתרופות של הגידול המקורי בהשוואה למודלים קונבנציונליים של שורות תאים.7,8,9,10,11,12מחקרים אחרונים הדגימו שניתן לבצע תרבית משותפת של PDTOs עם תאי מערכת חיסון אוטולוגיים כדי לדגמן תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות. ex vivoעם זאת, מרבית הגישות שפורסמו מסתמכות על מדידות חיות בנקודת סיום או על ניתוחים של דימות קונפוקאלי הדורשים עבודת כפיים מאומצת, דבר המגביל את התפוקה הניסויית ומונע ניטור דינמי של תגובת ההריגה13,14,15,16.

כאן אנו מתארים בדיקת תרבית משותפת (co-culture) מבוססת תמונות בזמן אמת, לקריאה כמותית המופקת מדימות של ציטוטוקסיות ממתווכת תאי T נגד PDTOs המסומנים פלואורסצנטית. השיטה משתמשת במיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת time-lapse בשילוב עם מצע פלואורסצנטי המופעל על ידי caspase-3, כדי להפיק עקומות אפופטוזיס קינטיות ברזולוציה של אורגנויד בודד לאורך חלון תצפית של 12–36 h. בהשוואה לבדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות, פלטפורמה זו מציעה מספר יתרונות טכניים: היא משמרת את ארכיטקטורת הגידול התלת-ממדית לאורך הבדיקה, מפרטת את הדינמיקה הזמנית של השראת האפופטוזיס, מאפשרת יחסי effector-to-target מוגדרים, ובעלת פוטנציאל ליישום עתידי בפורמטים של סריקת תרופות בקיבולת בינונית (medium-throughput), כולל מעכבי נקודות בקרה חיסוניות (immune checkpoint inhibitors) וחומרים ממוקדים שנבדקים לבדם או בשילוב. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים העוסקים באימונו-אונקולוגיה, רפואה מותאמת אישית פונקציונלית וביולוגיה של תאי T, וניתן ליישמו במעבדות המצוידות בתשתית סטנדרטית לתרביות רקמה ובמערכת לדימויי פלואורסצנציה של תאים חיים.

בידוד ותרבית של אורגנואידים של גידולים מהחולה (PDTOs) ותאי לימפוציטים חודרי גידול (TILs) תואמים מדגימות של גידולים אנושיים הם מתודולוגיות מבוססות היטב ומפורסמות באופן נרחב. פרוטוקולים חסונים המתארים דיסוציאציה מכנית ואנזימטית של הגידול, הטמעה תלת-ממדית במטריצת קרום בסיס, הרחבה ארוכת טווח של אורגנואידים, ובידוד מקבילי והרחבה ex vivo של TILs תוקפו באופן נרחב במגוון סוגי גידולים. שיטות אלו משמרות באופן מהימן את ההטרוגניות, הארכיטקטורה והספציפיות החיסונית של תאי הגידול, והותאמו למערכות תרבית משותפת (co-culture) כדי להעריך אינטראקציות בין הגידול למערכת החיסון. לפיכך, במחקר זה, בידוד והרחבה של אורגנואידים ו-TILs בוצעו על פי פרוטוקולים שפורסמו ותוקפו בעבר, ללא שינויים מהותיים אלא אם צוין אחרת.

פרוטוקול

ביצענו את כל ההליכים הכוללים רקמת גידול אנושית ותאי לימפוציטים חודרי גידול (TILs) בהתאם לאישור ועדת הלסינקי/ועדת אתיקה מוסדית (IRB#1305013903) ותקנות בטיחות ביולוגית מוסדיות, והשגנו הסכמה מדעת בכתב לפני רכישת הרקמה. הגוף המאשר היה ועדת האתיקה המוסדית של Weill Cornell Medicine (המפורטת כ-Institutional Review Board (IRB), Weill Cornell Medicine, New York, NY), תחת פרוטוקול #1305013903. הדגימות המכוסות תחת פרוטוקול זה כוללות שאריות רקמת גידול שהושגו בניתוחים של טיפול סטנדרטי או בהליכי מחקר לאחר הערכה פתולוגית שגרתית; רקמות קפואות מארכיון קיים או רקמות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין (FFPE) מ-Weill Cornell Medical College או ממוסדות אחרים; דם, ממנו מבודדים ומאחסנים תאים מונונוקלאריים של דם פריפרי (PBMCs), סרום ופלסמה; מטושים מהלחי, רוק, שתן או רקמה שפירה המשמשת כביקורת במקרים מסוימים; ועבור משתתפים הרשומים לתוכנית נתיחה מהירה (Rapid Autopsy Program), רקמה שנאספה בנתיחה שנערכה בתוך 6 שעות (עד 24 שעות) מהמוות. ה-TILs ששימשו במחקר זה הורחבו מדגימות רקמת הגידול שתוארו לעיל. מזהים אישיים הוסרו מכל הביו-דגימות, אשר קושרו לזהות המשתתף רק באמצעות מספר זיהוי פציינט ייחודי בהתאם לתקני HIPAA ותקנים מוסדיים; הנתונים זוהו מחדש רק בעת הפקת הדוח. כל הניסויים נערכו תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית מאושרת מסוג Class II. חומרים בסיכון ביולוגי הושלכו בהתאם למדיניות המוסדית. ראו את טבלת החומרים ואת קובץ משלים 1 עבור החומרים וההכנה של תמיסות הבאפר ומצעי הגידול ששימשו בעבודה זו.

1. סימון פלואורסצנטי ושחזור של אורגנואידים של גידולים מהחולה (PDTOs) (איור 1)

  1. הסרת Matrigel ישן והתחלת פירוק תאים.
    1. הנח את פלטת התרבית ב-BSC. שאב בזהירות את המדיום מהבארות מבלי להפריע לטיפות ה-Matrigel.
    2. הוסף 1–2 mL של אנזים לפירוק תאים בטמפרטורת החדר לכל בארה. בצע פיפטינג של עלייה וירידה שוב ושוב באמצעות P1000 וגורד תאים (cell scraper) סטרילי כדי לפרק לחלוטין את טיפות ה-Matrigel.
    3. העבר את תערובת התאים למבחנה קונית של 15 mL מסומנת. הוסף 1 mL נוסף של אנזים לפירוק תאים לכל בארה כדי לשטוף תאים שאריתיים והעבר לאותה מבחנה. התאם את הנפח כדי להבטיח שנאספו לפחות 5 mL של אנזים לכל בארה. סגור את המבחנה בפקק ונער ידנית לערבוב יסודי.
  2. פירוק אנזימטי
    1. הנח את המבחנה באמבט מים של 37 °C. הדגר למשך 10 דקות ונער את המבחנה ידנית כל 2–3 דקות כדי לעודד את הפירוק. עקוב ויזואלית אחר פירוק מלא של הצברים.
    2. לאחר הפירוק, סבב בצנטריפוגה במהירות של 300 × g למשך 3 דקות ב-4 °C. בדוק את המבחנה לאחר הסבב.
    3. אם לא נוצר משקע (pellet) וענן ה-Matrigel נותר, הוסף אנזים נוסף לפירוק תאים. נער והחזר לאמבט המים למשך 3–5 דקות. אם המשקע עדיין לא נוצר, הנח את המבחנה על קרח למשך 3 דקות כדי לאפשר למטריצה לשקוע.
  3. ספירת תאים והערכת חיוניות
    1. שאב את העלייה (supernatant) מבלי להפריע למשקע. הוסף 10 mL של מדיום שטיפה +++.
    2. סבב בצנטריפוגה במהירות של 300 × g למשך 3 דקות ב-4 °C. השהה מחדש את המשקע ב-1 mL של PBS. בצע טריטורציה עדינה כדי לקבל תרחיף תאים בודדים.
    3. ערבב 15 µL של תרחיף התאים עם 15 µL של 0.4% Trypan Blue. טען 10 µL לכל תא של למספירה (counting slide). ספור תאים חיים באמצעות סופר אוטומטי או המוציטומטר.
    4. שמור את התאים על קרח במהלך הספירה. הנח פלטת 6 בארות שאינה מיועדת לרקמות ומטופלת ב-37 °C כדי להתחמם לקראת הזריעה המאוחרת.
  4. סימון פלואורסצנטי של תאי גידול
    1. התאם את ריכוז התאים ל-1 × 106 תאים חיים/mL ב-PBS.
    2. המס מחדש צבע CellTrace Far Red עם 20 µL של DMSO להכנת תמיסת סטוק בריכוז 1 mM. בצע וורטקס וסבב בצנטריפוגה לזמן קצר.
    3. הוסף 1 µL של תמיסת הסטוק 1 mM לכל 1 mL של תרחיף תאים (1 × 106 תאים/mL), לקבלת ריכוז צביעה סופי של 1 µM. הפוך בעדינות לערבוב. הדגר 30 דקות ב-37 °C תוך הגנה מאור.
    4. הוסף 5 נפחים של PBS כדי לשטוף את הצבע. סבב בצנטריפוגה במהירות של 300 × g למשך 5 דקות. שטוף פעמיים עם PBS.
    5. הערך את יעילות הסימון. משקע תאים צבוע באופן גלוי משמש כקריטריון קבלה איכותי.
    6. קבע את החיוניות לאחר הצביעה באמצעות שיטת הדחת Trypan Blue ורשום את החיוניות שנצפתה (80%).
      ​הערה: העבר את התאים לשלב ההטמעה רק אם משקע התאים מראה צביעה אחידה והחיוניות לאחר הצביעה היא ≥80%.
  5. יצירת תרחיף מטריצה תאית בתלת-ממד
    1. השהה מחדש את המשקע בנפח מתאים של מדיום ספציפי לתרבית בהתאם לגודל המשקע (למשל, עבור 900,000 תאים, הוסף 500 µL של מדיום; עבור 1.8 מיליון תאים, הוסף 1,000 µL של מדיום).
    2. הוסף Matrigel מקורר ביחס של 1:2 (מדיום:מטריצה) לריכוז סופי של 67% Matrigel. ערבב ביסודיות אך בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות (יעד טיפוסי: 300,000 תאים לכל בארה בפלטת 6 בארות).
  6. זריעת טיפות מטריצה בתלת-ממד
    1. באמצעות פיפט של 200 µL, זרע טיפות של 100 µL: 5 טיפות לכל בארה בפלטות של 6 בארות. הנח את הפלטות באינקובטור של 37 °C למשך 5 דקות.
    2. הפוך את הפלטות למצב הפוך והדגר למשך 40 דקות נוספות עבור פולימריזציה מלאה. אשר את נוכחות התאים המוטמעים באמצעות מיקרוסקופיה.
    3. הוסף 4 mL של מדיום לכל בארה (פלטת 6 בארות) והחזר את הפלטות לאינקובטור. תרבת למשך 72 שעות כדי לאפשר היווצרות אורגנואידים בגודל 100–300 µm.

2. הכנת אורגנואידים לבדיקת הריגה (killing assay)

  1. המסת מטריקס של קרומי הבסיס תוך שימור מבנה תלת-ממדי של אורגנואידים.
    1. הוציאו את פלטות האורגנואידים מהאינקובטור והעבירו אותן לקלסון ביולוגי (biosafety cabinet). שאבו בזהירות את מצע התרבית מכל באר, ללא הפרעה של כיפות ה-Matrigel.
      הערה: הקצה והשאר באר אחת ללא טיפול לצורך דיסוציאציה מלאה וספירת תאי גידול (ראה סעיף 2.2).
    2. הוסיפו 1 מ"ל של Cell Recovery Solution קר מאוד לכל באער כדי להמיס את מטריצת קרום הבסיס. פצלו את כיפות המטריצה באופן מכני באמצעות פיפטת P1000 וגרד-תאים (cell scraper) סטרילי, עד שהמטריצה תהיה מנותקת לחלוטין מפני השטח של הפלטה.
    3. העבירו את התוהית מעד שלוש בארות לשפופרת קונית של 15 מ"ל שסומנה מראש ונשמרה על קרח. הוסיפו לשפופרת 8 מ"ל נוספים של Cell Recovery Solution קר מאוד. הניחו את השפופרת במצב אופקי על רוקר (rocker) ב- 4 °C במשך 30 דקות כדי להבטיח המסה מלאה של המטריצה.
      הערה: יש להגן על הדגימות מאור אם בוצע סימון פלואורסצנטי.
    4. לאחר הדגירה, סבבו בצנטריפוגה ב-300 × ג במשך 3 דקות ב- 4 °Cיש לשאוב בזהירות את העלייה (supernatant) באופן מלא, מבלי להפריע למשקע האורגנואידים.
    5. יש להשעות בעדינות את המשקע בתווך PDTO מלא, תוך שימוש בפיפוט איטי עם פיית פיפט רחבה (wide-bore pipetting), כדי לשמור על המבנה התלת-ממדי השלם של האורגנואידים.
      קריטי: יש להימנע מפיפטור או מערבוב (vertexing) מרובים, שכן אלו פוגעים במבנה התלת-ממדי.
      אם המטריצה השיורית נראית לעין לאחר הצנטריפוגציה, חזור על האינקובציה ב-Cell Recovery Solution קר למשך 10–15 דקות נוספות. בצע צנטריפוגציה שנית והערך מחדש.
  2. קבע את מספר תאי הגידול החיוניים והתאם את ריכוז ת сусפנזיית האורגנואידים.
    1. בצע דיסוציאציה מלאה של הבאר השמורה באמצעות אנזים לדיסוציאציית תאים כפי שמתואר בסעיף 1. הדגר ב- 37 °C במשך 5–7 דקות תוך כדי טריטורציה (trituration) לסירוגין.
    2. נטרלו באמצעות מצע PDTO מלא. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 300 × ג למשך 5 דקות. השהו ב-1 מ"ל מצע גידול.
    3. ערבב 15 µL של תרחיף תאים עם 15 µL של 0.4% Trypan Blue. ספרו את התאים החיוניים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) או סופר תאים אוטומטי.
    4. על סמך ספירת התאים החיים, חשבו את הדילול הנדרש כדי להגיע לריכוז של 200,000 תאים חיים למ"ל במצע PDTO מלא
      הערה: דוגמה לחישוב: עבור יעד של 20,000 תאי גידול לביורט ב- 100 µLנדרשת ריכוז עבודה של 200,000 תאים/מ"ל. עבור זריעה של פלטת דימוי מלאה של 96 בארות (60 הבארות הפנימיות), נפח הבדיקה הנדרש הוא 6 מ"ל בסך הכל (100 µL × 60 בארות), אך עם נפח מת לנסיגה (dead volume) של 20%, הכין 7.2 מ"ל. לפיכך, מספר התאים הנדרש הוא 6 מ"ל × 200,000 תאים/מ"ל = 1.2 × 106 תאים ו-7.2 מ"ל × 200,000 תאים/מ"ל = 1.44 × 106 תאים.
  3. זריעת אורגנואידים לבדיקת הרג (Killing Assay)
    ​הערה: השתמשו בלוחות דימוי בעלי 96 בארות עם דפנות שחורות ותחתית שקופה. העבירו כל תנאי למספר של שלושה חזרות טכניות לפחות.
    1. בעזרת פיפט רב-ערוצי, העבר 100 µL של תרחיף אורגנואידים לכל באר כדי להגיע ל-20,000 תאי גידול חיוניים לבאר.
    2. מלאו את הבארים החיצוניות ביותר של הפלטה ב- 200 µL של PBS סטרילי כדי למזער אידוי ואפקטים של קצוות.
    3. אשרו ויזואלית את ההתפלגות האחידה תחת המיקרוסקופ.
    4. אפשרו לאורגנואידים לשקוע ב- 37 °C במשך 10–30 דקות לפני הוספת תאי T.
  4. שמירה על התרחבות רציפה של האורגנואידים.
    1. קחו את תרחיף התאים הבודדים שהופק במהלך הספירה. השהו את התאים מחדש בתווך ייעודי לתרבית. הוסיפו Matrigel מקורר לריכוז סופי של 67%.
    2. העבירו לפלטות תליה של 6 בארות שחוממו מראש, בריכוז של 100,000 תאים לבערה. בצעו פולימריזציה וכסו במצע גידול כפי שמתואר בסעיף 1. החזירו לאינקובטור להמשך הרחבה.

3. הכנת תאי T מגיבים לגידול

  1. הרחבה ואיסוף של לימפוציטים חודרי גידול (TILs)
    1. בודד והרחב TILs מדגימות גידול באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר13,14.
    2. תעד את המאפיינים הבאים עבור כל הכנת TIL: חיוניות לאחר הרחבה: ≥80% (הדחה של Trypan Blue); טוהרה של CD3⁺: ≥85%; התפלגות CD4⁺/CD8⁺: ≥30% תאי T מסוג CD8⁺, כאשר יחס ה-CD4:CD8 מתועד; משך ההרחבה ותנאי התרבית: 10–14 ימים ב-RPMI-1640 מלא בתוספת 10% סרום AB אנושי ו-IL-2 אנושי רקומביננטי (600 IU/mL) בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder-free); פנוטיפ של אקטיבציה/תשישות: PD-1 ≤ 50%, TIM-3 ≤ 30%, ו-LAG-3 ≤ 20% מהתאים מסוג CD3⁺ בזמן הבדיקה; סממני אקטיבציה (למשל, CD69 או CD25) ניתנים לגילוי לאחר גירוי; ראיות לתגובתיות לגידול: פעילות מדידה ספציפית לאנטיגן לפחות במבחן תפקודי אחד (למשל, עלייה בייצור IFN-γ, ביטוי מוגבר של CD137/4-1BB, דה-גרנולציה של CD107a, או ציטוטוקסיות נגד תאי גידול אוטולוגיים).
    3. אשר שכל PDTO תורבת יחד באופן בלעדי עם הכנת ה-TIL האוטולוגית שלו.
      הערה: העדף אסטרטגיות הרחבה ללא תאי מאכיל כדי לשמר אוכלוסיות ציטוטוקסיות של CD8+. פרוטוקולים המשתמשים ב-PBMCs מאכיל שהוקרנו עלולים להטות את ההרחבה לכיוון תאי T מסוג CD4+. מערכות ללא תאי מאכיל משמרות טוב יותר תאי T מסוג CD8+.
      הגבל את הרחבת ה-TIL למקסימום 14 ימים כדי למנוע פנוטיפים של תשישות ואובדן של תפקוד ציטוטוקסי.
    4. ביום הבדיקה, אסוף תאי T מבקבוקי התרבית. העבר את התאים למבחנות קוניות של 15 mL. סבב בצנטריפוגה במהירות 300 × g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שאב את העלייה באופן מלא.
  2. הכנת תאי T למבחן תפקודי.
    1. שחזר את המשקע משלב 3.1.4 ב-1 mL של מצע בסיסי לתאי T (RPMI 1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep).
      הערה: ודא שהמצע אינו מכיל IL-2, IL-15, ציטוקינים, חרוזי anti-CD3/CD28, או תאי מאכיל.
      ​קריטי: ציטוקינים שיריים או חרוזי אקטיבציה יעצימו באופן מלאכותי את הציטוטוקסיות ויטעה את פרשנות הבדיקה.
    2. קבע את ריכוז התאים והחיוניות באמצעות Trypan Blue. המשך רק אם החיוניות היא ≥ 80%.
  3. הכנת יחסי אפקטור למטרה (E:T).
    1. הגדר את יחס ה-E:T כתאי T:תאי גידול.
      הערה: מספר תאי הגידול המשמש לחישוב יחס ה-E:T מוערך מבאר ייחוס מפורקת לחלוטין שעובדה במקביל (סעיף 2.2). מכיוון שאורגנואידים נזרעים כמבנים תלת-ממדיים שלמים, לא ניתן לקבוע את מספר תאי הגידול ישירות בתוך בארי תרבית משותפת בודדים מבלי להפריע לבדיקה. ריכוז תאי הגידול המוערך שהתקבל מבאר הייחוס מיושם באופן אחיד לכל הבארי שהוכנו מאותה תרחיף אורגנואידים מאוחד.
      1. עבור יחס E:T של 2:1 עם 20,000 תאי גידול לבאר, הוסף 40,000 תאי T לבאר. הכן תאי T בריכוז של 400,000 תאים/mL כדי להעביר 100 µL לבאר; לפיכך, 400,000 תאים/mL × 0.1 mL = 40,000 תאים.
      2. במידה וזורעים פלטת דימוי מלאה של 96 באריים (60 באריים פנימיים), נפח תאי ה-T הנדרש הוא 6 mL, ועם 20% נפח מת, נפח תאי ה-T הוא 7.2 mL.
        תאי T נדרשים: 6 mL × 400,000 תאים/mL = 2.4 × 106 תאים
        7.2 mL × 400,000 תאים/mL = 2.88 × 106 תאים
        הערה: יחס ה-E:T המוערך כפוף לשונות מובנית הקשורה לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית, כולל שונות בגודל האורגנואידים (בדרך כלל 100–300 µm בקוטר), אובדן תאים במהלך המסת Matrigel ושטיפה (סעיף 2.1), ושונות מינורית בפיפטור ובשקיעת תאים במהלך הכנת הפלטה.
        ​כדי למזער את השונות, זרע לפחות שלוש חזרות טכניות לכל תנאי, השתמש בקצות פיפטה רחבים ובשחזור עדין כדי לשמר את שלמות האורגנואידים, ואשר ויזואלית התפלגות אחידה של אורגנואידים בין הבאריים לפני הוספת תאי T (סעיף 2.3).
  4. הכנת ריאגנט לגילוי caspase-3.
    1. השתמש במצע Caspase-3; ריכוז מאגר: 200 µM כדי להכין תמיסת עבודה על ידי הוספת המצע ישירות לתרחיף תאי ה-T כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM בתרחיף תאי ה-T. ערבב בעדינות.
      הערה: הגן מאור בכל עת.
  5. אופציונלי: סריקת תרופות או מחקרי מודולציה חיסונית
    ​הערה: ניתן להתאים בדיקה זו להערכת מעכבי מולקולות קטנות (למשל, מעכבי קינאז, מודולטורים מטבוליים), מעכבי נקודות בקרה חיסוניות (למשל, anti-PD-1, anti-PD-L1), וטיפולים משולבים.
    1. דגרי מראש את התרופות עם האורגנואידים למשך 24–72 שעות לפני פירוק המטריצה והוספת תאי T, או הוסף אותם בו-זמנית עם תאי ה-T.
    2. כלול בקרים של vehicle בלבד לכל תנאי.
    3. בבדיקה של מעכבי נקודות בקרה חיסוניות, אשר את הביטוי של המטרה (למשל, PD-L1) על האורגנואידים ושל PD-1 על תאי T לפני הבדיקה.

4. הקמת תרבית משותפת (co-culture) ובקרות ניסוייות.

  1. הקמת תרבית משותפת (Co-culture)
    1. הוצא את פלטת הדימות בעלת 96 הבארים שבה נזרעו האורגנואידים מהאינקובטור והעבר אותה לקבינת בטיחות ביולוגית. השהה בעדינות את תרחיף תאי ה-T שהוכן (סעיף 3) מיד לפני הזריעה כדי להבטיח פיזור הומוגני (איור 2A).
    2. בעזרת פיפט רב-ערוצי, הוסף 100 µL של תרחיף תאי T (המכיל את מצע הקספאז בריכוז 2 µM) לכל באר המכילה 100 µL של אורגנואידים. לאחר ההוספה, הקש בעדינות על הפלטה 2–3 פעמים כדי להבטיח פיזור תאים אחיד.
      הערה: הימנע מנגיעה בתחתית הבאר כדי למנוע פגיעה באורגנואידים. אין לבצע פיפטור מעלה ומטה בתוך הבארים. טלטול מוגבר פוגע בשלמות האורגנואידים ומשנה את קינטיקת חדירת תאי ה-T.
    3. העבר מיד את הפלטה למערכת דימות של תאים חיים כדי למזער תנודות בטמפרטורה.
      ​הערה: ריכוזים סופיים בבאר לאחר ערבוב ביחס של 1:1: שילוב של 100 µL מתרחיף אורגנואידים (בתווך Complete Organoid) עם 100 µL מתרחיף תאי T (בתווך בסיסי לתאי T) מחצה את הריכוז של כל רכיב. הריכוזים הסופיים הם: B27 Supplement 0.5X; Nicotinamide 5 mM; glutamine substitute 0.5X; Penicillin/Streptomycin 50 U/mL / 50 µg/mL; HEPES 5 mM; N-Acetylcysteine 0.625 mM; Primocin 50 µg/mL; FGF-Basic (FGF-2) 0.5 ng/mL; FGF-10 10 ng/mL; PGE2 0.5 µM; SB202190 5 µM; EGF 25 ng/mL; Y-27632 5 µM; A-83-01 250 nM; NRG1 5 ng/mL; Noggin ו-R-Spondin 5% v/v כל אחד; FBS (מתווך תאי T) 5%; מצע caspase-3 בריכוז סופי בבאר של 1 µM.
      1. הגדר רכישה קינטית בתוכנת הדימות של תאים חיים על ידי בחירה ב-Scan on Schedule כדי לאפשר דימות חוזר לאורך כל משך הבדיקה (איור 3B), בחר סוג סריקה Standard לתאימות בין פאזה לפלואורסצנציה (איור 3C), והגדר ערוצי Phase, Green ו-Red בהגדלה של 10× עם זמני רכישה מותאמים לכל ערוץ (איור 3D).
      2. הגדר את זמן רכישת הפלואורסצנציה (חשיפה) לכל ערוץ לכ-300–400 ms עבור ערוצי ה-Green וה-Red, ואשר כי נבחרה עדשה של 10× (כיול תמונה 1.24 µm/px ב-10×).
        הערה: מערך הנתונים המייצג נרכש במערכת ניתוח תאים חיים המוזכרת (ראה טבלת החומרים). ניתוח התמונות בוצע באמצעות ה-Basic Analyzer עם הגדרת ניתוח שמורה (בשם red-green-overlap-Bladder).
      3. הגדר את הבארים כך שיירכשו ארבע תמונות לכל באר פנימית בפלטת 96 הבארים, כאשר הסריקות יחזרו מדי 2 h למשך עד 36 h (איור 3A,E).
      4. התחל את ניתוח התמונות על ידי יצירת הגדרת ניתוח חדשה (new Analysis Definition) והפעלת ערוצי Phase, Green ו-Red (איור 4A,B).
      5. בצע אופטימיזציה לפרמטרי הסגמנטציה של הערוץ האדום, כולל ספי thresholds של שטח ו-מסנני החרגת קצוות, כדי לבודד עצמי גידול משאריות ומצמדים (doublets) (איור 4C).
      6. עבור הערוץ האדום (גידול, CellTrace Far Red), הגדר את סוג הסגמנטציה (Segmentation Type) ל-Surface Fit עם Threshold של 2.0 RCU; הפעל Edge Split עם Edge Sensitivity = 0; הגדר Hole Fill = 0 µm2 ו-Adjust Size = 0 pixels; והחל מסנן שטח מינימלי לעצמים של 50 µm2 (ללא מסנני שטח מקסימלי, אקסצנטריות או עוצמה).
      7. עבור הערוץ הירוק (NucView 488 caspase-3/7), צור סגמנטציה ירוקה כאשר סוג הסגמנטציה מוגדר כ-Surface Fit ו-Threshold של 2.0 GCU; הפעל Edge Split עם Edge Sensitivity = 0; הגדר Hole Fill = 0 µm2 ו-Adjust Size = 0 pixels; ואל תחל מסנני שטח או עוצמה.
      8. הגדר את קריאת הגידול האפופטוטי כעצמים כפולי-חיוביים לירוק ואדום (Green + Red double-positive). אל תחל מסנני שטח או עוצמה נוספים על החפיפה. אחת את קריטריוני החפיפה מול בארי ביקורת של אפופטוזה ספונטנית והריגה חיובית, ולאחר מכן החל את הגדרת הניתוח באופן אחיד על כל הבארים.
      9. הגדר מדדי ניתוח עבור שני הערוצים כדי לכמת את פרופורציית העצמים האפופטוטים הכפולי-חיוביים לאדום/ירוק; בחן את שכבות הסגמנטציה כדי לוודא זיהוי מדויק של עצמי הגידול (איור 4D).
      10. בחר זמני סריקה ובארים כך שיכסו את כל נקודות הזמן הניסיוניות (איור 4E), ואשר כי ניתן לגשת לניתוחים שהושלמו לצורך סקירה וייצוא נתונים בטבלה או בגרף (איור 4F,G).
      11. ייצא את נתוני הניתוח ברמת העצם וברמת הבאר (לכל נקודת זמן) לצורך כימות בהמשך.

תוצאות

תרביות של אורגנואידים של גידולים ששימשו לתוצאות המוצגות כאן הוקמו והורחבו מעבר למעבר 5 ואוחסנו ביותר מ-6 מבחנות הקפאה בריכוז של 1 × 106 תאים למבחנה, כאשר התרביות הורחבו מחדש מהפשרה עבור כל בדיקה. זהות אפיתליאלית ממאירה והיעדר צמיחה יתרה של תאים אפיתליאליים נורמליים או תאי סטרומה אושרו באמצעות ריצוף ממוקד, אשר הדגים שימור של המוטציות הסומטיות שהיו נוכחות בגידול ההורה, ובאמצעות הטמעה היסטולוגית, שהראתה מורפולוגיה של אורגנואידים התואמת את הפתולוגיה של הגידול המקורי; כל השורות אושרו כמיקום נטול מיקופלסמה לפני השימוש. תרביות שהפגינו מורפולוגיה אפיתליאלית נורמלית או שנכשלו בשימור המאפיינים המולקולריים של גידול ההורה זוהו והוצאו מהמחקר, ובכך הופחתה למינימום זיהום של תאים שאינם תאי גידול בבדיקה.

כל התוצאות המוצגות (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4, ו-איור 5>) הופקו מזוג תואם אחד של אורגנואידים-TIL שהופקו ממטופל אחד עם אדנוקרצינומה של הריאה. דגימת הגידול הושגה מכריתה כירורגית שבוצעה ללא טיפול ניאואדג'ובנטי מקדים, והאורגנואידים היו במעבר 21. האורגנואידים הוחזקו בתרבית למשך כ-12 שבועות מהבידוד הראשוני ועד לבדיקה המוצגת (מעבר 21). תאריך כריתת הגידול נחשב למידע רפואי מוגן ולכן אינו מדווח.

בעקבות הרחבה חוזרת, ה-PDTOs מאוחזרים, נספרים ונזרעים בלוחות דימוי בעלי 96 בארות. TILs מוכנים במקביל ביחס של 2:1 בין תאי אפקטור למטרה, כאשר מצע NucView 488 caspase-3 מתווסף מיד לפני הקמת התרבית המשותפת (איור 2A). תמונות מייצגות מבארה בודדת בנקודת זמן ביניים מדגימות את תפוקת ארבעת הערוצים הצפויה: ניגודיות פאזה מאשרת את נוכחות האורגנוידים ותאי החסיון (איור 2B); פלואורסצנציה ירוקה מזהה אות אפופטוטי המופעל על ידי caspase-3 (איור 2C); פלואורסצנציה אדומה מסמנת באופן סלקטיבי אורגנוידי גידול המסומנים ב-CellTrace Far Red (איור 2D); והשכבה הממוזגת חושפת עצמים גידוליים אפופטוטיים כפולי-חיוביים לאדום/ירוק, המהווים את מדד הבדיקה העיקרי (איור 2E). בהיעדר הריגה המתווכת על ידי TILs, צפוי אות ירוק ספונטני מינימלי בתוך מבנים חיוביים לאדום. לצורך כימות, אורגנוידים כפולי-חיוביים לאדום/ירוק (אפופטוטיים) מבוטאים כאחוז ה-PDTOs האפופטוטיים ומשורטטים לאורך זמן כממוצע ± SEM, כאשר שכבות סגמנטציה מאשרות זיהוי מדויק של מבני הגידול (איור 4D).

בניסוי מייצג שבו נבחנו שישה מולקולות קטנות בריכוז של 1 µM, תרופה 4 ותרופה 5 מראות עלייה באפופטוזיס ביחס לקבוצת הביקורת החל מכ-24 שעות ואילך (איור 5A; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001); השוואה בתוך ניסוי מייצג בודד. תרשימי כינור (Violin plots) בנקודת הסיום של 36 שעות מספקים מבט משלים על התפלגות התגובה בין החזרות, ומראים כי תרופה 4 ותרופה 5 גורמות לעליות הגדולות ביותר במספר ה-PDTOs שעברו אפופטוזיס בניסוי מייצג זה, בעוד שתרופה 3 מראה תגובת הרג מופחתת באופן נומינלי, באופן העולה בקנה אחד עם פעילות אימונוסופרסיבית אפשרית (איור 5B).

כדי לאשש כי האפופטוזיס שנמדד משקף הרג תלוי בלימפוציטים חודרי גידול (TIL) ולא ציטוטוקסיות ישירה של התרופה או אות המופרש מתאי אפקטור, תרכובת מייצגת (Drug 5) נבדקה בשלוש זרועות מקבילות: תרבית משותפת (TIL + אורגנואיד), אורגנואידים בלבד (ללא TIL), ותאי T בלבד, לאורך פרק זמן של 36 h (איור 5C).

זרוע התרבית המשותפת (co-culture) הראתה הצטברות הדרגתית ותלוית-זמן של PDTOs אפופטוטיים, שהגיעו ל-19.2 ± 1.0% עד לשעה ה-36 (mean ± SEM, n = 6 wells), בעוד שזרוע האורגנואידים בלבד (ללא TIL) נותרה נמוכה לאורך כל התהליך, ועלה ל-4.0 ± 0.3% בלבד בשעה ה-36 (n = 3 wells), אות הנמוך פי 4.8. ביקורת התאים ה-T בלבד נותרה ברמת הבסיס לאורך כל השלב הזמני (0.0%; n = 3 wells), מה שעולה בקנה אחד עם העובדה שרק אורגנואידי גידול סומנו פלואורסצנטית ומאשר כי הקריאה אינה מקורה בתאי אפקטור. יחד, זרועות אלו מבודדות את ההריגה האפופטוטית נטו התלויה ב-TIL מעל רמת הבסיס של הגידול לבדו. מכיוון שזרוע האורגנואידים בלבד הושגה בנוכחות התרופה, היא משמשת גם כביקורת של תרופה פלוס גידול (ללא TIL): בנוכחות התרופה אך ללא TILs, האפופטוזיס נותר נמוך (4.0 ± 0.3% בשעה ה-36), מה שמעיד על כך שאי אפשר להסביר את ההריגה המוגברת בזרוע התרבית המשותפת התואמת באמצעות ציטוטוקסיות ישירה של התרכובת על האורגנואידים. זרוע תואמת של תרופה בלבד נוצרה עבור Drug 5 בלבד; עבור שאר התרכובות, האפופטוזיס המוגבר מתואר אפוא כהשפעה משולבת שאינה יכולה להיות מיוחסת עדיין באופן ספציפי להגברה חיסונית, וביקורת של תרופה בלבד עבור כל תרכובת מזוהה כשלב תיקוף נדרש.

כל הנתונים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים ללא הגבלה. סדרת תמונות ה-time-lapse הגולמיות, קבצי ייצוא ברמת האובייקט, קבצי הגדרת ניתוח של Incucyte, הגדרות פרמטרי סגמנטציה, מטא-נתונים, ונתוני המקור הסטטיסטיים העומדים בבסיס איור 5 הופקדו במאגר ציבורי ונגישים בחופשיות תחת רישיון פתוח doi: 10.5281/zenodo.21676769. נתוני המקור ברמת האובייקט, מפות פלטות, הגדרות סגמנטציה וקובץ הגדרת הניתוח ששימשו ליצירת איור 5 מסופקים בקובץ משלים 2.

תהליך בנייה מחדש של אורגנואידים: תרשים המראה תרחיף של תאים בודדים, צביעה, והשתלה בכיפות Matrigel.
איור 1: סימון פלואורסצנטי ושחזור תלת-ממדי של אורגנואידים של גידולים ממקור חולה. (A) סקירה סכימטית של זרימת העבודה להכנת PDTO: האורגנואידים מופרדים מ-Matrigel, מפורקים לתרחיף של תאים בודדים, מסומנים בצבע CellTrace Far Red, מושעים מחדש במטריצת Matrigel, ומושתלים כטיפות תלת-ממדיות למשך 72 h של התרחבות מחדש לפני בדיקת התרבית המשותפת. (B) תצלום מייצג של משקעי תאים מסומנים במבחנות של 15 mL, המדגים צבע נראה לעין המעיד על צביעת CellTrace Far Red מוצלחת. (C) תמונת ניגודיות פאזה המראה טיפת Matrigel המכילה אורגנואידים של גידול שהתרחבו מחדש לאחר 72 h של תרבית. (D) תמונת חפיפה פלואורסצנטית המראה אורגנואידים של גידול המסומנים באדום (CellTrace Far Red), המאשרת מורפולוגיית אורגנואידים תלת-ממדית שלמה וסימון פלואורסצנטי אחיד לפני הקמת בדיקת התרבית המשותפת. התמונות צולמו בהגדלה של 10×. סרגי קנה מידה = 800 µm (C) ו-400 µm (D). קיצור: PDTO = patient-derived tumor organoid. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים זרימה של בדיקת Organoid-TIL; צבע NucView 488; מדידת אפופטוזיס; מערכת Incucyte.
איור 2. תרשים זרימה של בדיקת קולטורה משותפת ודימויי פלואורסצנציה מייצגים של הרג אורגנואידי גידול המתווך על ידי TIL. (A) סכימה של תרשים הזרימה המלא של בדיקת הקולטורה המשותפת המתאר שני נתיבי הכנה מקבילים: (נתיב עליון) התאוששות של אורגנואידים מ-Matrigel, ספירה וזריעה בלוחות דימוי בעלי 96 בארות; (נתיב תחתון) הרחבת TIL, תליה מחדש והוספה יחד עם מצע ה-caspase-3. שני הנתיבים מתלכדים בהקמה של קולטורה משותפת בלוח 96 בארות המוזן למערכת דימוי תאים חיים לרכישה קינטית וניתוח אוטומטי. תמונות מייצגות מבארת קולטורה משותפת בנקודת זמן בודדת: (B) ניגודיות פאזה (phase contrast), (C) ערוץ פלואורסצנציה ירוק המראה אות NucView 488 המופעל על ידי caspase-3 בתאים אפופטוטיים, (D) ערוץ פלואורסצנציה אדום המראה אורגנואידי גידול המסומנים ב-CellTrace Far Red, ו-(E) מיזוג של שכבות פלואורסצנציה המדגים עצמים גידוליים אפופטוטיים כפולי-חיוביים לאדום/ירוק. התמונות נרכשו בהגדלה של 10×. סרגל קנה מידה = 400 µm. קיצור: TIL = tumor-infiltrating lymphocyte. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגדרת סריקה אוטומטית; ממשק הגדרות; רכישת נתונים; ניתוח דימות; מדריך תוכנה.
איור 3הגדרת סריקת המכשיר וקביעת פרמטרי רכישה לצילום תאים חיים. (Aלוח בקרה לתזמון מכשירים המציג סריקה פעילה עם מפת פלטה ומאפייני סריקה, הכוללים את סוג הכלי, ערוצי תמונה, עדשה, משך סריקה ולוח זמנים לרכישה.B) סריקה חוזרת או סריקה אחת? דיאלוג עם סריקה לפי לוח זמנים נבחרו כדי לאפשר דימות קינטי אורך לאורך כל משך הבדיקה. (Cלוח בחירת סוג הסריקה עם סטנדרט מצב נבחר, התומך ביישומי ניתוח מבוססי פאזה-ניגודית (phase contrast) ופלואורסצנציה. (ד') הגדרות סריקה לוח המפרט את ערוצי הדמות (פאזה, ירוק, אדום), זמני רכישה לכל ערוץ ובחירה בעדשה אובייקטיבית של 10×.ה) פאנל תבנית סריקה המציג בחירת בארות עבור הבארות הפנימיות של פלטת 96 בארות המוגדרת לארבע תמונות לבערה, עם משך סריקה מוערך. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סבב עבודה של תוכנה לניתוח תמונות; הגדרת תמונת מיקרוסקופיה; סריקה/אינטגרציה של נתונים; דיאגרמה לימודית.
איור 4הגדרת מכשיר לדימוי תאים חיים ותהליך עבודה לניתוח תמונות באמצעות תוכנה אינטגרטיבית. (A) הפעלת הניתוח ממשק המציג בחירה של יצירת הגדרת ניתוח חדשה להפעלת צינור עיבוד (pipeline) של ניתוח חדש. (B) בחירת ערוץ תמונה פאנל עם ערוצי פאזה (Phase), ירוק (Green) ואדום (Red) מופעלים לרכישת פלואורסצנציה כפולה. (C) הגדרת הניתוח ממשק המציג את פרמטרי הסגמנטציה של הערוץ האדום, כולל ספי סף מינימליים ומקסימליים של שטח, החרגת קצוות ומסנני פסולת המשמשים לזיהוי עצמי גידול.ד׳) הגדרת ניתוח ממשק המציג מדדי ניתוח שהוגדרו עבור הערוצים הירוק והאדום, עם שכבת סגמנטציה מייצגת המאשרת זיהוי מדויק של מבני גידול אפופטוטיים כפולי-חיוביים לאדום/ירוק.ה) זמן סריקה ובחירת בארות ממשק המשמש לתזמון רכישה חוזרת של תמונות לאורך הבארות הפנימיות של פלטת הדימות בעלת 96 בארות.ז'בחר את הגדרת הניתוח שהושלמה תחת קובץ התמונה.Gתצוגת סיכום של ניתוח שהושלם, המציגה מידע על הכלי, סוג הניתוח, מדדים זמינים ואפשרויות לייצוא נתונים, כולל ייצוא כגרף פלטה (microplate graph), גרף וטבלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גרף תגובה לתרופה לאפופטוזיס: מהלך זמן, ניתוח תרשים כינור, בדיקת תרופות באורגנואידים, יעילות טיפול.
איור 5. ניתוח מייצג של השפעות תרופות מולקולות קטנות על הרג של אורגנואידים סרטניים המתווך על ידי TIL. (A) עקומות הרג קינטיות המראות את אחוז ה-PDTOs האפופטוטיים לאורך זמן בהשוואה בין מספר תנאי טיפול במולקולות קטנות לבין ביקורת vehicle, מוצג כממוצע ± SEM. (B) תרשמי כינור הממחישים ניתוח נקודת סיום ב-36 שעות כגישה גרפית חלופית להדמיית התפלגות התגובות האפופטוטיות בין תנאי הטיפול, המאפשרת השוואה תיאורית בין תרביות משותפות שטופלו בתרופה לבין ביקורת vehicle בניסוי מייצג זה. (C) ביקורות תלות-TIL עבור תרכובת מייצגת (Drug 5): אחוז ה-PDTOs האפופטוטיים במהלך זמן של 36 h עבור תרבית משותפת (TIL + אורגנואיד), זרוע של אורגנואידים בלבד (no-TIL), וזרוע של תאי T בלבד, המאשרים כי אות האפופטוזיס תלוי ב-TIL ואינו נובע מתאי אפקטור (תרבית משותפת n = 6 בארות; אורגנואידים בלבד ותאי T בלבד n = 3 בארות; ממוצע ± SEM). קיצורים: PDTO = patient-derived tumor organoid; TIL = tumor-infiltrating lymphocyte; SEM = standard error of the mean. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הכנת מצעים ובאפרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2. נתוני מקור וקבצי ניתוח עבור איור 5. תיקיית ZIP זו מכילה את נתוני המקור ברמת האובייקט, מפות פלטות, הגדרות סגמנטציה וקובץ הגדרת ניתוח ששימשו ליצירת ניתוחי סריקת התרכובות ובקרת תרופה 5 ב-איור 5. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטת דימות של תאים חיים המבוססת על תמונות להערכת אינטראקציות ציטוטוקסיות בין אורגנואידים של גידולים ממקור חולה (PDTOs) לבין לימפוציטים חודרי גידול (TILs) תואמים. באמצעות שילוב של ארכיטקטורת גידול תלת-ממדית, אפקטורים חיסוניים אוטולוגיים ומדידות של הפעלת caspase-3 בזמן אמת, מערכת זו מאפשרת הערכה דינמית של אפופטוזיס של תאי הגידול תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית. זרימת העבודה משלבת שיטות מבוססות להרחבת אורגנואידים ו-TILs עם תנאי תרבית משותפת מבוקרים וכמותיות מבוססות תמונות אוטומטיות, ובכך מספקת גישה מבוססת דימות למחקרי תפקוד חיסוני. מאחר ששלבי הבידוד וההרחבה של ה-PDTO וה-TIL במעלה הזרם מבוצעים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר ולא מתוארים כאן במלואם, שחזור מלא של זרימת עבודה זו דורש עיון במקורות אלו בנוסף לפרוטוקול זה.

יתרון מרכזי של גישה זו הוא שימור ההטרוגניות הפנימית של הגידול בתוך האורגנואידים. בניגוד למערכות מונושכבה דו-ממדיות, אורגנואידים שומרים על מבנה תלת-ממדי ועל אינטראקציות בין תאי הגידול. כאשר הם גדלים בתרבית משותפת עם TILs תואמים, הדבר מאפשר הערכה של חדירת תאי T, הריגה תלוית-מגע ותגובות קינטיות לאורך זמן. שימוש במצע פלואורסצנטי המופעל על ידי caspase-3 מאפשר מדידה ישירה של אפופטוזיס, במקום להסתמך על מדדים עקיפים כגון אובדן התלכדות (confluence) או בדיקות חיוניות בנקודת סיום המבוססות על ATP.

מספר פרמטרים קריטיים קובעים את הצלחתו של הניסוי. שלמות האורגנואידים בעת הזריעה היא חיונית; עיכול יתר במהלך הדיסוציאציה הראשונית של הגידול או שיבוש מכני מוגבר במהלך הקמת התרבית המשולבת (co-culture) עלולים לגרום לפיצול של האורגנואידים, מה שיגדיל באופן מלאכותי את מספר האובייקטים האדומים וישנה את חישובי האפופטוזיס. התפלגות עקבית של גודל האורגנואידים משפרת את דיוק הסגמנטציה ומפחיתה את השונות בין הבארות. באופן דומה, יש לשמור על יחסי אפקטור-ליעד (E:T) מדויקים בין החזרות, שכן ספירה לא מדויקת של תאי T או התגבשותם יוצרות שונות בקינטיקה של ההריגה. רספנסיה עדינה מיד לפני הזריעה ממזערת בעיה זו. רק יחס E:T בודד (2:1) נבחן במערך הנתונים המייצג המוצג, בהתאם לפרמטר התפעולי הסטנדרטי שנקבע בפרוטוקול של המעבדה שלנו. על פי ספרות קיימת בנושא ציטוטוקסיות של תאי T, יחסי E:T גבוהים יותר צפויים בדרך כלל להגביר את הריגת הגידול, ותסנין (titration) פורמלי של פרמטר זה נותר ככיוון לתיקוף עתידי של פלטפורמה זו. בחירתם ותיקופם של פרמטרי הסגמנטציה מהווים שלב קריטי נוסף. ספי המינימום והמקסימום לגודל אובייקט חייבים להוציא פסולת תוך לכידת מבני גידול שלמים; ספים מקלילים מדי מנפחים את ספירת הגידולים, בעוד שספים מגבילים מדי מעריכים בחסר את נטל הגידול. יש לתקף את קריטריוני החפיפה עבור אותות אדומים וירוקים באמצעות בקרות של אפופטוזיס ספונטני ובקרות הריגה חיוביות, ויש להחילם באופן עקבי בכל הבארות כדי למנוע הטיה בחישובי אחוזי האפופטוזיס.

הכללת בקרות מתאימות מחזקת את יכולת הפרשנות. בארות של גידול בלבד קובעות את יציבות הבסיס של הפלואורסצנציה האדומה, בעוד שבקרות של גידול בתוספת סובסטרט מכמתות אפופטוזה ספונטנית שאינה תלויה בפעילות חיסונית. בקרות של תאי T בלבד קובעות את אות הקספז ברקע הנובע מלימפוציטים גוססים. בקרות אפופטוזה חיוביות מאשרות את תקינות הסובסטרט ומתקפות את ספי סגמנטציה. בקרות אלו חשובות במיוחד בעת השוואה בין זוגות בלתי תלויים של גידול-TIL, שכן שיעורי אפופטוזה בבסיס עשויים להשתנות בין קווי אורגנואידים.

פלטפורמה זו, המבוססת על דימוי, מציעה מספר יתרונות על פני בדיקות ציטוטוקסיות מסורתיות, כגון שחרור כרום או מדידות חיוניות מבוססות ATP בנקודת סיום. דימוי בזמן אמת מאפשר ניטור רציף ולא הרסני של אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון, ובכך מאפשר רזולוציה קינטית מדויקת של הריגה ממתווכת חיסון. בניגוד לבדיקות נקודת סיום, המספקות מדידה מצטברת אחת בלבד ועשויות להסוות אירועי ציטוטוקסיות חולפים או רצפיים, דימוי לאורכי (longitudinal imaging) מבחין בין תגובות ציטוטוקסיות מוקדמות ומהירות לבין אפופטוזיס מושהה או פרוגרסיבי. רזולוציה זמנית זו מאפשרת זיהוי של שלבי השהיה (lag phases) הקשורים להפעלה או חדירה של תאי T, מרווחי שיא של הריגה, ושלבי פלטו שעשויים לשקף תשישות של תאי T או עמידות של תאי המטרה. מדידות חוזרות מאותה באר מפחיתות את השונות בין הדגימות ומבטלות את הצורך בלוחיות מקבילות בנקודות זמן מרובות. מכיוון שעומס הגידול וההמרה לאפופטוזיס נמדדים כמותית בו-זמנית בכל מרווח, ניתן לבצע נורמליזציה דינמית, דבר המשפר את הדיוק בהשוואה לבדיקות ליזיס כוללות (bulk lysis assays) שאינן יכולות להבחין בין הריגה חיסונית לבין מוות תאי ספונטני. יחד, גישה זו מספקת הערכה של תפקוד ציטוטוקסי שהיא בעלת מידע פיזיולוגי רב יותר וניתנת לפירוש מכניסטי טוב יותר מאשר בדיקות מסורתיות בנקודת זמן אחת.

עם זאת, יש לשקול מספר מגבלות. למרות שאורגנואידים של גידולים המופקים מחולים משחזרים את ארכיטקטורת הגידול הטבעית בצורה מדויקת יותר מאשר תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות, הם אינם ממדלים באופן מלא את הרכיבים הסטרומליים, הווסקולריים או המיאלואידיים של מיקרו-סביבת הגידול. בנוסף, הדמיה בהגדלה של 10× מספקת תפוקה מספקת לניתוח אורך, אך עשויה שלא להבחין באינטראקציות של תאים בודדים בתוך אורגנואידים צפופים. הדמיה בהגדלה גבוהה יותר יכולה לשפר את הרזולוציה המרחבית אך מפחיתה את שדה הראייה ואת תפוקת הבדיקה. בדיקה זו מכמתה באופן ספציפי מוות אפופטוטי של תאי גידול התלוי ב-caspase-3. ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי T המתרחשת באמצעות מנגנונים שאינם תלויים ב-caspase, כולל נקרזה או נקרופטוזיס, אינה מזוהה על ידי קריאה זו ולכן יש לפרש אותה במסגרת היקף הבדיקה. בנוסף, פירוק לתאים בודדים, סימון והתרחבות מחדש למשך 72 h עשויים, באופן עקרוני, לבצע סלקציה של תתי-אוכלוסיות; עם זאת, המבנים בגודל 100–300 µm שנוצרו מחדש במהלך תקופה זו שומרים על הארכיטקטורה התלת-ממדית רב-תאית של האורגנואידים ההוריים, ולא נצפה שינוי מורפולוגי בולט ביחס לתרביות ההוריות, למרות שלא בוצעה השוואה פורמלית של הרכב קלונאלי לפני ואחרי ההתרחבות מחדש. המחקר הנוכחי אינו כולל נקודת ייחוס של בקרת חיוביות פרמקולוגית, כגון מעכב נקודת בקרה חיסונית (למשל, anti-PD-1) בזוג אורגנואיד–TIL מסוג PD-L1⁺/PD-1⁺, עם הגברת הריגה צפויה, כדי לכייל באופן פורמלי את הטווח הדינמי של הבדיקה; הכללה של חומר ייחוס כזה המגביר את החיסון היא שלב תיקוף חשוב בהמשך, ויש לפרש את תוצאות התרכובות ההשוואתיות המדווחות כאן בהתאם. בקרת תרופה לבדה (ללא TIL) תואמת בוצעה רק עבור Drug 5 בדוגמאות אלו; לא ניתן לייחס הגברה יחסית במוות תאי ליתר התרכובות, שחסרה להן בקרת תרופה לבדה לכל תרכובת. תיקוף אורתוגונלי של קריאה זו המבוססת על תמונה מול מדד "gold-standard" עצמאי למוות תאי באותה דגימה, כגון צביעת Annexin V בציטומטריה זרימתית או אישור של תאים בודדים במיקרוסקופ קונפוקאלי, לא בוצע כאן ומזוהה כשלב מרכזי הבא כדי לבסס עוד יותר את הספציפיות של הקריאה כפולה-חיובית אדום/ירוק17.

שיקול נוסף הוא שפלואורסצנציית CellTrace Far Red מדללת באופן הדרגתי עם כל סבב של חלוקת תאי גידול. כתוצאה מכך, פרוליפרציה במהלך תקופת ההתאוששות של האורגנואידים שנמשכת 72 h וחלון הדימות העוקב עשויה להפחית את עוצמת הפלואורסצנציה בנקודות זמן מאוחרות יותר, מה שעלול להפחית את מספר אובייקטי הגידול החיוביים ל-CellTrace ולהעלות במעט את אחוז האפופטוזיס המחושב עקב מכנה מופחת. כדי לנטר גורם מתבל this פוטנציאלי, מספר האובייקטים החיוביים ל-CellTrace Far Red נמעקב באופן לונגיטודי לאורך תקופת הדימום, ובארות נבחנו לאיתור ירידות משמעותיות באות החיובי לאדום שאינן תלויות בהפעלה של caspase-3/7 הקשורה לאפופטוזיס. לא נצפתה אובדן משמעותי לא מוסבר של אובייקטים חיוביים ל-CellTrace לאורך חלון הדימום, מה שמרמז כי דילול הצבע כנראה לא תרם באופן משמעותי לשינויים שנצפו במדידות האפופטוזיס. עם זאת, זו נותרת מגבלה אינהרנטית של מעקב אחר תאי גידול המבוסס על דילול פלואורסצנציה, ויש להביא זאת בחשבון בעת פרשנות של מדידות בנקודות זמן מאוחרות.

שונות ביולוגית בין דגימות המופקות ממטופלים מהווה הן את החוזק והן את האתגר של פלטפורמת בדיקה זו. בעוד ששונות זו משקפת הטרוגניות של גידול בעלת רלוונטיות קלינית, תכנון ניסויי נכון צריך להביא בחשבון את השונות הביולוגית בעת הגדרת גודל המחקר ודרישות השחזור. כל זוג גידול–TIL ייחודי צריך להיחשב כחזרה ביולוגית עצמאית, בעוד שחזרות טכניות משמשות להערכת השונות של הבדיקה בתוך הדגימה. מערך הנתונים המייצג המוצג באיור 5 משקף זוג אורגנויד–TIL בודד שנבדק בשלוש חזרות טכניות; לפיכך, מבחן ANOVA דו-כיווני למדידות חוזרות המוצג מתאר את שונות הבדיקה בתוך אותה דגימה בודדת, ואין לפרשו כהערכה של שונות ביולוגית בין מטופלים. מספר זוגות האורגנויד–TIL העצמאיים הדרושים לכל מחקר צריך להיקבע באמצעות חישובים פרוספקטיביים של עוצמה סטטיסטית (power calculations), המבוססים על גודל האפקט הצפוי, השונות הביולוגית ומטרות הניסוי. יש לכלול חזרות טכניות כדי לכמת את דיוק הבדיקה, אך אין לראות בהן תחליף לחזרות ביולוגיות עצמאיות

שינויים עתידיים של פרוטוקול זה עשויים לשלב חסימה של נקודות בקרה חיסוניות, מודולציה של ציטוקינים, מעכבים של מולקולות קטנות או הפרעות גנטיות כדי לנתח את המנגנונים המווסתים ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי T. שילוב עם טרנסקריפטומיקה של תא בודד או דימיון מרחבי עשוי להגביר עוד יותר את התובנה המכניסטית. בנוסף, התאמה לפורמטים של 384 בארות בעלת תפוקה גבוהה עשויה לאפשר יישומים של סריקת תרופות. פלטפורמה זו ניתנת להסתגלות בקלות גם להערכת טיפולים בתאי T בעלי קולטן אנטיגני כימרי (CAR-T) במקום TILs פוליקלונליים, מה שדורש רק אישור של ביטוי האנטיגן המטרה ב-PDTOs לפני תרבית משותפת, והכללה מתאימה של בקרות אורגנואידים שליליות לאנטיגן כדי לאשר ספציפיות למטרה18,19,20.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה כמותית מבוססת-תמונה למדידת ציטוטוקסיות המתווכת על ידי TIL כנגד אורגנואידים של גידולים אוטולוגיים בזמן אמת. תשומת לב קפדנית לשלמות האורגנואידים, יחסי אפקטורים עקביים, ספי סגמנטציה מתוקפים ובקרות מתאימות מבטיחות כימות מהימן. מערכת זו ישימה באופן רחב למחקרים באימונולוגיה של גידולים, מודולציה של נקודות בקרה חיסוניות, אופטימיזציה של טיפול תאי אדופטיבי ופרופיל חיסוני תפקודי מותאם אישית.

גילויים

B.D.H. הוא מייסד-שותף ויועץ של Faeth Therapeutics. O.E. מחזיק במניות של Volastra Therapeutics ו-Owkin, אך אין לכך קשר לפרויקט זה. לא Faeth Therapeutics, לא Volastra Therapeutics ולא Owkin סיפקו מימון, חומרים, ציוד, תוכנה, קניין רוחני או קלט לתכנון המחקר עבור עבודה זו. שאר המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

גילוי על שימוש ב-AI:
במהלך הכנת עבודה זו, המחבר(ים) השתמשו ב-Claude לצורך עריכה לשונית. לאחר השימוש בכלי/שירות זה, המחבר(ים) סקרו ועריכו את התוכן לפי הצורך והם נושאים באחריות מלאה על תוכן המאמר המפורסם.

תודות

אנו מודים למכון אנגלנדר לרפואה מדויקת ב-Weill Cornell Medicine על תמיכתם הנדיבה והגישה למשאבים המוסדיים. עבודה זו נתמכה גם על ידי MERIT Program Gift / The Medical Excellence Foundation, Inc. (מספר מענק 61500857), שהוענק ל-Olivier Elemento ו-Benjamin D. Hopkins. לגוף המממן לא היה תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים, בניתוחם או בהכנת כתב היד. קווי היצרן HEK293T המפרישים Noggin ו-R-Spondin התקבלו כמתנה מהמעבדה של Yu Chen (מרכז הסרטן Memorial Sloan Kettering) ויוצרו כפי שתואר בעבר21.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות קוניות 15 mLCorning430791איסוף תאים וסבוב (צנטריפוגציה)
פלטות 6 בארות ללא טיפול לתרבית רקמהGreiner Bio-One657185זריעה והרחבה של אורגנואידים בתלת-ממד
A-83-01 (מעכב TGF-beta)Tocris Bioscience2939מצע אורגנואידים מלא
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010רכיב מצע
תוסף B27 (50X), ללא סרוםThermo Fisher Scientific17504044מצע אורגנואידים מלא
מיקרופלטה עם דופן שחורה וקרקעית אופטית, 96 בארות, שחורה, משטח TCNunc165305פלטת דימוי תאים חיים לבדיקת הריגה
תמיסת התאוששות תאים (Cell Recovery Solution)Corning354253המסה קרה של Matrigel תוך שמירה על מבנה האורגנואיד בתלת-ממד
ערכה להבדיל תאי proliferated ב-CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564סימון פלואורסצנטי של תאי גידול (ערוץ אדום)
מטודת בטיחות ביולוגית Class IIThermo Fisher Scientific1375 (1300 Series A2, 4 ft)טיפול אספטי תחת BSL-2
אינקובטור CO2 (37 °C, 5% CO2, מושקה)Thermo Fisher Scientific51030400 (Heracell VIOS 160i)הרחבת אורגנואידים ודגירה של תרבית משותפת
סופר תאים אוטומטי Countess 3Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)AMQAX2000ספירת תאים/בדיקת חיות אוטומטית (בשימוש עם שקופיות Countess, C10312)
שקופיות ספירה Countess (או המוציטומטר)Thermo Fisher ScientificC10312ספירת תאים אוטומטית
Dimethyl Sulfoxide (DMSO), סטריליSigma-AldrichD2650המסה מחדש של צבע CellTrace Far Red
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X, ללא Ca2+/Mg2+Corning21-040-CVRריסוף תאים לספירה ולסימון בצבע
סרום עגל עובר (FBS), שעבר אינאקטיבציה בחוםThermo Fisher Scientific16140071רכיב מצע
תוסף GlutaMAX-I (100X)Thermo Fisher Scientific35050061רכיב מצע
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / DotmaticsVersion 10.6.1ניתוח סטטיסטי (two-way RM ANOVA) והצגת נתונים
קווי תאי ייצור HEK293T (מפרישים Noggin ו-R-Spondin)Yu Chen Lab, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)Gift (see Gao et al., Cell 2014)ייצור מצע מותנה (סעיף 0.2); מתנה מהמעבדה של Yu Chen (MSKCC); הופקו כפי שמופיע ב-Gao et al., Cell 2014, DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016
HEPES (תמיסה 1 M)Thermo Fisher Scientific15630080רכיב מצע
Human Recombinant FGF-10Thermo Fisher ScientificPHG0204מצע אורגנואידים מלא
Human Recombinant FGF-Basic (FGF-2)Thermo Fisher ScientificPHG0261מצע אורגנואידים מלא
תוכנת בסיס Incucyte (v2024B)SartoriusIntegrated software v2024Bתזמון רכישת תמונות וסגמנטציה/ניתוח אוטומטיים
מערכת Incucyte S3 לניתוח תאים חייםSartorius4647מכשיר לדימוי תאים חיים (37 °C, 5% CO2); רכישת תמונות במישור (phase) ופלואורסצנציה כפולה
מיקרוסקופ פלואורסצנציה/ניגודיות פאזה הפוךNikonEclipse Ts2-FLבקרת איכות (QC) של אורגנואידים ואישור סגמנטציה ויזואלית
מקפיא מעבדה (−20 °C / −80 °C)Thermo Fisher ScientificTSX40086A (TSX Series −86 °C)אחסון של מנות גורמי גדילה ומצעים מותנים
מנער מעבדה / פלטפורמת נעירה (תואם 4 °C)Benchmark ScientificB3D2300 (BenchRocker 3D)המסת מטריקס בתמיסת התאוששות תאים קרה (סעיף 2.1)
מטריקס ממבנה בסיס Matrigel, עם רמות מופחתות של גורמי גדילהCorning356231מטריקס תלת-ממדי להטמעה והרחבה של אורגנואידים
Mouse Recombinant EGFPeproTech315-09מצע אורגנואידים מלא
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165מצע אורגנואידים מלא
NicotinamideSigma-AldrichN0636מצע אורגנואידים מלא
Noggin (מצע מותנה או רקומביננטי)Lab-prepared aliquot—מצע אורגנואידים מלא
NRG1 (Neuregulin-1 / Heregulin)R&D Systems396-HBמצע אורגנואידים מלא
מצע NucView 488 Caspase-3 (מלאי 200 µM)Biotium30029זיהוי בזמן אמת של הפעלת caspase-3 (מדד לאפופטוזיס, ערוץ ירוק)
תמיסת פניצילין-סטרפטומייצין (100X)Thermo Fisher Scientific15140122רכיב מצע
PGE2 (Prostaglandin E2)Sigma-AldrichP0409מצע אורגנואידים מלא
PrimocinInvivoGenant-pm-1מצע אורגנואידים מלא
צנטריפוגה מקוררת (דליים נעים, 300 × g, 4 °C)Eppendorf022628187 (Centrifuge 5810 R, A-4-62 rotor)שלבי דיסוציאציה ושטיפה בסבוב
מצע RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093מצע בסיס לריסוף תאי T
R-Spondin (מצע מותנה או רקומביננטי)Lab-prepared aliquot—מצע אורגנואידים מלא
SB202190 (מעכב p38 MAPK)Sigma-AldrichS7076מצע אורגנואידים מלא
StaurosporineSigma-AldrichS4400ביקורת הריגה חיובית; סוכן פרו-אפופטוטי לאישור תפקודיות מצע ה-caspase
מערכת סינון בוואקום סטרילית Stericup (0.22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05REסינון/ייצור של מצעים מותנים של Noggin ו-R-Spondin (סעיף 0.2)
מגרדת תאים סטריליתCorning3008פירוק מכני של כיפות Matrigel
תמיסת Trypan Blue, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061הערכת חיות באמצעות דחיית צבע
אנזים TrypLE Express (1X)Thermo Fisher Scientific12604021דיסוציאציה אנזימטית של Matrigel ואורגנואידים
אמבט מים (37 °C)Thermo Fisher ScientificTSGP05 (Precision GP 05)דיסוציאציה אנזימטית וחימום מצעים
Y-27632 (מעכב ROCK)Sigma-AldrichY0503מצע אורגנואידים מלא

מקורות

  1. Reck M, et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2016;375(19):1823-33.
  2. Larkin J, et al. Overall survival in patients with advanced melanoma who received nivolumab versus investigator’s choice chemotherapy in CheckMate 037: a randomized, controlled, open-label phase III trial. J Clin Oncol. 2018;36(4):383-90.
  3. Weber J, et al. Adjuvant nivolumab versus ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N Engl J Med. 2017;377(19):1824-35.
  4. Karimi MA, et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 2014;9(2):e89357.
  5. Kaja S, Payne AJ, Naumchuk Y, Koulen P. Quantification of lactate dehydrogenase for cell viability testing using cell lines and primary cultured astrocytes. Curr Protoc Toxicol. 2017;72:2.26.1-2.26.10.
  6. Crouch SPM, Kozlowski R, Slater KJ, Fletcher J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods. 1993;160(1):81-8.
  7. Pauli C, et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discov. 2017;7(5):462-77.
  8. Lee SH, et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 2018;173(2):515-28.e17.
  9. Dijkstra KK, et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Rep. 2020;31(5):107588.
  10. Veninga V, Voest EE. Tumor organoids: opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 2021;39(9):1190-201.
  11. Wang HM, et al. Using patient-derived organoids to predict locally advanced or metastatic lung cancer tumor response: a real-world study. Cell Rep Med. 2023;4(2):100911.
  12. Betge J, et al. The drug-induced phenotypic landscape of colorectal cancer organoids. Nat Commun. 2022;13(1):3135.
  13. Dijkstra KK, et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 2018;174(6):1586-98.e12.
  14. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  15. Votanopoulos KI, et al. Model of patient-specific immune-enhanced organoids for immunotherapy screening: feasibility study. Ann Surg Oncol. 2020;27(6):1956-67.
  16. Harter MF, et al. Analysis of off-tumour toxicities of T-cell-engaging bispecific antibodies via donor-matched intestinal organoids and tumouroids. Nat Biomed Eng. 2024;8(4):345-60.
  17. Gelles JD, Chipuk JE. Robust high-throughput kinetic analysis of apoptosis with real-time high-content live-cell imaging. Cell Death Dis. 2016;7(12):e2493.
  18. Schnalzger TE, et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 2019;38(12):e100928.
  19. Ehlen L, et al. Lung tumouroids as a testing platform for precision CAR T cell therapy. Nat Biomed Eng. 2026;10:815-31.
  20. Logun M, et al. Patient-derived glioblastoma organoids as real-time avatars for assessing responses to clinical CAR-T cell therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(2):181-90.e4.
  21. Gao D, et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 2014;159(1):176-87.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TILsCaspase 3

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.