הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית באמצעות יינון אלקטרוספריי בדסורפציה המשולבת לספקטרומטרי מסה של Orbitrap

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית של תאי OVCAR-8 באמצעות יינון אלקטרוספריי דספורפציה המחובר לספקטרומטרי מסה Orbitrap לניתוח מטבולומי ברזולוציה מרחבית גבוהה.

תקציר

דימות יינון אלקטרוספריי–ספקטרומטריית מסה (DESI–MSI) מאפשר הדמיה מולקולרית סביבתית, ללא מטריצות, עם הכנת דגימה מינימלית. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה עבור MSI חד-תאי של תאי OVCAR-8 באמצעות DESI המקושר לספקטרומטרי מסה של Orbitrap. המערכת משלבת מרסס DESI, ממשק ספקטרומטר מסה מותאם, שלב XYZ ממונע, ולוח לחם אופטי להדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה. תאים מתרבתים על כיסויי זכוכית מרושתים, נשטפים בתמיסת אמוניום פורמט להפחתת הפרעות מלח, מיובשים ומנותחים בתנאים סביבתיים. הממס מועבר באופן רציף באמצעות מערכת כרומטוגרפיה ננו-נוזלית, וגז החנקן המפוזר מווסת לשמירה על יציבות הריסוס. הפרוטוקול מתאר גם הדמיית רסטר, בקרת פיקסלים ורישום תמונות מספקטרומטריה אופטית-למסה ללוקליזציה של תא יחיד. רזולוציית מסה גבוהה ודיוק מסה המספקים גילוי Orbitrap מאפשרים התמיינות של מינים מולקולריים קרובים ותומכים בניתוח מטבולומי חד-תא. פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה גמישה ליישום MSI חד-תאי ברזולוציה מרחבית גבוהה באמצעות מספר פלטפורמות ספקטרומטר מסה של Orbitrap.

מבוא

מטבולומיקה שואפת לאפיין באופן מקיף מטבוליטים של מולקולות קטנות המשקפים את המצב התפקודי של מערכות ביולוגיות 1,2,3,4,5. מכיוון שמטבוליטים הם תוצר ישיר של פעילות אנזימטית, הם מספקים קריאה דינמית של פנוטיפ תאים ורגולציה ביוכימית. עם זאת, תהליכי עבודה מטבולומיים קונבנציונליים בדרך כלל מסתמכים על שיטות חילוץ בכמויות גדולות שממוצעות אותות על פני אלפי עד מיליוני תאים, ובכך מטשטשות את ההטרוגניות התאית ^6,7,8.

מטבולומיקה של תא יחיד מתמודדת עם מגבלה זו על ידי אפשרות פרופיל מולקולרי ברמת התאים הבודדים, חשיפת גיוון מטבולי באוכלוסיות מורכבות ושיפור ההבנה המכניסטית של התקדמות המחלה, תגובת התרופות וההבדלות תאית. ספקטרומטריית מסה (MS) היא כלי חיוני לניתוח מולקולרי של דגימות ביולוגיות. התקדמות עדכנית בטכניקות טרשת נפוצה, כולל הכנת דגימות, ציוד וניתוח נתונים, מאפשרת ביצוע מחקרי מטבולומיקה של טרשת נפוצה ברמות תא יחיד 9,10,11,12.

הדמיית MS (MSI), המאפשרת ניתוח מולקולרי מפוזר במרחב של דגימות ביולוגיות, משלבת תנועה מדויקת של דגימה, דגימה מזעורה, יינון יעיל והדמיית נתונים על ידי רכישת ספקטרום מסה מלא בכל קואורדינטה מרחבית מוגדרת על פני משטח הדגימה 12,13,14. תמונות MS משוחזרות על ידי שרטוט עוצמת ערכי יחס מסה-מטען נבחרים (m/z) לאורך קואורדינטות x–y, ובכך נשמרות מידע כימי מרחבי בתוך מערכות ביולוגיות מורכבות 12,13,15,16,17,18. השגת מטבולומיקה חד-תאית ברזולוציה מרחבית דורשת פלטפורמות אנליטיות המסוגלות לשמר מיקום מולקולרי תוך שמירה על רגישות ורזולוציית מסה מספקת לזיהוי מינים בעלי שפע^נמוך 9,12,19,20.

MSI חד-תאי מציב אתגרים נוספים מכיוון שתאים בודדים בדרך כלל נעים בין 5 ל-20 מיקרון^{בקוטר 8,21}. בקנה מידה מרחבי זה, שפע האנליטים לכל אירוע דגימה מוגבל מאוד. לכן, גורמים רבים, כולל שליטה מדויקת בתנועת הדגימה, דגימה מינימלית, יעילות יינון גבוהה והעברת יונים יעילה, הם חיוניים באותה מידה לקבלת מידע מולקולרי ניתן לפירוש מתאים בודדים^14,22. דסורפציה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI)–MSI, טכניקה מבוססת ואקום המשמשת באופן שגרתי למחקרי MSI ברזולוציה מרחבית גבוהה, דורשת הפקדת מטריצה ותפעול בוואקום; עם זאת, התגבשות מטריצה ב-MALDI יכולה להכניס דה-לוקליזציה ושונות של אנליטים בקנה מידה של תא יחיד 23,24,25,26,27. לעומת זאת, גישות MSI סביבתיות פועלות בתנאים סביבתיים, והדגימות שומרות על מצבים כימיים כמעט טבעיים מכיוון שנדרש הכנת דגימה מועטה או כלל לא נדרשת. מבין שיטות MSI סביבתיות, DESI²⁸, ננו-DESI²¹, ננו-DESI²⁹ בסיוע פנאומטי, ו-Single-probe 8,30,31,32,33,34,35, שימשו בעבר במחקרי MSI חד-תאיים. למרות שטכניקות המבוססות על חילוץ מיקרו-נוזלי, כולל ננו-DASI, ננו-DESI בסיוע פנאומטי ו-Single-probe, מספקות יעילות דגימה וינון גבוהה, הן מסתמכות על שמירה על גשר נוזלי יציב בקצה הגשוש, בעוד שהפרעות בגשר הנוזל, כגון שינויים במורפולוגיית פני השטח או סתימת הגשושים, עלולות להשפיע על איכות ניסויי MSI ^5,8, 21,30,35.

DESI היא טכניקת יינון סביבתית שבה טיפות ממס טעונות פוגעות במשטח, מחלקות אנליטים ומייצרות טיפות משניות המכילות מין מיינן³⁶. DESI מספקת דגימה ללא מגע וללא סתימות, עם התאמה לתהליכי דימות מבוססי רסטר, מה שהופך אותה למתאימה למיפוי מולקולרי ברזולוציה גבוהה ורב-יונים של תאים בודדים מזוהים אופטית כאשר הם מחוברים לפלטפורמות Orbitrap בעלות הספק רזולוציה^גבוה 20,37,38,39,40. DESI משמש באופן נרחב להדמיית רקמות אך לעיתים נדירות יושם על MSI חד-תא, בעיקר בשל אתגרים טכניים^20,28. מחקרים עדכניים שבוצעו באמצעות מערכת מסחרית הכוללת Waters DESI XS בשילוב עם ספקטרומטר מסה SELECT SERIES Cyclic IMS הראה שניתן להשיג רזולוציה של תא יחיד עבור מספר קווי תאים. השגת רזולוציה מרחבית גבוהה ב-DESI–MSI דורשת שליטה מתואמת על יעילות היינון, העברת היונים, קצב רכישה, ויישור מרסס 12,20,28. במיוחד, התקדמות בעיצוב דורות חדשים של מרססי DESI, כולל DESI XS ויינון אלקטרו-זרימה (DEFFI) באמצעות דספורגיה, צמצמו משמעותית את שטח הדגימה^ב-41,42. בנוסף, הפחתת קצב זרימת הממס, כגון קצבי זרימה בננוליטר לדקה המסופקים על ידי משאבות כרומטוגרפיה ננו-נוזלית (LC), יכולה לשפר משמעותית את ההגבלה המרחבית להשגת הבחנה מולקולרית חד-תאית²⁸. למרות שגישה זו השיגה MSI ברזולוציה של תא יחיד, היא מסתמכת על מכשור מספק מסוים (Waters). לכן, יישום רחב יותר של DESI–MSI חד-תא דורש לכן אסטרטגיות שניתן לשלב עם ספקטרומטרי מסה ברזולוציה גבוהה הזמינים באופן נרחב, כגון מערכות Orbitrap, כדי לספק רגישות גבוהה, דיוק מסה וכוח פתרון גבוהים. שילוב DESI עם ספקטרומטרי מסה של Orbitrap מספק הזדמנויות חדשות במחקרי MSI חד-תאיים, כולל התמיינות של מינים קרובים ואיזובאריים בתמציות תאיות^{מורכבות} 20,43,44.

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה מודולרית לאינטגרציה של מרסס Waters DESI XS עם ספקטרומטר מסה Orbitrap למחקרי MSI חד-תאיים. תהליך העבודה משלב כיסויי רשת לחיבור תאים וקורלציה אופטית, שלב XYZ ממונע לסריקת רסטר מבוקרת, אספקת ממס בקנה מידה ננומטרי ליצירת ריסוס יציבה, וגילוי Orbitrap ברזולוציה גבוהה. למרות שנבחר ספקטרומטר מסה Thermo Orbitrap Tribrid Lumos כפלטפורמה, דגמי ספקטרומטר מסה רבים אחרים של Orbitrap המצוידים בגאומטריות ממשק מקור-מיס תואמות עשויים להיות משולבים עם תצורות DESI XS מותאמות אישית דומות לאחר התאמה ואופטימיזציה מכנית מתאימה.

פרוטוקול

תאי OVCAR-8 הושגו מאוסף תרביות הסוגים האמריקאי (ATCC). כל הליכי תרבית התאים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. התאים נבדקו באופן שגרתי לזיהום מיקופלסמה באמצעות ערכת זיהוי מיקופלזמה לפי הוראות היצרן.

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית. לבש ציוד מגן אישי מתאים. לטפל בממסים אורגניים בתוך מכסה אדים כימי.

1. תרבית והכנת תאי OVCAR-8 על כיסויי רשת

1. הכינו מדיום שלם על ידי תוספת למדיום RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין. חממו את הביניים ל-37°C.
2. לשמור על תאי OVCAR-8 בצלחות תרבית תאים בגודל 10 ס"מ המכילים 10 מ"ל מדיום שלם. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2.
3. מעבר התאים כאשר כ-80% משטח התרבית תפוס לעין על ידי תאים דבקים, בדרך כלל כל יומיים בתנאי התרבית המתוארים.
   1. שאיבו את המדיום מהצלחת של 10 ס"מ ושוטפים את התאים פעם אחת עם 5 מ"ל של 1× מלח מפוזר פוספט.
   2. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין–אתילנדיאמינטטטראצטית למנה של התרבית. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך כ-3 דקות, או עד שרוב התאים מתנתקים לעין מפני התרבית בעת בדיקה במיקרוסקופ.
   3. הוסיפו 8 מ"ל של מדיום מלא מחומם מראש למנה כדי לנטרל את הטריפסין. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הפיפט בעדינות את מתליית התא למעלה ולמטה כ-15–20 פעמים כדי לפזר את התאים.
   4. העבר 1 מ"ל מהמתלה ל-9 מ"ל של מדיום טרי מלא.
   5. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. טעין 10 מיקרו ליטר של המתלה התלוי מחדש ישירות למחסנית הספירה ללא דילול נוסף וביצוע ספירת תאים לפי הוראות היצרן.
      הערה: צבעי קיום תאים כמו טרייפן בלו לא שימשו בפרוטוקול זה. הערכו את מצב התא באופן חזותי על ידי מעקב אחר מורפולוגיית התא וההתקשרות לפני טריפסיניזציה.
4. זרעו את התאים על הכיסוי.
   1. דיללו את התאים לריכוז סופי של ~1 × 10⁶ תאים/מ"ל באמצעות מדיום מלא. מחשבים את נפח ההשעיה התאית הנדרש באמצעות C₁V₁ = C₂V₂, כאשר C₁ הוא ריכוז התא הנספר, V₁ הוא נפח ההשעיה התא הנדרש, C₂ הוא ריכוז היעד, ו-V₂ הוא הנפח הסופי הרצוי.
   2. הניחו מחליפי זכוכית מרופדים ברשת בגודל 28 מ"מ עם מרווח רשת של 50 מיקרון בתוך בארות של צלחת 6 בארות.
      הערה: אוטוקלאב את כיסויי הזכוכית לפני השימוש בתרבית תאים. הניחו את צד הרשת הפונה כלפי מטה כדי למזער הפרעות לצמיחת התאים.
   3. הוסף 2 מ"ל מדיום שלם ו-200 מיקרוליטר של תליית התא (~2 × 10⁵ תאים לבאר) לכל באר. נענעו בעדינות את הפלטת בעלת 6 בארות בתבנית "X" כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני משטח הכיסוי.
   4. דגרו את התאים במשך כ-15–20 שעות כדי לאפשר חיבור תאים.
      הערה: יש לעקוב באופן שגרתי אחרי מורפולוגיית התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי להבטיח גדילה תקינה. בדקו זיהום אפשרי במיקופלסמה באמצעות ערכת גילוי מיקופלסמה אם התאים גדלים בצורה גרועה.

2. שטיפת תאים עם תמיסת פורמט אמוניום (AF)

הערה: הכינו תמיסת AF טרייה לפני כל שימוש.

1. הכינו את בופר השטיפה איזוטוני AF מיד לפני השימוש. שקלו 0.45 גרם AF והמסו ב-50 מ"ל מים בדרגת LC/MS כדי להכין ריכוז AF סופי של 0.14 מ' (0.9% רוחב ללב). אל תכוונן את ה-pH ^5,45.
   הערה: השתמש בתמיסת AF הטרייה באותו יום ההכנה. שמור את התמיסה קריחה (0°C–4°C) עד השימוש.
2. שאפו את מדיום הגידול מכל באר בלוח עם 6 בארות. מיד הוסיפו 2 מ"ל של תמיסת AF קרה לכל באר.
3. באמצעות מלקחיים סטריליים, הרימו בעדינות כל כיסוי המכיל תאים דביקים מהבאר תוך שמירה על פני השטח המצופה בתא כלפי מעלה. הניחו לזמן קצר את הכיסוי ל-2–3 שניות בתוך באר נפרדת שמולאה מראש ב-2 מ"ל תמיסת AF קרה של 0.9%.
4. חזור על תהליך השטיפה לשתי שטיפות עם תמיסת AF טרייה בכל שטיפה. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הכיסוי מתמיסת AF ואפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר במכסה אדים כימי למשך כ-20–30 דקות לפני ניתוח DESI–MSI.
   הערה: שטוף את התאים בעדינות כדי לא להפריע לתאים במהלך שלב הכביסה.

3. ייצור ממשק מיקרוסופט מבוסס FAIMS מותאם

1. פירקו את מתאם מקור היונים של האלקטרודה FAIMS Pro כדי לגשת לאזור הפנימי של האלקטרודה. אשר שהמתאם תואם לספקטרומטרי מסה Thermo Orbitrap המצוידים בתצורת ממשק FAIMS Pro.
2. הסר את רכיבי האלקטרודות של ה-FAMIMS, כולל החוטים הפנימיים, מכלולי האלקטרודות, טבעות ה-O ומבנים פנימיים תומכים. שמרו על מעטפת המארז החיצוני, הפלנג'ים המתקינים ופין זיהוי הממשק הנדרש לזיהוי ספקטרומטר מסה של המתאם
3. שנו את הפתח המעגלי באמצעות נהלי עיבוד סטנדרטיים במכונות. הגדל את הפתח עד שיספק מרווח מספק סביב מכלול הכניסה/משפך היונים הבולט של Orbitrap.
4. להחליק ולהסיר את הקצה המעובד אחרי החיתוך. אשר שהפתח המותאם מאפשר מיקום חופשי של מתאם הבית על ספקטרומטר המסה.
5. שנו את אורך שתי הרגליים של מתאם המארז באמצעות מסור. גזמו את הרגליים לאורך סופי של כ-2 ורבע אינץ' כדי לאפשר חיבור ללוח הלחם האופטי.
   הערה: השתמשו בכלי עיבוד מתאימים והימנעו מפגיעה בשלמות המבנית של המארז שנותר.
6. הכינו לוח לחם אופטי מאלומיניום (10 אינץ' × 12 אינץ' × 0.5 אינץ', 1/4"-20 חורים מנוקשים). מקם את לוח הלחם אופקית מתחת למתאם FAIMS המותאם.
7. השתמש בשני תושבות הרכבה כדי לחבר את מתאם FAIMS המותאם ללוח הלחם האופטי. גזמו את התושבות לפי הצורך כדי להפחית משקל ולאפשר מיקום נכון של לוח הלחם ביחס לכניסת ה-Orbitrap.
8. אבטח את ממשק ה-FAIMS המותאם על לוח הלחם האופטי באמצעות חומרת הרכבה תואמת מכנית, המיושרת עם דפוס החור המנופח 1/4" עד 20 של לוח הלחם. להבטיח מיקום יציב במהלך ניסויי הדמיה.
   הערה: ודאו שהממשק קבוע היטב כדי למזער רעידות במהלך תנועת הבמה ואיסוף נתונים.
9. מכין או חתוך חריץ רדוד ללוח הלחם האופטי ישירות מתחת לאזור מגע המארז של FAIMS (אזור המגע). גודל ומיקום החריץ כך שיספקו מרווח מספק ליציבות ישיבה ויישור בית ה-FAIMS המותאם ביחס לפתח ה-Orbitrap.
   הערה: גודל החריץ כך שיתאים לבסיס מתאם הבית של FAIMS ולשפר את השחזור המיצובי.
10. יישר את הממשק המותקן עם כניסת ספקטרומטר המסה. וודא שהפלג'ים המורכבים שנשארו מתיישבים כראוי על המכשיר ושלוח הלחם האופטי נשאר מאוזן מתחת לממשק.
11. ודאו שהפתח המעגלי המותאם מספק מרווח חופשי סביב מכלול משפך הכניסה/יון של Orbitrap לפני התקנת מרסס ה-DSI.

4. הרכבת מרסס DESI וממשק Orbitrap

1. התקן את מרסס ה-DESI על המערכת המשולבת הכוללת את מסגרת FAIMS המותאמת אישית, שלב XYZ ממונע, ווסת גז ולוח לחם אופטי. השתמש בשלב ממונע הנשלט על ידי בקר CONEX-MFACC.
2. הגדר את ציר ה-x ככיוון סריקה רסטרית משמאל לימין והגדר את ציר ה-y ככיוון צעד קו מלמעלה למטה. הגדר את מיקום ציר ה-z לפני הרכישה ושמור עליו קבוע במהלך ההדמיה.
3. השתמש בטווח תנועה של כ-1 מ"מ בכיוון x וכ-1 מ"מ בכיוון y. אל תפעיל תנועת ציר z במהלך הרכישה.
4. מקם את מרסס ה-DESI בזווית של כ-70° יחסית לפני השטח של הדגימה. הניחו את הדגימה ישירות מתחת למרסס ומקמו את קצה המרסס קרוב ככל האפשר לכניסת ה-Orbitrap ללא מגע פיזי.
5. חבר את מתכת הארקת ה-DESI למקור הארקה מתחת לספקטרומטר המסה. שלוט בתנועת הרסטר באמצעות תוכנת בקרת השלבים (איור 1).
   הערה: מרסס ה-DESI ששימש במחקר זה זמין רק למשתמשים עם מכשירי DESI–MSI.
6. השתמש בבקר שלב XYZ ממונע לתנועת הבמה ולמיקום. חבר את קו המתח, קו גז החנקן, קו הממס והארקה לפני ההפעלה.
7. התקן צינור העברת יונים מנירוסטה בהתאמה אישית (1/16 אינץ' OD × 0.033 אינץ' ID) שתוכנן להתאים לכניסת מקור היונים של Orbitrap. מקם את צינור העברת היונים כך שיתיישר ישירות עם פתח ה-Orbitrap תוך התרחבות מספקת החוצה כדי לאפשר גישה חופשית לעמודות DESI.
   הערה: התאם את צינור העברת היונים בהתאם לתצורת ספקטרומטר המסה. ייצר את צינור העברת היונים באמצעות שיטות עיבוד מתאימות.
8. השתמש בצינור העברת יונים עם גאומטריה מעוקמת כדי לשפר את מיקום מרסס ה-DESI ביחס לפני השטח של הדגימה ופתח ה-Orbitrap.
9. יישר את המרסס בזווית של כ-70° יחסית לפני הדגימה כך שעמוד הריסוס של DESI יחתוך את אזור כניסת ה-Orbitrap מבלי לגעת במשטח הדגימה.
10. הגדר ענן ריסוס יציב על ידי נוכחות ספקטרום מסה יציב וערכי רמה מנורמלת עקבית (NL) במהלך הרכישה. כוונן את מיקום המרסס עד שנצפה אות יוני יציב.
11. הגדר את המרחק בין המרסס לפני השטח לכ-1.0–1.5 מ"מ כתנאי התחלתי. כוונן ידנית את מיקום המרסס בעדינות תוך ניטור ערכי NL כדי להשיג את אות היונים היציב הגבוה ביותר.

איור 1. מערכת אינטגרציה של דסורפציה עם יינון אלקטרוספריי (DESI)–הדמיית מסה (MSI) המחוברת לספקטרומטר מסה Orbitrap. מרסס ה-DESI מותקן על פלטפורמה משולבת הכוללת מתאם ספקטרומטריית ניידות יונים אסימטרית בשדה גבוה (FAIMS),  שלב XYZ ממונע, רגולטור גז ולוח לחם אופטי. הממס מסופק באמצעות מערכת כרומטוגרפיה ננו-נוזלית, וגז חנקן מסופק בכ-12 psi לייצוב ריסוס. האיור מציג גם את חיבור מתח היינון, קו הממס ומיקום המרסס ביחס לכניסת אורביטראפ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. הגדרת תנאי אספקת ממס וריסוס

1. הכינו ממס ריסוס טרי המורכב ממתנול/מים/חומצה פורמית (98:2:0.1, v/v/v) לפני ניתוח DESI–MSI.
   הערה: מערכות ממס תואמות DASI אחרות, כולל ממסים מבוססי אצטוניטריל ויחסי מתנול/מים שונים, עשויות לשמש לאחר אופטימיזציה. מתנול/מים/חומצה פורמית (98:2:0.1, v/v/v) שימש כתנאי התחלה סטנדרטי בפרוטוקול זה, משום שסיפק יצירת עמוד יציב, הפחתת התפשטות ממסים, ואותות שומנים במצב יוני חיובי לשכפול במהלך ניסויי DESI–MSI חד-תאיים.
   זהירות: מתנול דליק ורעיל. חומצה פורמית היא קורוזיבית. טפל בממסים בתוך מכסה אדים כימי.
2. לספק את הממס באמצעות מערכת Ultimate 3000 nano-LC המופעלת כמשאבת ממס איזוקרטית במהירות של 750 ננוליטר לדקה עבור הניסויים המדווחים. חבר את שקע הננו-LC למרסס DESI באמצעות צינור PEEK (1/16 אינץ' OD × 0.005 אינץ' ID).
3. התקן עמוד C18 (למשל, nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1.7 מיקרון, 300 מיקרון × 150 מ"מ) בקו כדי לספק לחץ חזרה מספק ליצירת ריסוס יציבה בקצבי זרימה נמוכים.
4. הגדר את שיטת ספקטרומטר המסה למצב יוני חיובי עם זיהוי Orbitrap, מתח ריסוס של 0.85 kV, רזולוציית Orbitrap של 120,000 ב-m/z 200, וטווח m/z של 150–1200.
5. הגדר את יעד ה-AGC המנורמל ל-100%, זמן הזרקה מקסימלי ל-100 מילישניות, עדשת RF ל-45%, ומיקרוסריקות ל-1. השבתת בידוד רביעי ופיצול מקור.
6. אספקו גז מעטפת חנקן ממחולל חנקן או מקור חנקן נוזלי בעוצמה של כ-12 psi כדי לייצב את ענן הריסוס של DESI. השתמש ב-12 psi כלחץ הפעלה התחלתי ובצע התאמות ידניות קלות רק במידת הצורך כדי לשפר את ערכי NL ולשמור על ספקטרום מסה יציב.

6. ביצוע הדמיית רסטר ובקרת פיקסלים

1. זהה אזור עניין המכיל תאים בודדים נראים אופטית באמצעות כיסויי הרשת כהפניה. בחר תאים מבודדים עם הפרדה חזותית ברורה מהתאים השכנים, מורפולוגיה דבקה שלמה, וללא חפיפה ברורה עם פסולת או אשכולות תאים.
2. הגדר את אזור הרסטר באמצעות תוכנת Fance Stage^{Controller 46}. הגדר את גודל שלב הרסטר ל-0.01 מ"מ, מהירות הבמה ל-0.01 מ"מ/שנייה, וזמן השהייה ל-20 שניות.
3. השתמש בסריקת רסטר משמאל לימין לאורך כל שורה, ואחריה תנועה לשורה הבאה בכיוון y. הגדר את גודל הצעד האורתוגונלי בין קווי רסטר ל-10 מיקרון.
4. כוונן את מהירות השלב בהתאם לקצב הרכישה של Orbitrap כדי להשיג את ממד הפיקסל הרצוי בכיוון הסריקה (למשל, כ-2.5–6.5 מיקרון). חשב את ממד הפיקסל בכיוון הסריקה באמצעות הקשר הבא: ממד פיקסל בכיוון סריקה = מהירות שלב × זמן רכישה לסריקה.
5. באמצעות מהירות שלב של 0.01 מ"מ/שנייה (10 מיקרומטר/שנייה), רכוש 376 סריקות לאורך 102 שניות כדי לייצר זמן רכישה של 0.271 שניות לסריקה וממד פיקסל כיוון סריקה תואם של כ-2.7 מיקרון. סנכרן את תנועת הבמה ורכישת ספקטרום המסה על ידי קביעת תזמון רכישת Orbitrap קצר מעט מהפרמטרים המשולבים של תנועת הבמה ותזמון השהייה המשולב.
   הערה: ממד הפיקסל האורתוגונלי נקבע על ידי גודל הצעד המתוכנת ומהמגבלות הפיזיקליות והמכניות של השלב, בעוד שממד כיוון הסריקה נשלט על ידי מהירות השלב וקצב הרכישה הספקטרלי.
6. רכישת נתוני הדמיה על טווח המסה שנבחר עד להשלמת אזור הרסטר המוגדר מראש. לאזור הדמיה של 1 מ"מ × 1 מ"מ שנרכש באמצעות שלב קו של 0.01 מ"מ ומהירות שלב של 0.01 מ"מ/שנייה, זמן הרכישה הכולל הוא כ-4–5 שעות.
7. יצירת קבצי נתונים RAW במהלך הרכישה ועצרו את הרכישה לאחר השלמת קואורדינטות הרסטר x–y שצוינו ומשך השיטה המתאים למכשיר. בתנאי מצב היונים החיוביים המתוארים כאן, כל שורת רסטר מייצרת בדרך כלל קובץ RAW בגודל של כ-50 מגה-בייט (MB), מה שמוביל לכ-5 ג'יגה-בייט נתונים בסך הכל עבור 101 שורות רסטר.

7. רישום תמונה אופטי ל-MS

1. ללכוד תמונות שדה בהיר של התאים באזור הרשת שנבחר לאחר שטיפה וייבוש AF ולפני רכישת DESI באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד באובייקטיב 10×.
2. המרו קבצי RAW לקבצי mzML באמצעות msConvert מ-ProteoWizard⁴⁸. המרו את קבצי ה-mzML לפורמט imzML באמצעות imzML Converter⁴⁹.
3. השתמש בהגדרות המרת סנטרואיד/פרופיל התואמות את פורמט הנתונים שנרכש. העלה את קבצי ה-imzML ישירות ל-METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ לצורך המחשת תמונה.
4. אין להחיל נרמליזציה, הסרת נקודות חמות או תיקוני עיבוד תמונה נוספים לפני הדמיה. יישר ידנית את תמונות האופטיקה והמיקרוסופט באמצעות סימני הרשת כהפניות מיקומיות.
5. קנה גודל התמונה האופטית לפי מידות התמונה הידועות ורווח הרשת. הנח ידנית את תמונת ה-MS כדי להעריך התאמה בין מיקומי תאים נראים אופטית לבין אותות יונים מקומיים.
6. אשר מיקום תא יחיד באמצעות הסכמה חזותית בין תאים מבודדים בתמונת השדה הבהיר לבין התפלגות יוני MS מתאימה.

תוצאות

ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה יוצר מערכי נתונים של DESI–MSI שבהם תאים בודדים מזוהים אופטית מתאימים במרחב לאותות יונים מולקולריים מקומיים (איור 2). תמונות מיקרוסקופ של Brightfield שנרשמו לפני ניתוח DESI–MSI מאפשרות זיהוי חזותי של תאי OVCAR-8 בודדים ומאפשרות רישום תמונה אופטי ל-MS באמצעות הכיסוי המקושט כנקודת ייחוס מיקומית. תמונות יוני DESI–MSI מייצגות התפלגויות יוניות מקומיות שמתואמות מרחבית עם תאים בודדים שזוהו בתמונת שדה בהיר מתאימה (איור 2A–2D).

איור 2. השוואה בין מיקרוסקופיית Brightfield ל-MSI של תאי OVCAR-8. (א) תמונת מיקרוסקופ ברייטפילד של תאי OVCAR-8 שנאספה בהגדלה של 10×. (B–D) תמונות MS שצולמו באמצעות DESI–MSI בגודל פיקסל של 5.5 מיקרון × 10 מיקרון. התפלגויות יונים מייצגות מוצגות עבור (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562, ו-(D) m/z 788.616. פס קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תאים בודדים מייצרים ספקטרום מסה מלא המכיל יונים רבים הקשורים לליפידים ומולקולות קטנות. במקום להסתמך על סמן מולקולרי יחיד, כל תא מציג פרופיל מולקולרי רב-יוני המשמש כטביעת אצבע כימית. תמונות יונים מייצגות ב-m/z 317.111, m/z 808.562 ו-m/z 788.616 מראות התפלגות מולקולרית הטרוגנית בין תאים שכנים, ומצביעות על הטרוגניות מטבולית מדידה ברמת התא היחיד (איור 2B–2D). הערות מבוססות METASPACE הציעו כי יונים שזוהו ב-m/z 808.562 ו-m/z 788.616 היו קשורים בעיקר למיני שומנים פוספטידילכולין ופוספטידילאתנולאמין, בעוד ש-m/z 317.111 התאימו למספר מולקולות קטנות מועמדות ולמינים הקשורים לדיפפטידים. תוצאות אלו מראות שהפלטפורמה מאפשרת זיהוי תכונות מולקולריות ממוקמות במרחב מתאים בודדים שזוהו אופטית בתנאים סביבתיים. תוצאות נוספות, כולל מינים עם הערות ראשוניות, מינים מזוהים בטרשת נפוצה/טרשת נפוצה, תמונות מייצגות של טרשת נפוצה וספקטרום מסה, ניתנו במחקרים קודמים²⁰.

פלטפורמת DESI–MSI המשולבת כוללת מרסס DESI, מתאם FAIMS מותאם, שלב XYZ ממונע ולוח לחם אופטי המותקן בסמוך לכניסת Orbitrap (איור 1). ההתקנה מאפשרת אספקת ממס יציבה, תנועת שלבים מבוקרת ויישור עמוד הריסוס של DESI עם כניסת ספקטרומטר המסה לניסויי הדמיה חד-תאית סביבתית. צינור העברת היונים המותאם אישית המוצג באיור 3 מאפשר העברת יונים בין אזור המקור של DESI לכניסת אורביטראפ. הגיאומטריה הקפילרית הכפופה מקלה על מיקום מרסס ה-DESI ביחס לפני השטח של הדגימה ואזור הכניסה, תוך שמירה על העברת יונים ללא הפרעה.

איור 3. צינור העברת יונים מותאם אישית ל-Orbitrap MSI. תמונה של צינור העברת היונים המותאם אישית ששימש לחיבור מרסס DESI לספקטרומטר המסה Orbitrap Fusion Lumos. האיור מציג את הגיאומטריה הקפילרית של ההעברה הכופפת ואת מכלול ההרכבה המשמשת להעברת יונים במהלך ניסויי MSI חד-תאיים סביבתיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4 מציג את מתאם ה-FAIMS המותאם המשולב עם לוח הלחם האופטי ושלב XYZ הממונע. התצוגה העליונה (איור 4A) ממחישה את מיקום שלב הדגימה והמתאם המותאם ביחס לכניסת אורביטראפ, בעוד שהתמונה התחתונה (איור 4B) מציגה את תושבות ההרכבה ומכלול הבמה ששימשו לתמיכה בפלטפורמת ההדמיה. היציבות המכאנית של המכלול המשולב חשובה לשמירה על תנועת רסטר עקבית ולהפחתת סטיית מיקום במהלך רכישת הדמיה.

איור 4. מתאם ספקטרומטריית ניידות יונים אסימטרית בשדה גבוה (FAIMS) משולב עם לוח המפרט האופטי ושלב XYZ הממונע. (A) תצוגה עליונה של המתאם המותאם, המותקן בסמוך לכניסת Orbitrap ולשלב הדגימה. (B) תצוגה תחתונה המציגה את התושבות המותאמות, לוח הלחם האופטי, ומכלול שלב XYZ הממונע ששימש לתמיכה וליישור פלטפורמת ההדמיה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

רזולוציית מסה גבוהה שמספקת גילוי Orbitrap מאפשרת הבדלה בין מיני ליפידים צפופים ואיזובאריים, ובכך משפרת את הספציפיות המולקולרית ואת הניגודיות בתמונה בהשוואה למערכות ברזולוציה נמוכה יותר. ניתן להשיג ממדים קטנים של פיקסלים באמצעות סנכרון של מהירות השלב וקצב הרכישה הספקטרלי. לדוגמה, ממדים של פיקסלים קטנים כמו 2.7 מיקרון × 10 מיקרון הושגו באמצעות פלטפורמות Orbitrap לרכישה מהירה ופרמטרי רסטר אופטימליים⁴². הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה מאפשרת הבחנה מולקולרית של תאים סמוכים תוך מזעור חפיפת האות בין אזורים תאיים סמוכים.

ניסויי DESI–MSI מוצלחים מאופיינים בתנאי ריסוס יציבים, עוצמת יונים עקבית על פני קווי רסטר, ומיקום מרחבי של אותות מולקולריים התואמים לתאים בודדים בתמונה האופטית. ניסויים לא אופטימליים עלולים לגרום להתפלגות יונים מפוזרות, עוצמת אות נמוכה, דפוסי רסטר לא עקביים, או אובדן מיקום תא עקבי בשל יצירת ריסוס לא יציבה, יישור לא נכון של מרסס, התפשטות מוגזמת של הממס או תנועת דגימה במהלך הרכישה. אופטימיזציה מדויקת של יישור הריסוס, קצב זרימת הממס, מהירות השלבים ומיקום הדגימה משפרת את הנאמנות המרחבית ואת יציבות אות היונים במהלך ניסויי הדמיה חד-תאיים.

דיון

פרוטוקול זה מאפשר DESI–MSI חד-תאי סביבתי באמצעות ספקטרומטרי מסה Orbitrap ברזולוציה גבוהה, באמצעות שילוב של שליטה מדויקת בשלבים, אספקת ממס בקנה מידה ננומטר, מיקוד אופטי וניתוח מסה ברזולוציה מרחבית גבוהה. השילוב של אלמנטים אלו מתמודד עם מחסומים טכניים רבים שהגבילו היסטורית את יישום DESI–MSI ברמת התא היחיד. במיוחד, שליטה מתואמת ביציבות הריסוס, העברת היונים ותזמון רכישה מאפשרת זיהוי אמין של אותות מולקולריים מנפחי דגימה קטנים מאוד התואמים לתאים בודדים. גורם מרכזי שמנחה את הביצועים בתהליך עבודה זה הוא היציבות וההגבלה של עמוד הריסוס של DESI. ברזולוציות מרחביות בקנה מידה מיקרומטר, הפרעות קטנות בקצב זרימת הממס, לחץ הגז או מיקום המרסס יכולות לשנות משמעותית את שטח הדגימה האפקטיבי. שימוש באספקת ממס בקנה מידה ננומטרי בשילוב עם לחץ חוזר מתאים משפר את יציבות הריסוס ומפחית את התפשטות הממסים, ובכך משפר את הדיוק המרחבי. בנוסף, שמירה על מרחק וזווית עקביים בין המרסס לפני השטח היא קריטית ליעילות יינון שחוזרת. אפילו סטיות קטנות בגאומטריה יכולות לגרום לשונות משמעותית בעוצמת האות, במיוחד בניתוח דגימות תאיות הטרוגניות. בפועל, אופטימיזציה של תנאי ריסוס DESI בוצעה אמפירית על ידי ניטור זרם יונים כולל, יציבות ספקטרלית וערכי NL (בדרך כלל סביב 10⁵–10⁶) במהלך הרכישה. איכות האות הניתנת לשחזור הושגה באמצעות התאמה איטרטיבית של מיקום המרוסס, יציבות זרימת הממס, לחץ גז ויישור עמוד ה-DESI ביחס לכניסת אורביטראפ.

יעילות העברת היונים מייצגת מגבלה מרכזית נוספת בקנה מידה של תא יחיד, מכיוון ששפע האנליטים נמוך מטבעו בתוך תאים בודדים. בקני מידה מרחביים אלו, העברת יונים יעילה עלולה להפוך למגבלה מעשית גדולה יותר מיעילות היינון במימושים מסוימים, מכיוון שרק חלק קטן מאוד מהיונים הסורגים מגיעים בסופו של דבר לכניסת ספקטרומטר המסה. לכן, העברה יעילה של יונים מאזור הדגימה אל כניסת ספקטרומטר המסה היא חיונית. מתאם הבית FAIMS המשודרג בפרוטוקול זה מספק ממשק בין מקור הריסוס DESI לספקטרומטר מסה תרמו, ומאפשר תאימות למספר דגמי מכשירים, כולל פלטפורמות סדרת Orbitrap Tribrid, Exploris ו-Astral. אינטגרציה של מתאם המארז FAIMS המותאם עם לוח לחם אופטי מספקת גם יציבות מכנית, ובכך מצמצמת חוסר יישור במהלך ניסויי הדמיה ממושכים. סנכרון בין תנועת הבמה לרכישת ספקטרום מסה הוא קריטי לא פחות להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה. ב-DESI–MSI, ממד הפיקסל בכיוון הסריקה נשלט על ידי הקשר בין מהירות השלב לקצב הרכישה, בעוד שהממד האורתוגונלי מוגדר על ידי גודל הצעד המתוכנת. שליטה מדויקת בפרמטרים אלו מאפשרת דגימה מדויקת. מכיוון שתאי יונקים רבים בדרך כלל נעים בקוטר של כ-5–20 מיקרון, נדרשים מממדי פיקסלים המתקרבים למספר מיקרומטרים בלבד כדי למזער חפיפת אות בין תאים סמוכים ולשפר את מיקום התכונות המולקולריות לאזורים תאיים בודדים. עם זאת, גודל הפיקסל הנומינלי אינו בהכרח תואם לטביעת הרגל האמיתית של הדגימה, מכיוון שאינטראקציה של ענן הממס עם משטח הדגימה עלולה לגרום להתפשטות רוחבית וחפיפה חלקית של האות בין פיקסלים סמוכים. לכן, יש לפרש את ממדי הפיקסלים המדווחים בהקשר של רזולוציה מרחבית אפקטיבית ולא בהגדרות גאומטריות בלבד. צינור העברת היונים המותאם אישית ששימש במחקר זה תוכנן בהתאם לגאומטריה של צינור העברת היונים הסטנדרטי כדי לשמר את מאפייני העברת היונים תוך מתן אינטגרציה עם תצורת מקור DEI.

עוצמת פתרון מסה גבוהה ודיוק מסה המספקים ספקטרומטרי מסה של אורביטראפ חיוניים לפתרון התערובת המורכבת של מטבוליטים וליפידים הנמצאים בתוך תאים בודדים. תכונות מולקולריות רבות שזוהו סומנו באופן זמני באמצעות מדידות מסה מדויקות וניתוח METASPACE. מכיוון שהקצאות מועמדות מרובות עשויות להתאים לערך m/z שנמדד אחד, אסטרטגיות אימות נוספות של MS/MS ואישור מולקולר אורתוגונלי עשויות לחזק עוד יותר את הזיהוי המולקולרי במחקרים עתידיים. במצב יוני חיובי, ספקטרום DESI נשלט לעיתים קרובות על ידי מיני פוספוליפידים בעלי ערכי m/z קרובים או איזובאריים. גילוי ברזולוציה גבוהה של אורביטראפ מאפשר התמיינות של מינים אלו, ובכך משפר את הספציפיות המולקולרית ומפחית את האמביוולנטיות הספקטרלית. יכולת זו חשובה במיוחד לניתוחים חד-תאיים, שבהם הסתמכות על מספר מוגבל של יונים עלולה להוביל לפרשנות שגויה של הטרוגניות תאית. גמישות זו מצביעה על כך שאסטרטגיות דומות עשויות להיות רלוונטיות גם לפלטפורמות ספקטרומטריית מסה אחרות המשתמשות בממשקים תואמים עם התאמות מתאימות. למרות היתרונות הללו, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. ראשית, מקור ה-DESI המשמש בעבודה הנוכחית זמין רק למשתמשים עם מערכות DESI–MSI, ולכן בניית מערכות רסיסה/אורביטראפ של DESI עשויה להיות מוגבלת בשל זמינות מקור DESI. עם זאת, ניתן ליישם גם מכשירי DESI, כולל DEFFI, למחקרי MSI ברזולוציה מרחבית^{גבוהה 42,47}. שנית, יישום פלטפורמה זו דורש התאמה אישית משמעותית, כולל עיבוד ממשקי מכשירים וייצור רכיבי התקנה. דרישות אלו עשויות להגביל את הנגישות למעבדות ללא ניסיון בפיתוח מכשירים או ייצור מכני. ביישום הנוכחי, בית הממשק של FAIMS שימש כפלטפורמת התקנה מכנית נוחה למיקום מערך המרסס DESI ביחס לכניסת Orbitrap. כתוצאה מכך, יישום התצורה המתוארת מעשי יותר למעבדות עם גישה למערכות Orbitrap תואמות FAIMS ותמיכה בסיסית בעיבוד שבבי. עם זאת, הקונספט הרחב יותר של קישור מכני של מקורות DESI לכניסות Orbitrap יכול להתבצע באמצעות עיצובים חלופיים מבלי לשנות את חומרת הממשק של FIMS. שלישית, אף שקצב זרימת ממס נמוך משפר את הכליאה המרחבית, הם עשויים גם להפחית את תפוקת היונים הכוללת, מה שמחייב אופטימיזציה זהירה לאיזון בין רגישות לרזולוציה מרחבית.

שיקול חשוב נוסף הוא הפוטנציאל לדלוקליזציה אנליטית במהלך הדגימה. למרות ש-DESI פועל בתנאים סביבתיים ואינו דורש יישום מטריצה, אינטראקציה של טיפות ממס עם משטח הדגימה עלולה להוביל להתפוצות מחדש של אנליטים, במיוחד עבור מינים מסיסים מאוד. לכן, מזעור נפח הממס ואופטימיזציה של תנאי הריסוס הם קריטיים לשמירה על שלמות מרחבית ברמת התא היחיד. באופן דומה, תהליך השטיפה באמצעות פורמט אמוניום איזוטוני יכול להפחית את דיכוי היונים הקשור למלח תוך שמירה על שלמות התאים ושימור מיני התאים, כפי שדווח בעבר בתהליכי עבודה של טרשת נפוצה חד-תאית⁵.

פיתוחים עתידיים עשויים לשפר עוד יותר את הביצועים והיישום של פלטפורמה זו. לדוגמה, אינטגרציה עם מערכות רכישת נתונים מהירות יותר יכולה לאפשר גדלי פיקסלים קטנים יותר יעילים וניסויים MSI בעלי תפוקה גבוהה יותר. הטמעת מערכות יישור אוטומטיות או בקרת משוב בזמן אמת עשויה להפחית שונות ולשפר את השחזוריות. בנוסף, שילוב גישה זו עם טכניקות משלימות, כגון הדמיית פלואורסצנציה או אסטרטגיות תיוג ממוקדת, יכול לשפר את זיהוי סוגי התאים ולאפשר ניתוחים רב-מודליים.

מעבר לשיקולים טכניים, לפלטפורמה זו יש השלכות רחבות על מחקר ביולוגי וביו-רפואי. היכולת לאפיין פרופילים מולקולריים ברמת תאים בודדים בתנאים סביבתיים מאפשרת הזדמנויות חדשות לחקר הטרוגניות תאית במערכות מורכבות. DESI–MSI כבר יושם בהצלחה ברמת הרקמות במחקרים של מיקרו-סביבות גידול, מחלות נוירולוגיות, אינטראקציות בין מארח-פתוגן, ואוכלוסיות תאים עמידות לתרופות 12,15,16,35. הרחבת DESI–MSI לרמת תא יחיד עשויה לשפר עוד יותר את היכולת לזהות הטרוגניות כימית מקומית בין תאים שכנים, לזהות תת-אוכלוסיות תאיות נדירות, ולגלות סמנים מולקולריים שעלולים להיות מוסתרים במדידות רקמות נפוצות. עם זאת, המחקר הנוכחי בוצע באמצעות מודל תרבית תאים חד-שכבתית פשוט, ונדרשים מחקרים נוספים להוכחת תאימות למערכות ביולוגיות מורכבות אחרות, כולל מודלים שונים של תאים, רקמות, אורגנואידים ותרביות תלת-ממדיות. תהליך העבודה הנוכחי עשוי לספק בסיס להרחבת מדידות DESI ברזולוציה מרחבית גבוהה לעבר סביבות ביולוגיות הטרוגניות יותר ויותר, לאחר אימות ואופטימיזציה נוספים. מכיוון ששיטה זו שומרת על הקשר מרחבי תוך מתן מידע מולקולרי מפורט, היא יכולה לשמש גשר בין הדמיה לגישות מבוססות אומיק. לסיכום, פרוטוקול זה קובע מסגרת גמישה וגמישה להשגת DESI–MSI ברזולוציה תא יחיד על ספקטרומטרי מסה של Orbitrap. על ידי התמודדות עם אתגרים מרכזיים הקשורים ליעילות יינון, העברת יונים, שליטה מרחבית ורזולוציית מסה, גישה זו מאפשרת אפיון מולקולרי מפורט של תאים בודדים. למרות שיש צורך באופטימיזציה ואימות נוספים, המתודולוגיה מספקת בסיס להרחבת השימוש ב-MSI סביבתי במחקרי מטבולומיקה חד-תאית ומרחבית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	Storage of biological samples before preparation.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	Mechanical support and stabilization of the custom sprayer-mount assembly
Acetonitrile	Fisher Chemical	240744	Organic solvent for DESI-compatible solvent preparation and optimization
Ammonium formate	Thermo Fisher Scientific	401152500	Preparation of isotonic ammonium formate wash buffer for cell washing prior to DESI–MSI
Brightfield microscope	Fisher Scientific	12575252	Optical imaging and visualization of adherent cells before DESI–MSI acquisition
C18 column	Waters	186009259	In-line backpressure generation for stable nano-flow DESI spray formation
Copper wire	N/A	N/A	Electrical connection and grounding during sprayer-mount fabrication
DESI XS sprayer	Waters	700014033	Ambient DESI ionization source for single-cell DESI–MSI experiments
Epoxy resin	Devcon	20945	Mechanical stabilization and fixation of custom sprayer-mount components
FAIMS Pro electrode ion source housing adaptor	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modification and fabrication of the custom Orbitrap-compatible DESI interface
Formic acid	Ward’s Science	470301-120	Acid modifier for DESI spray solvent preparation
Methanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Organic solvent for DESI spray solvent preparation
Gas regulator	Millipore Sigma	23831-U	Regulation of nitrogen sheath-gas pressure during DESI operation
Gridded glass coverslip	Ibidi	10817	Cell culture substrate and positional reference for optical-to-MS image registration
Grounding wire	N/A	N/A	Electrical grounding connection for DESI sprayer and interface assembly
Incubator	HeraCell	51026282	Maintenance of mammalian cell cultures under controlled temperature and CO2 conditions
LC/MS-grade water	Thermo Fisher Scientific	W6500	Preparation of ammonium formate wash buffer and DESI spray solvent
METASPACE platform	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Cloud-based MS image visualization and spatial metabolomics data analysis
Modified FAIMS interface	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Customized interface for coupling the DESI sprayer with Orbitrap mass spectrometers
Motorized XYZ stage	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Controlled raster-stage movement during DESI–MSI acquisition
MycoAlert PLUS mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-703	Routine monitoring of mycoplasma contamination in cultured cells
Nano-liquid chromatography system	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Nano-flow solvent delivery system for DESI spray generation
Optical breadboard	Thorlabs	MB1012	Mechanical support platform for DESI sprayer and modified interface assembly
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	UVPD	High-resolution Orbitrap mass spectrometer for DESI–MSI data acquisition
PEEK tubing	IDEX	1535	Solvent-line connection between nano-LC system and DESI sprayer
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic supplement for mammalian cell culture medium
Phosphate-buffered saline (PBS)	VWR	0780-50L	Washing solution for cultured cells during passaging
RPMI-1640 medium	Gibco	11875093	Mammalian cell culture medium for maintenance of OVCAR-8 cells
Stage-control software	Lasken Group	Version 6	Software control of raster scanning, stage movement, and imaging acquisition parameters
Stainless steel tubing	MicroGroup	316H16H	Custom-fabricated ion transfer tubing (1/16" OD, 0.033" ID) for Orbitrap interface integration
Syringe, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Solvent loading and nano-flow solvent delivery
Synthetic fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH3006603	Serum supplement for preparation of complete mammalian cell culture medium
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Automated counting of cultured cells before seeding on coverslips
Tissue culture dish, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansion and maintenance of adherent OVCAR-8 cell cultures
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Enzymatic detachment of adherent cells during passaging
UV-curing resin	Prime Dental	6.03	Fabrication and stabilization of custom DESI sprayer-mount components
Xcalibur software	Thermo Fisher Scientific	4.7	Instrument control, Orbitrap method setup, and mass spectral data acquisition