מאמר שיטה

הקמה של מערך בדיקת נחייה (Reporter Assay) עבור STAT6 לסריקת רעלנים סביבתיים המשפיעים על דלקת אלרגית של דרכי הנשימה

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את היצירה והתיקוף של מערך דיווח של לוסיפראז (luciferase reporter assay) יציב עבור STAT6 בתאי אפיתליום של דרכי הנשימה האנושיות. שיטה זו מאפשרת סריקה יעילה של רעלים סביבתיים ומרכיבי זיהום אוויר המודולטורים של פעילות STAT6 תחת תנאי in vitro מבוקרים.

תקציר

דלקת דרכי נשימה אלרגית הקשורה לזיהום אוויר היא בעיה גוברת בבריאות הציבור. אינטרלוקין-4 (IL-4) ואינטרלוקין-13 (IL-13), המפעילים את מסלול ה-Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6), מתווך מרכזי של דלקת דרכי נשימה אלרגית, עשויים לווסת את הרעילות הנשימתית של מזהמים. המחקר הנוכחי מתאר את היצירה והתיקוף של מערך בדיקת רפורטר לוציפראז יציב ל-STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיות, לצורך הערכת רעלים סביבתיים המווסתים את אותות ה-STAT6. תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מסוג 16HBE14o− עברו טרנסדוקציה עם רפורטר לוציפראז המגיב ל-STAT6 באמצעות וקטור לנטיוירי, ולאחר מכן בוצעו אופטימיזציה לברירה באמצעות פורומיצין ולריבוי זיהומים (MOI), ובידוד מונוקלונלי על ידי דילול מוגבל. נבחר קלון יציב עם השראה חזקה ועקבית לאורך מעברים סדרתיים. התגובתיות של הרפורטר תוקפה באמצעות גרייה של IL-4/IL-13, והתלות ב-STAT6 אוששה באמצעות מעכבים סלקטיביים של STAT6, STAT5 ו-STAT3. ביצועי הבדיקה נמדדו באמצעות ניתוח Z′-factor, אשר הצביע על הפרדה עקבית של האות. יתרה מכך, הבדיקה יושמה על רכיבים בודדים של זיהום אוויר, ונמצא כי benzo[b]fluoranthene וחומר חלקיקי הגבירו באופן משמעותי את פעילות רפורטר ה-STAT6. שיטה זו מספקת גישה ניתנת להרחבה למדידת פעילות STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה ולתיעדוף של רעלים סביבתיים המווסתים אותות אלרגיים בדרכי הנשימה.

מבוא

זיהום אוויר מהווה את אחד האתגרים הדחופים ביותר לבריאות הציבור בעולם, עם השפעות בריאותיות והשלכות סוציו-כלכליות עמוקות. כיום הוא מדורג כגורם הסיכון השני המוביל לתמותה, ואחראי ל-8.1 מיליון מקרי מוות מדי שנה1,2,3. בין המזהמים הנישאים באוויר, חלקיקים דקים בעלי קטרים של פחות מ-2.5 מיקרומטרים (PM2.5) מהווים את הסיכון הבריאותי הגבוה ביותר בשל יכולתם לחדור עמוק אל תוך דרכי הנשימה4,5. חשיפה מוגברת ל-PM2.5 נקשרה באופן עקבי לירידה בתפקודי הריאה ולעלייה בשיעורי האשפזים עקב מחלות דרכי נשימה6. השכיחות של מחלות דלקתיות אלרגיות, כולל אסתמה, נזלת אלרגית ודרמטיטיס אטופית, נמצאה בעלייה ברחבי העולם והיא גבוהה באופן לא פרופורציונלי במגה-ערים מזוהמות מאוד4.

מחלות דרכי נשימה אלרגיות, כגון אסמה אטופית, מתווכות בעיקר על ידי תגובה דלקתית מסוג 2 המאופיינת ברמות גבוהות שלB של הציטוקינים interleukin‑4 (IL‑4) ו-interleukin‑13 (IL‑13) ובפעילות של מסלול האיתות Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)7. בתאי אפיתל של דרכי הנשימה, פוספורילציה של STAT6 המונעת על ידי IL-4 ו-IL-13 מעודדת הפרשת יתר של ריר ופגיעה במחסום האפיתליאלי, מה שמגדיר את STAT6 כמתווך מרכזי של פתולוגיה אלרגית בדרכי הנשימה וכמטרה טיפולית רלוונטית8,9. ראיות ניסיוניות ממודלים של עכברים מצביעות על כך שחשיפה ל-PM2.5 ולדו-תחמוצת הגפרית מגבירה את איתות STAT6 ומחמירה את הדלקת האלרגית בדרכי הנשימה10,11. עם זאת, השאלה האם מרכיבי זיהום אוויר בודדים מושפעים באופן ישיר מהפעילות השעתוקית של STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיות לא נבחנה באופן שיטתי.

זיהום אוויר מורכב מתערובת כימית מורכבת של מרכיבים, הכוללת חלקיקים (particulate matter), פחמימנים ארומטיים רב-טבעתיים (PAHs), מתכות כבדות ומלחים אנאורגניים, שהתרומות האינדיבידואליות שלהם להפעלת STAT6 בדרכי הנשימה נותרו לא מוגדרות היטב12,13. מתודולוגיות נוכחיות למדידת פעילות STAT6 בתאי אפיתל של דרכי הנשימה, כגון בדיקות פוספורילציה של נקודת סיום (endpoint phosphorylation assays) או מערכות רפורטר מבוססות טרנספקציה זמנית, אינן מתאימות לסריקה כימית רחבת היקף. לכן, פלטפורמת רפורטר של STAT6 יציבה ומבוססת תאים בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיים תספק כלי בר-הרחבה לזיהוי תרכובות ממקור זיהומי המשפיעות על אותות של אלרגיה בדרכי הנשימה. פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח והתיקוף של בדיקת רפורטר לוציפראז של STAT6 יציבה בתאי אפיתל של דרכי נשימה מסוג 16HBE14o−, המאפשרת הערכה כמותית של הפעלת STAT6 לצורך סריקה שיטתית של דגימות סביבתיות ורעלים כימיים בודדים.

פרוטוקול

אישור אתי למשתתפים אנושיים אינו רלוונטי מכיוון שבמחקר זה נעשה שימוש בשורת תאי אפיתל ברונכיאלי אנושי מבוססת, 16HBE14o−.

1. יצירת 16HBE14o− תאים המבטאים באופן יציב רב-דיווח לפעילות STAT6

הערה: איור 1 מספק סקירה כללית של תהליך העבודה.

  1. תרבית תאים
    הערה: בצע את כל הפעולות בשימוש בטכניקה אספטית בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית Class II. ודא שהתאים נקיים מזיהום במיקופלסמה לפני השימוש.
    1. שמר את תאי 16HBE14o− במצע מינימלי חיוני (minimum essential medium) מועשר ב-10% סרום עגל עובר (fetal bovine serum) ו-1% פניסלין–סטריפטומייצין. דגרי את התאים ב-37 °C באטמוספירה לחית המכילה 5% CO2, והחלף את מצע התרבית מדי יומיים.
    2. המתן עד שהתאים יגיעו לכ-80% קונפלואנסיות (confluence). שאב את מצע התרבית ושטוף את שכבת התאים החד-שכבתיות (monolayer) פעם אחת במי מלח בבופר פוספט (phosphate-buffered saline).
    3. הוסף מספיק מי מלח בבופר פוספט כדי לכסות את שכבת התאים ודגרי את התאים למשך 20 דקות ב-37 °C. שאב את מי המלח בבופר הפוספט לחלוטין.
      הערה: השתמש בדגירה של 20 דקות במי מלח בבופר פוספט כדי להקל על פירוק הצמתים הבין-תאיים ההדוקים (tight intercellular junctions) שנוצרים בקו תאים זה. משך זמן זה מייצג התאמה שעברה אופטימיזציה פנימית במעבדה.
    4. הוסף תמיסת טריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ (trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid) בריכוז 0.25% בכמות מספיקה לכיסוי שכבת התאים. דגרי את התאים למשך 10 דקות ב-37 °C.
      הערה: עקוב אחר ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. טפוף בעדינות על כלי התרבית בעת הצורך כדי להקל על הניתוק.
    5. הוסף נפח של כחמישה פעמים נפח תמיסת הטריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ של מצע תרבית מלא כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית. העבר את התמיה בעזרת פיפט בעדינות כדי לקבל תמיה של תאים בודדים.
    6. העבר את תמיחת התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL. צנטריפוג את התמיחה ב-300 × g למשך 5 דקות ב-25 °C.
    7. שאב את העליון (supernatant) בזהירות והשהה מחדש את משקע התאים במצע תרבית טרי. ערבב בעדינות את התמיחה ואשר את קיומה של תמיחה של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ אור הפוך.
    8. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) והתאם את ריכוז התאים לצפיפות הנדרשת לניסוי הבא. השתמש ביחס פיצול שגרתי של 1:8.
      הערה: עיין בSupplementary Table 1 ובSupplementary Table 2 עבור שטחי הגדילה של כלי התרבית והנפחים התואמים של מי מלח בבופר פוספט ותמיסת טריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ.
  2. קביעת ציטוטוקסיות מושרית פוროמיצין (puromycin)
    הערה: בחר את האנטיביוטיקה בהתאם לגן העמידות המקודד על ידי המבנה הלנטי-ויראלי.
    1. זריע את תאי 16HBE14o− בצפיפות של 2 × 104 תאים לבאר בפלטה לתרבית של 96 בארות המכילה 100 µL של מצע תרבית מלא לבאר. דגרי את התאים למשך לילה.
    2. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל פוროמיצין בריכוזים סופיים של 0.5, 1, 2, או 4 µg/mL. הכן פלטות נפרדות לנקודות הזמן של 24, 48 ו-72 שעות.
    3. הוסף 5 µL של ריאגנט לספירת תאים לכל באר. דגרי את הפלטה למשך שעה אחת ב-37 °C.
      הערה: הימנע מהחדרת בועות אוויר לבארות, שכן הן עלולות להפריע למדידות הבליעה (absorbance).
    4. מדוד את הבליעה באורך גל של 450 nm תוך שימוש ב-650 nm כאורך גל ייחוס. נער את הפלטה למשך 15 שניות מיד לפני רישום הבליעה במצב endpoint.
    5. חשב את חיוניות התאים14 באמצעות משוואה 1.
      משוואת חיוניות תאים, OD450-650 לדגימות, ביקורת, בלאנק; נוסחה לניתוח ביו-אסאי.
      כאשר:
      משוואת בליעה OD450-650, שיטת חיסור, משמשת בספקטרופוטומטריה, נוסחה.
      נוסחת צפיפות אופטית (OD450-650) לניתוח בליעה בניסויי ספקטרוסקופיה.
      משוואת צפיפות אופטית, OD450-650blank=OD450blank-OD650blank, לניתוח נתונים ספקטרוסקופיים.
      הערה: הגדר את הביקורת (control) כתאים לא מטופלים ואת הבלאנק (blank) כמצע ללא תאים המכיל את ריאגנט הבדיקה. בחר את ריכוז הפוროמיצין הנמוך ביותר שמחסל לחלוטין את התאים שלא עברו טרנסדוקציה בתוך 48–72 שעות.
  3. קביעת ריבוי הזיהום (MOI) האופטימלי
    זהירות: טפל בחלקיקים לנטי-ויראליים תחת תנאי רמה 2 של בטיחות ביולוגית (Biosafety Level 2) במתקן רשום לרמה 2 ובהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. בצע את כל המניפולציות הוויראליות בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית Class II. כסה חומרים מתכלים ושפיכות מזוהמים בנגיף ב-10% אקונומיקה למשך שעה אחת לפחות לפני השלכתם כפסולת ביו-סיכונה.
    הערה: בצע אופטימיזציה לריבוי הזיהום (MOI) מכיוון שהוא משפיע ישירות על יעילות הטרנסדוקציה.
    1. חשב את הנפח הנדרש של מאגר הלנטי-ויראלי15 באמצעות משוואה 2.
      נוסחה לחישוב MOI, יחס בין חלקיקי נגיף לתאי מטרה, משוואת ביולוגיה מולקולרית.
      כאשר:
      נוסחת טיטר ויראלי פונקציונלי, T_virus = TU/mL, משוואה לניתוח נתוני מחקר בווירוлогия.
      משוואת נפח נגיף, V_virus=נפח נגיף ב-mL, נוסחה, מחקר בווירוлогия, שיטת חישוב
      שיווי משקל סטטי, משוואה: N_cells = מספר תאי מטרה, תרשים לשימוש במחקר חינוכי.
      הערה: הטיטר הפונקציונלי של מאגר הלנטי-ויראלי של STAT6 luciferase reporter ששימש בפרוטוקול זה היה 5 × 107 יחידות טרנסדוקציה/mL. עבור 2 × 104 תאי מטרה, MOI של 20 תואם ל-8 µL של מאגר לנטי-ויראלי לבאר. יש לחשב מחדש את נפח הנגיף עבור הכנות נגיף עם טיטרים שונים.
    2. זריע את תאי 16HBE14o− בצפיפות של 2 × 104 תאים לבאר בפלטה לבנה עם תחתית שקופה של 96 בארות המכילה 100 µL של מצע תרבית מלא לבאר. דגרי את התאים למשך לילה עד שיגיעו לכ-80% קונפלואנסיות.
    3. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל 5 µg/mL פוליברן (polybrene) ולנטי-ויראלי STAT6 luciferase reporter ב-MOIs של 1, 5, 10 ו-20. כלול באר ביקורת (mock-control) ללא טרנסדוקציה שאינה מכילה לנטי-ויראלי.
      הערה: חשב את הנפח הלנטי-ויראלי הנדרש לכל MOI מהטיטר הפונקציונלי של המאגר.
    4. דגרי את התאים עם החלקיקים הלנטי-ויראליים למשך 48 שעות. החלף את מצע הטרנסדוקציה במצע תרבית טרי ודגרי את התאים למשך 24 שעות נוספות.
    5. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל אינטרלוקין-4 ואינטרלוקין-13 בריכוז של 10 ng/mL לכל אחד. דגרי את התאים למשך 24 שעות.
    6. הוסף 25 µL של ריאגנט לבדיקת לוציפראז לכל באר16. הגן על הפלטה מפני אור ודגרי אותה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. נער את הפלטה באופן ליניארי למשך 20 שניות. מדוד לומניסנציה (luminescence) במצב endpoint באמצעות קריאה של הפלטה מלאה והגדרת gain של 120.
      זהירות: רשום את הלומניסנציה בתוך שעה לאחר הוספת ריאגנט בדיקת הלוציפראז כדי ללכוד את האות המקסימלי. פעל לפי הוראות הבטיחות והטיפול של יצרן הריאגנט.
      הערה: השתמש באותו קורא מיקרופלטה רב-מצבים ובאותן הגדרות רכישה עבור כל מדידות הבליעה והלומניסנציה.
  4. סלקציה של תאים שעברו טרנסדוקציה
    1. זריע את תאי 16HBE14o− בצפיפות של 2 × 105 תאים/mL בפלטה לתרבית של 24 בארות. דגרי את התאים למשך לילה.
    2. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל לנטי-ויראלי STAT6 luciferase reporter ב-MOI של 20 ו-5 µg/mL פוליברן. דגרי את התאים למשך 48 שעות.
    3. החלף את מצע הטרנסדוקציה במצע תרבית טרי. דגרי את התאים למשך 24 שעות נוספות.
    4. שאב את מצע התרבית והוסף מצע טרי המכיל 1 µg/mL פורומיצין. דגרי את התאים למשך 5 ימים, והחלף את מצע הסלקציה מדי יומיים.
    5. המשך בסלקציית פורומיצין עד שכל התאים בבאר ביקורת ה-mock-control ללא הטרנסדוקציה יחוסלו.
      הערה: המתן לפחות 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה לפני יישום סלקציית האנטיביוטיקה כדי לאפשר ביטוי של גן העמידות.
  5. בידוד של קלוני תאים בודדים על ידי דילול מגביל (limiting dilution)
    1. נתק וספור את תאי STAT6 reporter שנבחרו על ידי פורומיצין. הכן תמיחה של תאים בודדים בריכוז 5 תאים/mL על ידי דילול סדרתי.
      הערה: מנע התגבשות של תאים במהלך הדילול. העבר את התמיחה דרך מסנן תאים בעת הצורך.
    2. חלק 200 µL מהתמיחה של התאים לכל באר בפלטה לתרבית של 96 בארות כדי לקבל צפיפות ממוצעת של תא אחד לבאר בקירוב.
    3. בחן כל באר באמצעות מיקרוסקופ הפוך בתוך 24 שעות וזהה בארות המכילות תא בודד. שלול בארות המכילות יותר מתא אחד או מספר מוקדי תאים מופרדים מרחבית.
    4. עקוב אחר הבארות הנבחרות במהלך השבוע הראשון כדי לאשר גדילה קלונלית. החלף את מצע התרבית מדי 3 ימים.
    5. הרחב כל קלון בפלטת 96 הבארות המקורית למשך כ-20 ימים או עד שהתאים יגיעו לקונפלואנסיות. העבר כל קלון באופן רצפי לפלטה של 6 בארות ולאחר מכן לבקבוק תרבית T-25.
      הערה: דגרי את התאים בפלטה של 6 בארות למשך כ-6 ימים לפני העברתם לבקבוק T-25, או העבר אותם כאשר הם מגיעים לקונפלואנסיות המתאימה.
      נקודת עצירה (PAUSE POINT): המשך להרחיב את הקלונים או שמור אותם בהקפאה (cryopreserve) בריכוז של 1 × 106 תאים למבחנה ב-1 mL של מצע שימור בהקפאה המכיל 90% סרום עגל עובר ו-10% דימეთיל סולפוקסיד.
    6. זריע כל קלון מורחב בצפיפות של 2 × 105 תאים/mL בפלטה לבנה עם תחתית שקופה של 96 בארות. דגרי את התאים למשך לילה.
    7. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל IL-4 ו-IL-13 בריכוז של 10 ng/mL לכל אחד. דגרי את התאים למשך 24 שעות.
    8. מדוד את פעילות הלוציפראז כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7. השווה את פעילות הרפורטר המושרה בין הקלונים הבודדים.
    9. חזור על בדיקת הלוציפראז לאורך מספרים גדלים של מעברים תאיים (cell-passage). בחר קלונים השומרים על פעילות רפורטר עקבית המושרית על ידי ציטוקינים לאורך המעברים.
      הערה: קלון 3 נבחר בשל לומניסנציה בסיסית נמוכה ויכולתו לשמור על אות הפעלה עקבי המושרה על ידי ציטוקינים לאורך מעברים סדריים.

2. הקמה ותיקוף של בדיקת דיווח לפעילות STAT6

הערה: איור 2 מספק סקירה כללית של זרימת העבודה.

  1. תיקוף של בדיקת הדיווח (reporter assay) לפעילות STAT6
    1. זריעה של תאי הדיווח ל-STAT6 בריכוז של 2 × 105 תאים/mL לתוך פלטת 96 בארות לבנה עם תחתית שקופה, תוך שימוש ב-100 µL של מצע גידול מלא לכל באר. דגירה של התאים למשך לילה.
    2. החלפת מצע הגידול במצע טרי המכיל IL-4 ו-IL-13 בריכוזים סופיים של 10 ng/mL עבור כל אחד. הוספה סימולטנית של המעכבים הסלקטיביים באופן הבא: 100 nM AS1517499 (מעכב STAT6), 2.5 µM AC-4-130 (מעכב STAT5), או 2.5 µM Stattic (מעכב STAT3).
    3. הכללת בקרת נשא (vehicle control) המכילה 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO). דגירה של התאים למשך 24 h.
    4. קביעת חיוניות התאים באמצעות בדיקת ספירת תאים כפי שמתואר בשלבים 1.2.3–1.2.5.
    5. מדידת פעילות לוציפראז (luciferase) כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7.
    6. נורמליזציה של אות הלומינסנס של כל באר ביחס לחיוניות התאים המתאימה לה. ביטוי הערכים המנורמלים ביחס לקבוצת הביקורת שטופלה בציטוקינים.
      הערה: חיוניות תאים מופחתת עלולה להוריד את אות הלוציפראז באופן בלתי תלוי בפעילות STAT6. יש לפרש את פעילות הדיווח רק לאחר אישור חיוניות תאים מקובלת.
  2. הערכת חוסן הבדיקה
    1. הערכת חוסן הבדיקה על ידי חישוב ה-Z′-factor באמצעות 21 בארות חזרתיות עבור קבוצות הביקורת החיובית והשלילית.
    2. חישוב ה-Z′-factor באמצעות משוואה 3.
      משוואת שיווי משקל סטטית, נוסחת Z-factor, ביטוי מתמטי לבקרת איכות של בדיקה.
      כאשר:
      משוואת שיווי משקל סטטית, σₚ מציינת סטיית תקן בביקורת, איור של נוסחה לימודית.
      משוואת סטיית תקן, σn, המשמשת בניתוח סטטיסטי לדיוק של ביקורת שלילית.
      משוואה μ<sub>p</sub>=אות ממוצע של הביקורת החיובית; קונספט של ניתוח נתונים סטטיסטי.
      שיווי משקל סטטי, משוואה μn= אות ממוצע של הביקורת השלילית, ניתוח לימודי.
      הערה: Z′-factor שבין 0.5 ל-1.0 מעיד על כך שהבדיקה מתאימה לסריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening).

3. יישום של בדיקת הדיווח (reporter assay) של STAT6 לסריקת רעלים סביבתיים

זהירות: יש להתייחס לפוליציקליים ארומטיים ולמלחים של מתכות כבדות כחומרים רעילים ופוטנציאליים למסרטנים. השתמשו בציוד מגן אישי מתאים, בצעו את כל הפעולות במנדף כימי מאושר, והשליכו חומרים מזוהמים בהתאם לנהלי פסולת מסוכנת של המוסד.

  1. סריקת רעלים סביבתיים
    1. זריעה של תאי הדווח (reporter cells) של STAT6 בריכוז של 2 × 105 תאים/mL לתוך פלטה לבנה בעלת תחתית שקופה של 96 בארות, תוך שימוש ב-100 µL של מצע גידול מלא לכל בארה. דגירה של התאים למשך הלילה.
    2. החלפת מצע הגידול במצע טרי המכיל כל תרכובת לבדיקה בריכוז הסופי הרצוי, אשר בפרוטוקול זה הוא 10 µM, וטיפול בתאים בהיעדרה של IL-4 ו-IL-13.
    3. הכללת קבוצת ביקורת שלילית המכילה 0.1% dimethyl sulfoxide וקבוצת ביקורת חיובית המכילה IL-4 ו-IL-13 בריכוז של 10 ng/mL כל אחד. דגירה של התאים למשך 24 h.
    4. קביעת חיות התאים באמצעות בדיקת ספירת תאים כפי שמתואר בשלבים 1.2.3–1.2.5.
    5. מדידת פעילות לוציפראז כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7.
    6. נורמליזציה של אות הלומניסנציה מכל בארה ביחס לערך חיות התאים המתאים. ביטוי התוצאה המנורמלית ביחס לקבוצת הביקורת השלילית.
    7. הדרה של תרכובות המורידות את חיות התאים מתחת ל-80% מתוך פרשנות פעילות הדווח של STAT6.
      הערה: יש להתייחס לאותות דווח שהתקבלו בתנאים ציטוטוקסיים כלא מהימנים, שכן ירידה בחיות התאים עלולה לשנות את הלומניסנציה באופן בלתי תלוי בפעילות מסלול ה-STAT6.

תוצאות

כדי לקבוע את ריכוז הפוּרוֹמִיצין האופטימלי לברירה יציבה, תאי 16HBE14o− הוריים טופלו בריכוזים עולים של פוּרוֹמִיצין (0.5–4 µg/mL), וחיוניות התאים נבדקה לאחר 24, 48 ו-72 שעות באמצעות מבחן חיוניות תאים. פוּרוֹמִיצין הפחית את חיוניות התאים באופן תלוי מינון וזמן, כאשר כל הריכוזים הפחיתו את החיוניות לרמה של פחות מ-20% לאחר 48–72 שעות (איור 3). ריכוז של 1 µg/mL היה הריכוז הנמוך ביותר שחיסל לחלוטין תאים שאינם טרנסדוקטריים, והפחית את אות החיוניות השאריתי לכ-4.5% תוך 48 שעות (p < 0.0001). הגדלת ריכוז הפוּרוֹמִיצין לא הובילה להפחתה נוספת בחיוניות התאים. לפיכך, נבחר ריכוז של 1 µg/mL פוּרוֹמִיצין לברירה העוקבת של תאים טרנסדוקטריים.

כדי למטב את יעילות הטרנסדוקציה הלנטיביראלית, תאי 16HBE14o− עברו טרנסדוקציה עם לנטיבירוס של דוחן לוציפראז STAT6 בריבוי זיהומים (MOIs) של 1, 5, 10 ו-20 למשך 48 h, ולאחר מכן עברו גרייה באמצעות IL-4 ו-IL-13 (במינון של 10 ng/mL כל אחד) למשך 24 h להפעלת סיגנל STAT6. כפי שמוצג ב-איור 4, יחידות לומינצנציה יחסיות (RLUs) עלו באופן תלוי MOI. MOI של 20 הניב את האינדוקציה הגבוהה ביותר של הדוחן, מה שהוביל לעלייה של כ-50 מומים בלומינצנציה בהשוואה לבקרת אי-הגרייה (p < 0.0001). בהתבסס על תוצאות אלה, נבחר MOI של 20 עבור הניסויים הבאים.

בעקבות הטרנסדוקציה והסלקציה באמצעות puromycin תחת התנאים הממוטבים, תאים שאינם טרנסדוקטיביים עברו מוות תאי נרחב, בעוד שתאים טרנסדוקטיביים שמרו על מורפולוגיה וחיוניות תקינות (איור 5). התאים ששרדו הועברו לאחר מכן לדילול מגביל (limiting dilution) לצורך הקמת קווי תאים מונוקלונליים של STAT6 reporter.

שלושה קווי תאי דגמי (reporter) מונוקלונליים שהופקו מתאים בודדים נבחנו עבור פעילות דגמי של STAT6. כל השיבטים הפגינו לומינסנציה בסיסית נמוכה (<1,000 RLU). גרייה באמצעות IL-4 ו-IL-13 השריתה פעילות דגמי חזקה בשיבטים 2 ו-3, עם לומינסנציה שעברה את 20,000 RLU והתאימה להשראה של יותר מ-20 מנתים (איור 6A). שיבט 3 הפגין את הלומינסנציה הבסיסית הנמוכה ביותר ולכן נבחר לאפיון נוסף. פעילות הדגמי בשיבט 3 נבחנה לאורך מעברים סדרתיים (P9–P21) כדי להעריך יציבות לטווח ארוך. כפי שמוצג ב-איור 6B, השראת הדגמי התלויה ב-STAT6 נותרה יציבה לאורך טווח המעברים שנבדק. שיבט נחשב למתאים לניסויים עוקבים כאשר הפגין קצב גדילה תקין, לומינסנציה בסיסית נמוכה מכ-1,000 RLU, והשראה של יותר מ-20 מנתים בעקבות גרייה של ציטוקינים.

מכיוון ש-IL-4 ו-IL-13 יכולים להפעיל חברים נוספים במשפחת STAT, כולל STAT3 ו-STAT5, נבחנה בהמשך הספציפיות של מערך הדיווח (reporter assay)17,18. תאי דיווח של STAT6 עוררו באמצעות IL-4 ו-IL-13 בנוכחות או בהיעדר מעכבים סלקטיביים המכוונים ל-STAT6, STAT5 או STAT3 למשך 24 h19,20,21. חיוניות התאים נותרה מעל 90% בכל תנאי הטיפול (מעכב STAT6 AS1517499, 100 nM: 98.4%; מעכב STAT5 AC-4-130, 2.5 µM: 97.4%; מעכב STAT3 Stattic, 2.5 µM: 96.2%; איור 7A). עיכוב של STAT6 הפחית באופן משמעותי את פעילות הלוקיפראז (p < 0.0001), בעוד שעיכוב של STAT5 או STAT3 לא הניב השפעה מובהקת על פעילות הדיווח (p = 0.2593 ו-p = 0.8857, בהתאמה; איור 7B). ממצאים אלו אישרו כי הפעלת הדיווח תלויה בעיקר ב-STAT6.

את חסוּנות הבדיקה העריכו באמצעות חישוב של מקדם Z′-factor, כאשר תאים שעברוהסטימולציה של IL-4 ו-IL-13 שימשו כביקורת לאות גבוה, ותאים שטופלו במעכב STAT6 שימשו כביקורת לאות נמוך. הבדיקה הניבה Z′-factor של 0.703 ± 0.097, דבר המעיד על ביצועי בדיקה מצוינים, חלון אות רחב והתאמה לסריקה בתוספת גבוהה (high-throughput screening).

לבסוף, נעשה שימוש בבדיקת הדו"ח (reporter assay) של STAT6 כדי לסנן מרכיבים סביבתיים נבחרים של חומר חלקיקי (particulate matter) לבחינת יכולתם לווסת את אותות ה-STAT6. לאחר 24 שעות של טיפול, benzo[b]fluoranthene (10 µM) הגביר באופן מובהק את פעילות הדו"ח של STAT6 בכ-1.75-מכפלות (p = 0.0006), בעוד שחומר חלקיקי (100 µg/mL) הגביר את פעילות הדו"ח בכ-1.5-מכפלות (p = 0.0398; איור 8). לעומת זאת, שאר הפחמימנים הארומטיים הפוליציקליים ותרכובות המתכות הכבדות, כולל CdCl2, HgCl2, ו-NiSO4 (10 µM כל אחד), לא שינו באופן מובהק את פעילות הדו"ח. יחד, תוצאות אלו מדגימות כי בדיקת הדו"ח של STAT6 היא יציבה, ספציפית, חסונה ומתאימה לסריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות סביבתיות המווסתות את אותות ה-STAT6.

תרשים טרנסדוקציה של תאים; STAT6 luciferase reporter; סלקציה אנטיביוטית; אופטימיזציה של MOI.
איור 1: זרימת עבודה ליצירת תאי 16HBE14o− STAT6 reporter. סקירה סכמטית של הפרוטוקול ליצירת תאי 16HBE14o− המבטאים באופן יציב STAT6 luciferase reporter. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים זרימה של תהליך בדיקת תאי דגימה של STAT6; גרייה ב-IL4/13, CCK8, הוספת לוציפראז, תוצאות.
איור 2: זרימת העבודה להקמה ויישום של בדיקת דגימה של STAT6. סקירה סכימטית של בדיקת דגימה של STAT6 לצורך תיקוף הבדיקה וסריקה של רעלים סביבתיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים עמודות של חיות תאים המראה את השפעות הפיורומיצין בריכוזים של 0.5-4µg/mL לאורך 24-72 שעות; ניתוח סטטיסטי.
איור 3: קביעת ריכוז הפיורומיצין האופטימלי לבחירה של תאים יציבים. תאי 16HBE14o− הורים טופלו בפיורומיצין (0.5, 1, 2, או 4 µg/mL) למשך 24, 48, או 72 שעות. תאי ביקורת-נשאי קיבלו 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO). חיות התאים נקבעה באמצעות בדיקת חיות תאים. חיות התאים חושבה מהפרש הבליעה בין 450 ל-650 nm לאחר חיסור רקע ונורמליזציה לביקורת-הנשאי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות עם כפילויות טכניות (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Dunnett. ערכי p להשוואות מול ביקורת-הנשאי מצוינים בתרשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גרפים של לומינסנציה לעומת MOI; ניתוח נתונים של שינוי קיפול ב-RLU וערכי p סטטיסטיים.
איור 4: אופטימיזציה של יעילות טרנסדוקציה לנטיווירלית. תאי 16HBE14o− עברו טרנסדוקציה עם לנטיווירוס רפורטר לוסיפראז של STAT6 בריבוי זיהומים (MOIs) של 1, 5, 10, או 20 למשך 48 h. לאחר תקופת התאוששות של 24 h, התאים עוברו בגירוי עם IL-4 ו-IL-13 (במינון של 10 ng/mL כל אחד) למשך 24 h. (A) יחידות לומינסנציה יחסיות (RLUs) בתאים שעברו טרנסדוקציה דמה (mock) ובתאים שעברו טרנסדוקציה עם הרפורטר ב-MOIs המצוינים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות one-way ANOVA, ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Dunnett. (B) קיפול ההשראה לאחר גירוי בציטוקינים ביחס לביקרת MOI 20 לא מעוברית. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות unpaired Student's t-test. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3). ערכי p מצוינים בגרף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מורפולוגיית תאים תחת חשיפה לפיורומיצין; תמונת מיקרוסקופיה המראה וריאציות בקנה מידה של 50 μm.
איור 5: תמונות מייצגות של תאים לאחר סלקציה של פיורומיצין.תאי 16HBE14o− עברו טרנסדוקציה עם או ללא לנטי-וירוס של רפורטר לוסיפרז עבור STAT6 (MOI = 20) וטופלו לאחר מכן ב-1 µg/mL פיורומיצין למשך 5 ימים. התמונות הופקו באמצעות מיקרוסקופ הפוך בניגודיות פאזה (phase-contrast) בהגדלה של 100× תחת תנאי דימוי זהים. תאי הורה שלא טופלו יצרו שכבה אפיתליאלית נורמלית (שמאלה). תאים שלא עברו טרנסדוקציה וטופלו בפיורומיצין הראו מוות תאי נרחב והיפרדות (מרכז), בעוד שתאים שעברו טרנסדוקציה ונבחרו באמצעות פיורומיצין נותרו חיוניים ושמרו על מורפולוגיה נורמלית (ימינה). Scale bar = 50 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות בדיקת לומינסנציה; תרשים עמודות המשווה בין תנאי בקרה לתנאי IL בשיבוטים של תאים ובמעברים.
איור 6: זיהוי של שיבוטי דורג (reporter) של STAT6 והערכת יציבות הדורג. בעקבות דילול מגביל, הורחבו שלושה שורות תאים מונוקלונליות של דורג STAT6 ועוברו גרייה באמצעות IL-4 ו-IL-13 (במינון של 10 ng/mL כל אחד) למשך 24 h. (A) פעילות לוסיפראז של שיבוטי דורג בודדים לאחר גרייה בציטוקינים בהשוואה לבקרה ללא גרייה. (B) יציבות פעילות דורג STAT6 בשיבוט 3 לאורך מעברים סדרתיים (P9–P21). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD של כפילויות טכניות. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מורחבת של איור זה.

תרשימי עמודות המשווים את % חיות התאים והלומינסנציה מנורמלת במבחני תאים שעובדו בתרופות.
איור 7: עיכוב סלקטיבי של פעילות דגיש (reporter) של STAT6 ללא השפעה על חיות התאים. תאי דגיש של STAT6 עוררו באמצעות IL-4 ו-IL-13 (10 ng/mL כל אחד) למשך 24 h בנוכחות מעכב STAT6 מסוג AS1517499 (100 nM), מעכב STAT5 מסוג AC-4-130 (2.5 µM), או מעכב STAT3 מסוג Stattic (2.5 µM). קבוצת הביקורת (vehicle) שעוררה בציטוקינים קיבלה 0.1% DMSO. (A) חיות התאים נקבעה באמצעות מבחן חיות תאים. (B) פעילות לוקיפראז התלויה ב-STAT6 מנורמלת לביקורת שעוררה בציטוקינים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3). ערכי p מצוינים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים עמודות של תוצאות בדיקת לומנסנס נורמליזציה המשווה בין טיפולים כימיים לדגימות ביקורת.
איור 8: הערכת ההשפעות המודולטוריות של רעלים סביבתיים על STAT6. תאי רפורטר של STAT6 טופלו במשך 24 h בחומר חלקיקי (100 µg/mL) או ברעלים סביבתיים מצוינים, כולל פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) ומתכות כבדות (10 µM כל אחד). פעילות לוסיפרז תלויית STAT6 נורמליזה ביחס לביקורת ה-vehicle (0.1% DMSO). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי השוואה לביקורת ה-vehicle, וערכי p מצוינים. נא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה נלווית 1: מפרטי כלי תרבית ופרמטרי מעבר עבור תרבית תאים של 16HBE14o−אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 2: השוואה בין שיטות למדידת פעילות STAT6.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מסלול השגורה IL-4/IL-13–JAK–STAT6 אינו רק יעד טיפולי חשוב, אלא גם גורם מפתח בפתוגנזה של מחלות אלרגיות, כולל אסמה ונזלת אלרגית22. פרוטוקול זה מתאר מערך רפורטר (reporter assay) פשוט ויציב המבוסס על שורת תאים, לזיהוי מודולטורים של פעילות STAT6. ניתן להשתמש במערך זה להערכת ההשפעות המודולטוריות של STAT6 עבור מגוון רחב של תרכובות סביבתיות, והוא ניתן להתאמה קלה לסריקות בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput screening), כפי שמוצג במחקר סריקה להוכחת היתכנות (איור 8). באמצעות שילוב רפורטר לוסיפראז עם מערך מקבילי לבדיקת חיוניות תאים, השיטה מאפשרת הערכה כמותית של המודולציה של מסלול STAT6 תוך מזעור השפעות מטעה הנובעות מרעילות תאית הנגרמת על ידי התרכובות.

מאפיין ייחודי של שיטה זו הוא השימוש בתאי אפיתל ברונכיאלי אנושי 16HBE14o− שעברו טרנסדוקציה יציבה, סוג תאי רלוונטי פיזיולוגית שבו סיגנל IL-4/IL-13 המושרה על ידי מזהמים תורם לדלקת בדרכי הנשימה על רקע אלרגיה. לגישות קיימות למדידת פעילות STAT6 יש מגבלות מעשיות משמעותיות. זיהוי של פוספורילציה של STAT6 או חלבונים מטרת-מצב (downstream) באמצעות Western blotting או סמימרסורבנציה מקושרת לאנזים (ELISA) הוא תהליך עתיר עבודה בעל תפוקה נמוכה יחסית. בדיקות של רפורטר לוסיפראז המבוססות על טרנספקציה זמנית מודדות באופן ישיר את הפעילות התעתيكية של STAT6, אך הן מושפעות מנצילות טרנספקציה משתנה, שונות בין סדרות (batch-to-batch) ומהצורך לחזור על הטרנספקציה עבור כל ניסוי, ובכך מפחיתות את השחזוריות ואת התפוקה.

קו התאים המדווח היציב המתואר במחקר המכניס פתרון לרבות מהמגבלות הללו. כיוון שמבנה הדיווח (reporter construct) משולב גנומית ונבחר באופן קלונלי, ביטוי הדיווח נותר אחיד בכל אוכלוסיית התאים וניתן לשחזור בין מעברים, ובכך מ eliminated השונות הקשורה לטרנספקציה זמנית. אות הלומינסנציה נמדד בתאים חיים וניתן לנרמל אותו למדידה מקבילה של חיוניות תאים כדי להוציא ארטיפקטים ציטוטוקסיים. בנוסף, הבדיקה תואמת בקלות לפורמט של 96 בארות עבור יישומים בתפוקה בינונית עד גבוהה. הבדיקה הניבה Z′-factor של 0.703, מה שמעיד על הפרדה מצוינת בין בקרות עם אות גבוה לנמוך ומאשר את התאמתה לסריקה בתפוקה גבוהה. השוואה של גישות נפוצות למדידת פעילות STAT6 מופיעה ב-Supplementary Table 2. עם זאת, כיוון שהבדיקה מדווחת על הפעלה של פרומוטור המגיב ל-STAT6 ולא על ביטוי של גן מטרה אנדוגני, נותרו חשובים תיקופים אורתוגונליים באמצעות מטרות מורד של STAT6, כגון MUC5AC ו-CCL26.

מספר שלבים הם קריטיים להקמה וליישום מוצלחים של בדיקת הדיווח (reporter assay) של STAT6. אופטימיזציה של ריבוי זיהום הנגיפי (MOI) של ה-lentivirus היא חיונית, כיוון שכמות נגיפית לא מספקת מפחיתה את יעילות הטרנסדוקציה, בעוד שחשיפה נגיפית מוגברת עלולה להשרות סטרס תאי ולפגוע בחיות התאים. בדומה לכך, נדרשת אופטימיזציה של ריכוז הבחירת הפומוסין (puromycin) כדי לסלק תאים שאינם בטרנסדוקציה תוך שמירה על חיותם של תאי הדיווח העמידים. מכיוון שהרגישות לטרנסדוקציה לנטיוויראלית ולבחירה אנטיביוטית משתנה בין סוגי תאים שונים, יש לבצע אופטימיזציה אמפירית של שני הפרמטרים לפני הקמת קווי תאי דיווח יציבים. קו התאים 16HBE14o− הוא קו תאים אפיתליאליים ברונכיאליים אנושיים מונחליים (immortalized), הנמצא בשימוש נרחב לחקירת דלקת בדרכי הנשימה מכיוון שהוא יוצר צומתים הדקים (tight junctions) תפקודיים ומייצר ריר8,23. תאים שנבחרו ליצירת הדיווח צריכים להביע רצפטורים תפקודיים ל-IL-4 ול-IL-13 ולשמור על שרטוחי JAK–STAT תקינים במורד הזרם24. לפני הקמת קווי דיווח יציבים, יש לתקף את מבנה הדיווח על ידי אישור תגובה לגירוי של ציטוקינים, דיכוי על ידי מעכבים ספציפיים למסלול, והיעדר השפעות ציטוטוקסיות תחת תנאי הבדיקה שנבחרו. שלבי תיקוף אלו מסייעים להבטיח ששינויים בפעילות הדיווח משקפים במדויק סיגנלינג תלוי-STAT6 ולא סטרס תאי לא ספציפי.

יש לשקול גם מספר מגבלות של שיטה זו. וקטורים לנטיביריים משתלבים באופן אקראי בגנום המארח, מה שעלול להוביל לשונות בין שיבוטים בפעילות הבסיסית של הרפורטר, ביכולת ההשראה ובביציבות הביטוי לטווח ארוך. בנוסף, מכיוון שהבדיקה מודדת הפעלה של מקדם המגיב ל-STAT6, היא אינה מעריכה באופן ישיר הפעלת רצפטורים במעלה הזרם או אירועי סיגנלינג אנדוגניים במורד הזרם. תרבית ממושכת של תאי רפורטר יציבים עלולה להוביל להשתקה אפיגנטית או להפחתה בביטוי התראנסגן. כדי למזער השפעות אלו, יש להקים בנקי תאי מאסטר במעברים מוקדמים, ויש לאמת באופן תקופתי את התגובתיות של הרפורטר בטווח מעברים מוגדר. יתרה מכך, הבדיקה טרם תוקפה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה אנושיים ראשוניים או בפלטפורמה אוטומטית לחלוטין לסריקה בסריקה רחבה (high-throughput screening). לבסוף, הרעלים הסביבתיים שנבחנו במחקר זה מייצגים פאנל להוכחת היתכנות ולא ספרייה כימית מקיפה.

זיהום אוויר, ובמיוחד חלקיקים דקים (PM2.5), מורכב מתערובת מורכבת של מרכיבים מגוונים מבחינה כימית ופיזית, כולל פחמן שחור, מלחים אנורגניים, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים ומתכות כבדות12,13. שינויים במקורות הפליטה ובמעיבוד האטמוספרי יוצרים הבדלים משמעותיים בהרכב החלקיקים, אשר עשויים לתרום לתוצאות בריאותיות שליליות שונות. כתוצאה מכך, זיהוי הרכיבים הספציפיים האחראים לתגובות אלרגיות נותר מאתגר במחקרים אפידמיולוגיים ובמחקרים in vivo. בדיקת הדיווח (reporter assay) של STAT6 המתוארת במחקר מספקת פלטפורמה מעשית in vitro לסריקת הפעילות המודולטורית של STAT6 עבור רעלים בודדים המועברים באוויר, תמציות של חלקיקים המזוהים עם מקור ספציפי, או פראקציות של חלקיקים המוגדרות כימית. פרוטוקול זה עשוי להקל על תיעדוף רעלים מועמדים למחקרים מכניסטיים ולתמוך בהערכה מוכוונת-סיכון של תערובות מורכבות של זיהום אוויר.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר של תאילנד (NRCT) (מענק מס' N42A680388), ופרויקט מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מהידול (קרן מחקר אסטרטגית: 2025) (מענק מס' 35). איורים 1 ו-2 נוצרו באמצעות BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200072ריאגנט לפירוק תאים
מבחנה קונית לצנטריפוגה בנפח 15 מ"לCorningCLS430791מבחנה צנטריפוגית סטרילית מפוליפרופילן
16HBE14o- שורת תאי אפיתל ברונכיאליים אנושייםמתנה מד"ר Nawiya Huipao (אוניברסיטת Prince of Songkla, תאילנד) ופרופ' ד"ר Dieter C. Gruenert (אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו, ארה"ב)RRID:CVCL_0112שבט תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים (מעברים 35–40); אושרו כנקיים ממיקופלסמה והם שומרים על מורפולוגיה של אפיתל דרכי נשימה מובחן ועל תכונות מחסום. מקור: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
פלטה שקופה בעלת תחתית שטוחה, מטופלת לתרבית רקמה, עם 24 בארותCorning3527צלחת לתרבית תאים
פלטה שקופה בעלת תחתית שטוחה, מטופלת לתרביות רקמה, בעלת 6 בארותCorning3516פלטת תרבית תאים
מיקרופלטה מפסטירון בעלת 96 בארות, שקופה, בעלת תחתית שטוחה ומטופלת לתרביות רקמהCorning3599לוחית לבדיקת חיוניות תאים
מיקרופלטה לבנה בעלת תחתית שקופה, 96 בארות, פוליסטירן, מטופלת לתרבית רקמותCorning3610פלטה לבדיקת לומניסנציה
AC-4-130 (מעכב STAT5)MedChemExpressHY-124500מעכב STAT5 סלקטיבי
AS1517499 (מעכב STAT6)MedChemExpressHY-100614מעכב STAT6 סלקטיבי
בנזו[b]פלואורנתןAccuStandardH-128Nפחמימן ארומטי פוליציקלי
מCבט בטיחות ביולוגי, Class IINuaireNU-543-400Eלנהלי תרביות תאים בשיטות סטריליות (aseptic)
קדמיום כלוריד (CdCl2)סיגמא202908תרכובת מתכת כבדה
ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301בדיקת חיוניות תאים
בקראק לתרבית תאים, 25 ס"מ² (T-25)Corning430639בקבוק לתרבית רקמות
פחמן חד-חמצני2 אינקובטורNuaireNU-5710Eנשמר ב- 37 °C, 5% CO22, atmosfera מלחחית
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמאD2650ממס (ריכוז סופי של 0.1%) וחומר קריו-פרוטקטורי (10%)
סרום עגל עוברי (FBS)SigmaF7524תוסף מצע (10%) ומצע הקפאה (10%)
המוציטומטרBOECOBOE14ספירת תאים ידנית
מיקרוסקופ אור עם ניגודיות פאזה הפוךZEISSPrimovertתצפית על מורפולוגיית תאים
מערכת בדיקת לוסיפראז (שלב אחד)BPS Bioscience60690בדיקת דהיינר לוציפראז (Luciferase reporter assay)
מרקורי כלוריד (HgCl2)סיגמא215465תרכובת מתכת כבדה
קורא מיקרו-פלטותBioTekSynergy Neo2קורא לוחות מיקרו-פלטה רב-מצבי/לומינומטר הנשלט על ידי תוכנת Gen5 (גרסה 3.08.01). בליעתיות נמדדה באורך גל של 450 ננומטר עם רפרנס של 650 ננומטר לאחר 15–ניעור ליניארי למשך 20 שניות. מדידת לומנס (Luminescence) במצב נקודת סיום (endpoint mode) עם הגברת גלאה (detector gain) של 120 לאחר ניעור ליניארי למשך 20 שניות.
מצע מינימלי חיוני של איגל (Minimum Essential Medium Eagle - MEM)Gibco11095-080מצע גידול בסיסי
ניקל סולפט (NiSO₄)4)Tokyo Chemical IndustryN1203תרכובת מתכת כבדה
חומר חלקיקי (PM)המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיהSRM 2975חומר ייחוס סטנדרטי לחלקיקים מרחפים
פניצילין-סטרפטומייצין (100×)Gibco15140122תוסף אנטיביוטיקה (ריכוז סופי של 1%)
סלוני פוספט מאוזן (PBS)Gibco18912014בופר שטיפה
פוליבren (Polybrene)סיגמאTR-1003-Gמשפר טרנסדוקציה לנטיוויראלית
פיורומיציןMedChemExpressHY-B1743Aאנטיביוטיקה לבחירת תאים יציבים
IL-13 אנושי רקומביננטיThermo Fisher ScientificA42526ציטוקין לעירור
IL-4 אנושי רקומביננטיThermo Fisher ScientificA42602ציטוקין לעידוד
לנטי-וירוס רפורטר לוסיפראז ל-STAT6BPS Bioscience78799סמי constructs של רהיטור לנטיבירי; טיטר של מלאי 5 × 107 TU/mL
Stattic (מעכב STAT3)MedChemExpressHY-13818מעכב STAT3 סלקטיבי

מקורות

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי אפיתל של דרכי הנשימהשסורב STAT6רפורטר לוסיפראזגירוי IL-4גירוי IL-13ניתוח Z-factorטרנסדוקציה לנטיוויראלית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.