הקמה של מערך בדיקת נחייה (Reporter Assay) עבור STAT6 לסריקת רעלנים סביבתיים המשפיעים על דלקת אלרגית של דרכי הנשימה

Aekkacha Moonwiriyakit; Phattarin Pothipan; Dhanpisit Toyingsirikul; Pawit Santiwong; Sirapop Lusawat

doi:10.3791/71694

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמה של מערך בדיקת נחייה (Reporter Assay) עבור STAT6 לסריקת רעלנים סביבתיים המשפיעים על דלקת אלרגית של דרכי הנשימה

139 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 באוגוסט 2026

Aekkacha Moonwiriyakit¹ , Phattarin Pothipan¹ , Dhanpisit Toyingsirikul¹ , Pawit Santiwong¹ , Sirapop Lusawat¹

¹Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את היצירה והתיקוף של מערך דיווח של לוסיפראז (luciferase reporter assay) יציב עבור STAT6 בתאי אפיתליום של דרכי הנשימה האנושיות. שיטה זו מאפשרת סריקה יעילה של רעלים סביבתיים ומרכיבי זיהום אוויר המודולטורים של פעילות STAT6 תחת תנאי in vitro מבוקרים.

תקציר

דלקת דרכי נשימה אלרגית הקשורה לזיהום אוויר היא בעיה גוברת בבריאות הציבור. אינטרלוקין-4 (IL-4) ואינטרלוקין-13 (IL-13), המפעילים את מסלול ה-Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6), מתווך מרכזי של דלקת דרכי נשימה אלרגית, עשויים לווסת את הרעילות הנשימתית של מזהמים. המחקר הנוכחי מתאר את היצירה והתיקוף של מערך בדיקת רפורטר לוציפראז יציב ל-STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיות, לצורך הערכת רעלים סביבתיים המווסתים את אותות ה-STAT6. תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מסוג 16HBE14o⁻ עברו טרנסדוקציה עם רפורטר לוציפראז המגיב ל-STAT6 באמצעות וקטור לנטיוירי, ולאחר מכן בוצעו אופטימיזציה לברירה באמצעות פורומיצין ולריבוי זיהומים (MOI), ובידוד מונוקלונלי על ידי דילול מוגבל. נבחר קלון יציב עם השראה חזקה ועקבית לאורך מעברים סדרתיים. התגובתיות של הרפורטר תוקפה באמצעות גרייה של IL-4/IL-13, והתלות ב-STAT6 אוששה באמצעות מעכבים סלקטיביים של STAT6, STAT5 ו-STAT3. ביצועי הבדיקה נמדדו באמצעות ניתוח Z′-factor, אשר הצביע על הפרדה עקבית של האות. יתרה מכך, הבדיקה יושמה על רכיבים בודדים של זיהום אוויר, ונמצא כי benzo[b]fluoranthene וחומר חלקיקי הגבירו באופן משמעותי את פעילות רפורטר ה-STAT6. שיטה זו מספקת גישה ניתנת להרחבה למדידת פעילות STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה ולתיעדוף של רעלים סביבתיים המווסתים אותות אלרגיים בדרכי הנשימה.

מבוא

זיהום אוויר מהווה את אחד האתגרים הדחופים ביותר לבריאות הציבור בעולם, עם השפעות בריאותיות והשלכות סוציו-כלכליות עמוקות. כיום הוא מדורג כגורם הסיכון השני המוביל לתמותה, ואחראי ל-8.1 מיליון מקרי מוות מדי שנה¹^,²^,³. בין המזהמים הנישאים באוויר, חלקיקים דקים בעלי קטרים של פחות מ-2.5 מיקרומטרים (PM2.5) מהווים את הסיכון הבריאותי הגבוה ביותר בשל יכולתם לחדור עמוק אל תוך דרכי הנשימה⁴^,⁵. חשיפה מוגברת ל-PM2.5 נקשרה באופן עקבי לירידה בתפקודי הריאה ולעלייה בשיעורי האשפזים עקב מחלות דרכי נשימה⁶. השכיחות של מחלות דלקתיות אלרגיות, כולל אסתמה, נזלת אלרגית ודרמטיטיס אטופית, נמצאה בעלייה ברחבי העולם והיא גבוהה באופן לא פרופורציונלי במגה-ערים מזוהמות מאוד⁴.

מחלות דרכי נשימה אלרגיות, כגון אסמה אטופית, מתווכות בעיקר על ידי תגובה דלקתית מסוג 2 המאופיינת ברמות גבוהות שלB של הציטוקינים interleukin‑4 (IL‑4) ו-interleukin‑13 (IL‑13) ובפעילות של מסלול האיתות Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)⁷. בתאי אפיתל של דרכי הנשימה, פוספורילציה של STAT6 המונעת על ידי IL-4 ו-IL-13 מעודדת הפרשת יתר של ריר ופגיעה במחסום האפיתליאלי, מה שמגדיר את STAT6 כמתווך מרכזי של פתולוגיה אלרגית בדרכי הנשימה וכמטרה טיפולית רלוונטית⁸^,⁹. ראיות ניסיוניות ממודלים של עכברים מצביעות על כך שחשיפה ל-PM2.5 ולדו-תחמוצת הגפרית מגבירה את איתות STAT6 ומחמירה את הדלקת האלרגית בדרכי הנשימה¹⁰^,¹¹. עם זאת, השאלה האם מרכיבי זיהום אוויר בודדים מושפעים באופן ישיר מהפעילות השעתוקית של STAT6 בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיות לא נבחנה באופן שיטתי.

זיהום אוויר מורכב מתערובת כימית מורכבת של מרכיבים, הכוללת חלקיקים (particulate matter), פחמימנים ארומטיים רב-טבעתיים (PAHs), מתכות כבדות ומלחים אנאורגניים, שהתרומות האינדיבידואליות שלהם להפעלת STAT6 בדרכי הנשימה נותרו לא מוגדרות היטב¹²^,¹³. מתודולוגיות נוכחיות למדידת פעילות STAT6 בתאי אפיתל של דרכי הנשימה, כגון בדיקות פוספורילציה של נקודת סיום (endpoint phosphorylation assays) או מערכות רפורטר מבוססות טרנספקציה זמנית, אינן מתאימות לסריקה כימית רחבת היקף. לכן, פלטפורמת רפורטר של STAT6 יציבה ומבוססת תאים בתאי אפיתל של דרכי נשימה אנושיים תספק כלי בר-הרחבה לזיהוי תרכובות ממקור זיהומי המשפיעות על אותות של אלרגיה בדרכי הנשימה. פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח והתיקוף של בדיקת רפורטר לוציפראז של STAT6 יציבה בתאי אפיתל של דרכי נשימה מסוג 16HBE14o⁻, המאפשרת הערכה כמותית של הפעלת STAT6 לצורך סריקה שיטתית של דגימות סביבתיות ורעלים כימיים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אישור אתי למשתתפים אנושיים אינו רלוונטי מכיוון שבמחקר זה נעשה שימוש בשורת תאי אפיתל ברונכיאלי אנושי מבוססת, 16HBE14o⁻.

1. יצירת 16HBE14o⁻תאים המבטאים באופן יציב רב-דיווח לפעילות STAT6

הערה: איור 1 מספק סקירה כללית של תהליך העבודה.

תרבית תאים
הערה: בצע את כל הפעולות בשימוש בטכניקה אספטית בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית Class II. ודא שהתאים נקיים מזיהום במיקופלסמה לפני השימוש.
1. שמר את תאי 16HBE14o⁻ במצע מינימלי חיוני (minimum essential medium) מועשר ב-10% סרום עגל עובר (fetal bovine serum) ו-1% פניסלין–סטריפטומייצין. דגרי את התאים ב-37 °C באטמוספירה לחית המכילה 5% CO₂, והחלף את מצע התרבית מדי יומיים.
2. המתן עד שהתאים יגיעו לכ-80% קונפלואנסיות (confluence). שאב את מצע התרבית ושטוף את שכבת התאים החד-שכבתיות (monolayer) פעם אחת במי מלח בבופר פוספט (phosphate-buffered saline).
3. הוסף מספיק מי מלח בבופר פוספט כדי לכסות את שכבת התאים ודגרי את התאים למשך 20 דקות ב-37 °C. שאב את מי המלח בבופר הפוספט לחלוטין.
  הערה: השתמש בדגירה של 20 דקות במי מלח בבופר פוספט כדי להקל על פירוק הצמתים הבין-תאיים ההדוקים (tight intercellular junctions) שנוצרים בקו תאים זה. משך זמן זה מייצג התאמה שעברה אופטימיזציה פנימית במעבדה.
4. הוסף תמיסת טריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ (trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid) בריכוז 0.25% בכמות מספיקה לכיסוי שכבת התאים. דגרי את התאים למשך 10 דקות ב-37 °C.
  הערה: עקוב אחר ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. טפוף בעדינות על כלי התרבית בעת הצורך כדי להקל על הניתוק.
5. הוסף נפח של כחמישה פעמים נפח תמיסת הטריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ של מצע תרבית מלא כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית. העבר את התמיה בעזרת פיפט בעדינות כדי לקבל תמיה של תאים בודדים.
6. העבר את תמיחת התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL. צנטריפוג את התמיחה ב-300 × g למשך 5 דקות ב-25 °C.
7. שאב את העליון (supernatant) בזהירות והשהה מחדש את משקע התאים במצע תרבית טרי. ערבב בעדינות את התמיחה ואשר את קיומה של תמיחה של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ אור הפוך.
8. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) והתאם את ריכוז התאים לצפיפות הנדרשת לניסוי הבא. השתמש ביחס פיצול שגרתי של 1:8.
  הערה: עיין בSupplementary Table 1 ובSupplementary Table 2 עבור שטחי הגדילה של כלי התרבית והנפחים התואמים של מי מלח בבופר פוספט ותמיסת טריפסין–אתילנדיאמיןטטרהחומץ.
קביעת ציטוטוקסיות מושרית פוროמיצין (puromycin)
הערה: בחר את האנטיביוטיקה בהתאם לגן העמידות המקודד על ידי המבנה הלנטי-ויראלי.
1. זריע את תאי 16HBE14o⁻ בצפיפות של 2 × 10⁴ תאים לבאר בפלטה לתרבית של 96 בארות המכילה 100 µL של מצע תרבית מלא לבאר. דגרי את התאים למשך לילה.
2. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל פוროמיצין בריכוזים סופיים של 0.5, 1, 2, או 4 µg/mL. הכן פלטות נפרדות לנקודות הזמן של 24, 48 ו-72 שעות.
3. הוסף 5 µL של ריאגנט לספירת תאים לכל באר. דגרי את הפלטה למשך שעה אחת ב-37 °C.
  הערה: הימנע מהחדרת בועות אוויר לבארות, שכן הן עלולות להפריע למדידות הבליעה (absorbance).
4. מדוד את הבליעה באורך גל של 450 nm תוך שימוש ב-650 nm כאורך גל ייחוס. נער את הפלטה למשך 15 שניות מיד לפני רישום הבליעה במצב endpoint.
5. חשב את חיוניות התאים¹⁴ באמצעות משוואה 1.
  
  כאשר:
  
  הערה: הגדר את הביקורת (control) כתאים לא מטופלים ואת הבלאנק (blank) כמצע ללא תאים המכיל את ריאגנט הבדיקה. בחר את ריכוז הפוროמיצין הנמוך ביותר שמחסל לחלוטין את התאים שלא עברו טרנסדוקציה בתוך 48–72 שעות.
קביעת ריבוי הזיהום (MOI) האופטימלי
זהירות: טפל בחלקיקים לנטי-ויראליים תחת תנאי רמה 2 של בטיחות ביולוגית (Biosafety Level 2) במתקן רשום לרמה 2 ובהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. בצע את כל המניפולציות הוויראליות בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית Class II. כסה חומרים מתכלים ושפיכות מזוהמים בנגיף ב-10% אקונומיקה למשך שעה אחת לפחות לפני השלכתם כפסולת ביו-סיכונה.
הערה: בצע אופטימיזציה לריבוי הזיהום (MOI) מכיוון שהוא משפיע ישירות על יעילות הטרנסדוקציה.
1. חשב את הנפח הנדרש של מאגר הלנטי-ויראלי¹⁵ באמצעות משוואה 2.
  
  כאשר:
  
  הערה: הטיטר הפונקציונלי של מאגר הלנטי-ויראלי של STAT6 luciferase reporter ששימש בפרוטוקול זה היה 5 × 10⁷ יחידות טרנסדוקציה/mL. עבור 2 × 10⁴ תאי מטרה, MOI של 20 תואם ל-8 µL של מאגר לנטי-ויראלי לבאר. יש לחשב מחדש את נפח הנגיף עבור הכנות נגיף עם טיטרים שונים.
2. זריע את תאי 16HBE14o⁻ בצפיפות של 2 × 10⁴ תאים לבאר בפלטה לבנה עם תחתית שקופה של 96 בארות המכילה 100 µL של מצע תרבית מלא לבאר. דגרי את התאים למשך לילה עד שיגיעו לכ-80% קונפלואנסיות.
3. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל 5 µg/mL פוליברן (polybrene) ולנטי-ויראלי STAT6 luciferase reporter ב-MOIs של 1, 5, 10 ו-20. כלול באר ביקורת (mock-control) ללא טרנסדוקציה שאינה מכילה לנטי-ויראלי.
  הערה: חשב את הנפח הלנטי-ויראלי הנדרש לכל MOI מהטיטר הפונקציונלי של המאגר.
4. דגרי את התאים עם החלקיקים הלנטי-ויראליים למשך 48 שעות. החלף את מצע הטרנסדוקציה במצע תרבית טרי ודגרי את התאים למשך 24 שעות נוספות.
5. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל אינטרלוקין-4 ואינטרלוקין-13 בריכוז של 10 ng/mL לכל אחד. דגרי את התאים למשך 24 שעות.
6. הוסף 25 µL של ריאגנט לבדיקת לוציפראז לכל באר¹⁶. הגן על הפלטה מפני אור ודגרי אותה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
7. נער את הפלטה באופן ליניארי למשך 20 שניות. מדוד לומניסנציה (luminescence) במצב endpoint באמצעות קריאה של הפלטה מלאה והגדרת gain של 120.
  זהירות: רשום את הלומניסנציה בתוך שעה לאחר הוספת ריאגנט בדיקת הלוציפראז כדי ללכוד את האות המקסימלי. פעל לפי הוראות הבטיחות והטיפול של יצרן הריאגנט.
  הערה: השתמש באותו קורא מיקרופלטה רב-מצבים ובאותן הגדרות רכישה עבור כל מדידות הבליעה והלומניסנציה.
סלקציה של תאים שעברו טרנסדוקציה
1. זריע את תאי 16HBE14o⁻ בצפיפות של 2 × 10⁵ תאים/mL בפלטה לתרבית של 24 בארות. דגרי את התאים למשך לילה.
2. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל לנטי-ויראלי STAT6 luciferase reporter ב-MOI של 20 ו-5 µg/mL פוליברן. דגרי את התאים למשך 48 שעות.
3. החלף את מצע הטרנסדוקציה במצע תרבית טרי. דגרי את התאים למשך 24 שעות נוספות.
4. שאב את מצע התרבית והוסף מצע טרי המכיל 1 µg/mL פורומיצין. דגרי את התאים למשך 5 ימים, והחלף את מצע הסלקציה מדי יומיים.
5. המשך בסלקציית פורומיצין עד שכל התאים בבאר ביקורת ה-mock-control ללא הטרנסדוקציה יחוסלו.
  הערה: המתן לפחות 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה לפני יישום סלקציית האנטיביוטיקה כדי לאפשר ביטוי של גן העמידות.
בידוד של קלוני תאים בודדים על ידי דילול מגביל (limiting dilution)
1. נתק וספור את תאי STAT6 reporter שנבחרו על ידי פורומיצין. הכן תמיחה של תאים בודדים בריכוז 5 תאים/mL על ידי דילול סדרתי.
  הערה: מנע התגבשות של תאים במהלך הדילול. העבר את התמיחה דרך מסנן תאים בעת הצורך.
2. חלק 200 µL מהתמיחה של התאים לכל באר בפלטה לתרבית של 96 בארות כדי לקבל צפיפות ממוצעת של תא אחד לבאר בקירוב.
3. בחן כל באר באמצעות מיקרוסקופ הפוך בתוך 24 שעות וזהה בארות המכילות תא בודד. שלול בארות המכילות יותר מתא אחד או מספר מוקדי תאים מופרדים מרחבית.
4. עקוב אחר הבארות הנבחרות במהלך השבוע הראשון כדי לאשר גדילה קלונלית. החלף את מצע התרבית מדי 3 ימים.
5. הרחב כל קלון בפלטת 96 הבארות המקורית למשך כ-20 ימים או עד שהתאים יגיעו לקונפלואנסיות. העבר כל קלון באופן רצפי לפלטה של 6 בארות ולאחר מכן לבקבוק תרבית T-25.
  הערה: דגרי את התאים בפלטה של 6 בארות למשך כ-6 ימים לפני העברתם לבקבוק T-25, או העבר אותם כאשר הם מגיעים לקונפלואנסיות המתאימה.
  נקודת עצירה (PAUSE POINT): המשך להרחיב את הקלונים או שמור אותם בהקפאה (cryopreserve) בריכוז של 1 × 10⁶ תאים למבחנה ב-1 mL של מצע שימור בהקפאה המכיל 90% סרום עגל עובר ו-10% דימეთיל סולפוקסיד.
6. זריע כל קלון מורחב בצפיפות של 2 × 10⁵ תאים/mL בפלטה לבנה עם תחתית שקופה של 96 בארות. דגרי את התאים למשך לילה.
7. החלף את מצע התרבית במצע טרי המכיל IL-4 ו-IL-13 בריכוז של 10 ng/mL לכל אחד. דגרי את התאים למשך 24 שעות.
8. מדוד את פעילות הלוציפראז כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7. השווה את פעילות הרפורטר המושרה בין הקלונים הבודדים.
9. חזור על בדיקת הלוציפראז לאורך מספרים גדלים של מעברים תאיים (cell-passage). בחר קלונים השומרים על פעילות רפורטר עקבית המושרית על ידי ציטוקינים לאורך המעברים.
  הערה: קלון 3 נבחר בשל לומניסנציה בסיסית נמוכה ויכולתו לשמור על אות הפעלה עקבי המושרה על ידי ציטוקינים לאורך מעברים סדריים.

2. הקמה ותיקוף של בדיקת דיווח לפעילות STAT6

הערה: איור 2 מספק סקירה כללית של זרימת העבודה.

תיקוף של בדיקת הדיווח (reporter assay) לפעילות STAT6
1. זריעה של תאי הדיווח ל-STAT6 בריכוז של 2 × 10⁵ תאים/mL לתוך פלטת 96 בארות לבנה עם תחתית שקופה, תוך שימוש ב-100 µL של מצע גידול מלא לכל באר. דגירה של התאים למשך לילה.
2. החלפת מצע הגידול במצע טרי המכיל IL-4 ו-IL-13 בריכוזים סופיים של 10 ng/mL עבור כל אחד. הוספה סימולטנית של המעכבים הסלקטיביים באופן הבא: 100 nM AS1517499 (מעכב STAT6), 2.5 µM AC-4-130 (מעכב STAT5), או 2.5 µM Stattic (מעכב STAT3).
3. הכללת בקרת נשא (vehicle control) המכילה 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO). דגירה של התאים למשך 24 h.
4. קביעת חיוניות התאים באמצעות בדיקת ספירת תאים כפי שמתואר בשלבים 1.2.3–1.2.5.
5. מדידת פעילות לוציפראז (luciferase) כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7.
6. נורמליזציה של אות הלומינסנס של כל באר ביחס לחיוניות התאים המתאימה לה. ביטוי הערכים המנורמלים ביחס לקבוצת הביקורת שטופלה בציטוקינים.
  הערה: חיוניות תאים מופחתת עלולה להוריד את אות הלוציפראז באופן בלתי תלוי בפעילות STAT6. יש לפרש את פעילות הדיווח רק לאחר אישור חיוניות תאים מקובלת.
הערכת חוסן הבדיקה
1. הערכת חוסן הבדיקה על ידי חישוב ה-Z′-factor באמצעות 21 בארות חזרתיות עבור קבוצות הביקורת החיובית והשלילית.
2. חישוב ה-Z′-factor באמצעות משוואה 3.
  
  כאשר:
  
  הערה: Z′-factor שבין 0.5 ל-1.0 מעיד על כך שהבדיקה מתאימה לסריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening).

3. יישום של בדיקת הדיווח (reporter assay) של STAT6 לסריקת רעלים סביבתיים

זהירות: יש להתייחס לפוליציקליים ארומטיים ולמלחים של מתכות כבדות כחומרים רעילים ופוטנציאליים למסרטנים. השתמשו בציוד מגן אישי מתאים, בצעו את כל הפעולות במנדף כימי מאושר, והשליכו חומרים מזוהמים בהתאם לנהלי פסולת מסוכנת של המוסד.

סריקת רעלים סביבתיים
1. זריעה של תאי הדווח (reporter cells) של STAT6 בריכוז של 2 × 10⁵ תאים/mL לתוך פלטה לבנה בעלת תחתית שקופה של 96 בארות, תוך שימוש ב-100 µL של מצע גידול מלא לכל בארה. דגירה של התאים למשך הלילה.
2. החלפת מצע הגידול במצע טרי המכיל כל תרכובת לבדיקה בריכוז הסופי הרצוי, אשר בפרוטוקול זה הוא 10 µM, וטיפול בתאים בהיעדרה של IL-4 ו-IL-13.
3. הכללת קבוצת ביקורת שלילית המכילה 0.1% dimethyl sulfoxide וקבוצת ביקורת חיובית המכילה IL-4 ו-IL-13 בריכוז של 10 ng/mL כל אחד. דגירה של התאים למשך 24 h.
4. קביעת חיות התאים באמצעות בדיקת ספירת תאים כפי שמתואר בשלבים 1.2.3–1.2.5.
5. מדידת פעילות לוציפראז כפי שמתואר בשלבים 1.3.6–1.3.7.
6. נורמליזציה של אות הלומניסנציה מכל בארה ביחס לערך חיות התאים המתאים. ביטוי התוצאה המנורמלית ביחס לקבוצת הביקורת השלילית.
7. הדרה של תרכובות המורידות את חיות התאים מתחת ל-80% מתוך פרשנות פעילות הדווח של STAT6.
  הערה: יש להתייחס לאותות דווח שהתקבלו בתנאים ציטוטוקסיים כלא מהימנים, שכן ירידה בחיות התאים עלולה לשנות את הלומניסנציה באופן בלתי תלוי בפעילות מסלול ה-STAT6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לקבוע את ריכוז הפוּרוֹמִיצין האופטימלי לברירה יציבה, תאי 16HBE14o⁻ הוריים טופלו בריכוזים עולים של פוּרוֹמִיצין (0.5–4 µg/mL), וחיוניות התאים נבדקה לאחר 24, 48 ו-72 שעות באמצעות מבחן חיוניות תאים. פוּרוֹמִיצין הפחית את חיוניות התאים באופן תלוי מינון וזמן, כאשר כל הריכוזים הפחיתו את החיוניות לרמה של פחות מ-20% לאחר 48–72 שעות (איור 3). ריכוז של 1 µg/mL היה הריכוז הנמוך ביותר שחיסל לחלוטין תאים שאינם טרנסדוקטריים, והפחית את אות החיוניות השאריתי לכ-4.5% תוך 48 שעות (p <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מסלול השגורה IL-4/IL-13–JAK–STAT6 אינו רק יעד טיפולי חשוב, אלא גם גורם מפתח בפתוגנזה של מחלות אלרגיות, כולל אסמה ונזלת אלרגית²². פרוטוקול זה מתאר מערך רפורטר (reporter assay) פשוט ויציב המבוסס על שורת תאים, לזיהוי מודולטורים של פעילות STAT6. ניתן להשתמש במערך זה להערכת ההשפעות המודולטוריות של STAT6 עבור מגוון רחב של תרכובות סביבתיות, והוא ניתן להתאמה קלה לסריקות בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput screening), כפי שמוצג במחקר סריקה להוכחת היתכנות (איור 8). באמצעות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר של תאילנד (NRCT) (מענק מס' N42A680388), ופרויקט מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מהידול (קרן מחקר אסטרטגית: 2025) (מענק מס' 35). איורים 1 ו-2 נוצרו באמצעות BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	ריאגנט לפירוק תאים
מבחנה קונית לצנטריפוגה בנפח 15 מ"ל	Corning	CLS430791	מבחנה צנטריפוגית סטרילית מפוליפרופילן
16HBE14o- שורת תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים	מתנה מד"ר Nawiya Huipao (אוניברסיטת Prince of Songkla, תאילנד) ופרופ' ד"ר Dieter C. Gruenert (אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו, ארה"ב)	RRID:CVCL_0112	שבט תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים (מעברים 35–40); אושרו כנקיים ממיקופלסמה והם שומרים על מורפולוגיה של אפיתל דרכי נשימה מובחן ועל תכונות מחסום. מקור: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
פלטה שקופה בעלת תחתית שטוחה, מטופלת לתרבית רקמה, עם 24 בארות	Corning	3527	צלחת לתרבית תאים
פלטה שקופה בעלת תחתית שטוחה, מטופלת לתרביות רקמה, בעלת 6 בארות	Corning	3516	פלטת תרבית תאים
מיקרופלטה מפסטירון בעלת 96 בארות, שקופה, בעלת תחתית שטוחה ומטופלת לתרביות רקמה	Corning	3599	לוחית לבדיקת חיוניות תאים
מיקרופלטה לבנה בעלת תחתית שקופה, 96 בארות, פוליסטירן, מטופלת לתרבית רקמות	Corning	3610	פלטה לבדיקת לומניסנציה
AC-4-130 (מעכב STAT5)	MedChemExpress	HY-124500	מעכב STAT5 סלקטיבי
AS1517499 (מעכב STAT6)	MedChemExpress	HY-100614	מעכב STAT6 סלקטיבי
בנזו[b]פלואורנתן	AccuStandard	H-128N	פחמימן ארומטי פוליציקלי
מCבט בטיחות ביולוגי, Class II	Nuaire	NU-543-400E	לנהלי תרביות תאים בשיטות סטריליות (aseptic)
קדמיום כלוריד (CdCl₂)	סיגמא	202908	תרכובת מתכת כבדה
ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8)	MedChemExpress	HY-K0301	בדיקת חיוניות תאים
בקראק לתרבית תאים, 25 ס"מ² (T-25)	Corning	430639	בקבוק לתרבית רקמות
פחמן חד-חמצני₂ אינקובטור	Nuaire	NU-5710E	נשמר ב- 37 °C, 5% CO2₂, atmosfera מלחחית
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא	D2650	ממס (ריכוז סופי של 0.1%) וחומר קריו-פרוטקטורי (10%)
סרום עגל עוברי (FBS)	Sigma	F7524	תוסף מצע (10%) ומצע הקפאה (10%)
המוציטומטר	BOECO	BOE14	ספירת תאים ידנית
מיקרוסקופ אור עם ניגודיות פאזה הפוך	ZEISS	Primovert	תצפית על מורפולוגיית תאים
מערכת בדיקת לוסיפראז (שלב אחד)	BPS Bioscience	60690	בדיקת דהיינר לוציפראז (Luciferase reporter assay)
מרקורי כלוריד (HgCl₂)	סיגמא	215465	תרכובת מתכת כבדה
קורא מיקרו-פלטות	BioTek	Synergy Neo2	קורא לוחות מיקרו-פלטה רב-מצבי/לומינומטר הנשלט על ידי תוכנת Gen5 (גרסה 3.08.01). בליעתיות נמדדה באורך גל של 450 ננומטר עם רפרנס של 650 ננומטר לאחר 15–ניעור ליניארי למשך 20 שניות. מדידת לומנס (Luminescence) במצב נקודת סיום (endpoint mode) עם הגברת גלאה (detector gain) של 120 לאחר ניעור ליניארי למשך 20 שניות.
מצע מינימלי חיוני של איגל (Minimum Essential Medium Eagle - MEM)	Gibco	11095-080	מצע גידול בסיסי
ניקל סולפט (NiSO₄)₄)	Tokyo Chemical Industry	N1203	תרכובת מתכת כבדה
חומר חלקיקי (PM)	המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה	SRM 2975	חומר ייחוס סטנדרטי לחלקיקים מרחפים
פניצילין-סטרפטומייצין (100×)	Gibco	15140122	תוסף אנטיביוטיקה (ריכוז סופי של 1%)
סלוני פוספט מאוזן (PBS)	Gibco	18912014	בופר שטיפה
פוליבren (Polybrene)	סיגמא	TR-1003-G	משפר טרנסדוקציה לנטיוויראלית
פיורומיצין	MedChemExpress	HY-B1743A	אנטיביוטיקה לבחירת תאים יציבים
IL-13 אנושי רקומביננטי	Thermo Fisher Scientific	A42526	ציטוקין לעירור
IL-4 אנושי רקומביננטי	Thermo Fisher Scientific	A42602	ציטוקין לעידוד
לנטי-וירוס רפורטר לוסיפראז ל-STAT6	BPS Bioscience	78799	סמי constructs של רהיטור לנטיבירי; טיטר של מלאי 5 × 10⁷ TU/mL
Stattic (מעכב STAT3)	MedChemExpress	HY-13818	מעכב STAT3 סלקטיבי

מקורות

Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי אפיתל של דרכי הנשימה שסורב STAT6 רפורטר לוסיפראז גירוי IL-4 גירוי IL-13 ניתוח Z-factor טרנסדוקציה לנטיוויראלית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

עדכנו אותי: