הכנת וזיקולות גדולות וענקיות חד-למלריות, פולימר פונקציונלי עם חלבון ממברנלי, ופולימר/שומן

סיכום

פרוטוקול זה מדגים שיקום בתיווך דטרגנט של חלבון ממברנה, ציטוכרום bo3 אוביקווינול אוקסידאז, לוזיקולות חד-למלריות גדולות העשויות מ-PDMS-g-PEO והמרה שלהן לוזיקולות ענקיות באמצעות היתוך ואלקטרופורמציה (היתוך-אלקטרופורמציה). התאים הפונקציונליים מבוססי פולימר המתקבלים מתאימים למחקרים ביוכימיים וביופיזיקליים מתקדמים.

תקציר

וזיקולות המורכבות מקופולימרים אמפיפיליים, לבדם או מעורבבים עם פוספוליפידים, מציעות יציבות מכנית וכימית גבוהה יותר בהשוואה לוזיקולות שומנים קונבנציונליות. זה הופך אותם לשלדה אטרקטיבית, שניתן לפתח ולהרחיב אותה עוד כדי לאפשר יישומים ספציפיים, כגון אספקת תרופות, חישה ביולוגית אבחנתית, בניית תאים מלאכותיים ומיקרו-כורים בהשראה ביולוגית. במיוחד, פונקציונליזציה באמצעות שילוב חלבוני ממברנה היא חיונית לרבים מהיישומים הללו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת וזיקולות חד-למלריות גדולות (LUVs) עם תפקוד חלבון ממברנה מקופולימר השתל PDMS-g-PEO באמצעות שיקום מתווך דטרגנטי. יתרה מזאת, אנו מתארים כיצד ניתן להמיר וזיקולות גדולות אלו ל-VUVs ענקיות (GUVs) באמצעות גישת היתוך-אלקטרופורמציה (fusion-electroformation). הפרוטוקול כולל תיוג פלואורסצנציה של חלבוני ממברנה, הכנת LUVs פולימריים והיברידיים, שיקום חלבוני ממברנה, ניתוח התפלגות גודל באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), הערכת פעילות חלבונים באמצעות מדידות צריכת חמצן, הכנת GUVs פונקציונליים חלבונים, וניתוח החדרת חלבונים ופעילות משאבת פרוטונים ב-GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תוצאות מייצגות מראות היווצרות פרוטאו-LUVs מונודיספיז עם מדד פולידיספיסריות (PDI) מתחת ל-0.2, ויצירת מוצלחת של פרוטאו-GUVs בקוטר של 5–35 מיקרון. פעילות החלבון מאושרת על ידי מדידות צריכת חמצן הן ב-LUVs פולימריים (18.2 nmol/min/mL) והן ב-LUVs היברידיים (26.9 nmol/min/mL). הכנסת חלבונים ל-GUVs נמדדת באמצעות עוצמת פלואורסצנציה, ומניבה 20.6 ± 3.7 a.u. עבור GUVs פולימריים ו-26.2 ±-5.0 a.u. עבור GUVs היברידיים. פעילות שאיבת פרוטונים ב-GUVs, המפוקחת באמצעות צבע רגיש ל-pH בכיסוי, תואמת את תפקוד החלבונים, כאשר שאיבת פרוטונים פנימה היא הדומיננטית. הרכות המכאנית של הקופולימר ועובי השכבה הדו-ליפידית שלו (~5.3 ננומטר) תומכים בהכנסת חלבונים יעילה ובשימור תפקוד.

מבוא

קופולימרים של בלוק אמפיפיליים יכולים להתאסף בעצמם בתמיסה מימית לממברנות, אשר מתעקלות ונסגרות על עצמן באופן ספונטני ליצירת תאים כדוריים מוקפים בממברנה הנקראים פולימרזומים (וזיקולות פולימרים). בהשוואה לממברנות שומן, תאים מבוססי פולימר מציעים גמישות כימית מוגברת ויציבות כימית¹ ויציבות מכנית^{משופרת 2}, מה שהופך אותם לאטרקטיביים במיוחד ליישומים כמו העברת תרופות, ננו-כורים ומיקרו-ריאקטורים, ובניית תאים מלאכותיים עמידים. גם הקבוצה שלנו וגם אחרות הפכו ממברנות פולימריות לפונקציונליות על ידי הכנסת חלבוני ממברנה ליצירת אברונים ותאים מלאכותיים 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . פולימרים המכילים גרעין הידרופובי פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) מתאימים במיוחד לשילוב חלבון ממברנה בזכות גמישות השרשרת הגבוהה והאפשרות לכוון את עובי ההידרופובית של הממברנה כך שיתאים טוב יותר לתחום הטרנסממברנלי של החלבון⁵. בעוד שהמעבדה שלנו התמקדה בעיקר בקופולימר פולי (דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי (תחמוצת אתילן) (PDMS-g-PEO), היוצר ממברנות דינמיות ^{מאוד 4,16,17} הרכות יותר משכבות שומן קונבנציונליות ומציגות עובי של כ-5.3 ננומטר¹, קבוצות אחרות השתמשו בהצלחה בקופולימרים טריבלוקיים מבוססי PDMS כגון PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^5,6,7,8,9,10,11 ו-PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² לשיקום חלבון ממברנה. אפילו קופולימרים דיבלוקיים קשיחים יחסית כמו PBD-b-PEO, במיוחד במערכות היברידיות המעורבבות עם ליפידים, שימשו לשילוב חלבון מוצלח¹³. דוגמאות אלו מדגישות את הרב-שימושיות של ממברנות מבוססות פולימר כפלטפורמות שיקום, שיכולות גם לספק יציבות כימית משופרת^{והארכת חיים תפקודית} לחלבוני ממברנה משולבים. למרות שממברנות היברידיות של פולימר/ליפידים עשויות שלא תמיד להתאים ליציבות הכימית של מערכות פולימר טהורות¹, הן מציעות פשרה אטרקטיבית בשילוב עמידות מכנית של פולימרים עם הרלוונטיות הביולוגית של הליפידים. כתוצאה מכך, נוצרת סביבה ממברנית שמדמה יותר ממברנות ביולוגיות טבעיות תוך שמירה על יתרונות מרכזיים של חומרים סינתטיים. ארכיטקטורות היברידיות כאלה יכולות להציע יתרונות נוספים, כולל הפחתת חדירות פרוטונים הנובעת מסידור ננומטרי¹ והיווצרות דומיין בתוך הממברנה¹⁵.

קיימות מספר טכניקות לשיקום חלבוני ממברנה לוסיקולות ננו-גדלות (LUVs), כולל שיקום מתווך ממיס אורגני (למשל, אידוי הפוך, הידרציה מחדש של שכבות חלבוני שמן), גישות מכניות (למשל, סוניקציה, פרנץ' פרס, הקפאה-הפשרה), ושיקום מתווך על ידי חומר ניקוי (באמצעות הסרת חומרי ניקוי, דילול או שילוב ישיר)¹⁸, ואסטרטגיות עדכניות יותר כמו העברה ישירה מננודיסקים קופולימריים של חומצת סטירן-מאלית¹⁹. בעוד שפורינים שולבו בהצלחה ב-LUVs פולימריים באמצעות החדרה ישירה, לדוגמה, על ידי הוספת החלבון לשכבת הפולימר במהלך הידרציה⁸. גישה זו בדרך כלל גורמת ליעילות החדרה נמוכה לחלבוני ממברנה גדולים או מורכבים יותר, ולעיתים מובילה לאוריינטציה אקראית של חלבונים. כתוצאה מכך, שיטה מחדש בתיווך חומרי ניקוי, הכוללת תוספת מבוקרת של חומר ניקוי ואחריה הסרה, נותרה השיטה הנפוצה ביותר. זו גם האסטרטגיה המועדפת לשילוב חלבוני ממברנה גדולים יותר בתוך LUVs מבוססי פולימר, במיוחד עבור חלבונים אסימטריים שבהם כיוון מבוקר הוא קריטי לתפקוד. בגישה זו, ממברנות הוזיקולות רוויות תחילה בחומר הניקוי המועדף (ריכוז הדטרגנט הרווי מסומן כ-R_sat), ממוססות חלקית (קיום משותף של וזיקולות ומיצלות), או ממוססות לחלוטין, כלומר מפורקות למיצלות (ריכוז הדטרגנט מסומן כ-R_sol). טיפול ראשוני בממברנה זה מלווה בהוספת חלבונים, דגירה^והסרת חומר ניקוי. האחרונה יכולה להתבצע באמצעות דיאליזה, כרומטוגרפיה של החרגת גודל, או ספיחה על חרוזי פוליסטירן הידרופוביים (למשל, חרוזי ביו). בחירת חומר הכביסה, ריכוזו ושיטת ההסרה מותאמים לכל סוג ממברנה וחלבון כדי למקסם את יעילות השילוב ולשלוט בכיוון החלבון²⁰.

בעוד ש-LUVs מתאימים מאוד למדידות פעילות נפוצה, מחקרי שלף יחיד וניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה אופטית דורשים שיחזור חלבוני ממברנה לשליפיות חד-למלריות ענקיות (GUVs). חמש גישות עיקריות משמשות לשילוב חלבונים ב-GUVs: קו-פורמציה בנוכחות חלבון וממס אורגני²¹, קו-פורמציה בנוכחות דטרגנט²², החדרה ל-GUVs מוכנים מראש באמצעות דילול דטרגנט²³, החדרה באמצעות מיזוג ממברנה עם פרוטאו-LUVs^16,24, והיתוך-אלקטרופורמציה²⁵. למרות שגישות אלו יושמו בהצלחה על GUVs עם שמן, העברתן ל-GUVs היברידיים מפולימר או פולימר/ליפידים היא לעיתים קרובות מאתגרת. במיוחד, שיטות קו-פורמציה ודילול חומר ניקוי לעיתים קרובות גורמות ליעילות החדרה נמוכה בממברנות פולימריות או שאינן תואמות עם תרכובות פולימרים מסוימות¹⁵. אסטרטגיות מבוססות היתוך 4,16,24,26,27 התלויות בסוכנים פוזוגניים נוספים עשויות גם הן להיות בעייתיות, שכן ליפידים/פולימרים קטיוניים סינתטיים או פפטידים פוזוגניים עלולים לפגוע ביציבות חלבוני הממברנה, לשנות את תכונות הממברנה או להפחית את יעילות השילוב של החלבון המטרה. פיוז'ן-אלקטרופורמציה מתגברת על רבות מהמגבלות הללו והוכחה כשיטה חזקה ויעילה לשילוב חלבוני ממברנה ב-GUVs היברידיים של פולימר ופולימר/ליפידים ^1,5,15. גישה זו מאפשרת שילוב מבוקר של חלבונים תוך שמירה על שלמות הממברנה ותפקוד החלבון, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד ליצירת GUVs פולימריים פונקציונליים על ידי חלבון.

שיקום משאבות פרוטון לוזיקולות מבוססות פולימר הוא חיוני לבניית תאים מלאכותיים עמידים, שכן הוא מאפשר יצירת גרדיאנטים פרוטונים טרנסממברנליים — המטבע האנרגטי הבסיסי של מערכות חיים. על ידי שחזור המרת אנרגיה כימאוסמוטית בסביבת ממברנה מינימלית מבוקרת²⁸, וזיקולות אלו יכולות להניע סינתזת ATP, הובלה פעילה ותגובות מטבוליות, וליצור את הבסיס האנרגטי הנדרש לפונקציונליות אוטונומית ודמוית חיים. משאבת פרוטון מייצגת המשמשת במערכות כאלה היא ציטוכרום bo₃ אוקסידאז מ-E. coli, אנזים נשימתי סופי שמקשר הפחתת חמצן להעברת פרוטונים דרך הממברנה. מכיוון שהעברת אלקטרונים ושאיבת פרוטונים קשורות זו לזו באופן הדוק, ניתן למעקב כמותי אחר פעילותן בוסיקולות סינתטיות באמצעות צריכת חמצן ^1,20 או על ידי מעקב אחר יצירת גרדיאנט^{פרוטונים 1}.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים תהליך מפורט להכנת LUVs מבוססי PDMS-g-PEO, כולל ממברנות היברידיות של פולימר טהור ופולימר/ליפידים, פונקציונליזציה שלהן עם חלבוני ממברנה, הגדלה ל-GUVs, ומדידות פעילות של ציטוכרום bo₃ אוקסידאז במשאבת פרוטונים מחודשת באמצעות בדיקות צריכת חמצן בכמות גדולה ומדידות שאיבת פרוטון חד-וזיקולית.

פרוטוקול

הערה: כל פסולת כימית מסוכנת שנוצרת במהלך פרוטוקול זה חייבת להיפטר בהתאם לתקנות מוסדיות ומקומיות.

1. הכנה ל-Bio-Beads SM-2

הערה: Bio-Beads SM-2 נשטפים מראש עם מתנול להסרת חומרים משמרים ומזהמים אורגניים לפני ספיגת חומרי הניקוי.

1. הנח נייר סינון במשפך זכוכית הממוקם מעל בקבוק זכוכית נקי או בקבוק.
2. הוסף לפחות 600 מ"ג Bio-Beads SM-2 למשפך (מספיק ל-3 חזרות של בנייה מחדש גם עבור LUVs היברידיים וגם פולימריים).
   הערה: נדרש מינימום של 90 מ"ג Bio-Beads SM-2 בכל תהליך בנייה מחדש, כפי שמפורט בשלב 4.4.1. ניתן להכין סכום גדול יותר אם מתוכננים שיפוצים נוספים.
3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מתנול טהור, תוך שימוש בנפח מספיק כדי לטבול אותם במלואם בכל פעם.
   אזהרה: בצע את כל שלבי הטיפול במתנול בתוך מכסה אדים כימיקלים.
4. שטפו מיד את החרוזים שלוש פעמים במי מילי-קיו כדי להסיר את שאריות המתנול.
   הערה: אל תתנו לחרוזים להתייבש במהלך תהליך הכביסה. בעת הסרת תמיסות הכביסה, ודאו שהחרוזים נשארים לחים ולא מאפשרים להם להתייבש לחלוטין.
5. העבר את החרוזים השטופים למיכל אחסון מתאים (למשל, צינור צנטריפוגה פוליפרופילן סטרילי בנפח 50 מ"ל או בקבוק זכוכית עם מכסה אטום היטב), הוסף מי מילי-Q עד שהחרוזים טבולים לחלוטין, ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.

2. תיוג פלואורסצנטי של חלבוני ממברנה

1. דילול חלבון
   1. המיס ציטוכרום _{bo 3} אוקסידאז ל-2.2 mg/mL בבופר HEPES של 20 מ"מ המכיל 0.05% n-דודציל β-D-מלטוזיד (DDM) (עם v), pH 8.3. pH זה מבטיח חלק מספק של אמינים ראשוניים לא פרוטוניים (ריאקטיביים) לסימון יעיל.
      הערה: לסימון מיטבי עם צבעי ATTO N-הידרוקסיסוקינימידיל (NHS), שמרו על pH בופר בין 8.3 ל-8.5. לצבעים אחרים, עקבו אחרי הוראות היצרן לגבי קונוגציית חלבונים, כולל תנאי הסימון המומלצים.
2. הוספת צבע
   1. הוסיפו עודף מולר של אסטר תגובתי לאמין ATTO 643 N-הידרוקסיסוקינימידיל (NHS), מומס ב-2 מ"ג/מ"ל ב-DMSO אנהידר, לתמיסת החלבון.
      הערה: לגבי צבעים אחרים, יש לעקוב אחרי הוראות היצרן לגבי קונוגציה של חלבון, כולל עודף מולר מומלרי מצבע לחלבון.
   2. ערבבו בעדינות על ידי נגיעה בצינור המיקרוצנטריפוגה שלוש פעמים כדי להבטיח פיזור הומוגני של הצבע.
3. דגירה
   1. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) במשך 1.5 שעות תחת ערבוב עדין (250 סל"ד) בתרמומיקסר ובחושך כדי למנוע הלבנת פוטו.
4. הסרת צבע לא כרוך
   1. איזון עמודת Superdex 200 10/300 GL (CV: 23.562 mL) עם לפחות 2 נפחי עמודה (כ-48 מ"ל) של בופר שחרור חלבוני ממברנה (20 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM KCl, 0.05% DDM (w/v)) בקצב זרימה של 0.3 mL/min באמצעות מערכת טיהור ÄKTA.
      הערה: להסרת צבע פלואורסצנטי עודף, עמודי סינון ג'ל קצרים יותר (אורך מיטה של 10–20 ס"מ) בדרך כלל מספיקים, במיוחד לצבעים פחות הידרופיליים. יצרן הצבעים ממליץ להסיר מלח באמצעות מטריצת Sephadex G-25. בעמוד Superdex 200 10/300 GL שימש במחקר זה בשל זמינות המכשיר.
   2. טעין עד 500 מיקרוליטר מהחלבון המסומן באמצעות לולאת קפילריות של 1 מ"ל ועם אותו בופר ב-0.3 מ"ל לדקה.
   3. יש לעקוב אחרי הספיגה על ידי מדידת ספיגה ב-280 ננומטר לחלבון ו-643 ננומטר עבור צבע ATTO 643.
   4. אסוף שברים של 0.5 מ"ל על פני נפחי עמודה של 1.5. זהה שברים המכילים גם חלבון וגם צבע. השתמש ישירות אם מרוכז מספיק, או ריכז באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות אמיקון. לריכוז באמצעות מסנני אמיקון, השתמשו במסנן צנטריפוגלי עם חיתוך משקל מולקולרי של 30 קילודאלטון ובצנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. קביעת ריכוז החלבון ומידת הסימון (DOL)
   1. מדוד ספקטרום הספיגה של הקונגוגט המטוהר.
   2. חשב את ריכוז החלבון ואת מספר מולקולות הצבע הממוצע לכל אנזים באמצעות:
      
      כאשר _{A מקסימום} מייצג את הספיגה של הקונגוגט במקסימום הספיגה של הצבע (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 ננומטר), A₂₈₀ הוא הספיגה ב-280 ננומטר (מקסימום הספיגה של חלבונים), ε_פרוט הוא מקדם ההכחדה המולרית של ציטוכרום bo₃ אוקסידאז (184,720 M⁻¹ס"מ⁻¹), ε_צבע הוא מקדם הכחדת המולר של הצבע (150,000 M⁻¹ס"מ⁻¹), ו-CF₂₈₀ הוא גורם תיקון לספיגה ATTO 643 ב-280 ננומטר (0.04).

3. הכנת וזיקולות חד-למלריות גדולות (LUVs)

1. הכנת סרט פולימר דק או פולימר/ליפידים
   1. השתמש בפיפטות עם הזזה חיובית עם קצוות עמידים לממס או במזרקי זכוכית אטומים לגז כדי להעביר תמיסות פולימר, ליפידים וצבע פלואורסצנטי המומסות בכלורופורם:מתנול (2:1, v/v) לבקבוקון זכוכית נקי לפי ההרכבים המפורטים בטבלה 1.
      אזהרה: יש לבצע את כל הטיפול בממס תחת מכסה אדים תוך כדי לבישת כפפות מגן ומשקפי מגן.
   2. ערבבו את התמיסה היטב על ידי מערבולת עדינה תוך החזקת הבקבוקון זקוף כדי להבטיח הומוגניות.
      זהירות: כוון את מהירות המערבולת בזהירות כדי למנוע מהנוזל להתיז או להתיז החוצה מהבקבוקון על ידיך.
   3. אידוי את הממסים האורגניים תחת זרם עדין של חנקן במכסה האדים למשך כשעה, עד שנוצרת שכבה דקה ואחידה על דופן המבחנה (איור 1).
      הערה: כוון את זרימת החנקן כך שהנוזל ינוע בעדינות מבלי להתיז; זרימה גבוהה מדי עלולה לגרום להיווצרות שכבה לא אחידה. לאחר 5–10 דקות, ניתן להגביר מעט את הזרימה כדי להבטיח ייבוש מלא והתפשטות אחידה של תערובת הווסיקולות לאורך תחתית הבקבוקון.
2. הידרציה בסרט
   1. החזירו את הסרט היבש עם 1 מ"ל בופר הידרציה (1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ"מ סוכרוז) כדי לקבל ריכוז אמפיפיל סופי של 5 מ"ג/מ"ל (המקביל ל-1.67 מ"מ לפולימרזומים ו-2.14 מ"מ לוסיקולות היברידיות). אם משתמשים בפולימרזומים לשיקום, הוסיפו לבופר ההידרציה 0.1% נתרן כולאט.
      אזהרה: נתרן כולאט הוא מגרה קל. הימנעו ממגע עור ממושך ושאיפת אבקה. לטפל בהתאם לגיליון הבטיחות של היצרן (SDS).
   2. מערבולת בעוצמה עד שהסרט מתנתק לחלוטין ותלוי לחלוטין, ויוצר שלפוחיות רב-למלריות (MLVs).
3. מחזורי הקפאה–הפשרה (וזיקולות היברידיות בלבד)
   1. הנושא מתלים ב-MLV היברידי לחמישה מחזורי הקפאה-הפשרה כדלקמן: הקפאת הדגימות בחנקן נוזלי למשך דקה, הפשרת הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס עד שהן נמסות לחלוטין, ומערבולת ב-2500–3000 סל"ד למשך 30 שניות באמצעות שייקר צינור. חזור על ההליך הזה במשך חמישה מחזורים בסך הכל.
      הערה: דלג על שלב זה עבור פולימרזומים טהורים.
      אזהרה: חנקן נוזלי (−196 מעלות צלזיוס) עלול לגרום לכוויות קריוגניות קשות. לטפל באזור מאוורר היטב עם ציוד מגן אישי מתאים (כפפות קריוגניות, משקפי מגן ומעיל מעבדה). הימנעו ממגע עם עור ועיניים.
4. אקסטרוזיה
   1. העבר את תליית הווסיקולה למיני-אקסטרודר המצויד בממברנת פוליקרבונט בגודל נקבוב 100 ננומטר.
   2. יש להוציא את המתלה 21 פעמים כדי לקבל LUVs הומוגניים בגודל.
      הערה: ודא ששלב האקסטרוזיה הסופי יוצא מהמתלה של LUV במזרק שממול למזרק הטעינה הראשוני. זה ממזער זיהום הדגימה הסופית עם וזיקולות גדולות יותר או חומר שאריתי שאולי לא עבר במלואו דרך הממברנה.
5. אחסון
   1. אחסן את תליית ה-LUV בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמש בו תוך שבוע כדי לשמור על התפלגות גודל הווסיקולות ולמנוע הצטברות או גדילה מיקרוביאלית בבופר המכיל סוכרוז.
   2. לפני השימוש, יש להומוגן בעדינות את מתלה ה-LUV על ידי וורטקס.

4. שיקום חלבון ממברנה ל-LUVs

1. טיפול מקדים של וזיקולות עם חומר ניקוי
   1. העבר 200 מיקרוליטר של LUVs לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל (איור 1). אם משתמשים ב-LUVs היברידיים, הוסף 1 מיקרוליטר של 20% (עם כולאט נתרן כולאט) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1% (w/v). אם משתמשים ב-LUVs פולימריים, אין צורך בחומר ניקוי נוסף שכן נתרן כולאט כבר קיים.
      הערה: הכינו את חומר הניקוי באותו בופר שבו השתמשו בניסויים כדי להבטיח תאימות עם הוזיקולות.
   2. ערבבו בעדינות על ידי הקשה קלה על צינור המיקרוצנטריפוגה שלוש פעמים. הימנעו מערבולות עזות או מערבולות, שעלולות ליצור קצף ולהכניס בועות אוויר.
2. הכנסת חלבון לוזיקולות שטופלו בחומרי ניקוי
   1. הוסף ציטוכרום _{bo 3} אוקסידאז (למדידות פעילות) או ציטוכרום _{bo 3} אוקסידאז–ATTO 643 (להדמיית פלואורסצנציה) לוזיקולות שהתבלבלו בדטרגנט כדי להשיג את ריכוזי החלבון הסופיים הבאים: עבור פולימרזומים, 0.556 מיקרומולר לניסויי LUV ו-1.112 מיקרומולר לניסויי GUV; עבור וזיקולות היברידיות, 0.714 מיקרומולר לניסויי LUV ו-1.428 מיקרומולר לניסויי GUV.
      הערה: ריכוזים אלו מתאימים ליחס מולר חלבון-פולימר של 1:3,000 עבור LUVs ו-1:1,500 עבור GUVs.
   2. הוסיפו את החלבון לאט תוך ערבוב עדין, במטרה לפזר אותו באופן שווה לאורך התמיסה ולמנוע ריכוז יתר מקומי.
      הערה: נפח החלבון המוסף עשוי להשתנות בין חלקים עקב הבדלים בריכוז מלאי החלבון.
3. הרכבת קומפלקסים של חלבון–דטרגנט–פולימר
   1. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב קל (400 סל"ד) בתרמומיקסר כדי לאפשר היווצרות מרכבי חלבון–דטרגנטה–פולימר מעורבים לפני הסרת חומר הניקוי.
4. הסרת חומרי ניקוי
   1. הסרת חומר ניקוי על ידי הוספת Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) ברצף. הסר 30 מ"ג של חרוזי ביו מתמיסת האחסון, ודא שהם נשארים לחים (רטובים אך ללא נוזלים עודפים). הוסף את החרוזים לדגימה ודגר 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין ב-600 סל"ד בתרמומיקסר. חזרו על שלב זה פעמיים נוספות, לסך של 90 מ"ג Bio-Beads וזמן דגירה כולל של 1.5 שעה.
      הערה: השתמשו רק בחרוזים ביולוגיים מיובשים לחלוטין. אין להעביר חרוזים יבשים, חרוזים הדביקים לדפנות צינור ה-Bio-Beads או חרוזים הצפים על פני השטח. אם החרוזים נדבקים לדופן צינור התגובה לשיקום מעל רמת הנוזל לאחר ההוספה, יש לצנטריפוגה קצרה את הצינור (למשל, 3–5 שניות במיניצנטריפוגה על שולחן) כדי לאסוף את החרוזים בתחתית לפני הדגירה.
   2. הכדור את חרוזי הביולוגיה בצנטריפוגה בעוצמה של 2,000 × גרם למשך 2 דקות באמצעות צנטריפוגה קטנה על שולחן. אסוף בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור החרוזים.
      הערה: כחלופה לצנטריפוגה, אפשר לחרוזים לשקוע בכוח הכבידה למשך כ-5 דקות, ואז להסיר בזהירות את הסופרנטנט.
5. אחסון
   1. יש לאחסן bo 3-LUVs משוחזרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בהם באותו יום למדידות פעילות חלבון.

5. גודל ופיזור של LUVs לפי פיזור אור דינמי (DLS)

1. טעינה של LUVs למדידות DLS
   1. העבר 45 מיקרוליטר של תליית LUV או פרוטאו-LUV לא מדולל לקובט קוורץ נקי. ודאו שהקובטה נקייה מאבק, טביעות אצבע או שאריות אחרות כדי למזער את פיזור האור.
      הערה: הימנעו מהחדרת בועות אוויר, שכן הן עלולות להפריע למדידות DLS. כדי למנוע בועות, הפיפט באיטיות על הדגימה לאורך דופן הקובט ואל תוציא את הטיפה האחרונה בכוח. אם נוצרות בועות קטנות, אפשר להן לעלות ולהתפזר לפני המדידה.
2. קביעת גודל ופיזור LUV באמצעות DLS
   1. למדוד את קוטר ההידרודינמי ואת מדד הפולידיפיזוריות (PDI) באמצעות מכשיר DLS המצויד בלייזר הליום-ניאון של 633 ננומטר ובזיהוי פיזור אחורי בזווית קבועה של 173°.
   2. בצע לפחות שלוש מדידות עצמאיות לכל דגימה כדי להבטיח שחזוריות.
   3. נתח את הנתונים באמצעות מודל כללי (התפלגות נורמלית) כדי לקבל את הגודל הממוצע ואת ה-PDI.

6. ניתוח צריכת חמצן של LUVs

1. הגדרת טמפרטורה
   1. כוון את תא המדידה של מערכת אלקטרודות חמצן מסוג קלארק ל-22 מעלות צלזיוס ואפשר למערכת להתאזן.
2. הוספת בופר
   1. הוסף 1 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), בופר סוכרוז של 200 מ"מ מ' לתא המדידה לנפח כולל של 1,000 מיקרוליטר. כוון את נפח הבופר לפי סוג הדגימה: 942.9 מיקרוליטר לפולימר _bo 3-LUVs ו-953.7 מיקרוליטר עבור _bo 3-LUVs היברידיים.
      הערה: הנפח הנותר יתפוס על ידי LUVs ותערובת DTT/Q₁ כדי להגיע לנפח המדידה הסופי.
3. הוספת LUVs
   1. הוסיפו bo_3-LUV לתא המדידה והתחילו לערבב בעדינות באמצעות מערבל מגנטי ב-100 סל"ד ו-22 מעלות צלזיוס. כוונן את נפח bo 3-LUVs כדי להגיע לריכוז תאורטי של bo₃ אוקסידאז של כ-27 ננומטר: 48.6 מיקרוליטר _{ל-bo 3-LUVs} פולימריים ו-37.8 מיקרוליטר עבור bo 3-LUVs היברידיים.
      הערה: לביקורת שלילית, החליפו bo-3-LUVs בנפח שווה של LUVs ללא חלבון בעלי הרכב וריכוז שומן/פולימר זהים. כל השלבים הבאים נשארים זהים.
4. מדידת קו הבסיס
   1. אפשר לריכוז החמצן להתייצב ולמדוד במשך 3 דקות תחת ערבוב מתמיד בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס כדי לקבל קו בסיס יציב.
5. הכנת תערובת הפחתה/קינון
   1. הכינו מחדש את תערובת DTT/Q₁ מיד לפני השימוש על ידי ערבוב 9.6 מיקרוליטר של 1 מ' DTT במי מילי-Q עם 0.6 מיקרוליטר של 80 מילימטר יוביקווינון-1 (Q₁) ב-DMSO, ואז לבצע מערבולת יסודית כדי להבטיח הומוגניות.
6. הפעלת אנזימים
   1. הפעל bo₃ אוקסידאז על ידי הוספת 8.5 מיקרו-ליטר מתערובת DTT/Q₁ הטרייה לתא המדידה, מה שמוביל לריכוזים סופיים של 8 mM DTT ו-40 מיקרומום Q₁.
7. שכפולים
   1. מדוד כל דגימה שלוש פעמים כדי להבטיח שחזוריות.
8. ניתוח נתונים
   1. תשרטט את ריכוז החמצן מול הזמן. קבעו את השיפוע של החלק הליניארי של העקומה, התואם לקצב צריכת החמצן.
9. דיווח
   1. דווח על קצב צריכת החמצן כממוצע של שלוש מדידות, עם סטיית תקן.

7. הכנת GUVs פונקציונליים חלבונים

1. ניקוי פלזמה של שקופיות זכוכית מצופות ITO
   1. הניחו את הזכוכית המצופה בדיל אינדיום (ITO) בתוך מנקה הפלזמה כאשר הצד המוליך (מצופה ITO) פונה כלפי מעלה. פלזמה מנקה אותם למשך דקה אחת בהגדרת הספק גבוהה ("HI") (230 וולט, הספק RF מקסימלי 18 וואט) ולחץ של כ-0.5 מ"בר.
      הערה: הצתת פלזמה מוצלחת ניתנת לאישור חזותי על ידי הופעת זוהר ורוד/סגול בתוך החדר.
2. התייבשות חלקית של פרוטאו-LUVs
   1. מערבבים 20 מיקרוליטר LUVs ללא חלבון עם 20 מיקרוליטר של פרוטאו-LUVs המכילים bo₃ oxidase-ATTO 643 ששוחזר. מערבולת עדינה כדי להבטיח ערבוב הומוגני.
   2. הפקדו שבע טיפות של 2 מיקרוליטר מההשעיה LUV/פרוטאו-LUV של 5 מ"ג/מ"ל על פני השטח המוליך (מצופה ITO) של כל שקף המשמש לאלקטרופורמציה (איור 2A). פזר את הטיפות באופן שווה על פני משטח ה-160.6 מ"^{מ 2} , תוך הפרדה ביניהן כדי לקדם יצירת שכבה אחידה.
      הערה: במערכות פולימר אחרות, ריכוז LUV ונפח הטיפות עשויים לדרוש אופטימיזציה (טווח טיפוסי: LUVs של 5–100 מ"ג/מ"ל; טיפות 0.2–2 מיקרוליטר).
   3. אפשר לטיפות להתייבש חלקית בטמפרטורת החדר (∼22°C) ולחות של ∼20% למשך כ-40 דקות, או עד שנוצרת טבעת לבנה בהיקף הטיפה (איור 2B).
      הערה: התייבשות תלויה בלחות הסביבתית. אם הלחות היחסית מעל 40%, יש להאריך את זמן ההתייבשות לפי הצורך (עד 20 דקות). קבעו את נקודת הסיום בהתבסס על הופעת טבעת לבנה בהיקף הטיפה ולא על בסיס זמן קבוע. בתנאי סביבה עקביים (טמפרטורה ולחות), זמן ההתייבשות הנדרש ניתן לשחזור. הימנע מייבוש יתר, שנראה כטיפות שטוחות ואחידות לבנות לחלוטין, שכן זה עלול לגרום למשקעים של חלבון.
3. הרכבת תא האלקטרופורמציה
   1. הרכיבו את תא האלקטרופורמציה על ידי הצבת שני מחסניות מצופות ITO (צדדים מצופים הפונים פנימה) המופרדים על ידי מרווח סיליקון בעובי 1.81 מ"מ עם חיתוך בצד אחד, המאפשר להוסיף או להסיר בופר במהלך המילוי והאיסוף.
   2. מלאו את התא בבופר הידרציה (1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5; 200 מ"מ סוכרוז).
      לניסויים רגישים ל-pH, הוסף 10 מיקרומום פירנין (8-הידרוקסיפירן-1,3,6-טריסולפוניק חומצה טריסולפונית, מלח HPTS) לבופר.
4. אלקטרופורמציה
   1. הפעילו שדה חשמלי מתחלף סינוסואידלי באמצעות התוכנית הבאה: 50 הרץ בתדרים 50, 100, 200, 300, 500, 700 ו-900 mV למשך 6 דקות כל אחד; 50 הרץ ב-1.1 וולט ל-2 שעות.
      הערה: כדי לקדם את היווצרות פרוטאו-GUV גדולים יותר, שלב זה יכול להיות מורחב ל-12 שעות, ו-4 הרץ ב-2 וולט למשך 30 דקות לשלב הניתוק. כאשר המאגר מכיל 10 מיקרומום פירנין, הגדילו את התדר ל-500 הרץ במהלך שני שלבי העלאת המתח הראשונים.
5. אוסף של רכבי ה-GUV
   1. פתחו בזהירות את התא באמצעות פינצטה ואספו פיפטות GUV באמצעות פיפטות FineTip Ultra-Micro Pastette (או פיפטות העברה נמוכות מקבילות) כדי למזער עומס מכני.
      הערה: הימנעו משימוש בקצות פיפטות סטנדרטיות בנפח נמוך מתחת ל-200 מיקרוליטר, שכן אלו עלולות לגרום לפיצוץ GUVs גדולים יותר. לחילופין, ניתן לחתוך קצוות סטנדרטיים בקצה כדי להרחיב את הפתח ולהפחית גזירה במהלך האיסוף.
6. אחסון
   1. אחסן פרוטאו-GUVs בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמש בשימוש תוך 48 שעות לשימור פעילות החלבון.
      הערה: קצב אובדן הפעילות תלוי בסוג וביציבות חלבון הממברנה המחודש, וכן בהרכב הממברנה.

8. מיקרוסקופיה של GUVs פונקציונליים חלבונים

1. הגדרת מיקרוסקופ
   1. תדליק את המיקרוסקופ הקונפוקלי. אם משתמשים במערכת Leica, הפעל את תוכנת LAS X. למותגי מיקרוסקופים אחרים, השתמשו בתוכנת הרכישה המומלצת על ידי היצרן.
   2. בחר מטרה לטבילה בשמן 63× (NA 1.40); כוון להגדלה גבוהה או נמוכה יותר במידת הצורך, בהתאם לגודל ה-GUV.
   3. פתח שני ערוצי הדמיה התואמים לפלואורופורים: רודמין רד (ממברנה) ו-ATTO 643 (חלבון משוחזר).
      הערה: עבור פלואורופורים עם ספקטרום חופף חלקית, בחרו קווי לייזר מתאימים וחלונות גילוי צרים כדי למזער דיבור ספקטרלי. רכוש כל ערוץ ברצף כדי למנוע דליפת אות ולהבטיח כימות פלואורסצנציה מדויק.
2. שקיעה של מערכות GUV
   1. הניחו מבודד סיליקון לחיצה לאיטום על כיסוי זכוכית נקי מס' 1.5 (עובי 0.17 מ"מ).
      הערה: למיקרוסקופים עומדים (לא הפוכים), ניתן להשתמש במגשישי זכוכית עבים יותר.
   2. פיפט 60 מיקרוליטר של בופר (1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM גלוקוז) למרכז המרווח.
   3. הוסיפו בעדינות 20 מיקרוליטר של מתלי ה-GUV מעל הבופר.
   4. כסה מיד את התא במחסנית זכוכית שנייה כדי למנוע אידוי.
   5. תן ל-GUVs לשקוע ~5 דקות לפני ההדמיה.
3. רכישת תמונה
   1. התמקד בתחתית התא כדי ללכוד חתכי רוחב של ה-GUVs.
   2. לצלם תמונות של GUVs שונים ברחבי החדר על ידי סריקה שיטתית מהפינה השמאלית העליונה לפינה הימנית התחתונה (דפוס "נחש") כדי לקבל אוכלוסייה מייצגת (~100 GUVs). תדמיין את כל הוזיקולות שנפגשו במהלך הסריקה ללא בחירה מוקדמת, ללא קשר לגודל או לעוצמת הפלואורסצנציה, כדי למנוע הטיית בחירה ולהבטיח שחזוריות.
      הערה: הימנעו מהדמיה חוזרת של אותו GUV כדי למנוע פוטובלינציה.
4. ניתוח תמונה
   1. כימות את עוצמת הפלואורסצנציה של חלבון מסומן ב-ATTO 643 שחזר על ידי ציור פוליליין לאורך הממברנה של GUVs בודדים. בעת שימוש בתוכנת LAS X, בחר Quantify → Line Profile, ואז בחר את כלי הפוליליין ועקוב אחרי הממברנה של כל GUV. כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת, יש לפתוח את סטטיסטיקה ולרשום את הערך הממוצע. לנתח רק GUVs נקיים וחד-למלריים; יש להוציא וזיקולות רב-וזיקולריות וזיקולות מצטברות מהניתוח.
      הערה: אם המדידות נרכשות בימים שונים, יש לנרמל את עוצמות הפלואורסצנציה לעוצמת הלייזר, ונמדדות תחת הגדרות דימות זהות (אורך גל ועוצמה נומינלית). כדי להתחשב בשינויים היומיומיים בתפוקת הלייזר, מיישמים את הנרמול הבא: , כאשר F_a.u. היא עוצמת הפלואורסצנציה הנמדדת ביחידות שרירותיות, P_{התייחסות} היא עוצמת הלייזר שנמדדה ביום הייחוס, והיא עוצמת הלייזר שנמדדה ביום הרכישה. תיקון זה מניח קשר ליניארי בין עוצמת הלייזר לעוצמת הפלואורסצנציה בתנאי תאורה שאינם רוויים. במחקר הנוכחי, כל התמונות צולמו באותו יום, ולכן לא נדרשה נורמליזציה.
   2. דווח על עוצמת הפלואורסצנציה כממוצע של 100 GUVs עם סטיית התקן המתאימה.

9. ניתוח שאיבת פרוטונים ב-proteo-GUVs

1. הגדרת מיקרוסקופ
   1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי והשיק את תוכנת הרכש המתאימה (למשל, LAS X למערכות Leica).
   2. בחר מטרה לטבילה בשמן בקוטר 63× (NA 1.40). כוון להגדלה גבוהה או נמוכה יותר אם צריך, תלוי בגודל ה-GUV.
   3. הגדר שלושה ערוצי הדמיה התואמים לפלואורופורים. עבור רודמין אדום (סמן ממברנה), יש להשתמש בגירוי של 561 ננומטר ובטווח פליטה של 570–620 ננומטר. לפירנין (צבע רגיש ל-pH בכיסוי), השתמש בגירורים ב-448 ננומטר ו-405 ננומטר, ואסף פליטה על פני 499–551 ננומטר.
      הערה: אם יש לייזר 458 ננומטר זמין, יש להשתמש בו במקום 448 ננומטר כדי לעורר את הצורה הבסיסית (דה-פרוטונית) של הפירנין.
   4. כוון את עוצמת הלייזר והגבר הגלאי כדי להימנע מרוויית פיקסלים ולמזער הלבנת פוטו. שמור על הגדרות רכישה קבועות לאורך כל הניסוי.
2. שקיעה של מערכות GUV
   1. הוסף 280 מיקרוליטר של בופר (1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM גלוקוז) לבאר אחת של סלייד עם 8 תאים (נפח באר כולל: ~874 מיקרוליטר).
      הערה: אין להשתמש בפחות מ-200 מיקרוליטר, שכן נפחים מתחת ל-200 מיקרוליטר מגדילים את האידוי ואת סטיית ה-pH. אין לעלות על 400 מיקרוליטר כדי למנוע דליפות ולהבטיח פיפטינג נוח. אם משתמשים בפורמט תא שונה, כוון את הווליום בהתאם. למיקרוסקופים הפוכים, השתמשו במחסניות תא התואמות לעובי כיסוי #1.5H.
   2. הוסיפו בעדינות 20 מיקרוליטר של מתלה _{bo 3-GUV} מעל הבופר מבלי להכניס בועות אוויר.
      הערה: לשליטה שלילית, החליפו את תליית _{bo 3-GUV} בנפח שווה ערך (20 מיקרוליטר) של GUVs ללא חלבון בעלי אותו הרכב שומן/פולימר, מוכנים ומשקעים בתנאים זהים. בקרה זו מתעדכנת בכל השפעות לא ספציפיות של DTT ו-Q₁ על יחס הפלואורסצנציה של הפירנין, שהן בלתי תלויה בפעילות bo₃ אוקסידאז.
   3. אפשר ל-GUVs לשקוע במשך כ-5 דקות לפני ההדמיה.
3. רכישת בסיס
   1. התמקד במישור התחתון של התא שבו ה-GUVs שקעו.
   2. כוון את הזום כדי לקבל 3–6 GUVs בשדה הראייה.
   3. הקלט פלואורסצנציה בסיסית בכל הערוצים במשך 5 דקות לפני ההפעלה.
4. הפעלת שאיבת פרוטונים
   1. הכינו תערובת DTT–Q₁ טרייה מיד לפני השימוש על ידי ערבוב 4.8 מיקרוליטר של 1 M DTT עם 0.3 מיקרוליטר של 80 mM Q₁ ב-DMSO, ואז ערבוב היטב באמצעות מערבוב.
   2. הפעל ציטוכרום _{bo 3} אוקסידאז על ידי הוספת עדינה של 2.6 מיקרוליטר מתערובת DTT–Q₁ על פני השטח של התמיסה מבלי להכניס את קצה הפיפטה לבופר, מה שמוביל לריכוזים סופיים של כ-8 mM DTT ו-40 מיקרומום Q₁ בתא.
   3. מעקב אחרי פלואורסצנציה תוך-וזיקולרית של פירנין במשך 30 דקות תחת רכישה רציפה.
5. ניתוח פלואורסצנציה תוך-וזיקולרית פירנין
   1. עבור כל GUV, הגדר אזור עניין (ROI) בתוך לומן הווסיקולה. בתוכנת LAS X, עבור ל-Quantify → Stack Profile, בחר Draw Ellipse, וצייר ROI מעגלי בתוך כל GUV.
   2. כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת ב-499–551 ננומטר עבור שני אורכי הגל של העירור (448 ננומטר ו-405 ננומטר), פתח את סטטיסטיקה בתוכנה ורשם את הערך הממוצע.
   3. חשב את יחס הפלואורסצנציה כ-R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. צייר את היחס לאורך זמן כדי לקבל עקבות קינטיות של שינוי pH תוך-ווסיקולרי.

תוצאות

האוקסידאז של E. coli ציטוכרום _{bo 3} הובע מפלסמיד pETcyo בזן E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE וטוהר כפי שתואר קודם²⁹. bo₃ אוקסידאז מטוהר שימש ישירות למדידות שיקום ופעילות, או סומן בצבעים פלואורסצנטיים, כמו ATTO 643 (מחקר זה) או צבעי ATTO^{אחרים 1,15}. לצבעים הידרופיליים מאוד כמו ATTO 643, נעשה שימוש בעמודה של 30 ס"מ להשגת הפרדה יעילה של צבע לא קשור לחלבון מסומן (איור 3A). דרגת הסימון (DOL), שחושבה מספקטרום ספיגה, נעה בדרך כלל בין 1.1 ל-1.3 מולקולות צבע לכל אנזים, בהתאם לצבע ATTO שבו השתמשו. עבור bo₃ אוקסידאז המסומן ב-ATTO 643, מדד ה-DOL היה 1.16 (איור 3B).

לצורך שיקום חלבונים, LUVs הוכנו תחילה באמצעות הידרציה בשכבת דקה, לאחר מכן מחזורי הקפאה-הפשרה ואקסטרוזיה להשגת גודל אחיד של ווסיקולות. לפולימרזומים, בופר ההידרציה הושלם עם חומר ניקוי. התפלגויות גודל הווסיקולות נותחו באמצעות פיזור אור דינמי לפני הבנייה מחדש (איור 4, טבלה 2). גם LUVs היברידיים וגם פולימריים הציגו בדרך כלל קוטרים ממוצעים של 85–95 ננומטר עם התפלגויות גודל צרות (PDI < 0.2). ציפויות מבוססות PDMS-g-PEO צפויות להיות קטנות מעט מגודל הנקבובית הנומינלית של ממברנת האקסטרוזיה. פולימרזומים טיפוסיים הציגו גדלים אחידים מאוד, עם ערכי PDI מתחת ל-0.1, בעוד ששלפוחיות היברידיות יצרו אוכלוסיות אחידות יחסית עם ערכי PDI לעיתים מעל 0.1 אך בעקביות מתחת ל-0.2.

חלבון ממברנה bo₃ oxidase הוכנס לאחר מכן ל-LUVs בנוכחות חומרי ניקוי (נתרן כולאט במחקר זה). הניקוי הוסר לאחר מכן באמצעות Bio-Beads. לאחר הבנייה מחדש, גודל הפולימרזום גדל רק במעט (איור 4A), בעוד שגודל הווסיקולה ההיברידית נותר ללא שינוי (איור 4B). בשתי המערכות, נצפתה עלייה קטנה ב-PDI (טבלה 2). שינויים קטנים כאלה בגודל צפויים, שכן מסיסה והסרה בתיווך דטרגנטים יכולים לארגן מחדש את שרשראות הפולימר בממברנה. פעילות החלבון הוערכה על ידי מדידת צריכת חמצן, מה שמציין האם החלבון שמר על פעילות תפקודית (איור 5A). היעדר צריכת חמצן בבקרת LUV השלילית ללא חלבון מאשר שהאות הנצפה נובע ספציפית מפעילות bo₃ אוקסידאז. עם שיקום מתווך נתרן כולאט בריכוזים שבהם השתמשו כאן, פעילות החלבון הייתה בדרך כלל מעט גבוהה יותר בווסיקולות היברידיות בהשוואה לפולימרזומים (איור 5B). נצפתה שונות מסוימת בפעילות החלבון בין אצוות הטיהור ואפילו בין חלקים באותה אצווה. לכן, במחקרים השוואתיים — כמו השוואת פעילות חלבונים במערכות ממברנות שונות — יש להשתמש באותו חלק של חלבון מטוהר כדי להבטיח עקביות.

כדי לייצר PDMS-g-PEO ו-PDMS-g-PEO/סויה GUVs עם פונקציונליות חלבון, נעשה שימוש בגישה של פיוז'ן-אלקטרופורמציה (fusion-electroformation). בשיטה זו, פרוטאו-LUVs מעורבבים עם LUVs חסרי חלבון והונחו על שקופיות זכוכית מצופות ITO, ולאחר מכן בוצעו התייבשות חלקית לקידום מיזוג ווסיקולות ויצירת שכבת פולימר/חלבון או פולימר/ליפידים/חלבון. התייבשות לא מספקת גרמה לתפוקת פרוטאו-GUV נמוכה, גודל GUV קטן יותר, ונוכחות של LUVs (פרוטאו-)לא מאוחדים.

שילוב מוצלח של החלבון המסומן, bo₃ oxidase–ATTO 643, לממברנה אושר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שקיעת ה-GUVs בגרדיאנט צפיפות סוכרוז/גלוקוז (איור 6A, B). ניתן להטיית כימות של פלואורסצנציה הקשורה לממברנה באמצעות פרופיל קו פשוט, שכן העוצמה הנמדדת תלויה בזווית שבה נצייר הקו. כדי למזער אפקט זה, עוצמת הפלואורסצנציה הוערכה באמצעות פוליליין שצויר לאורך כל קווי המתאר של כל ממברנה של כל GUV.

כדי להעריך מתאמים אפשריים בין גודל הווסיקולות לשילוב חלבון, קוטר ה-GUV נותח במקביל (איור 6C, D). GUVs גדולים יותר (מעל 20 מיקרון) הציגו בדרך כלל פלואורסצנציה נמוכה יותר של חלבונים הקשור לממברנה בהשוואה לווסיקולות קטנות יותר. תצפית זו עשויה להיות מיוחסת למנגנון ההיתוך-אלקטרופורמציה (Fra-Electformation): וזיקולות קטנות יותר נוצרות מוקדם יותר ועשויות לשלב חלבונים ביעילות רבה יותר, בעוד שלזיקולות גדולות נוצרות מאירועי מיזוג מאוחרים וגידול ממברנה, מה שעלול להוביל לדילול עם חומר דל חלבון.

הטמעת החלבון הכוללת נקבעת בעיקר בשלב המוקדם של החזרה ל-LUVs, במיוחד לפי סוג החומר ניקוי, ריכוז והשלב שבו הוא מתווסף. עבור LUVs פולימריים, נצפה השילוב מעט נמוך יותר כאשר הוסף חומר ניקוי לוזיקולות מוקדמות בהשוואה להוספה במהלך היווצרות ווסיקולות (שלב הידרציה מחדש), מה שהניב עוצמות פלואורסצנציה של 18.9 ± 3.9 a.u. ו-20.6 ± 3.7 a.u. בהתאמה (איור 6C, D, משמאל). במערכות היברידיות, שבהן מוסיפים חומר ניקוי לאחר היווצרות וזיקולות, ריכוז הדטרגנט ממלא תפקיד בולט: העלאת נתרן כולאט מ-0.015% ל-0.1% הובילה לעלייה משמעותית בשילוב חלבונים (22.1 ± 5.2 a.u. לעומת 26.2 ± 5.0 a.u., איור 6C, D, מימין). בהשוואה בין מערכות פולימר ומערכות היברידיות, נצפה בדרך כלל שילוב מעט גבוה יותר של bo₃ אוקסידאז בממברנה ב-GUVs היברידיים. סביר להניח שזה נובע מנוכחות ליקויי אריזה בממשקי פולימר-ליפידים, אשר בנוסף לפגמים הנגרמות על ידי חומרי ניקוי, מספקים אתרי החדרה מועדפים לחלבוני ממברנה.

באמצעות שלב אלקטרופורמציה שני של 2 שעות, הקוטר הממוצע של bo₃ GUVs פונקציונליים באוקסידאז היה כ-14–15 מיקרון (13.5 ± 3.7 מיקרון ל-GUVs פולימריים ו-15.4 ± 6.3 מיקרון ל-GUVs היברידיים), אם כי היו גם וזיקולות גדולות יותר (איור 6C, D). הארכת משך שלב האלקטרופורמציה השני ל-12 שעות הביאה לעלייה כוללת בגודל GUV^ב-1,27.

פרוטוקול ההיתוך-אלקטרופורמציה מאפשר גם עטיפה של מינים מסיסים במים, כגון צבעים רגישי pH (למשל, פירנין), על ידי הוספת הצבע לבופר ההידרציה במהלך האלקטרופורמציה (איור 7A). גודל ה-GUV בדרך כלל קטן כאשר וזיקולות נוצרות בנוכחות צבעים מסיסים במים. כדי לפצות על השפעה זו, יש להגדיל את התדר במהלך שלבי האלקטרופורמציה הראשוניים מ-50–500 הרץ.

הקפסולציה של צבע רגיש ל-pH מתייצב, כגון פירנין, מאפשרת ניטור חד-וזיקול של שאיבת פרוטון ומספקת תובנות לגבי כיוון משאבות הפרוטונים. לאחר החמצת לומן הוזיקולה, יחס הפלואורסצנציה של הפירנין המעורר ב-448 ננומטר ו-405 ננומטר יורד. יחס זה משקף את מצב הפרוטונציה של הפירנין ולכן מתאם ל-pH. מדידות רציומטריות הן יתרון, שכן הן ברובן אינן רגישות לשינויים ביעילות עטיפת הצבע ובפוטוליצ'ינג. דוגמה לפעילות שאיבת פרוטונים מוצגת באיור 7B, שם נצפתה ירידה ביחס הפלואורסצנציה הפירניני התוך-וזיקולרי (I₄₄₈/I₄₀₅) ב-GUVs היברידיים המכילים bo₃ אוקסידאז משוחזר לאחר הוספת תורם האלקטרונים DTT ומתווך האלקטרונים Q₁. יחס הפלואורסצנציה מתחיל לרדת בחדות כדקה לאחר ההפעלה וממשיך לרדת במהירות במשך כדקה, ואז מאט במהלך ~18 דקות הבאות. התנהגות זו מצביעה על כך שרוב מולקולות bo₃ אוקסידאז מכוונות כך ששאיבת פרוטונים מתרחשת לכיוון פנים ה-GUVs. GUVs ללא חלבון שנחשפו לתנאים זהים הראו ירידה קטנה יותר ביחס הפלואורסצנציה, מה ששימש כבקרה שלילית ומאשר כי הירידה הגדולה יותר שנצפתה ב-bo-3-GUVs נובעת ספציפית מפעילות שאיבת פרוטון באוקסידאז של bo₃ אוקסידאז ולא מהשפעות לא ספציפיות של DTT_ו-Q1 על יחס הפלואורסצנציה של הפירנין.

איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת וזיקולה חד-למלרית גדולה (LUV), שיקום חלבון ממברנה ציטוכרום bo₃ אוקסידאז ל-LUVs, והיווצרות וזיקולות ענק חד-למלריות (GUVs) עם פונקציונלציה של bo₃ באמצעות גישת היתוך-אלקטרופורמציה. LUVs מוכנים על ידי הידרציה של שכבה דקה, מחזורי הקפאה-הפשרה, ואקסטרוזיה דרך ממברנה בגודל נקבוביות של 100 ננומטר. שיקום הציטוכרום bo₃ oxidase מתבצע בנוכחות חומר ניקוי, אשר מוסר לאחר מכן באמצעות Bio-Beads. bo 3-GUVs נוצרים על ידי הפקדת bo 3-LUVs על מחסניות זכוכית מצופות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO), ואחריהן התייבשות חלקית והידרציה מחדש בנוכחות זרם חשמלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2. היווצרות שכבת ווסיקולה חד-למלית גדולה (LUV) מותכת באמצעות ייבוש. שבע טיפות של 2-מיקרוליטר של פרוטאו-LUVs מעורבים ו-LUVs הושקעו על מחסניות זכוכית מצופות אינדיום בדיל (ITO): (א) מיד לאחר ההפקדה ו-(ב) לאחר התייבשות חלקית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3. תיוג פלואורסצנטי של ציטוכרום bo₃ אוקסידאז. (A) כרומטוגרמה (פרופיל שחרור) של bo₃ oxidase-ATTO 643 שטוהר על עמודת Superdex 200 10/300 GL. החלקים המודגשים באפור נאספו ורוכזו לאחר מכן. (B) ספקטרום הספיגה של bo₃ אוקסידאז-ATTO 643 מרוכז, המראה שיאים ב-280 ננומטר (חלבון), 400 ננומטר (רצועת סורט של קופקטורים ההמיים ב-bo₃ אוקסידאז), ו-643 ננומטר (צבע). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4. התפלגות הגודל של וזיקולות חד-למלריות גדולות (LUVs) לפני ואחרי שיקום חלבון: (A) פולימר פולי(דימתילסילוקסנ)-גרפט-פולי (אתילן אוקסיד) (PDMS-g-PEO) ו-(B) וזיקולות היברידיות PDMS-g-PEO/סויה פוספטידילכולין (PC). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5. צריכת חמצן על ידי bo₃ אוקסידאז שנוצר מחדש בווזיקולות חד-למלריות גדולות (LUVs). (A) עקבות ייצוגיות של ריכוז החמצן לאורך זמן לאחר הפעלת ציטוכרום bo₃ אוקסידאז מחודש על ידי הוספת דיתיותרייטול (DTT) ויוביקווינון-1 (Q₁). העקבות הירוקות מתאימות ל-LUVs ששוחזרו על ידי חלבון, והעקבות האפורות עם הבקרה השלילית (LUVs ללא חלבון). (B) קצבי צריכת חמצן (OCR) של bo₃ אוקסידאז ששוחזר בפולי(דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי (תחמוצת אתילן) (PDMS-g-PEO) ו-PDMS-g-PEO/סויה פוספטידילכולין (PC). הפסים מייצגים את סטיית התקן הממוצעת ± (SD) של שלוש מדידות בלתי תלויות (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6. הכנסת bo₃ oxidase מסומן פלואורסצנטי לתוך וזיקולות ענק חד-למלריות (GUVs). מיקרוגרפים מייצגים של (A) פולי(דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי(אתילן אוקסיד) (PDMS-g-PEO) ו-(B) PDMS-g-PEO/סויה פוספטידילכולין (PC) GUVs (ממברנות מסומנות בפוספטידילאתנולאמין-רודאמין (PE-Rho), אדום) המכילות ציטוכרום מחודש bo₃ oxidase-ATTO 643 (מג'נטה). כימות עוצמת פלואורסצנציה bo₃ oxidase-ATTO 643 כפונקציה של גודל GUV (N = 100) לתנאי שיקום שונים: (C) הוספת 0.2% נתרן כולאט (SC) לווסיקולות פולימריות גדולים חד-למלריות (LUVs) מוכנות מראש ו-0.015% SC ל-LUVs היברידיים מוכנים; (D) LUVs פולימריים שנוצרו בנוכחות LUVs של 0.1% SC ו-LUVs היברידיים שטופלו ב-0.1% SC לאחר היווצרות. הערכים מייצגים את עוצמת הפלואורסצנציה של GUVs בודדים (N = 100 לכל תנאי). ערכי סטיית תקן ממוצעת ± (SD) מדווחים בטקסט. ההשוואות הן תיאוריות; לא בוצעו בדיקות סטטיסטיות פורמליות. A.U. (יחידות שרירותיות). פס קנה מידה = 20 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 7. שאיבת פרוטון על ידי bo₃ אוקסידאז שנוצר מחדש בווזיקולות חד-למלריות ענקיות (GUVs). (א) מיקרוגרף פלואורסצנציה מייצג של פולי(דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי (אתילן אוקסיד) (PDMS-g-PEO)/סויה פוספטידילכולין (PC), עם ממברנות מסומנות ב-0.05 מול% פוספטידילאתנולאמין-רודאמין (PE-Rho, אדום), המכילות ציטוכרום bo₃ אוקסידאז מחודש וצבע פירנין רגיש ל-pH (עירור ב-405 ו-448 ננומטר; תעלות כחולות וירוקות), שוקעות בזכוכית עם תאים. (B) שינוי ביחס הפלואורסצנציה התוך-וזיקולרי של פירנין עם הפעלה עם דיתיותרייטול (DTT) ויוביקווינון-1 (Q₁) ב-PDMS-g-PEO/סויה GUVs PC המכילים bo₃ אוקסידאז משוחזר. העקבות הירוקות תואמות ל-GUVs ששוחזרו על ידי חלבון, והעקבות האפורות לבקרת השלילית (GUVs ללא חלבון). העקבה מייצגת את סטיית התקן הממוצעת ± (SD) (n = 3 וזיקולות). פס קנה מידה = 20 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

	רכיב	סטוק	סכום	הרכב הממברנה הסופי
פולימרזומים	PDMS-g-PEO בכלורופורם:מתנול (2:1, v/v)	10 מ"ג/מ"ל	499.9 מיקרוליטר	99.95 מול%
	PE-רודמין בכלורופורם	1 מ"ג/מ"ל	1.1 מיקרוליטר	0.05 מול%
וזיקולות היברידיות	PDMS-g-PEO בכלורופורם:מתנול (2:1, v/v)	10 מ"ג/מ"ל	450.1 מיקרוליטר	70 מול%
	סויה PC (95%) בכלורופורם	10 מ"ג/מ"ל	49.8 מיקרוליטר	29.95 מול%
	PE-רודמין בכלורופורם	1 מ"ג/מ"ל	1.4 מיקרוליטר	0.05 מול%

טבלה 1: תמיסות ונפחים מקוריים המשמשים להכנת שכבה דקה להיווצרות ווסיקולה חד-למלרית גדולה (LUV). ריכוזי המלאי ניתנים במ"ג/מ"ל. הנפחים מחושבים עבור ריכוז כולל של 5 מ"ג/מ"ל אמפיפילים. הרכב הממברנה הסופי מבוטא ב-mol%. PDMS-g-PEO: פולי(דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי (תחמוצת אתילן); PE-רודמין: פוספטידילאתנולאמין-רודמין; סויה PC: סויה פוספטידילכולין; V/V: ווליום/ווליום.

	תנאי שיקום	קוטר (ננומטר)	PDI
פולימרזומים	טרום-הרכבה מחדש	84.34 ± 0.22	0.084
	לאחר הבנייה מחדש	100.73 ± 0.81	0.109
היברידים	טרום-הרכבה מחדש	89.21 ± 0.77	0.129
	לאחר הבנייה מחדש	85.01 ± 0.42	0.17

טבלה 2: גודל ווסיקולה ממוצע ומדד פולידיפיזוריות (PDI) של פולימזומים (פולי(דימתילסילוקסן)-גרפט-פולי (תחמוצת אתילן), PDMS-g-PEO) ווזיקולות היברידיות (PDMS-g-PEO/סויה פוספטידילכולין (PC)) לפני ואחרי הבנייה מחדש. הנתונים מייצגים את ממוצע שלוש מדידות בלתי תליות.

דיון

פולימרזומים ווזיקולות היברידיות של פולימר/ליפידים מציגים יציבות כימית ומכנית משופרת בהשוואה לוזיקולות ליפידים קונבנציונליות, מה שהופך אותם לאטרקטיביים במיוחד ליישומים הנעים מהעברת תרופות וחישה ביולוגית ועד ננו-ריאקטורים ותאים מלאכותיים. עם זאת, ארכיטקטורת הממברנה הייחודית והתכונות הביופיזיקליות שלהן לעיתים מונעות העברה ישירה של פרוטוקולים מותאמים לוזיקולות ליפידים למערכות מבוססות פולימר 15,20,30. הפרוטוקול המוצג כאן מתמודד עם הבדלים אלו ומספק זרימת עבודה אופטימלית לשיקום חלבוני ממברנה ל-LUVs פולימריים מבוססי PDMS-g-PEO ו-LUVs היברידיים, ולאחר מכן הרחבה ל-GUVs באמצעות היתוך-אלקטרופורמציה (frafusion-electroformation).

שלב קריטי בפרוטוקול הוא הכנת LUVs עם התפלגות גודל צרה וניתנת לשחזור. בדומה לסרטי ליפידים, סרטי PDMS-g-PEO מתאספים מעצמם לוסיקולות בעת ההידרציה מחדש באמצעות בופר מימי. בניגוד למערכות ליפידים, שלעיתים קרובות מניבות תערובת של וזיקולות חד-למלריות ורב-למפיות, PDMS-g-PEO יוצר באופן מועדף מבנים חד-למלריים¹, ובכך מבטל את הצורך במחזורי הקפאה-הפשרה המשמשים בדרך כלל להפחתת רב-למלריות בהכנות ליפידים. אקסטרוזיה מתבצעת כדי לתקן את התפלגות גודל הוזיקולות. עקב הרכות המוגברת של ממברנות PDMS-g-PEO ביחס לשתי שכבות^{ליפידים 1}, לחצי האקסטרוזיה נמוכים מספיקים. בעוד ש-11 מעברי האקסטרוזיה המומלצים על ידי היצרן בדרך כלל מספיקים, הגדלת מספר המעברים בדרך כלל מובילה להתפלגות גודל מצומצמת יותר ולשיפור השחזוריות. עם זאת, אקסטרוזיה מופרזת עלולה לייצר שלפיות קטנות מעט מגודל הנקבובית הנומינלי של הממברנה. אקסטרוזיה חוזרת עלולה גם להפחית את תפוקת הווסיקולות עקב אובדן חומרים; קבענו בעבר שכ-31% מ-PDMS-g-PEO וכ-25% מחומר ווסיקולת PDMS-g-PEO/סויה אבדו לאחר 21 מעבר דרך ממברנת¹⁰⁰ ננומטר 1. לכן, יש לאופטם את מספר מעברי האקסטרוזיה כדי לאזן בין אחידות הגודל לבין שלמות והיפוקה של השפיות.

שיקום בתיווך חומרי ניקוי מהווה גורם קריטי נוסף להצלחה. סוג הדטרגנט האופטימלי והריכוז תלויים הן בחלבון הממברנה הספציפי והן בהרכב הממברנה ^3,20. במקרה של ממברנות פולימריות טהורות, כאשר תנאי הרוויה אופטימליים, שילוב חומר ניקוי במהלך הידרציה מחדש של סרט מניב יעילות החדרה גבוהה יותר מאשר שלפיות רוויות מראש. ממברנות פולימריות קשיחות יותר, כמו אלו שנוצרות מ-PBD-b-PEO, דורשות ריכוזי דטרגנט גבוהים בהרבה לצורך מסיסות ממברנה³⁰, מה שמדגיש את הצורך באופטימיזציה ייחודית לפולימר. החדרה מוצלחת צריכה להיות מאומת לא רק באמצעות מדידות פעילות — בהשוואה למיצלות של דטרגנט או וזיקולות ליפיד — אלא גם באמצעות ניתוח מבני, כגון קריו-TEM, להערכת עומק ההחדרה והסתגלות הממברנה לאי-התאמה הידרופובית¹. כיוון החלבון קריטי לא פחות, במיוחד עבור משאבות פרוטון, שכן גרדיאנט פרוטון פונקציונלי דורש שרוב המשאבות יהיו מכוונות באופן אחיד. באופן אידיאלי, משאבות צריכות להוביל פרוטונים פנימה כדי לאפשר חיבור לתהליכים צורכי גרדיאנט, כמו סינתזת ATP ^3,15. ניתן להעריך את הכיוון באמצעות תגי חלבון, לדוגמה, על ידי כיבוי סלקטיבי של צבעים החשופים לחלק החיצוני של הווסיקולה או על ידי הזזת תוויות פלואורסצנטיות שמחוברות לתגי^His-20. גישות אלו מוצגות כהמלצות כלליות לאופטימיזציה של פרוטוקולים ולא בוצעו במחקר זה.

הגדלה מפרוטאו-LUVs לפרוטאו-GUVs באמצעות אלקטרופורמציה מיתוך-דורשת שליטה מדויקת בפרמטרי השקיעה והתייבשות. ריכוז ה-LUVs וגודל הטיפות משפיעים באופן קריטי על תפוקת ה-GUV והטוהר הסופיים. ריכוזי LUV גבוהים מדי (≥10 mg/mL) עלולים לגרום לכך ש-LUVs לא מותכים יישארו בדגימה הסופית, בעוד שריכוזים נמוכים מדי (<5 mg/mL) מפחיתים את תפוקת ה-GUV עקב מחסור בחומר ששוקע. ההתייבשות חייבת להיות חלקית ולא מלאה — כפי שניתן לראות בהופעת טבעת לבנה בהיקף הטיפה במקום טיפה לבנה לחלוטין — שכן התייבשות מופרזת עלולה לפגוע או לבטל את פעילות חלבוני הממברנה, במיוחד במשאבות פרוטונים. לחות וטמפרטורה מבוקרות הן לכן חיוניות לערער ממברנות מספיק למיזוג תוך שמירה על תפקוד החלבון.

עומסי חלבון גבוהים יכולים להקטין את גודל ה-GUV, אך ניתן להפחית השפעה זו על ידי דילול LUVs פונקציונליים חלבונים עם LUVs ללא חלבון. בדרך זו, ניתן לווסת בדיוק את צפיפות החלבון בתוך ממברנות GUV לפני ההפקדה. לדוגמה, ערבוב של_bo 3-LUVs עמוסים מאוד עם LUVs ריקים (עד 1:10, v/v) יוצר GUVs בקוטר של 5–30 מיקרון ותכולת חלבונים ניתנת לכוונון תוך שמירה על התפלגות ממברנה אחידה²⁷. למרות שאסטרטגיה זו גורמת לאוכלוסיות וזיקולות הטרוגניות מבחינת צפיפות חלבון, נהלי כיול מאפשרים הערכה כמותית של רמות השילוב^23,31. חשוב לציין כי שיטת הערבוב מאפשרת עומס חלבון כולל גבוה יותר ללא הפחתה מופרזת בגודל GUV²⁷.

ניתוח פונקציונלי של חלבונים משוחזרים ניתן לבצע על ידי עטיפת צבעים רגישים ל-pH כמו פירנין בבופר האלקטרופורמציה כדי לעקוב אחר שינויים ב-pH התוך-וזיקולרי. להדמיה חיה אמינה, יש לשקוע או להשתקע ולזיקולות כדי למנוע תנועה, מה שעלול לטשטש אותות פלואורסצנציה ולהפריע לכימות מדויק של דינמיקת ה-pH התוך-וזיקולרית. קיבוע באמצעות קישור ביוטין-סטרפטווידין באמצעות ליפידים ביוטיניליים ומשטחים מצופים סטרפטווידין³² מספק חיבור יציב אך עשוי לשנות את הרכב או מתח הממברנה. חצי-קיבוע במלכודות מיקרופלואידיות מציע אלטרנטיבה שמונעת רכיבי ממברנה נוספים ומזערת הפרעות ^1,33. למרות שמדידות פלואורסצנציה בתפזורת אפשריות לאחר הסרת צבע חיצוני באמצעות סדימנציה חוזרת והחלפת בופר, צבע שאריתי הקשור לממברנה עלול להפריע לקריאה; לכן, מיקרוסקופיה קונפוקלית של GUVs בודדים מועדפת בדרך כלל.

בהשוואה לגישות חלופיות שמנסות להכניס חלבון ישירות ל-GUVs מוכנים מראש, אסטרטגיית ההיתוך-אלקטרופורמציה מאפשרת אופטימיזציה עצמאית של תנאי הבנייה מחדש ברמת ה-LUV לפני ההגדלה ל-GUVs. תהליך עבודה מודולרית זו משפר את השחזוריות והתפוקה הפונקציונלית, במיוחד עבור ממברנות פולימריות והיברידיות שפחות מתאימות לפרוטוקולים מבוססי ליפידים קונבנציונליים. השיטה תואמת למגוון רחב של חלבוני ממברנה¹, כולל מערכות רב-חלבונית¹⁵, ומאפשרת פונקציונליזציה של הממברנה וקיפוסולציה משותפת של רכיבים נוספים. כתוצאה מכך, היא מספקת פלטפורמה גמישה לבניית תאים מלאכותיים עמידים, מיקרוריאקטורים ומערכות מודל לחקר אינטראקציות פולימרי-חלבון בתנאים מבוקרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			מיוצר במעבדה, חתוך מגיליון סיליקון
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600