הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בניית התקן "איבר על שבב" (Organ-on-a-Chip) של קומפלקס דנטין-מוך במבנה של שכבות אנכיות באמצעות דיסקת דנטין אנושית

110 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

במאמר זה

סיכום

לתיאור הייצור וההרכבה של התקן "איבר-על-שבב" (organ-on-a-chip) של קומפלקס דנטין-מוך המונח במבנה אנכי, המשלב דיסקת דנטין אנושית ומיקרו-תעלות שיוצרו באמצעות פוטוליתוגרפיה, ובהמשך לכך זריעה ותרבית של תאי גזע ממוך השן.

תקציר

מודלים פרה-קליניים קונבנציונליים המשמשים במחקר דנטלי, כולל מודלים של בעלי חיים ותרביות תאים סטטיות, מציגים מגבלות משמעותיות בשחזור התנאים הפיזיולוגיים של הממשק בין הדנטין למוך השן ובניבוי תגובות ביולוגיות אנושיות לחומרים ביו-דנטליים. טכנולוגיית איבר-על-שבב (OoC) מספקת גישה חלופית על ידי מתן אפשרות לשחזור של מיקרו-סביבות ספציפיות לרקמה בתוך מערכות מיקרו-פלואידיות מבוקרות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור ולהרכבה של התקן OoC של קומפלקס דנטין-מוך השן, המשלב דיסקת דנטין אנושית בתוך פלטפורמה מיקרו-פלואידית של פולידימטילסילוקסן (PDMS) בעלת שלוש שכבות. הפרוטוקול כולל הכנה של דיסקת דנטין, ייצור תבניות בעלות מיקרו-מבנה באמצעות פוטוליתוגרפיה, יציקה ואשפרה של PDMS, חיבור שכבות בסיוע פלזמה, הרכבת ההתקן, בדיקת נזילות, והזריעה של תאי גזע ממוך השן תחת תנאי תרבית סטטיים. נדונים פרמטרי ייצור קריטיים המשפיעים על ביצועי ההתקן, כולל בקרת עובי שכבת ה-PDMS, טיפול פלזמה במשטח, ושילוב דיסקת הדנטין בתוך ההתקן כדי למזער נזילות. היצמדות התאים וחיוניותם בתוך ההתקן הוערכו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק וצביעת חי/מת קונפוקלית. תוצאות מייצגות מדגימות שילוב מוצלח של דיסקת הדנטין בתוך המכלול המיקרו-פלואידי, שמירה על תנאים ללא נזילה, והיצמדות של תאי גזע חיוניים ממוך השן לפני השטח של הדנטין. פרוטוקול זה מספק גישה הניתנת לשחזור לייצור פלטפורמת OoC של קומפלקס דנטין-מוך השן, שעשויה לתמוך במחקרים עתידיים הבוחנים תגובות תאיות לחומרים ביו-דנטליים ולגירויים מיקרו-סביבתיים.

מבוא

ניסויים בבעלי חיים הם כבר זמן רב כלי מרכזי לקידום ההבנה של תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים, ומילאו תפקיד מרכזי בשלבים המוקדמים של פיתוח תרופות1. במהלך המאה ה-20, תוחלת החיים של בני האדם עלתה באופן משמעותי, ואף שאינו ניתן לכמת במדויק את המידה שבה שיפור זה מיוחס למחקר בבעלי חיים בלבד, מקובל להכיר בכך שטיפולים רפואיים עכשוויים רבים פותחו או תוקפו באמצעות מודלים של בעלי חיים2. דוגמאות בולטות כוללות את פיתוח החיסונים נגד פוליו, חסרה והפטיטיס B, הערכת הבטיחות והיעילות של פניצילין, וייצור אינסולין. בתחום המחקר של חומרי דנטליים וביומטריאליים, מודלים אלו היו קריטיים לחקר תהליך העששת, הביולוגיה וההתחדשות של קומפלקס הדנטין-מוך, והפיזי פתולוגיה של רקמות הפריודונטום3,4.

למרות השימוש הנרחב במתודולוגיות אלו, צינור הפיתוח הנוכחי של תרופות ממשיך להפגין שיעורי כישלון גבוהים, כאשר מועמדים רבים לתרופות נכשלים במהלך ניסויים קליניים למרות שהפגינו יעילות ובטיחות במסגרות מעבדה פרה-קליניות ובמודלים של בעלי חיים5. פער זה נקשר להבדלים בין-מיניים שעשויים להגביל את יכולת הניבוי התרגומית (translational predictability) של מודלים בבעלי חיים עקב הבדלים אנטומיים, גנטיים ופיזיולוגיים בין המינים6. בנוסף, פיתוחם של גישות טיפוליות חדשות נותר תהליך הגוזל זמן רב ועלויות גבוהות7. יתרה מכך, מודלים קונבנציונליים in vitro משתמשים בעיקר בתרביות מונושכבה דו-ממדיות (2D) פשוטות על מצעי פלסטיק שאינם פיזיולוגיים, ובכך אינם מצליחים לשחזר את הרמזים הביוכימיים והפיזיים, את האינטראקציות בין תאים ואת האותות של המטריצה החוץ-תאית (ECM) הקיימים בחלל הפה האנושי8,9. למרות שמודלים דו-ממדיים מציעים יתרונות ניסיוניים מסוימים, הם אינם מסוגלים מטבעם לשחזר את האינטראקציות המורכבות המתרחשות בין מספר רכיבים בו-זמנית, כגון ביופילמים, ביו-חומרים, דנטין ותאי פולפה10. כתוצאה מכך, קיים עניין גובר בפיתוח פלטפורמות ניסיוניות חלופיות המסוגלות לשחזר בצורה מדויקת יותר תגובות ביולוגיות אנושיות. בשנת 2022, חוק ה-FDA Modernization Act 2.0 הסיר את הדרישה המחייבת לבדיקות בבעלי חיים בתהליך אישור תרופות והכיר בשימוש פוטנציאלי בפלטפורמות חלופיות, כולל טכנולוגיות של איבר-על-שבב (OoC), במחקר פרה-קליני11.

איבר על שבב (OoC) הוא התקן מיקרופלואידי שנועד לשחזר את המבנה, התפקוד והמיקרו-סביבה של איבר ספציפי או רכיב רקמתי12. התקנים אלו מאוכלסים בתאים ורקמות חיים המגודלים בתוך מיקרו-תעלות הנדסיות המשחזרות היבטים מרכזיים של המיקרו-סביבה הפיזיולוגית אליה התאים חשופים באופן טבעי. מעבר לחיקוי מבני, המיקרו-תעלות מאפשרות בקרה ספציו-טמפורלית על הסביבה התאית ותומכות בשימור תפקודי רקמה ספציפיים, ובכך מספקות תנאים ניסיוניים שעשויים לדמות באופן הדוק יותר את הפיזיולוגיה in vivo מאשר מערכות תרבית קונבנציונליות12. רלוונטי במיוחד הוא העובדה שמיקרו-תעלות בהתקני OoC מקלות על זרימה מבוקרת של תוצר תרבית, המפעילה מאמץ גזירה (shear stress) על התאים השוכנים בהן13. גירויים מכניים אלו משפיעים על תגובות תאיות הכוללות היצמדות, פרוליפרציה, נדידה, ביטוי גנים ואינטראקציות בין-תאיות14,15. בנוסף, זרימה רציפה של התוצר תורמת לשימור המיקרו-סביבה באמצעות אספקת חומרי הזנה ופינוי תוצרי פסולת מטבוליים16. יתרה מכך, בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות, דווח כי חלק מפלטפורמות ה-OoC תומכות בבקרה משופרת של מדדי סטרס חמצוני, כולל מיני חמצן ריאקטיביים תוך-תאיים וחיוניות תאים, במודלים תלת-ממדיים (3D) על שבב17. לפיכך, מערכות OoC התגלו כפלטפורמות מבטיחות לחקר פיזיולוגיה של רקמות, אינטראקציות של חומרי ביו-מטריאל ותהליכי מחלה תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים18. במחקר דנטלי, טכנולוגיית OoC יושמה באופן הדרגתי למידול ממשקי רקמות חלל פה מורכבים יותר ויותר19. פלטפורמות מוקדמות של "שן על שבב" חיקו את הממשק שבין הביו-מטריאל, הדנטין והמוך20, בעוד שגרסאות מתקדמות יותר שולבו מאז עם כלי דם ועצבוב טריגמינלי כדי לשחזר באופן נאמן יותר את המורכבות המבנית והתפקודית של קומפלקס המוך-דנטין21. מעבר למוך, מודלים תלת-ממדיים של תעלות שורש לא בשלות אפשרו הערכה של חומרי שטיפה אנדודונטיים ונביטה אנגיוגנית של תאי גזע מהפפילה האפיקלית22,23. ברמה הפריודונטלית, פלטפורמות של "חניכיים על שבב" שימשו לחקר אינטראקציות מאחסן-מיקרוב ולהערכת הפוטנציאל האימונו-מודולטורי של פרוביוטיקה כסוכנים טיפוליים24, בעוד שהתקני "רצועה פריודונטלית על שבב" הדגימו כיצד זרימה של נוזל בינאי מודולית את היווצרות הרשת הווסקולרית ואת הדיפרנציאציה האוסטאוגנית של ספרואידים של תאי גזע מהרצועה הפריודונטלית25,26. כהשלמה למודלים אלו, מערכות ייעודיות של "רירית הפה על שבב" ו"שתל דנטלי על שבב" הרחיבו עוד יותר את היקף המחקר המיקרופלואידי הדנטלי על ידי אפיון אינטראקציות מאחסן-חומר והציטוטוקסיות של מונומרים דנטליים תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית27,28.

בעוד שמערכות OoC יושמו יותר ויותר במחקרים דנטליים, אוראליים וקרניו-פציאליים, מאמצים מתמשכים להשגת סטנדרטיזציה ושחזוריות של תהליכי הייצור נותרים חשובים. מספר מודלים של tooth-on-a-chip דווחו בספרות20,29,30,31, והם מדגימים תצורות מכשיר שונות ויישומים ניסיוניים שונים. עם זאת, הבדלים בארכיטקטורת המכשיר, בשיטות הייצור, בשילוב הדנטין ובדיווח על פרמטרים ניסיוניים עלולים להגביל את השחזוריות ואת ההשוואה הישירה בין מחקרים. בפרט, הבדלים בגיאומטריית המיקרו-ערוצים, באסטרטגיות שילוב הדנטין ובגישות הייצור עשויים להשפיע על המיקרו-סביבה הביולוגית והמכנית בתוך המכשיר. חלק מהמודלים שדווחו משלבים דנטין כדי לשחזר היבטים של הממשק בין הדנטין לפולפה20,29,30, בעוד שאחרים משתמשים בתצורות חלופיות31. בנוסף, שיטות ייצור כגון פוטוליתוגרפיה, חיתוך בלייזר, מיקרו-כרסום והדפסה בתלת-ממד מציגות כל אחת יתרונות ומגבלות ספציפיים, בהתאם לתכנון המכשיר וליישום המיועד. יתרה מכך, גורם קריטי לתועלת הביולוגית הוא האוריינטציה הארכיטקטונית של המכשיר, ובייחוד השאלה האם הערוצים ופרוסת הדנטין מסודרים בתצורה אופקית או אנכית19,32. בתצורות עם שכבות אופקיות, תאים המסודרים זה לצד זה מאפשרים מדוריות לטרלית וויזואליזציה של תאים בזמן אמת, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד למידול רקמות בעלות ארגון מרחבי לטרלי מולד, כגון הקומפלקס הפריודונטלי24,32. עם זאת, תכנון זה מוגבל מטבעו ביכולתו לשחזר ממשקים ביולוגיים ניצביים, כגון קומפלקס הביומטריאל-דנטין-פולפה, שכן הסידור הלטרלי של התאים אינו משחזר נאמנה את האוריינטציה in vivo של מחסום הדנטין בין החלל לפולפה20,32. תצורות עם שכבות אנכיות נותנות מענה למגבלות אלו על ידי הצבת שני תאים זה מעל זה לאורך ציר ה-y, המופרדים על ידי פרוסת דנטין טבעית, מה שמאפשר כימות סימולטני של הובלה מולקולרית דרך דנטין שלם וניטור בזמן אמת של תגובות תאי פולפה הנמדדות במדיום המוצא30. עם זאת, מגבלה ידועה של אוריינטציה זו נוגעת לדימוי חתך של ממשק הדנטין-תא, שכן השגת תמונות חתך של ממשק הדנטין-תא בתוך אותו מישור מוקד נותרת מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר בתצורות עם שכבות אופקיות, שבהן התאים ומטריצות חוץ-תאיות מסודרים לטרלית. למרות שבספרות דווחו מודלים מרובים של קומפלקס דנטין-פולפה on-a-chip, הרוב מאמצים תצורה של שכבות אופקיות שבה התאים מסודרים זה לצד זה בתוך אותו מישור10,20,21,29, בעוד שרק מעטים שילבו פרוסת דנטין טבעית בתוך תצורה של שכבות אנכיות30. למרות זאת, הבדלים בגישות הייצור ובפרמטרי הדיווח בין מודלים אלו ממשיכים להגביל את השחזוריות ואת ההשוואות בין מחקרים33. המאמר הנוכחי שואף לשפר את השחזוריות המתודולוגית על ידי אספקת פרוטוקול ייצור מפורט עבור מכשיר tooth-on-a-chip בעל שכבות אנכיות, ובכך להקל על אימוץ רחב יותר של הפלטפורמה בקהילת המחקר הדנטלית.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור והרכבה של התקן OoC של קומפלקס דנטין-מוך המונח בערימה אנכית, המשלב דיסק דנטין אנושי בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית תלת-שכבתית מ-polydimethylsiloxane (PDMS) שיוצרה באמצעות תבנית המיוצרת בפוטוליתוגרפיה. הפרוטוקול מתאר בנוסף זריעה ותרבית של תאי גזע של מוך השן בתוך ההתקן בתנאים סטטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של Universidad de La Frontera עבור מחקרים הכוללים דגימות אנושיות.

1. השגת דיסקת דנטין

הערה: הכינו את תכנון המכשיר לפני תחילת הפרוטוקול (איור 1A–1C).

  1. איסוף ואחסון של שיניים
    1. אסוף שיריים בריאות מסוג טוחנות או טרי molarיות לאחר קבלת הסכמה מושכלת מהמטופל.
    2. שמור את כל הדגימות בתמיסת כלורמין 0.5% בטמפרטורה של 4°C כדי למנוע התייבשות של הדנטין ודנטורציה של חלבונים.
    3. החלף את תמיסת הכלורמין פעם בשבוע במהלך האחסון.
  2. הכנת דיסקיות דנטין
    1. בצע חיתוך אופקי של כל שן בשליש האמצעי של הכתר באמצעות ידית מהירה הפועלת במהירות של 350,000 rpm ומצוידת במקדח יהלום צילינדרי (קוטר 1 mm; גודל גרגירים 100–150 µm).
    2. בצע את החיתוך תחת השקיה רציפה של מים בקצב של כ-50 mL/min.
    3. מקם את החיתוך בשליש האמצעי של הכתר כדי להימנע מתא הפולפה ומהזגוגית (enamel) הנמצאת בחריצים ובסדקים האוקלוזליים, ובכך השג דיסקיה המורכבת בעיקר מרקמת דנטין.
      זהירות: בצע את חיתוך השן תחת השקיה רציפה והשתמש בציוד מיגון אישי מתאים, כולל כפפות, מסכה ומשקפי מגן.
  3. גימור של דיסקיות הדנטין
    1. לטש את דיסקית הדנטין באמצעות דיסקיות גימור בעלות גודל גרגירים פוחת באופן סדרתי.
    2. המשך בליטוש עד להשגת עובי דנטין סופי של כ-0.8 mm (±± 0.3 mm) וממדים צדדיים של כ-5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm) (איור 1D).
  4. אחסון של דיסקיות דנטין
    1. אחסן את דיסקיות הדנטין המוכנות בתמיסת כלורמין 0.5% בטמפרטורה של 4°C עד להרכבת מכשיר ה-OoC.

דיאגרמת הרכבת התקן מיקרופלואידי; שלבי ייצור עם פינצטה, כלי ניקוב, ותיוך נוזלים.
איור 1: זרימת העבודה של התכנון והייצור של התקן איבר-על-שבב (OoC) של קומפלקס הדנטין-מוך השן. (A) תכנון תלת-ממדי של ההתקן המציג את ארכיטקטורת שלוש השכבות. (B) מבט עליון של תכנון ההתקן עם הממדים העיקריים. (C) מבט צידי של תצורת ההתקן בעל שלוש השכבות. (D) דיסק דנטין מייצג שהוכן בעובי מקורב של 0.8 mm וממדים צידיים של כ-5 mm × 5 mm. (E) תבנית מאסטר מסיליקון שיוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה ושימשה ליציקה של שכבות ה-polydimethylsiloxane (PDMS) העליונה והתחתונה. (F) הסרה של שכבת PDMS מומצקת מהתבנית הסיליקונית לאחר פולימריזציה תרמית. (G) טיפול בפלזמה של פני השטח של ה-PDMS לפני הצמדת השכבות. (H) התקן OoC סופי של קומפלקס דנטין-מוך השן בעל שלוש שכבות, שהורכב על ידי הצמדה בפלזמה ושילוב של ממשק הדנטין. (I) התקן מורכב המחובר לצינוריות לצורך בדיקת דליפות והכנה לניסויי מיקרופלואידיקה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ייצור התקן OoC של קומפלקס הדנטין-מוך

  1. הכנת סביבת העבודה והחומרים
    1. הכנת חומרים וציוד
      1. הכינו את כל החומרים והציוד המפורטים ב- טבלת חומרים לפני תחילת ייצור ההתקן.
      2. הכינו את המחתכים לביופסיה לפני הרכבת המכשיר.
      3. יש לבצע את כל הליכות הייצור בסביבה נקייה ונקיָה מאבק.
      4. יש להשתמש בכפפות, במשקפי מגן ובציוד הגנה אישי מתאים לאורך כל תהליך הייצור וההרכבה של המכשיר.
        הערה: הכינו את התבנית שהופקה בפוטוליתוגרפיה לפני תחילת הפרוטוקול (איור 1E).
  2. ייצור התבנית בעלת המבנה המיקרוסקופי
    1. הכנת פרוסת הסיליקון
      1. ייצרו את התבנית על גבי פרוסת סיליקון מלוטשת בצד אחד בקוטר 4 אינץ' (סוג N, מסומם ב-As, שיטת גידול CZ, <100> אוריינטציה, 500 ±± 25 µm עובי, TTV ≤ 10 µm, רוחב קורה (BOW) ≤ 35 µm, התנגדות סגולית 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. נקה את הפרוסה (wafer) באופן סדרתי באצטון, איזופרופנול ובמים מזוקקים במיוחד (ultrapure water), למשך 10 דקות בכל שלב, תחת טיפול באולטרסוניקציה.
      3. ייבשו את הפרוסה (wafer) בעזרת אוויר דחוס.
      4. האפו את הפרוסה ב- 200°C במשך 10 דקות על פלטה חשמלית (hot plate) כדי להסיר לחות שיורית.
      5. יש להניח לוופר להתקרר לטמפרטורת החדר (RT; 20°C–25°C).
    2. הפעלת שטח וציפוי בפוטורזיסט
      1. הפעילו את פני השטח של פרוסת הסיליקון באמצעות מנקה פלזמה בוואקום, המופעל עם פלזמת אוויר ברמה 7 למשך 120 שניות.
      2. יש למרוח פוטורזיסט שלילי מבוסס אפוקסי מסוג GM 1060 באמצעות ציפוי ספין (spin coating) במהירות של 300 סל"ד למשך 10 שניות.
      3. המשך את ציפוי הסבב (spin coating) במהירות של 565 rpm למשך 100 שניות ו-965 rpm למשך שנייה אחת, תוך שימוש בתאוצה של 200 rpm/s.
      4. השאירו את הפרוסה המצופה למנוחה למשך 10 דקות.
      5. בצע אפייה מקדימה ב- 65°C למשך 10 דקות.
      6. המשך את שלב האפייה המקדימה ב- 95°C למשך שעה אחת.
      7. יש להמתין עד שהפרוסה (wafer) תתקרר לטמפרטורת החדר.
    3. חשיפה ופיתוח
      1. חשפו את הפוטורזיסט (photoresist) באמצעות מערכת ליתוגרפיה בלייזר ישירה במינון של 1,950 mJ/cm²2.
      2. בצע אפייה לאחר עיבוד (post-bake) ב- 65°C למשך 10 דקות.
      3. המשך את שלב האפייה ב- 95°C למשך 30 דקות.
      4. אפשרו לגלגלת להתקרר לטמפרטורת החדר.
      5. השאירו את הפרוסה למנוחה למשך 10 דקות.
      6. פתח את התבנית ב-PGMEA למשך 4 דקות.
      7. האריך את פיתוח הדגימה במרווחים של 30 שניות אם נותר פוטורזיסט (photoresist).
      8. הפסיקו את הפיתוח על ידי שטיפה באיזופרופנול.
      9. ייבשו את הפרוסה באמצעות אוויר דחוס.
    4. הקשיה בתנור (Hard bake)
      1. בצעו אפייה קשיחה (hard bake) ב- 135°C למשך 2 שעות.
      2. השג תבנית מאסטר בעלת מיקרו-מבנה המכילה מיקרו-תעלות ברוחב של 1 מ"מ ו- 50 µm בגובה.
  3. הכנה וניקוי בועות (degassing) של תערובת ה-PDMS
    1. הכנת תערובת ה-PDMS
      1. ערבבו את בסיס ה-PDMS ואת חומר ההקשיה ביחס משקלי של 10:1.
      2. ערבבו את התערובת ידנית בעזרת מוט זכוכית בתוך כוס כימית מפלסטיק למשך כ-5 דקות.
      3. יש לשמור על תנועות סיבוביות איטיות ורציפות במהלך הערבוב.
        הערה: יש להימנע מהחדרת בועות אוויר במהלך הערבוב.
    2. ניקוי גזים
      1. הניחו את תערובת ה-PDMS בתוך דסיקטור ואקום המחובר למשאבת ואקום.
      2. בצעו דגזינג (Degas) לתערובת בלחץ של כ-700 mmHg למשך 5 דקות.
      3. שחררו את הוואקום לזמן קצר כדי לאפשר לבועות שעל פני השטח להתפוצץ.
      4. יש להפעיל מחדש את הוואקום.
      5. חזור על המחזור עד שלא יישארו בועות נראות לעין.
        הערה: זמן ניתוק הגזים הכולל הוא בדרך כלל כ-30 דקות.
  4. יציקת PDMS על התבנית
    1. הכנת התבנית
      1. הנח את התבנית על משטח שטוח.
      2. נקה את התבנית באמצעות אוויר דחוס.
      3. הימנעו ממגע ישיר עם המשטח המדופס.
      4. וודאו כי התבנית נקייה מאבק וממזהמים.
    2. מזיגת PDMS
      1. הנח כ-8 גרם של PDMS מסביב לדיסק הדנטין כדי ליצור את שכבת ההטמעה של הדנטין.
      2. כווננו את גובה ה-PDMS כך שיתאים לעובי דיסקת הדנטין (0.8 ± 0.3 מ"מ).
      3. מנעו מה-PDMS לכסות את פני השטח של הדנטין.
      4. הקצה כ-0.26 גרם של PDMS לכל יחידת תבנית כדי לייצר כל שכבת מיקרו-ערוץ.
      5. הקישו בעדינות על התבנית או הפעילו רעידה כדי להקל על מילוי המבנים המיקרוסקופיים.
      6. אפשרו ל-PDMS לשקוע אל תוך המבנים הקטנים ביותר.
      7. כסו את התבנית באמצעות מכסה או כיסוי שטוח, ללא מגע עם פני השטח של ה-PDMS.
        הערה: שכבת הטמיעה של הדנטין היא בעובי של כ-0.8 מ"מ, וכל שכבת מיקרו-תעלה היא בעובי של כ-0.4 מ"מ, מה שנותן עובי כולל של ההתקן של כ-1.6 מ"מ.
        הערה: התאימו את עובי השכבה למרחק העבודה של העדשה הקונפוקלית כאשר מתוכננת הדמיה קונפוקלית.
  5. הקשיה
    1. הניחו את התבניות בתנור בטמפרטורה של 50°C.
    2. יש להקשות את ה-PDMS למשך 4 שעות.
  6. הסרת שכבות ה-PDMS
    1. הסרת PDMS שהוקשח
      1. קלפו בזהירות את שכבות ה-PDMS המקשחות מהתבנית (איור 1F).
      2. טפלו בשכבות ה-PDMS בזהירות כדי למנוע פגיעה במיקרו-מבנים.
  7. הדבקת שכבות ה-PDMS ויצירת פתחי כניסה ויציאה
    1. ייצור פתחי כניסה ויציאה
      1. צורו נקבי פרפורציה במיקומי הכניסה והיציאה שנקבעו באמצעות מחץ ביופסיה (biopsy punch) בקוטר 1 מ"מ.
      2. מקם את צד המיקרו-תעלה הפונה כלפי מעלה במהלך הניקוב.
        הערה: הנח את שכבת ה-PDMS על משטח חיתוך כדי למנוע נזק מבני.
      3. צרו שני חורים בשכבה העליונה התואמים למיקרו-ערוץ העליון.
    2. ניקוי שכבות PDMS
      1. יש לנקות את שכבות ה-PDMS באמצעות איזופרופנול או אתנול.
      2. הסר חלקיקי אבק שאריתיים באמצעות סרט דביק סטרילי.
      3. יש לוודא שכל משטחי ההדבקה נקיים מזיהומים לפני ההרכבה.
    3. הפעלת פלזמה של משטחי PDMS
      1. מקם את שכבות ה-PDMS העליונה והאמצעית לטיפול בפלזמה (איור 1G).
      2. הפעילו את המשטחים באמצעות מכשיר טיפול בפלזמת קורונה ידני הפועל בהספק של כ-25 W, כאשר אוויר סביבתי משמש כגז העבודה.
      3. שמרו על מרחק עבודה של כ-1 מ"מ בין מקור הפלסמה לבין פני השטח של ה-PDMS.
        אזהרה: יש לבצע את טיפול הפלזמה תחת אוורור מתאים ולהימנע מחשיפה ישירה לאוזון הנוצר מהפלזמה.
      4. הפעילו את מכשיר הטיפול בפלסמה והמתינו 5 שניות לייצוב.
      5. יש לאמת את יצירת קרן פלזמה אחידה לפני הטיפול.
      6. טפלו בשכבת ה-PDMS העליונה במשך 10 שניות בתנועה רציפה הלוך ושוב במהירות של כ-5 מ"מ/שנייה.
      7. טפל בשכבת ה-PDMS האמצעית למשך 10 שניות תוך שימוש באותה תנועה ומרחק.
      8. החל פלזמה למשך שנייה אחת נוספת על השכבה העליונה מיד לפני ההדבקה.
    4. הדבקה של השכבה העליונה והשכבה האמצעית
      1. יישרו את המיקרו-תעלה העליונה עם דיסק הדנטין מיד לאחר הטיפול בפלזמה.
      2. הדבק את השכבה העליונה והשכבה האמצעית זו לזו.
      3. הנח את המכלול המחובר בתנור בטמפרטורה של 75°C למשך 5 דקות.
      4. בצע חיזוק של הקשר במהלך הדגירה.
        הערה: דיסק הדנטין והמיקרו-תעלה נראים לעין בלתי מזוינת וניתן ליישרם ללא כלי יישור נוספים.
    5. ייצור פתחי מיקרו-ערוצים תחתונים
      1. בצע שני ניקובים התואמים למיקרוערוץ התחתון דרך השכבות העליונה והאמצעית המחוברות.
      2. בצעו ניקוב של שני השכבות בו-זמנית כדי להבטיח יישור.
        הערה: הליך זה יוצר ארבעה נקבי חור (perforations) בשכבה העליונה ושני נקבי חור בשכבה האמצעית.
      3. הנח את המכלול המודבק על משטח חיתוך יציב לפני הניקוב.
      4. הפעילו לחץ קבוע כלפי מטה בתנועה אחת.
        הערה: יש להימנע מכוחות סיבוב או כוחות צדיים כדי למזער את הסיכון להיפרדות שכבות (delamination).
      5. הסר שאריות מאתרי הפרפורציה באמצעות גזה סטרילית נטולת סיבים, הלחה באיזופרופיל אלכוהול.
      6. יש לבחון את הפורציות ואת אזורי ההדבקה שסביבן תחת תאורה נאותה.
      7. יש לוודא כי אין דלמינציה (הפרדה בין שכבות), קרעים או ניקובים חלקיים לפני ההמשך.
    6. הדבקה של השכבה התחתונה
      1. בצע טיפול בפלסמה בשכבה התחתונה כפי שמתואר בשלב 2.7.4.
      2. יישרו את פתחי הכניסה והיציאה של המיקרו-תעלה התחתונה עם הפתוחים בשכבות העליונה והאמצעית.
      3. הדבק את השכבה התחתונה כדי להשלים את הרכבת המכשיר.
        הערה: סמנו את מיקומי הכניסה והיציאה על פני השטח החיצוניים של השכבה התחתונה לפני ההדבקה כדי להקל על היישור.
        הערה: תאי פלזמה עשויים לספק קישור חזק יותר מעטי פלזמה, כפי שדווח בספרות36.
        הערה: המכשיר המוגמר מורכב מפלטפורמה מיקרופלואידית תלת-שכבתית הכוללת ממשק דנטין (איור 1H). פני השטח התחתונים של הדנטין מייצגים את צד הפולפה (מוך השן) של המודל, בעוד שפני השטח העליונים של הדנטין מייצגים את הצד הקורונלי (הכתרי) לחשיפה לחומרי בנייה דנטליים או לתכשירים בקטריאליים.
  8. בדיקת דליפות של המכשיר המיקרופלואידי
    1. בדיקה של המכשיר המורכב
      1. בדקו את המכשיר המורכב כדי לוודא שאין חוסר יישור.
      2. בדקו את המכלול כדי לוודא שאין הדבקה חלקית או דליפות גלויות.
    2. בדיקת דליפות
      1. חברו מחטים מסוג Luer-lock בכיול 19G לפתחי הכניסה (איור 1E).
      2. חברו את המחטים לצינורות של משאבת המיקרופלואידיקה.
      3. לחץ בעדינות את בסיסי המחטים לתוך הפתחים שנוקבו כדי להשיג אטימה הרמטית.
      4. הזרק PBS סטרילי או מצע תרבית בקצב זרימה של 10 µL/min.
      5. שמר זרימה של הנוזל למשך 5 דקות לפחות.
      6. יש לבחון את כל הממשקים המודבקים, את שולי התעלות ואת גבולות דיסקי הדנטין במהלך הזרימה.
      7. יש להשגיח על המכשיר תחת תאורה נאותה במהלך ההזרקה ולאחריה.
      8. אשרו את היעדר הצטברות נוזלים, רטיבות או היווצרות טיפות.
      9. סווג את המכשיר כחסין דליפות אם לא זוהתה דליפה.
      10. יש להשליך מכשירים המראים דליפה.
        הערה: יש לבצע בדיקת דליפות לכל התקן שיוצר לפני זריעת תאים או שימוש ניסויי.
  9. עיקר ועיקר ואחסון של ההתקן המיקרופלואידי
    1. עיקור
      1. חשפו את פני השטח העליונים של המכשיר המורכב לאור UV (במרחק של 254 ננומטר) למשך 30 דקות בתוך תא זרימה למינרית.
      2. חשוף את פני השטח התחתונים לקרינת UV למשך 30 דקות נוספות.
      3. שטפו את המיקרו-תעלות באתנול 70% למשך 20 דקות.
      4. שטפו את המיקרו-תעלות שלוש פעמים ב-PBS סטרילי כדי להסיר שאריות אתנול.
    2. אחסון
      1. השתמשו במכשיר שעקר באופן מיידי לניסויי תרביות תאים.
      2. לחלופין, יש לאחסן את המכשיר כשהוא טבול ב-PBS סטרילי ב- 4°C בתוך מכל סטרילי עד למועד השימוש.
        זהירות: אין להשתמש בכלוראמין או בתמיסות חיטוי אחרות לאחר הרכבת המכשיר, כיוון ש-PDMS עלול לספוג תרכובות אלה ולפגוע בחיוניות התאים.

3. הערכת היצמדות וחיוניות של תאי גזע מפולפה דנטלית

  1. הכנה מוקדמת של פני השטח של הדנטין
    1. הזריק 10% EDTA אל תוך המכשיר.
    2. שמור על מגע בין תמיסת ה-EDTA לפני השטח של הדנטין למשך 15 min.
    3. הזריק 0.5 mL EDTA כל 3 min כדי לשמור על תנועת נוזלים בתוך המיקרו-תעלה.
    4. שטוף את דיסק הדנטין שלוש פעמים במים אולטרה-טהורים.
    5. שמור על כל שטיפה למשך 5 min.
      הערה: טיפול ב-EDTA מסיר את שכבת הסימיר (smear layer) וחושף חלבוני מטריקס של הדנטין.
      זהירות: טפל בתמיסות EDTA תוך שימוש בכפפות ובמשקפי מגן כדי למנוע גירוי של העור והעיניים.
  2. זריעה של תאי גזע מפולפה שיניית
    1. הרחבת תאי גזע מפולפה שיניית
      1. זרוע תאי גזע מפולפה שיניית לתוך בקבוק T75 בצפיפות של 1 × 106 תאים לבקבוק.
      2. דגרי את התאים ב-37°C ו-5% CO2 עד להגעה לכ-80% התמסרות (confluency).
      3. נתק את התאים באמצעות טריפסין.
      4. נטרל את הטריפסין באמצעות מצע גידול מלא.
      5. סבב את תרחיף התאים בצנטריפוגה כדי לקבל משקעת תאים (cell pellet).
      6. הערך את חיוניות התאים באמצעות trypan blue.
      7. השתמש בתרחיפי תאים המראים חיוניות של ≥90%.
    2. הכנת תרחיף התאים
      1. הכן תרחיף תאים שחומם מראש ל-37°C.
      2. כוונן את ריכוז התאים ל-100,000 תאים/mL במצע גידול מלא.
      3. הכן נפח סופי של תרחיף של 1–2 mL.
        הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאים במעבר (passage) 5.
    3. זריעת תאים
      1. הזריק את תרחיף התאים אל פתח הכניסה של המיקרו-תעלה התחתונה.
      2. הפוך את המכשיר לאחר זריעת התאים
        הערה: היפוך המכשיר מקדם שקיעה של תאים לעבר פני השטח של הדנטין ומשפר את היצמדות התאים.
    4. דגירה
      1. הנח את המכשיר ההפוך בתוך צלחת פטרי.
      2. הוסף 1 mL מצע גידול לצלחת הפטרי כדי למזער אידוי.
      3. דגרי את המכשיר ב-37°C ו-5% CO2 למשך 24 h.
      4. שמור על תנאי תרבית סטטיים לאורך תקופת הדגירה.
        הערה: תיקוף זרימה דינמית לא בוצע במחקר הנוכחי.
        הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר תנאי תרבית סטטיים לצורך תיקוף ראשוני של המכשיר והערכת היצמדות תאים.
    5. תיקוף ראשוני של המכשיר
      1. הערך את היצמדות התאים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
      2. הוצא את דיסק הדנטין על ידי פירוק המכשיר לפני האנליזה.
  3. הכנת דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק
    1. הוצאת ושטיפת דגימות
      1. פרק את המכשיר לאחר 24 h של דגירה.
      2. הוצא את דיסק הדנטין והעבר אותו לצלחת תרבית או לצלחת פטרי.
      3. מקם את פני השטח של הדנטין שזריעו התאים כלפי מעלה.
      4. שטוף את דיסק הדנטין פעמיים באמצעות 1 mL PBS.
    2. קיבוע
      1. הוסף 2 mL של 2.5% glutaraldehyde בתוך 0.1 M Sorensen’s phosphate buffer.
      2. דגרי את הדגימה למשך 30 min ב-RT.
        זהירות: Glutaraldehyde הוא רעיל ועלול לגרום לגירוי של העור, העיניים ודרכי הנשימה. בצע את תהליכי הקיבוע בתוך מכסה מסיח כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. שטיפה לאחר קיבוע
      1. הסר את תמיסת ה-glutaraldehyde.
      2. שטוף את דיסק הדנטין שלוש פעמים במים מזוקקים אולטרה-טהורים ב-RT.
    4. אנליזת SEM
      1. נתח את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק סביבתי (ESEM).
      2. הפעל את המיקרוסקופ בתנאי ואקום נמוך (25 Pa).
      3. השתמש במתח האצה של 10.0 kV ובמרחק עבודה של 7.0 mm.
      4. רכוש תמונות באמצעות מצב גילוי תלת-ממדי של אלקטרונים מפוזרים לאחור (BSE-3D).
      5. צלם תמונות בהגדלה של ×200 (איור 2A).
  4. הערכת חיוניות תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. הכנת דגימות
      1. זרוע וגדל תאים כפי שמתואר בשלב 3.2.
      2. דגרי את המכשיר למשך 24 h ב-37°C ו-5% CO2.
      3. פרק את המכשיר וחשוף את פני השטח של הדנטין.
      4. העבר את דיסק הדנטין ללוחית בארות המכילה HBSS+/+ שחומם מראש והועשר ב-Ca2+ ו-Mg2+.
    2. שטיפת דגימות
      1. שטוף את דיסק הדנטין פעמיים ב-HBSS+/+.
      2. הסר שאריות סרום ו-phenol red לפני הצביעה.
        הערה: שאריות סרום ו-phenol red עלולות להגביר אוטופלורסצנציה של הרקע.
    3. צביעת תאים חיים
      1. הכן תמיסת עבודה טרייה של Calcein AM בריכוז 2 µM ב-HBSS+/+.
      2. הוסף כמות מספקת של תמיסת צביעה כדי לכסות לחלוטין את פני השטח של הדנטין.
      3. דגרי את הדגימה למשך 20 min ב-37°C בחשיכה.
      4. הסר את תמיסת הצביעה לאחר הדגירה.
    4. צביעת תאים מתים
      1. הוסף תמיסת עבודה של Propidium Iodide (1–2 µg/mL ב-HBSS+/+).
      2. דגרי את הדגימה למשך 5–8 min ב-37°C בחשיכה.
      3. אין לעבור 10 min של דגירה.
      4. שטוף את הדגימה פעמיים ב-HBSS+/+.
      5. שמור על הדגימה טבולה בבופר עד לצילום.
    5. רכישת תמונות במיקרוסקופיה קונפוקלית
      1. רכוש תמונות קונפוקליות בתוך 30 min מהצביעה.
      2. רכוש תמונות באופן רציף בערוצים הירוק והאדום.
      3. השתמש ב-λex 490 nm וב-λem 515 nm לצילום תאים חיים.
      4. השתמש ב-λex 535 nm וב-λem 617 nm לצילום תאים מתים.
        הערה: הגן על תמיסות צביעה פלואורסצנטיות ועל דגימות צבועות מחשיפה לאור במהלך תהליכי הדגירה והצילום (איור 2B).

השוואה בין מיקרוסקופיה אלקטרונית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתוח מבנה תאי.
איור 2: הערכה מייצגת של היצמדות וחיוניות של תאי גזע של מוך השן בתוך התקן OoC של קומפלקס הדנטין-מוך השן. (Aתמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק המראה תאי גזע של פולפה דנטלית (asterisk לבן) הדבקים לפני השטח של הדנטין לאחר 24 שעות של תרבית סטטית בתוך התקן ה-OoC. לאחר 24 שעות של תרבית, תאים הדבקים כיסו 54.35 ± 0.92% מפני השטח של הדנטין שנחשפו למיקרו-ערוץ. לא נצפו תאים באזור הדנטין המכוסה ב-PDMS (asterisk שחור), דבר המעיד על איטום יעיל בין שכבות ההתקן. סרגל קנה מידה = 200 µm. (B) תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית המראה תאי גזע של פולפה דנטלית חיים, הצבו בירוק והיצמדו לפני השטח של הדנטין (חצים לבנים) לאחר 24 שעות של תרבית סטטית. נצפים גם תאים שאינם חיים הצבו באדום (חצים כחולים). סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ייצור מוצלח של התקן השן-על-שבב (tooth-on-a-chip) בוצע בהתאם לזרימת העבודה המומחשת באיור 1A–1I, כולל הכנת דיסק דנטין (איור 1D), ייצור התבנית המבוססת על פוטוליתוגרפיה (איור 1E), הסרת שכבות PDMS מאושרות (איור 1F), הפעלת פלזמה לפני ההדבקה (איור 1G), הרכבת ההתקן הסופי (איור 1H), וחיבור ההתקן למערך המיקרופלואידיקה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור התקן שן-על-שבב (tooth-on-a-chip) בערימה אנכית, המשלב דנטין ותאי גזע של מוך השן, ומדגים היצמדות ותאימות תאים מייצגת בתוך ההתקן בתנאי תרבית סטטיים. הפרוטוקול פותח כדי לספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור לייצור ולהרכבה של פלטפורמת OoC למכלול דנטין-מוך, המתאימה למחקרי in vitro של ממשק הדנטין. ביסוס של זרימת עבודה כזו הוא משמעותי במיוחד כיוון שהסקירה הסיסטמטית האחרונה שלנו הדגישה כי תחום המודלים המיקרופלואידיים למכלול דנטין-מוך נמצא עדיין בשלב ראשוני, המאופיין בהטרוגניות מתודולוגית גבוהה בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים ואין להם קונפליקטים של אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט DIM24-0004 ופרויקט PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; מענק FONDECYT Regular מס' 1260116; ומענק FONDECYT de Iniciación מס' 11230701, הסוכנות הלאומית למחקר ופיתוח (ANID), צ'ילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים ביולוגיים וכימיים
אצטוןExpertQSOLV 8ניקוי פרוסות סיליקון
תוכית גידול Alpha MEMCytivaSH30265.02תווך תרבית לתאי גזע של מוך השן
כלורמין (0.5%)Merck7080-50-4תמיסת אחסון עבור דיסקי דנטין
תאי גזע של מוך השןלא רלוונטילא רלוונטיתרבית תאים ראשונית. ראו שלבים 3.2.1 ו-3.2.2
EDTA (10%)וינקלרN2222158Eהסרת שכבת הסימוב (Smear layer)
פוטו-רזיסט שלילי מבוסס אפוקסיGersteltecGM1060ייצור תבניות באמצעות פוטוליתוגרפיה
גלוטראלדהיד (2.5%) ב-0.1 M Sorensen’בופר פוספטSigma-Aldrich210908-06קיבוע ל-SEM
שיניים אנושיות בריאות (טחונות או טחונות קטנות)לא רלוונטילא רלוונטידגימה אנושית
איזופרופנולExpertQSOLV 16ניקוי פרוסות סיליקון (Wafer), עצירת פיתוח וניקוי PDMS
ערכה לבדיקת חיוניות LIVE/DEADSigma-Aldrich451צביעת חיות פלואורסצנטית. 
PBS (סליין מתוחם פוספט)Corning46-013-CMשטיפה ובדיקת דליפה
בסיס PDMS וחומר מקשה (פולידימטילסילוקסאן)דאוSylgard 184ייצור התקן
PGMEASigma Aldrich484431פיתוח פוטורזיסט
טריפאן בלו (Trypan blue)Sigma Aldrich T8154-100מ"להערכת חיות תאים
טריפסיןCorning25-053-CIהסרת תאים
מים בדרגת טוהר גבוהה במיוחד (Ultrapure water)CytivaSH30529.01תמיסת שטיפה
<חזק>חומרים מתכלים וכלים למעבדה
מחטי מזרק 19GVmaticVCB19050חיבור המכשיר למשאבה מיקרוסקופית או למזרק
מנקח ביופסיה (קוטר: 1 ממ")Harris UnicoreWHAWB100073ייצור פתחי כניסה ויציאה
משטח חיתוךNicecoolלא רלוונטיהגנה על השטח במהלך ניקוב
דיסקי גימור דנטליים (למשל, Sof-Lex)3MSof-Lexהברקת דנטין
מתאמי Luer נקבה למחבר משונןRunze FluidicsRH-M016חיבור צינורות
מקל ערבוב מזכוכית או מפלסטיקדוראןלא רלוונטיערבוב PDMS
מזרקים תת-עורייםחמנילן (Cranberry)pc-12246זריעת תאים ובדיקת דליפה
גזה סטרילית נטולת סיביםלינדרסוןלא רלוונטיהסרת שאריות ניקוב
מתאמי לוּאֶר (Luer) זכריםRunze FluidicsRH-G016חיבור צינורות
כלי ערבובדוראןלא רלוונטיהכנת PDMS
צלחת פטרי (140 מ"מ) × 20 מ"מ)Deltalab2000219תרבית תאים/אינקובציה
בסיס פוליטטרהפלואורואתילןCCTValלא רלוונטיייצור שכבת דנטין בינונית
פרוסת סיליקוןJiaozuo Commercial FineWinלא רלוונטיייצור תבניות
צינור סיליקוןRunze Fluidics96421חיבור פלואידי
בקבוק תרבית T75Corning 353136הרחבת תאי גזע של פולפה דנטלית
פלטת בארותSPL Life Sciences30006הכנה לצביעה ודימות קונפוקליים
<חזק>ציוד ומכשירים
מייבש אווירMETALPLANTITAN-040ייבוש אוויר דחוס
מקור אוויר דחוסשולץCSD-18.1ניקוי עובש וניקוי משטחים
מיקרוסקופ קונפוקליOlympusלא רלוונטידגם: FV1000
מערכת ליתוגרפיה בלייזר ישירHeidelberguPG 101חשיפת פוטורזיסט
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק סביבתיHitachiלא רלוונטידגם: Quanta 400 
קוצב יד במהירות גבוההנקנישילא רלוונטידגם: Pana-max2
פלטה מחממתLabTechEH20A Plusאפיית פרוסה ואפיית פוטו-רזיסט
מ ihūנית זרימה למינריתBioBaseBBS8V1708313Dסטריליזציה של מכשירים
משאבה מיקרופלואידיתעידן חדשלא רלוונטידגם: 1002X-ES. בדיקת דליפה ב-10 µליטר/דקה
תבנית בעלת מיקרו-מבנה (שיוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה)CCTValלא רלוונטיראה שלב 2.2 למפרטי ייצור התבנית
תנור או אינקובטורMemmertUN110הקשחת PDMS ב-50 מעלות°גיבוש פחמן וקשרים ב-75°C
תא ניקוי בפלסמה בוואקוםפלזמת פאריGD-5הפעלה בפלזמה של פרוסות סיליקון (Wafer)
פלזמת קורונה נישאת Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACהפעלה של PDMS באמצעות פלזמה
מכשיר אולטרסוניקטורElma SonicS 10 (H)ניקוי פרוסות סיליקון (Wafer cleaning)
תא ואקום או דסיקטור (250 מ"מ)ווינגלאסלא רלוונטיניקוך אוויר מ-PDMS
משאבת ואקוםמנער (Rocker)300ניקוי בועות אוויר מ-PDMS (degassing)

מקורות

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDMS

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.