מאמר שיטה

בניית התקן "איבר על שבב" (Organ-on-a-Chip) של קומפלקס דנטין-מוך במבנה של שכבות אנכיות באמצעות דיסקת דנטין אנושית

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתיאור הייצור וההרכבה של התקן "איבר-על-שבב" (organ-on-a-chip) של קומפלקס דנטין-מוך המונח במבנה אנכי, המשלב דיסקת דנטין אנושית ומיקרו-תעלות שיוצרו באמצעות פוטוליתוגרפיה, ובהמשך לכך זריעה ותרבית של תאי גזע ממוך השן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים פרה-קליניים קונבנציונליים המשמשים במחקר דנטלי, כולל מודלים של בעלי חיים ותרביות תאים סטטיות, מציגים מגבלות משמעותיות בשחזור התנאים הפיזיולוגיים של הממשק בין הדנטין למוך השן ובניבוי תגובות ביולוגיות אנושיות לחומרים ביו-דנטליים. טכנולוגיית איבר-על-שבב (OoC) מספקת גישה חלופית על ידי מתן אפשרות לשחזור של מיקרו-סביבות ספציפיות לרקמה בתוך מערכות מיקרו-פלואידיות מבוקרות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור ולהרכבה של התקן OoC של קומפלקס דנטין-מוך השן, המשלב דיסקת דנטין אנושית בתוך פלטפורמה מיקרו-פלואידית של פולידימטילסילוקסן (PDMS) בעלת שלוש שכבות. הפרוטוקול כולל הכנה של דיסקת דנטין, ייצור תבניות בעלות מיקרו-מבנה באמצעות פוטוליתוגרפיה, יציקה ואשפרה של PDMS, חיבור שכבות בסיוע פלזמה, הרכבת ההתקן, בדיקת נזילות, והזריעה של תאי גזע ממוך השן תחת תנאי תרבית סטטיים. נדונים פרמטרי ייצור קריטיים המשפיעים על ביצועי ההתקן, כולל בקרת עובי שכבת ה-PDMS, טיפול פלזמה במשטח, ושילוב דיסקת הדנטין בתוך ההתקן כדי למזער נזילות. היצמדות התאים וחיוניותם בתוך ההתקן הוערכו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק וצביעת חי/מת קונפוקלית. תוצאות מייצגות מדגימות שילוב מוצלח של דיסקת הדנטין בתוך המכלול המיקרו-פלואידי, שמירה על תנאים ללא נזילה, והיצמדות של תאי גזע חיוניים ממוך השן לפני השטח של הדנטין. פרוטוקול זה מספק גישה הניתנת לשחזור לייצור פלטפורמת OoC של קומפלקס דנטין-מוך השן, שעשויה לתמוך במחקרים עתידיים הבוחנים תגובות תאיות לחומרים ביו-דנטליים ולגירויים מיקרו-סביבתיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים הם כבר זמן רב כלי מרכזי לקידום ההבנה של תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים, ומילאו תפקיד מרכזי בשלבים המוקדמים של פיתוח תרופות1. במהלך המאה ה-20, תוחלת החיים של בני האדם עלתה באופן משמעותי, ואף שאינו ניתן לכמת במדויק את המידה שבה שיפור זה מיוחס למחקר בבעלי חיים בלבד, מקובל להכיר בכך שטיפולים רפואיים עכשוויים רבים פותחו או תוקפו באמצעות מודלים של בעלי חיים2. דוגמאות בולטות כוללות את פיתוח החיסונים נגד פוליו, חסרה והפטיטיס B, הערכת הבטיחות והיעילות של פניצילין, וייצור אינסולין. בתחום המחקר של חומרי דנטליים וביומטריאליים, מודלים אלו היו קריטיים לחקר תהליך העששת, הביולוגיה וההתחדשות של קומפלקס הדנטין-מוך, והפיזי פתולוגיה של רקמות הפריודונטום3,4.

למרות השימוש הנרחב במתודולוגיות אלו, צינור הפיתוח הנוכחי של תרופות ממשיך להפגין שיעורי כישלון גבוהים, כאשר מועמדים רבים לתרופות נכשלים במהלך ניסויים קליניים למרות שהפגינו יעילות ובטיחות במסגרות מעבדה פרה-קליניות ובמודלים של בעלי חיים5. פער זה נקשר להבדלים בין-מיניים שעשויים להגביל את יכולת הניבוי התרגומית (translational predictability) של מודלים בבעלי חיים עקב הבדלים אנטומיים, גנטיים ופיזיולוגיים בין המינים6. בנוסף, פיתוחם של גישות טיפוליות חדשות נותר תהליך הגוזל זמן רב ועלויות גבוהות7. יתרה מכך, מודלים קונבנציונליים in vitro משתמשים בעיקר בתרביות מונושכבה דו-ממדיות (2D) פשוטות על מצעי פלסטיק שאינם פיזיולוגיים, ובכך אינם מצליחים לשחזר את הרמזים הביוכימיים והפיזיים, את האינטראקציות בין תאים ואת האותות של המטריצה החוץ-תאית (ECM) הקיימים בחלל הפה האנושי8,9. למרות שמודלים דו-ממדיים מציעים יתרונות ניסיוניים מסוימים, הם אינם מסוגלים מטבעם לשחזר את האינטראקציות המורכבות המתרחשות בין מספר רכיבים בו-זמנית, כגון ביופילמים, ביו-חומרים, דנטין ותאי פולפה10. כתוצאה מכך, קיים עניין גובר בפיתוח פלטפורמות ניסיוניות חלופיות המסוגלות לשחזר בצורה מדויקת יותר תגובות ביולוגיות אנושיות. בשנת 2022, חוק ה-FDA Modernization Act 2.0 הסיר את הדרישה המחייבת לבדיקות בבעלי חיים בתהליך אישור תרופות והכיר בשימוש פוטנציאלי בפלטפורמות חלופיות, כולל טכנולוגיות של איבר-על-שבב (OoC), במחקר פרה-קליני11.

איבר על שבב (OoC) הוא התקן מיקרופלואידי שנועד לשחזר את המבנה, התפקוד והמיקרו-סביבה של איבר ספציפי או רכיב רקמתי12. התקנים אלו מאוכלסים בתאים ורקמות חיים המגודלים בתוך מיקרו-תעלות הנדסיות המשחזרות היבטים מרכזיים של המיקרו-סביבה הפיזיולוגית אליה התאים חשופים באופן טבעי. מעבר לחיקוי מבני, המיקרו-תעלות מאפשרות בקרה ספציו-טמפורלית על הסביבה התאית ותומכות בשימור תפקודי רקמה ספציפיים, ובכך מספקות תנאים ניסיוניים שעשויים לדמות באופן הדוק יותר את הפיזיולוגיה in vivo מאשר מערכות תרבית קונבנציונליות12. רלוונטי במיוחד הוא העובדה שמיקרו-תעלות בהתקני OoC מקלות על זרימה מבוקרת של תוצר תרבית, המפעילה מאמץ גזירה (shear stress) על התאים השוכנים בהן13. גירויים מכניים אלו משפיעים על תגובות תאיות הכוללות היצמדות, פרוליפרציה, נדידה, ביטוי גנים ואינטראקציות בין-תאיות14,15. בנוסף, זרימה רציפה של התוצר תורמת לשימור המיקרו-סביבה באמצעות אספקת חומרי הזנה ופינוי תוצרי פסולת מטבוליים16. יתרה מכך, בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות, דווח כי חלק מפלטפורמות ה-OoC תומכות בבקרה משופרת של מדדי סטרס חמצוני, כולל מיני חמצן ריאקטיביים תוך-תאיים וחיוניות תאים, במודלים תלת-ממדיים (3D) על שבב17. לפיכך, מערכות OoC התגלו כפלטפורמות מבטיחות לחקר פיזיולוגיה של רקמות, אינטראקציות של חומרי ביו-מטריאל ותהליכי מחלה תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים18. במחקר דנטלי, טכנולוגיית OoC יושמה באופן הדרגתי למידול ממשקי רקמות חלל פה מורכבים יותר ויותר19. פלטפורמות מוקדמות של "שן על שבב" חיקו את הממשק שבין הביו-מטריאל, הדנטין והמוך20, בעוד שגרסאות מתקדמות יותר שולבו מאז עם כלי דם ועצבוב טריגמינלי כדי לשחזר באופן נאמן יותר את המורכבות המבנית והתפקודית של קומפלקס המוך-דנטין21. מעבר למוך, מודלים תלת-ממדיים של תעלות שורש לא בשלות אפשרו הערכה של חומרי שטיפה אנדודונטיים ונביטה אנגיוגנית של תאי גזע מהפפילה האפיקלית22,23. ברמה הפריודונטלית, פלטפורמות של "חניכיים על שבב" שימשו לחקר אינטראקציות מאחסן-מיקרוב ולהערכת הפוטנציאל האימונו-מודולטורי של פרוביוטיקה כסוכנים טיפוליים24, בעוד שהתקני "רצועה פריודונטלית על שבב" הדגימו כיצד זרימה של נוזל בינאי מודולית את היווצרות הרשת הווסקולרית ואת הדיפרנציאציה האוסטאוגנית של ספרואידים של תאי גזע מהרצועה הפריודונטלית25,26. כהשלמה למודלים אלו, מערכות ייעודיות של "רירית הפה על שבב" ו"שתל דנטלי על שבב" הרחיבו עוד יותר את היקף המחקר המיקרופלואידי הדנטלי על ידי אפיון אינטראקציות מאחסן-חומר והציטוטוקסיות של מונומרים דנטליים תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית27,28.

בעוד שמערכות OoC יושמו יותר ויותר במחקרים דנטליים, אוראליים וקרניו-פציאליים, מאמצים מתמשכים להשגת סטנדרטיזציה ושחזוריות של תהליכי הייצור נותרים חשובים. מספר מודלים של tooth-on-a-chip דווחו בספרות20,29,30,31, והם מדגימים תצורות מכשיר שונות ויישומים ניסיוניים שונים. עם זאת, הבדלים בארכיטקטורת המכשיר, בשיטות הייצור, בשילוב הדנטין ובדיווח על פרמטרים ניסיוניים עלולים להגביל את השחזוריות ואת ההשוואה הישירה בין מחקרים. בפרט, הבדלים בגיאומטריית המיקרו-ערוצים, באסטרטגיות שילוב הדנטין ובגישות הייצור עשויים להשפיע על המיקרו-סביבה הביולוגית והמכנית בתוך המכשיר. חלק מהמודלים שדווחו משלבים דנטין כדי לשחזר היבטים של הממשק בין הדנטין לפולפה20,29,30, בעוד שאחרים משתמשים בתצורות חלופיות31. בנוסף, שיטות ייצור כגון פוטוליתוגרפיה, חיתוך בלייזר, מיקרו-כרסום והדפסה בתלת-ממד מציגות כל אחת יתרונות ומגבלות ספציפיים, בהתאם לתכנון המכשיר וליישום המיועד. יתרה מכך, גורם קריטי לתועלת הביולוגית הוא האוריינטציה הארכיטקטונית של המכשיר, ובייחוד השאלה האם הערוצים ופרוסת הדנטין מסודרים בתצורה אופקית או אנכית19,32. בתצורות עם שכבות אופקיות, תאים המסודרים זה לצד זה מאפשרים מדוריות לטרלית וויזואליזציה של תאים בזמן אמת, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד למידול רקמות בעלות ארגון מרחבי לטרלי מולד, כגון הקומפלקס הפריודונטלי24,32. עם זאת, תכנון זה מוגבל מטבעו ביכולתו לשחזר ממשקים ביולוגיים ניצביים, כגון קומפלקס הביומטריאל-דנטין-פולפה, שכן הסידור הלטרלי של התאים אינו משחזר נאמנה את האוריינטציה in vivo של מחסום הדנטין בין החלל לפולפה20,32. תצורות עם שכבות אנכיות נותנות מענה למגבלות אלו על ידי הצבת שני תאים זה מעל זה לאורך ציר ה-y, המופרדים על ידי פרוסת דנטין טבעית, מה שמאפשר כימות סימולטני של הובלה מולקולרית דרך דנטין שלם וניטור בזמן אמת של תגובות תאי פולפה הנמדדות במדיום המוצא30. עם זאת, מגבלה ידועה של אוריינטציה זו נוגעת לדימוי חתך של ממשק הדנטין-תא, שכן השגת תמונות חתך של ממשק הדנטין-תא בתוך אותו מישור מוקד נותרת מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר בתצורות עם שכבות אופקיות, שבהן התאים ומטריצות חוץ-תאיות מסודרים לטרלית. למרות שבספרות דווחו מודלים מרובים של קומפלקס דנטין-פולפה on-a-chip, הרוב מאמצים תצורה של שכבות אופקיות שבה התאים מסודרים זה לצד זה בתוך אותו מישור10,20,21,29, בעוד שרק מעטים שילבו פרוסת דנטין טבעית בתוך תצורה של שכבות אנכיות30. למרות זאת, הבדלים בגישות הייצור ובפרמטרי הדיווח בין מודלים אלו ממשיכים להגביל את השחזוריות ואת ההשוואות בין מחקרים33. המאמר הנוכחי שואף לשפר את השחזוריות המתודולוגית על ידי אספקת פרוטוקול ייצור מפורט עבור מכשיר tooth-on-a-chip בעל שכבות אנכיות, ובכך להקל על אימוץ רחב יותר של הפלטפורמה בקהילת המחקר הדנטלית.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור והרכבה של התקן OoC של קומפלקס דנטין-מוך המונח בערימה אנכית, המשלב דיסק דנטין אנושי בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית תלת-שכבתית מ-polydimethylsiloxane (PDMS) שיוצרה באמצעות תבנית המיוצרת בפוטוליתוגרפיה. הפרוטוקול מתאר בנוסף זריעה ותרבית של תאי גזע של מוך השן בתוך ההתקן בתנאים סטטיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של Universidad de La Frontera למחקרים הכוללים דגימות אנושיות.

1. השגת דיסקת דנטין

הערה: הכינו את תכנון המכשיר לפני תחילת הפרוטוקול (איור 1A–1C).

  1. איסוף ואחסון שיניים
    1. אסוף שיניים טחונות (molars) או שיניים קטנות (premolars) בריאות של בני אדם לאחר קבלת הסכמה מושכלת מהמטופל.
    2. שמור את כל הדגימות בתמיסת כלוראמין 0.5% בטמפרטורה של 4°C כדי למנוע התייבשות של הדנטין ודנטורציה של חלבונים.
    3. החלף את תמיסת הכלוראמין פעם בשבוע במהלך האחסון.
  2. הכנת דיסקיות דנטין
    1. בצע חיתוך אופקי של כל שן בשליש האמצעי של הכתר באמצעות ידית מהירה (high-speed handpiece) הפועלת במהירות של 350,000 rpm ומצוידת במקדח יהלום צילינדרי (קוטר 1 mm; גודל גרגר 100–150 µm).
    2. בצע את החיתוך תחת השקיה רציפה של מים בקצב של כ-50 mL/min.
    3. מקם את החיתוך בשליש האמצעי של הכתר כדי להימנע מתא הפולפה (pulp chamber) ומהזגגית (enamel) הנמצאת בחריצים ובשקעים האוקלוזליים, ובכך להשיג דיסקית המורכבת בעיקר מרקמת דנטין.
      זהירות: בצע את חיתוך השן תחת השקיה רציפה והשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מסכה ומשקפי מגן.
  3. גימור של דיסקיות הדנטין
    1. לטש את דיסקית הדנטין באמצעות דיסקיות גימור עם גודל גרגר יורד באופן רציף.
    2. המשך בליטוש עד להשגת עובי דנטין סופי של כ-0.8 mm (±± 0.3 mm) וממדים צדיים של כ-5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm) (איור 1D).
  4. אחסון של דיסקיות הדנטין
    1. אחסן את דיסקיות הדנטין המוכנות בתמיסת כלוראמין 0.5% בטמפרטורה של 4°C עד להרכבת מכשיר ה-OoC.

figure-protocol-1
איור 1: תזרים התכנון והייצור של התקן איבר-על-שבב (OoC) של קומפלקס הדנטין-מוך השן. (A) תכנון תלת-ממדי של ההתקן המציג את ארכיטקטורת שלוש השכבות. (B) מבט עליון על תכנון ההתקן עם הממדים העיקריים. (C) מבט צדדי של תצורת שלוש השכבות של ההתקן. (D) דיסקת דנטין מייצגת שהוכנה בעובי מקורב של 0.8 mm וממדים צדיים של כ-5 mm × 5 mm. (E) תבנית מאסטר מסיליקון שיוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה ושימשה ליציקת שכבות ה-polydimethylsiloxane (PDMS) העליונות והתחתונות. (F) הסרה של שכבת PDMS מתושבבת מהתבנית הסיליקונית לאחר פולימריזציה תרמית. (G) טיפול בפלסמה של פני השטח של ה-PDMS לפני הדבקת השכבות. (H) התקן OoC סופי של קומפלקס דנטין-מוך השן בעל שלוש שכבות, שהורכב על ידי הדבקת פלסמה ושילוב של ממשק הדנטין. (I) התקן מורכב המחובר לצינוריות לצורך בדיקת דליפות והכנה לניסויי מיקרופלואידקה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

2. ייצור התקן OoC של קומפלקס הדנטין-מוך

  1. הכנת סביבת העבודה והחומרים
    1. הכנת חומרים וציוד
      1. הכינו את כל החומרים והציוד המפורטים בטבלת החומרים לפני תחילת ייצור ההתקן.
      2. הכינו את מחלצי הביופסיה (biopsy punches) לפני הרכבת ההתקן.
      3. בצעו את כל הליכי הייצור בסביבה נקייה וללא אבק.
      4. ענדו כפפות, משקפי מגן וציוד מגן אישי מתאים לאורך כל תהליך הייצור וההרכבה של ההתקן.
        הערה: הכינו את התבנית המיוצרת בפוטוליתוגרפיה לפני תחילת הפרוטוקול (איור 1E).
  2. ייצור התבנית בעלת המבנה המיקרוסקופי
    1. הכנת פרוסת הסיליקון
      1. ייצרו את התבנית על פרוסת סיליקון של 4 אינץ', מלוטשת בצד אחד (N-type, As-doped, שיטת גידול CZ, אוריינטציה <100>, עובי 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, התנגדות סגולית 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. נקו את הפרוסה באופן רצף באצטון, איסופרופנול ומים אולטרא-טהורים למשך 10 דקות כל אחד תחת טיפול באולטרסוניקציה.
      3. ייבשו את הפרוסה באמצעות אוויר דחוס.
      4. חממו את הפרוסה ב-200°C למשך 10 דקות על פלטה חמה כדי להסיר לחות שיורית.
      5. המתינו לקירור הפרוסה לטמפרטורת החדר (RT; 20°C–25°C).
    2. הפעלת פני השטח וציפוי פוטו-רזיסט
      1. הפעילו את פני השטח של פרוסת הסיליקון באמצעות מנקה פלזמה בוואקום המופעל עם פלזמת אוויר ברמה 7 למשך 120 s.
      2. מרחו פוטו-רזיסט שלילי מבוסס אפוקסי מסוג GM 1060 בשיטת spin coating במהירות של 300 rpm למשך 10 s.
      3. המשיכו ב-spin coating במהירות של 565 rpm למשך 100 s ו-965 rpm למשך 1 s תוך שימוש בהאצה של 200 rpm/s.
      4. הניחו לפרוסה המצופה לנוח במשך 10 דקות.
      5. בצעו אפייה מקדימה (pre-bake) ב-65°C למשך 10 דקות.
      6. המשיכו באפייה המקדימה ב-95°C למשך שעה אחת.
      7. המתינו לקירור הפרוסה ל-RT.
    3. חשיפה ופיתוח
      1. חשפו את הפוטו-רזיסט באמצעות מערכת ליתוגרפיה ישירה בלייזר במינון של 1,950 mJ/cm2.
      2. בצעו אפייה לאחר החשיפה (post-bake) ב-65°C למשך 10 דקות.
      3. המשיכו באפייה לאחר החשיפה ב-95°C למשך 30 דקות.
      4. המתינו לקירור הפרוסה ל-RT.
      5. הניחו לפרוסה לנוח במשך 10 דקות.
      6. פתחו את התבנית ב-PGMEA למשך 4 דקות.
      7. האריכו את זמן הפיתוח במרווחים של 30 s אם נותר פוטו-רזיסט שיורי.
      8. עצרו את הפיתוח על ידי שטיפה באיסופרופנול.
      9. ייבשו את הפרוסה באמצעות אוויר דחוס.
    4. אפייה סופית (Hard bake)
      1. בצעו אפייה סופית ב-135°C למשך שעתיים.
      2. השיגו תבנית מאסטר בעלת מבנה מיקרוסקופי המכילה מיקרו-ערוצים ברוחב 1 mm ובגובה 50 µm.
  3. הכנה וניקוון של תערובת ה-PDMS
    1. הכנת תערובת ה-PDMS
      1. ערבבו את בסיס ה-PDMS וחומר ההקשיה ביחס משקלי של 10:1.
      2. ערבבו את התערובת ידנית בעזרת מוט זכוכית בכלי פלסטיק למשך כ-5 דקות.
      3. שמרו על תנועות סיבוביות איטיות ורציפות במהלך הערבוב.
        הערה: הימנעו מהכנסת בועות אוויר במהלך הערבוב.
    2. ניקוון (Degassing)
      1. הניחו את תערובת ה-PDMS בדסיקטור ואקום המחובר למשאבת ואקום.
      2. נקו את התערובת בלחץ של כ-700 mmHg למשך 5 דקות.
      3. שחררו את הוואקום לזמן קצר כדי לאפשר לבועות השטח להתפוצץ.
      4. הפעילו שוב את הוואקום.
      5. חזרו על המחזור עד שלא יישארו בועות נראות לעין.
        הערה: זמן הניקוון הכולל הוא בדרך כלל כ-30 דקות.
  4. יציקת PDMS על התבנית
    1. הכנת התבנית
      1. הניחו את התבנית על משטח שטוח.
      2. נקו את התבנית באמצעות אוויר דחוס.
      3. הימנעו ממגע ישיר עם המשטח המובנה.
      4. וודאו שהתבנית נקייה מאבק וממזהמים.
    2. מזיגת PDMS
      1. מזגו כ-8 g של PDMS מסביב לדיסק הדנטין כדי לייצר את שכבת ההטמעה של הדנטין.
      2. כווןנו את גובה ה-PDMS כך שיתאים לעובי דיסק הדנטין (0.8 ±± 0.3 mm).
      3. מנעו מה-PDMS לכסות את פני השטח של הדנטין.
      4. מזגו כ-0.26 g של PDMS לכל יחידת תבנית כדי לייצר כל שכבת מיקרו-ערוץ.
      5. הקישו בעדינות על התבנית או הפעילו רטט כדי להקל על מילוי המבנים המיקרוסקופיים.
      6. הניחו ל-PDMS להתמקם בתוך הפרטים הקטנים ביותר.
      7. כסו את התבנית באמצעות מכסה או כיסוי שטוח מבלי לגעת במשטח ה-PDMS.
        הערה: שכבת ההטמעה של הדנטין היא בעובי של כ-0.8 mm, וכל שכבת מיקרו-ערוץ היא בעובי של כ-0.4 mm, מה שנותן עובי כולל של ההתקן של כ-1.6 mm.
        הערה: התאימו את עובי השכבות בהתאם למרחק העבודה של העדשה הקונפוקלית כאשר מתוכננת הדמיה קונפוקלית.
  5. הקשיה
    1. הניחו את התבניות בתנור ב-50°C.
    2. הקשיחו את ה-PDMS למשך 4 שעות.
  6. הסרת שכבות ה-PDMS
    1. הסרת PDMS שהקשיח
      1. קלפו בזהירות את שכבות ה-PDMS שהקשיחו מהתבנית (איור 1F).
      2. טפלו בשכבות ה-PDMS בזהירות כדי למנוע פגיעה במבנים המיקרוסקופיים.
  7. הדבקת שכבות ה-PDMS וייצור פתחי כניסה ויציאה
    1. ייצור פתחי כניסה ויציאה
      1. צרו נקבים במיקומי הכניסה והיציאה המיועדים באמצעות מחלץ ביופסיה של 1 mm.
      2. מכמו את צד המיקרו-ערוץ כלפי מעלה במהלך הנקיבה.
        הערה: הניחו את שכבת ה-PDMS על משטח חיתוך כדי למנוע נזק מבני.
      3. צרו שני נקבים בשכבה העליונה התואמים למיקרו-ערוץ העליון.
    2. ניקוי שכבות ה-PDMS
      1. נקו את שכבות ה-PDMS באמצעות איסופרופיל אלכוהול או אתנול.
      2. הסירו חלקיקי אבק שיוריים באמצעות סרט דביק סטרילי.
      3. וודאו שכל משטחי ההדבקה נקיים ממזהמים לפני ההרכבה.
    3. הפעלת פלזמה של משטחי PDMS
      1. מכמו את שכבות ה-PDMS העליונה והאמצעית לטיפול בפלזמה (איור 1G).
      2. הפעילו את המשטחים באמצעות מטפל פלזמת קורונה ידני הפועל בכ-25 W עם אוויר סביבתי כגז עבודה.
      3. שמרו על מרחק עבודה של כ-1 mm בין מקור הפלזמה למשטח ה-PDMS.
        זהירות: בצעו את הטיפול בפלזמה תחת אוורור מתאים והימנעו מחשיפה ישירה לאוזון הנוצר מהפלזמה.
      4. הפעילו את מכשיר הטיפול בפלזמה והמתינו להתייצבות למשך 5 s.
      5. וודאו יצירה של קרן פלזמה אחידה לפני הטיפול.
      6. טפלו בשכבת ה-PDMS העליונה למשך 10 s תוך שימוש בתנועה רציפה קדימה ואחורה במהירות של כ-5 mm/s.
      7. טפלו בשכבת ה-PDMS האמצעית למשך 10 s תוך שימוש באותה תנועה ומרחק.
      8. בצעו טיפול פלזמה נוסף של 1 s לשכבה העליונה מיד לפני ההדבקה.
    4. הדבקת השכבות העליונה והאמצעית
      1. יישרו את המיקרו-ערוץ העליון עם דיסק הדנטין מיד לאחר הטיפול בפלזמה.
      2. הדביקו את השכבה העליונה והאמצעית יחד.
      3. הניחו את המכלול המודבק בתנור ב-75°C למשך 5 דקות.
      4. בססו את ההדבקה במהלך האינקובציה.
        הערה: דיסק הדנטין והמיקרו-ערוץ נראים לעין וניתן ליישראם ללא כלי יישור נוספים.
    5. ייצור פתחי מיקרו-ערוץ תחתון
      1. נקבו שני נקבים התואמים למיקרו-ערוץ התחתון דרך השכבות העליונה והאמצעית המודבקות.
      2. בצעו את הנקיבה דרך שתי השכבות בו-זמנית כדי להבטיח יישור.
        הערה: הליך זה יוצר ארבעה נקבים בשכבה העליונה ושני נקבים בשכבה האמצעית.
      3. הניחו את המכלול המודבק על משטח חיתוך יציב לפני הנקיבה.
      4. הפעילו לחץ יורד קבוע בתנועה אחת.
        הערה: הימנעו מכוחות סיבוביים או צדיים כדי למזער את הסיכון להיפרדות שכבות (delamination).
      5. הסירו שאריות מאתרי הנקיבה באמצעות גזה סטרילית ללא סיבים המלהבת באיסופרופיל אלכוהול.
      6. בדקו את הנקבים ואת האזורים המודבקים סביבם תחת תאורה נאותה.
      7. וודאו שאין היפרדות שכבות, קרעים או נקבים חלקיים לפני ההמשך.
    6. הדבקת השכבה התחתונה
      1. בצעו טיפול בפלזמה לשכבה התחתונה כפי שמתואר בשלב 2.7.4.
      2. יישרו את פתחי הכניסה והיציאה של המיקרו-ערוץ התחתון עם הנקבים בשכבות העליונה והאמצעית.
      3. הדביקו את השכבה התחתונה כדי להשלים את הרכבת ההתקן.
        הערה: סמנו את מיקומי הכניסה והיציאה על המשטח החיצוני של השכבה התחתונה לפני ההדבקה כדי להקל על היישור.
        הערה: תאי פלזמה עשויים לספק הדבקה חזקה יותר מאשר עטי פלזמה, כפי שדווח בספרות36.
        הערה: ההתקן המושלם מורכב מפלטפורמה מיקרופלואידית תלת-שכבתית המשלבת ממשק דנטין (איור 1H). משטח הדנטין התחתון מייצג את צד המוח (pulp side) של המודל, בעוד שמשטח הדנטין העליון מייצג את הצד הכתר (coronal side) לחשיפה לחומרים ביו-דנטליים או לתכשירים בקטריאליים.
  8. בדיקת דליפות של ההתקן המיקרופלואידי
    1. בדיקה של ההתקן המורכב
      1. בדקו את ההתקן המורכב לאיתור חוסר יישור.
      2. בדקו את ההרכבה לאיתור הדבקה חלקית ודליפות נראות.
    2. בדיקת דליפות
      1. חברו מחטי Luer-lock של 19G לפתחי הכניסה (איור 1E).
      2. חברו את המחטים לצינורות של משאבה מיקרופלואידית.
      3. לחצו בעדינות את בסיסי המחטים אל תוך הנקבים כדי להשיג אטימה לאוויר.
      4. הזריקו PBS סטרילי או תוציר תרבית בקצב זרימה של 10 µL/min.
      5. שמרו על זרימת נוזלים למשך 5 דקות לפחות.
      6. בדקו את כל ממשקי ההדבקה, שולי הערוצים וגבולות דיסק הדנטין במהלך הזרימה.
      7. צפו בהתקן תחת תאורה נאותה במהלך ואחרי ההזרקה.
      8. וודאו שאין הצטברות של נוזלים, רטיבות או היווצרות טיפות.
      9. סנפו את ההתקן כנטול דליפות אם לא זוהתה דליפה.
      10. השליכו התקנים המראים דליפות.
        הערה: בצעו בדיקת דליפות בכל התקן שיוצר לפני זריעת תאים או שימוש ניסויי.
  9. סטריליזציה ואחסון של ההתקן המיקרופלואידי
    1. סטריליזציה
      1. חשפו את המשטח העליון של ההתקן המורכב לאור UV (ב-254 nm) למשך 30 דקות בתוך ארון זרימה למינרית.
      2. חשפו את המשטח התחתון לאור UV למשך 30 דקות נוספות.
      3. שטפו את המיקרו-ערוצים באתנול 70% למשך 20 דקות.
      4. שטפו את המיקרו-ערוצים שלוש פעמים ב-PBS סטרילי כדי להסיר אתנול שיורי.
    2. אחסון
      1. השתמשו בהתקן הסטרילי מיד לניסויי תרביות תאים.
      2. לחלופין, אחסנו את ההתקן טבול ב-PBS סטרילי ב-4°C בתוך מכל סטרילי עד לשימוש.
        ​זהירות: אין להשתמש בכלוראמין או בתמיסות חיטוי אחרות לאחר הרכבת ההתקן, מכיוון ש-PDMS עלול לספוג תרכובות אלו ולפגוע בחיוניות התאים.

3. הערכת היצמדות וחיוניות של תאי גזע מפולפה השן

  1. הכנה מוקדמת של פני השטח של הדנטין
    1. הזריק 10% EDTA לתוך המכשיר.
    2. שמור על מגע בין תמיסת ה-EDTA לפני השטח של הדנטין למשך 15 min.
    3. הזריק 0.5 mL EDTA בכל 3 min כדי לשמור על תנועת נוזלים בתוך המיקרו-תעלה.
    4. שטוף את דיסק הדנטין שלוש פעמים במים אולטרה-טהורים.
    5. שמור על כל שטיפה למשך 5 min.
      הערה: טיפול ב-EDTA מסיר את שכבת הסימיר (smear layer) וחושף חלבוני מטריקס של הדנטין.
      זהירות: טפל בתמיסות EDTA תוך שימוש בכפפות ובמשקפי מגן כדי למנוע גירוי של העור והעיניים.
  2. זריעה של תאי גזע של מוך השן
    1. הרחבה של תאי גזע של מוך השן
      1. זראה תאי גזע של מוך השן לתוך בקבוק T75 בצפיפות של 1 × 106 תאים לבקבוק.
      2. דגור את התאים ב-37°C ו-5% CO2 עד להגעה לכ-80% קונפלואנסיות (confluency).
      3. נתק את התאים באמצעות טריפסין.
      4. נטרל את הטריפסין באמצעות מצע גידול מלא.
      5. סבב את תרחיף התאים בצנטריפוגה לקבלת משקע תאים.
      6. העריך את חיוניות התאים באמצעות trypan blue.
      7. השתמש בתרחיפי תאים המראים חיוניות ≥90%.
    2. הכנת תרחיף התאים
      1. הכן תרחיף תאים שחומם מראש ל-37°C.
      2. כוון את ריכוז התאים ל-100,000 תאים/mL במצע גידול מלא.
      3. הכן נפח סופי של תרחיף של 1–2 mL.
        הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאים במעבר (passage) 5.
    3. זריעת תאים
      1. הזריק את תרחיף התאים לתוך פתח הכניסה של המיקרו-תעלה התחתונה.
      2. הפוך את המכשיר לאחר זריעת התאים
        הערה: היפוך המכשיר מקדם שקיעה של התאים לעבר פני השטח של הדנטין ומשפר את היצמדות התאים.
    4. דגירה
      1. הנח את המכשיר ההפוך בתוך צלחת פטרי.
      2. הוסף 1 mL מצע גידול לצלחת הפטרי כדי למזער אידוי.
      3. דגור את המכשיר ב-37°C ו-5% CO2 למשך 24 h.
      4. שמור על תנאי תרבית סטטיים לאורך תקופת הדגירה.
        הערה: תיקוף של זרימה דינמית לא בוצע במחקר הנוכחי.
        הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר תנאי תרבית סטטיים לצורך תיקוף ראשוני של המכשיר והערכת היצמדות תאים.
    5. תיקוף ראשוני של המכשיר
      1. הערך את היצמדות התאים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM).
      2. הוצא את דיסק הדנטין על ידי פירוק המכשיר לפני הניתוח.
  3. הכנת דגימות למיקרוסקופ אלקטרוני סורק
    1. הוצאת הדגימות ושטיפה
      1. פרק את המכשיר לאחר 24 h של דגירה.
      2. הוצא את דיסק הדנטין והעבר אותו לפלטת תרבית או לצלחת פטרי.
      3. מקם את פני השטח של הדנטין שזורעו בו התאים כלפי מעלה.
      4. שטוף את דיסק הדנטין פעמיים באמצעות 1 mL PBS.
    2. קיבוע
      1. הוסף 2 mL של 2.5% glutaraldehyde בתוך 0.1 M Sorensen’s phosphate buffer.
      2. דגור את הדגימה למשך 30 min ב-RT.
        זהירות: Glutaraldehyde הוא רעיל ועלול לגרום לגירוי של העור, העיניים ודרכי הנשימה. בצע את הליכי הקיבוע בתוך מנדף כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. שטיפה לאחר קיבוע
      1. הסר את תמיסת ה-glutaraldehyde.
      2. שטוף את דיסק הדנטין שלוש פעמים במים מזוקקים אולטרה-טהורים ב-RT.
    4. ניתוח SEM
      1. נתח את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק סביבתי.
      2. הפעל את המיקרוסקופ בתנאי ואקום נמוך (25 Pa).
      3. השתמש במתח מאיץ של 10.0 kV ובמרחק עבודה של 7.0 mm.
      4. רכוש תמונות באמצעות מצב גילוי תלת-ממדי של אלקטרונים מפוזרים לאחור (BSE-3D).
      5. צלם תמונות בהגדלה של ×200 (איור 2A).
  4. הערכת חיוניות תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. הכנת דגימות
      1. זראה וגדל תאים כפי שמתואר בשלב 3.2.
      2. דגור את המכשיר למשך 24 h ב-37°C ו-5% CO2.
      3. פרק את המכשיר וחשוף את פני השטח של הדנטין.
      4. העבר את דיסק הדנטין לפלטת בארות המכילה HBSS+/+ שחומם מראש ומועשר ב-Ca2+ וב-Mg2+.
    2. שטיפת דגימות
      1. שטוף את דיסק הדנטין פעמיים עם HBSS+/+.
      2. הסר שאריות סרום ו-phenol red לפני הצביעה.
        הערה: שאריות סרום ו-phenol red עלולות להגביר את האוטופלואורסצנציה של הרקע.
    3. צביעת תאים חיים
      1. הכן תמיסת עבודה טרייה של Calcein AM בריכוז 2 µM ב-HBSS+/+.
      2. הוסף תמיסת צביעה מספקת כדי לכסות באופן מלא את פני השטח של הדנטין.
      3. דגור את הדגימה למשך 20 min ב-37°C בחשיכה.
      4. הסר את תמיסת הצביעה לאחר הדגירה.
    4. צביעת תאים מתים
      1. הוסף תמיסת עבודה של Propidium Iodide (1–2 µg/mL ב-HBSS+/+).
      2. דגור את הדגימה למשך 5–8 min ב-37°C בחשיכה.
      3. אין לחרוג מ-10 min של דגירה.
      4. שטוף את הדגימה פעמיים עם HBSS+/+.
      5. שמור על הדגימה טבולה בבופר עד לצילום.
    5. רכישת תמונות במיקרוסקופיה קונפוקלית
      1. רכוש תמונות קונפוקליות בתוך 30 min מהצביעה.
      2. רכוש תמונות באופן רצית בערוצים הירוק והאדום.
      3. השתמש ב-λex 490 nm וב-λem 515 nm לצילום תאים חיים.
      4. השתמש ב-λex 535 nm וב-λem 617 nm לצילום תאים מתים.
        ​הערה: הגן על תמיסות צביעה פלואורסצנטיות ועל דגימות צבועות מחשיפה לאור במהלך הליכי הדגירה והצילום (איור 2B).

figure-protocol-2
איור 2: הערכה מייצגת של היצמדות וחיוניות של תאי גזע של מוך השן בתוך התקן OoC של קומפלקס הדנטין-מוך השן. (A) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק המראה תאי גזע של מוך השן ההיצמדים (כוכבית לבנה) על פני השטח של הדנטין לאחר 24 h של תרבית סטטית בתוך התקן ה-OoC. לאחר 24 h של תרבית, תאים היצמדים כיסו 54.35 ± 0.92% מפני השטח של הדנטין שנחשפו למיקרו-תעלה. לא נצפו תאים באזור הדנטין המכוסה ב-PDMS (כוכבית שחורה), מה שמעיד על איטום יעיל בין שכבות ההתקן. סרגל קנה מידה = 200 µm. (B) תמונת מיקרוסקופ קונפוקאלי המראה תאי גזע חיוניים של מוך השן הצבועים בירוק וההיצמדים לפני השטח של הדנטין (חצים לבנים) לאחר 24 h של תרבית סטטית. נצפו גם תאים שאינם חיוניים הצבועים באדום (חצים כחולים). סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור המוצלח של התקן ה-tooth-on-a-chip בוצע בהתאם לזרימת העבודה המוצגת באיור 1A–1I, כולל הכנת דיסק דנטין (איור 1D), ייצור התבנית מבוססת הפוטוליתוגרפיה (איור 1E), הסרת שכבות PDMS שהקשחו (איור 1F), הפעלת פלזמה לפני ההדבקה (איור 1G), הרכבת ההתקן הסופי (איור 1H), וחיבור ההתקן למערכת המיקרופלואידיקה (איור 1I). ההתקן שהתקבל היה מורכב ממבנה PDMS בעל שלוש שכבות, שבו דיסק הדנטין שולב באופן מלא בשכבה האמצעית, כאשר מיקרוערוצים עליונים ותחתונים ממוקמים משני צידי פני השטח של הדנטין (איור 1H).

תוצאה חיובית בשלב זה אופיינה בהיעדר בועות אוויר נראות לעין או דלמינציה, ובמעבר נוזלים ללא דליפות לאחר הזרקת PBS או מצע תרבית דרך פתחי הכניסה (איור 1I). חוסר יישור של פתחי המיקרו-ערוץ, איחוי פלזמה לא שלם, או דליפה בממשק שבין הדנטין ל-PDMS העידו על הרכבה כושלת ודרשו חזרה על הליך הייצור.

יוצרו בסך הכל 30 התקנים, שמתוכם כ-20% נכשלו במהלך הייצור או הבדיקה. הכישלונות קשורים בעיקר לדליפת נוזלים מעבר לגבולות המיקרו-תעלה עקב איחום פלסמה (plasma bonding) לא מלא, בעוד שחלק קטן יותר מהכישלונות נבעו מהפרדה (delamination) באזורים אחרים של ההתקן. לא נרשמו כישלונות שיוחסו לדליפה בממשק שבין הדנטין ל-PDMS או לחוסר יישור של פתחי הכניסה והיציאה של המיקרו-תעלה.

לאחר 24 h של תרבית סטטית, זריעה מוצלחת של תאים אוששה על ידי נוכחותם של תאי גזע של מוך השן (dental pulp stem cells) הדבקים למשטח והמפגינים מורפולוגיה פיברובלאסטית על פני השטח של הדנטין. מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) סיפקה הערכה הן של היצמדות התאים והן של שלמות ההתקן (איור 2A). בשימוש בפרוטוקול הנוכחי, תאים הדבקים כיסו 54.35 ± 0.92% מפני השטח של הדנטין שנחשף למיקרו-ערוץ לאחר 24 h של תרבית. תוצאה חיובית הוכחה על ידי נוכחות תאים הדבקים אך ורק באזור המיקרו-ערוץ, בעוד שפני השטח של הדנטין שכוסיו ב-PDMS נותרו ללא היצמדות תאים (איור 2A). התפלגות מרחבית זו תמכה באיטום מוצלח בין שכבות ההתקן ובהרכבה נכונה של ההתקן. לעומת זאת, נוכחות של תאים מעבר לגבולות המיקרו-ערוץ העידה על דליפה ויש להחשיבה כתוצאה שלילית.

מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות צביעת חי/מת אפשרה הערכה לא-הרסנית של חיוניות התאים בתוך ההתקן. תוצאה מוצלחת אופיינה בשליטה של תאים חיוניים המפגינים פלואורסצנציה ירוקה ומורפולוגיה פיברובלאסטית, כאשר רק לעיתים רחוקות נצפו תאים לא חיוניים הצבועים באדום (איור 2B). לעומת זאת, שיעור גבוה של תאים לא חיוניים היה מעיד על התניית דנטין תת-אופטימלית, שטיפה לא מספקת או תנאי תרבית לא מתאימים.

במהלך אופטימיזציית הפרוטוקול, נבחנה אסטרטגיית ייצור ראשונית שבה נעשה שימוש בתבנית קבועה הכוללת שקע מוגדר מראש כדי למקם את דיסק הדנטין בתוך שכבת ה-PDMS האמצעית (איור 3A). למרות שגישה זו נועדה להבטיח מיקום סטנדרטי של הדיסק ולהפחית דליפה בממשק שבין הדיסק ל-PDMS, היא התגלתה כבלתי יעילה בפועל. מכיוון שהיה צורך לחתוך ידנית מהשכבה המקשחת של ה-PDMS את האזור התואם לשקע של דיסק הדנטין, לא ניתן היה להשיג באופן מהימן התאמה מדויקת בין שולי הדיסק לבין קצוות ה-PDMS החתוכים, מה שהוביל למרווחים בממשק שגרמו לדליפה בכ-50% מההתקנים שיוצרו (איור 3A).

figure-results-1
איור 3: תמונות מייצגות המדגימות גישות ייצור לא מוצלחות שזוהו במהלך אופטימיזציה של התקן ה-OoC של קומפלקס הדנטין-מוך. (A) תבנית סיליקון המכילה שקעים קבועים שתוכננו למיקום סטנדרטי של דיסקיות דנטין (חצים לבנים). בשל שונות מובנית בממדי דיסקיות הדנטין הנובעת מהכנה ידנית של הדגימות, לא ניתן היה להשיג התאמה אמינה לגיאומטריה הקבועה של התבנית, מה שהוביל למרווחים בממשק ודליפות בכ-50% מההתקנים שיוצרו. (B) תמונת מיקרוסקופיה אלקטרונית סורפת (SEM) של פני השטח של הדנטין לאחר יישום חומר איטום בממשק שבין הדיסקית ל-PDMS. דנטין חשוף (כוכבית שחורה) ומשקעי חומר איטום (כוכבית לבנה) מסומנים. התפשטות לא רצויה של חומר האיטום על פני השטח של הדנטין פגמה בהיצמדות התאים והפחיתה את שטח הפנים הזמין להתנחלות תאים. סרגל קנה מידה = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לטפל במגבלה זו, הוחמר חומר איטום בממשק שבין הדיסקה ל-PDMS. עם זאת, גישה זו הוסיפה חיסרון נוסף, שכן חומר האיטום התפשט על פני השטח של הדנטין ומנע היצמדות תאים באזורים המכוסים, כפי שהודגם במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (איור 3B). תוצאות תת-אופטימליות אלו הדגישו שתי מגבלות קריטיות של אסטרטגיית הייצור הראשונית: התאמה לא מספקת בין השקע ב-PDMS שנגזר ידנית לבין דיסקת הדנטין, והיצמדות תאים מופחתת הקשורה לחומר האיטום.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר פרוטוקול שלב-אחר-שלב לייצור התקן שן-על-שבב (tooth-on-a-chip) בערימה אנכית, המשלב דנטין ותאי גזע של מוך השן, ומדגים היצמדות ותאימות תאים מייצגת בתוך ההתקן בתנאי תרבית סטטיים. הפרוטוקול פותח כדי לספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור לייצור ולהרכבה של פלטפורמת OoC למכלול דנטין-מוך, המתאימה למחקרי in vitro של ממשק הדנטין. ביסוס של זרימת עבודה כזו הוא משמעותי במיוחד כיוון שהסקירה הסיסטמטית האחרונה שלנו הדגישה כי תחום המודלים המיקרופלואידיים למכלול דנטין-מוך נמצא עדיין בשלב ראשוני, המאופיין בהטרוגניות מתודולוגית גבוהה בארכיטקטורת ההתקנים ובחומרים, דבר הפוגע קשות ביכולת השחזור ובסטנדרטיזציה של מודלי שן-על-שבב נוכחיים34. באמצעות אספקת פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור, מחקר זה נותן מענה למגבלות אלו ותורם לפיתוח מודלים ביולוגיים המוגדרים טוב יותר. בהקשר הרחב יותר של פיתוח OoC המיושם בביולוגיה של חלל הפה, França et al.15 היו חלוצים בתחום עם מודל מיקרופלואידי של שן-על-שבב המשלב דיסקות דנטין ותאים דמויי אודונטובלסטים, ובכך הדגימו את ההיתכנות של שחזור ממשק דנטין-מוך בסביבה מיקרופלואידית דינמית והערכה של התגובה הציטוטוקסית לחומרים דנטליים. מאז תרומה פורצת דרך זו, דווחה בספרות על מספר גדל והולך של פלטפורמות OoC לרפואת הפה34, העוסקות בהיבטים מגוונים של ביולוגיה של רקמות השן, אינטראקציות של חומרים ביומטריים, ומיקרוביולוגיה של חלל הפה, ובכך ביססו גישה זו כתחום מחקר פעיל ומתרחב במהירות. הפרוטוקול הנוכחי תורם למבנה זה על ידי אספקת זרימת עבודה מפורטת וניתנת לשחזור לייצור של פלטפורמת שן-על-שבב בערימה אנכית, הנגישה לקבוצות מחקר בעלות יכולות מיקרופלואידיות סטנדרטיות.

מספר שלבים בפרוטוקול הם קריטיים לייצור מוצלח ולביצועים תקינים של ההתקן. בפרט, מזיגת PDMS על התבנית דורשת בקרה קפדנית כדי להשיג עובי שכבה אחיד ויצירה תקינה של המיקרו-תעלות. יש לבחור את עובי שכבות ה-PDMS בהתאם ליישום המתוכנן בהמשך. לדוגמה, מיקרוסקופיה קונפוקאלית דורשת שכבות PDMS דקות מספיק כדי לאפשר ויזואליזציה אופטית של תאים ההידבקים לפני השטח של הדנטין. עם זאת, שכבות דקות יותר עשויות להיות קשות יותר לטיפול במהלך הליכי הייצור וההרכבה. כתוצאה מכך, אופטימיזציה של עובי ה-PDMS מייצגת איזון חשוב בין נגישות הדימוי לבין טיפול פרקטי במהלך ייצור ההתקן. יתר על כן, במחקר הנוכחי, מיקרוסקופיה קונפוקאלית של התקנים שלמים לא הייתה khả thi מכיוון ששכבת ה-PDMS המכסה את התאים הייתה בעובי של 0.4 mm, מה שעלה על עומק החדירה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי הזמין (0.2 mm). כתוצאה מכך, הדימוי הקונפוקאלי בוצע לאחר פירוק ההתקן וחשיפה ישירה של פני השטח של הדנטין. בנוסף, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לא הייתה ישימה בהתקן זה מכיוון שהאטימות המובנית של הדנטין מנעה ויזואליזציה אופטית ישירה של תאים ההידבקים לפני השטח שלו.

מגבלה זו רלוונטית במיוחד עבור תצורות OoC בערימה אנכית, שבהן המיקרוערוץ המכיל את התאים ממוקם מתחת לדיסק הדנטין, מה שגורם לכך שהגישה האופטית נחסמת הן על ידי שכבת ה-PDMS שמעל והן על ידי אטימותו של הדנטין עצמו. מגבלה זו אינה קיימת בתכנוני שבב בערימה אופקית, שבהם המיקרוערוצים רצים לצד הדנטין באופן לטראלי ולא מתחתיו, ובכך מאפשרים גישה אופטית ישירה למשטח הזרוע בתאים ללא הפרעה מאטימות הדנטין או מעובי ה-PDMS. לכן, הבחירה בין תצורות ערימה אנכיות לאופקיות צריכה להתחשב לא רק בדרישות פלואידיות וביולוגיות, אלא גם בשיטות הדימות הזמינות במעבדה. במערכת OoC, לתכנון המכשיר תפקיד משמעותי, ויש לשמור על המיקרו-סביבה קרובה ככל האפשר לתנאי in vivo. בדומה לרוב הרקמות, השן חשופה לגירויים מכניים ומפגינה התנהגות אניזוטרופית35, כלומר שתכונותיה משתנות בהתאם לכיוון הגירוי המופעל. יתרה מכך, קיימים הבדלים היסטולוגיים בין החלק הקורונלי של קומפלקס הדנטין-מוך, שבו הדנטין והאודונטובלסטים מסודרים באופן אנכי, לבין החלק הלטראלי, שבו האודונטובלסטים שוכנים בסמיכות לדנטין, עם הבדלים ניכרים במספר התאים, בארגון ובכיוון של השפופי הדנטין. לפיכך, תכנון שבב בערימה אנכית מספק ייצוג אנטומי נאמן יותר של נגעי עששת וחומרי שחזור המשפיעים על ההיבט הקורונלי של קומפלקס הדנטין-מוך.

טיפול מדויק של פני השטח בפלסמה חיוני להרכבה מוצלחת של התקנים ונותר אחד האתגרים העיקריים בייצור שבבים36. במחקר זה, התרחשה דלמינציה ב-20% מההתקנים שהיוקו. תוצאה זו אינה בלתי צפויה, מכיוון שהדבקת PDMS–PDMS המושגת באמצעות עט פלסמה ידני, כפי שנעשה במחקר הנוכחי, מייצרת ריכוז נמוך יותר של מיני חמצן ריאקטיביים מאשר מערכות תא פלסמה מבוססות ואקום, המאפשרות ריכוזי חמצן מעל רמות האטמוספירה ובהתאם מייצרות מספר רב יותר של קבוצות פנים קוולנטיות הזמינות להדבקה36. כתוצאה מכך, חוזק ההדבקה המושג באמצעות עט פלסמה הוא מטבעו נמוך יותר ופחות הדיר מאשר זה המושג באמצעות תא פלסמה ייעודי, דבר אשר ככל הנראה תרם לשיעור הדלמינציה שנצפה. אופטימיזציה של אסטרטגיית שילוב הדנטין דרשה גם היא מספר סבבי ייצור כדי להשיג מגע הדוק בין דיסק הדנטין לשכבת ה-PDMS האמצעית תוך מזעור הדליפות. גישה ראשונית כללה ייצור של שקע מוגדר מראש בתוך השכבה האמצעית להנחת הדנטין; עם זאת, חיתוך ידני של השקע מנע התאמה עקבית בין דיסק הדנטין לשולי ה-PDMS, מה שהוביל לדליפות במהלך הזרקת תוצר התרבית והניב שיעור הצלחה כולל בייצור של כ-50%.

בהמשך, נבחן דבק עבור שיניים תותבות כדי לשפר את האיטום בממשק שבין הדנטין ל-PDMS, אך מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת הראתה הפרעה להיצמדות תאים והפחתה בנראות התאים על פני השטח של הדנטין. לפיכך, הפרוטוקול הסופי עבר אופטימיזציה על ידי מיקום דיסקט הדנטין ישירות בתוך התבנית לפני יציקת PDMS זהירה סביב הדגימה, ובכך שופרה השילוב של דיסקט הדנטין בתוך ההתקן ופחת הצורך בחומרי איטום נוספים. גישה זו ביטלה ביעילות דליפות בממשק שבין הדנטין ל-PDMS על ידי הבטחת מגע הדוק וקונפורמלי בין שולי דיסקט הדנטין ל-PDMS הסובב, ללא הסתמכות על חומרי איטום משניים שעלולים להפריע להיצמדות התאים לפני השטח של הדנטין. יש לשקול גם מספר מגבלות של השיטה הנוכחית. ייצור התקנים מיקרופלואידיים נותר תלוי בחלקו בהליכי טיפול ידניים, שעלולים להכניס שונות בין התקנים ומפעילים. למרות שפוטוליתוגרפיה מספקת דיוק ושחזוריות גבוהים לייצור גאומטריות של מיקרו-תעלות, התהליך עשוי לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות טכנית. גישות ייצור חלופיות, כולל טכניקות הדפסה תלת-ממדית, עשויות להקל על בניית אב-טיפוס של ההתקן ועל הנגישות עבור מעבדות מסוימות; עם זאת, גורמים כגון רזולוציית הדפסה, מונומרים שיוריים ותאימות ביולוגית של החומר דורשים אופטימיזציה קפדנית37.

אספקה רציפה של מצע מספקת לתאים סביבה יציבה ומגנה עליהם מהצטברות של פסולת או מחוסר איזון של סידן/פוספט16. מספר מחקרים הראו כי מאמץ גזירה המושרה על ידי זרימה קבועה יכול לדמות תהליכי מכנו-טרנסדוקציה הדומים לאיתות in vivo, המהווים גורמים מכריעים בהתנהגות התאים38,39, ותורמים לדDifferentiation (הגבהה) והבשלה של תאים ומשרים שינויים משמעותיים במורפולוגיה, בביטוי הגנים ובתפקוד של התאים39. המחקר הנוכחי מדווח על הייצור והתיקוף הראשוני של ההתקן, תוך הדגמת היצמדות וחיוניות של תאים לאחר 24 h בתנאי תרבית סטטיים; לפיכך, השפעות של זרימה דינמית לא נבחנו. יישומם של תנאי זרימה דינמיים מהווה נתיב חשוב למחקר עתידי ויטופל בחקירות המשך. הפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור לייצור של התקן OoC של קומפלקס דנטין-מוך בערימה אנכית, המשלב דנטין בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית של PDMS בעלת שלוש שכבות. יישומים פוטנציאליים של המודל כוללים חקירה של אינטראקציות בין דנטין לביומטריאלים, תגובות תאיות לחומרים דנטליים, והערכה in vitro של הממשק בין הדנטין למוך תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים ואין להם קונפליקטים של אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט DIM24-0004 ופרויקט PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; מענק FONDECYT Regular מס' 1260116; ומענק FONDECYT de Iniciación מס' 11230701, הסוכנות הלאומית למחקר ופיתוח (ANID), צ'ילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים ביולוגיים וכימיים
אצטוןExpertQSOLV 8ניקוי פרוסות סיליקון
תוכית גידול Alpha MEMCytivaSH30265.02תווך תרבית לתאי גזע של מוך השן
כלורמין (0.5%)Merck7080-50-4תמיסת אחסון עבור דיסקי דנטין
תאי גזע של מוך השןלא רלוונטילא רלוונטיתרבית תאים ראשונית. ראו שלבים 3.2.1 ו-3.2.2
EDTA (10%)וינקלרN2222158Eהסרת שכבת הסימוב (Smear layer)
פוטו-רזיסט שלילי מבוסס אפוקסיGersteltecGM1060ייצור תבניות באמצעות פוטוליתוגרפיה
גלוטראלדהיד (2.5%) ב-0.1 M Sorensen’בופר פוספטSigma-Aldrich210908-06קיבוע ל-SEM
שיניים אנושיות בריאות (טחונות או טחונות קטנות)לא רלוונטילא רלוונטידגימה אנושית
איזופרופנולExpertQSOLV 16ניקוי פרוסות סיליקון (Wafer), עצירת פיתוח וניקוי PDMS
ערכה לבדיקת חיוניות LIVE/DEADSigma-Aldrich451צביעת חיות פלואורסצנטית. 
PBS (סליין מתוחם פוספט)Corning46-013-CMשטיפה ובדיקת דליפה
בסיס PDMS וחומר מקשה (פולידימטילסילוקסאן)דאוSylgard 184ייצור התקן
PGMEASigma Aldrich484431פיתוח פוטורזיסט
טריפאן בלו (Trypan blue)Sigma Aldrich T8154-100מ"להערכת חיות תאים
טריפסיןCorning25-053-CIהסרת תאים
מים בדרגת טוהר גבוהה במיוחד (Ultrapure water)CytivaSH30529.01תמיסת שטיפה
<חזק>חומרים מתכלים וכלים למעבדה
מחטי מזרק 19GVmaticVCB19050חיבור המכשיר למשאבה מיקרוסקופית או למזרק
מנקח ביופסיה (קוטר: 1 ממ")Harris UnicoreWHAWB100073ייצור פתחי כניסה ויציאה
משטח חיתוךNicecoolלא רלוונטיהגנה על השטח במהלך ניקוב
דיסקי גימור דנטליים (למשל, Sof-Lex)3MSof-Lexהברקת דנטין
מתאמי Luer נקבה למחבר משונןRunze FluidicsRH-M016חיבור צינורות
מקל ערבוב מזכוכית או מפלסטיקדוראןלא רלוונטיערבוב PDMS
מזרקים תת-עורייםחמנילן (Cranberry)pc-12246זריעת תאים ובדיקת דליפה
גזה סטרילית נטולת סיביםלינדרסוןלא רלוונטיהסרת שאריות ניקוב
מתאמי לוּאֶר (Luer) זכריםRunze FluidicsRH-G016חיבור צינורות
כלי ערבובדוראןלא רלוונטיהכנת PDMS
צלחת פטרי (140 מ"מ) × 20 מ"מ)Deltalab2000219תרבית תאים/אינקובציה
בסיס פוליטטרהפלואורואתילןCCTValלא רלוונטיייצור שכבת דנטין בינונית
פרוסת סיליקוןJiaozuo Commercial FineWinלא רלוונטיייצור תבניות
צינור סיליקוןRunze Fluidics96421חיבור פלואידי
בקבוק תרבית T75Corning 353136הרחבת תאי גזע של פולפה דנטלית
פלטת בארותSPL Life Sciences30006הכנה לצביעה ודימות קונפוקליים
<חזק>ציוד ומכשירים
מייבש אווירMETALPLANTITAN-040ייבוש אוויר דחוס
מקור אוויר דחוסשולץCSD-18.1ניקוי עובש וניקוי משטחים
מיקרוסקופ קונפוקליOlympusלא רלוונטידגם: FV1000
מערכת ליתוגרפיה בלייזר ישירHeidelberguPG 101חשיפת פוטורזיסט
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק סביבתיHitachiלא רלוונטידגם: Quanta 400 
קוצב יד במהירות גבוההנקנישילא רלוונטידגם: Pana-max2
פלטה מחממתLabTechEH20A Plusאפיית פרוסה ואפיית פוטו-רזיסט
מ ihūנית זרימה למינריתBioBaseBBS8V1708313Dסטריליזציה של מכשירים
משאבה מיקרופלואידיתעידן חדשלא רלוונטידגם: 1002X-ES. בדיקת דליפה ב-10 µליטר/דקה
תבנית בעלת מיקרו-מבנה (שיוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה)CCTValלא רלוונטיראה שלב 2.2 למפרטי ייצור התבנית
תנור או אינקובטורMemmertUN110הקשחת PDMS ב-50 מעלות°גיבוש פחמן וקשרים ב-75°C
תא ניקוי בפלסמה בוואקוםפלזמת פאריGD-5הפעלה בפלזמה של פרוסות סיליקון (Wafer)
פלזמת קורונה נישאת Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACהפעלה של PDMS באמצעות פלזמה
מכשיר אולטרסוניקטורElma SonicS 10 (H)ניקוי פרוסות סיליקון (Wafer cleaning)
תא ואקום או דסיקטור (250 מ"מ)ווינגלאסלא רלוונטיניקוך אוויר מ-PDMS
משאבת ואקוםמנער (Rocker)300ניקוי בועות אוויר מ-PDMS (degassing)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים