מנגנון קונגשנג ג'נז'ונג דן במסלולים הקשורים לאוטיזם: מחקר המבוסס על פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ואימות ניסויי

סיכום

מחקר זה משלב פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית וסימולציה של דינמיקה מולקולרית (MD) כדי להבהיר רכיבים פעילים מרכזיים ומטרות טיפוליות של קונגשנג ג'נז'ונג דן (KSZZD) בהפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), מזהה שאריות קישור מרכזיות באמצעות סריקת אלנין, ומאמת השפעות במודל חולדות ASD המושרה על ידי חומצת ולפרואיק.

תקציר

הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) היא הפרעה נוירו-התפתחותית מורכבת, והפתוגנזה שלה קשורה קשר הדוק לדלקת נוירולוגית כרונית. כנוסחה קלאסית ברפואה הסינית המסורתית (TCM), קונגשנג ג'נז'ונג דן (KSZZD) משמשת להפרעות נוירו-התפתחותיות וזיכרון בשל ההשפעות הנוירופרוטקטיביות המדווחות שלו, אך המנגנון המולקולרי הספציפי שלה ב-ASD עדיין לא ברור. מחקר זה משלב פרמקולוגיה רשתית, ניתוח עגינה מולקולרית וסימולציית MD כדי להבהיר באופן שיטתי את המרכיבים הפעילים המרכזיים ואת היעדים הטיפוליים המועמדים של KSZZD ל-ASD הן ברמה המערכתית והן ברמה האטומית. לאחר מכן, שאריות קישור מרכזיות מזוהות באמצעות סריקה גמישה באלנין, וההשפעות הביולוגיות מוערכות באמצעות מודל חולדות ASD המושרה על ידי חומצת ולפרואיק (VPA). ניתוח פרמקולוגיה רשתית גילה כי קוורצטין, רכיב מרכזי ב-KSZZD, עשוי לפעול בחלקו על ידי ויסות מסלול האיתות הדלקתי המתווך על ידי TNF-α. תוצאות העגינה המולקולרית הראו כי אנרגיות הקישור של רכיבי הליבה של KSZZD למטרות היו כולן נמוכות מ-5.0 קק"ל למול, כאשר קוורצטין הראה את הזיקה החזקה ביותר ל-TNF (-8.52 קקלורי/מול). סימולציית MD הציעה כי קוורצטין יכול לשמור על קשירה יציבה לכיס הפעיל של TNF-α, וסריקת אלנין זיהתה עוד יותר את GLU104 ו-GLN102 כשאריות מפתח לחומצות אמינו לשמירה על היציבות המבנית של הקומפלקס. ניסויים ב-vivo הראו כי התערבות קוורצטין שיפרה משמעותית את ההתנהגויות המוטוריות והחקר בעכברי ASD שנגרמו על ידי VPA, והפחיתה ביעילות את רמות הביטוי של TNF-α בסרום וברקמת המוח. ממצאים אלו מצביעים על כך שקוורצטין עשוי לתרום להשפעות החזויות של KSZZD, לפחות בחלקו, באמצעות עיכוב מסלול האיתות TNF-α.

מבוא

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) היא הפרעה נוירו-התפתחותית מורכבת המאופיינת בתקשורת חברתית לקויה, תחומי עניין מוגבלים והתנהגויות סטריאוטיפיות חוזרות על עצמן.¹. המנגנון הפתולוגי של ASD הוא מורכב מאוד, וכולל אינטראקציה בין וריאציות גנטיות, ויסות אפיגנטי וגורמים סביבתיים, מה שמוביל בסופו של דבר לפגיעה בפלסטיות הסינפטית ולקישוריות חריגה במעגלים עצביים ^2,3. דלקת כרונית במערכת העצבים המרכזית (CNS) ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של ASD, והתערבויות המיועדות לדלקת עצבית הפכו לאסטרטגיות טיפוליות מבטיחות.

קונגשנג ג'נז'ונג דן (KSZZD), נוסחת TCM קלאסית, נרשמה לראשונה במרשמים חיוניים בשווי אלף זהב למקרי חירום. הוא מורכב מארבעה עשבי מרפא: שריון הצב, Os Draconis, Polygalae Radix, ו-Acori Tatarinowii Rhizoma. KSZZD משמש באופן מסורתי לחיזוק הלב והכליה, להרדים את הנפש ולייצוב הרוח. קלינית, הוא משמש בדרך כלל לטיפול בעיכוב התפתחותי אינטלקטואלי ופגיעה בזיכרון⁴. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הציעו כי KSZZD ורכיביו הפעילים מפעילים אפקטים נוירו-פרוטקטיביים, אנטי-דלקתיים ונוגדי חמצון, ועשויים לשפר התנהגויות למידה, זיכרון וחרדה^{במודלים} של הפרעות נוירו-התפתחותיות. הניתוח הפיטוכימי שלנו גילה כי קוורצטין ופלבונואידים אחרים הם המרכיבים הפעילים המרכזיים בנוסחה זו, שיכולה לחדור את מחסום הדם-מוח ולהציג פעילות אנטי-דלקתית משמעותית⁶. עם זאת, המנגנון שבו רכיבים פעילים אלו מתווכים את ההשפעות הטיפוליות של KSZZD ב-ASD עדיין לא מובן היטב.

עם ההתפתחות המהירה של הביולוגיה החישובית, טכניקות כמו פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית, סימולציה של דינמיקה מולקולרית וחישוב כימיה קוונטית סיפקו כלים רבי עוצמה להבהרת האינטראקציות בין רכיבים פעילים ברפואה הסינית המסורתית לבין מטרות מחלות ברמה האטומית 7,8,9,10,11 . על ידי שילוב מקורות נתונים הטרוגניים, פרמקולוגיית הרשת מאפשרת בניית רשת מורכבת ואינטראקטיבית של "רכיב-יעד-נתיב" מנקודת מבט של ביולוגיה מערכתית, ובכך מזהה באופן ראשוני צמתים ביולוגיים מרכזיים להתערבות ברפואה הסינית המסורתית במחלות.

על בסיס זה, ניתן להשתמש בעגינה מולקולרית לסימולציה של התאמה גיאומטרית והתאמת אנרגיה בין רכיבים לחלבוני המטרה, ולחזות את מצבי הקישור שלהם ופעילותם הפוטנציאלית. בהמשך, מבוצעת סימולציה של דינמיקה מולקולרית (MD) כדי לבדוק את התנודות המבניות ויציבות הקישור של הקומפלקס בתנאים מימיים ופיזיולוגיים. בשילוב עם סריקת אלנין, מיושמת סימולציית מוטגנזה מכוונת אתר כדי לאתר במדויק את שאריות הליבה של נקודות החמות האחראיות לשמירה על זיקת הקשר, ולהבהיר את משקל התרומה של הפרמקופור ברמת חומצות האמינו. לבסוף, אימות המבוסס על ניסויים פרמקולוגיים מתוכננים היטב יכול לחשוף ביעילות את המנגנון המולקולרי שמאחורי ההשפעות הטיפוליות של תרכובות מסורתיות ברפואה הסינית על מחלות מסוימות.

בהתאם לכך, מחקר זה שואף תחילה לסנן את המרכיבים והיעדים המרכזיים של KSZZD בטיפול ב-ASD באמצעות פרמקולוגיה רשתית. בהמשך, בשילוב עם עגינה מולקולרית, סימולציית דינמיקה מולקולרית וסריקה גמישה של אלנין, יזוהו "שאריות נקודות חמות" השומרות על יציבות מורכבת, ודפוס האינטראקציה הדינמית בין קוורצטין ל-TNF-α יוערך. לבסוף, התוצאות החישוביות יאומתו בניסוי במודל חולדות ASD מושרה על ידי VPA, באמצעות הערכות התנהגות בעלי חיים, היסטופתולוגיה מוחית ורמות ביטוי גורמי דלקת. מחקר זה שואף לבחון מנגנונים פוטנציאליים שבאמצעותם רכיבים שמקורם ב-KSZZD עשויים להשפיע על מסלולי דלקת הקשורים לאוטיזם מנקודת מבט רב-קנית, ולספק בסיס לחקירה נוספת של התערבויות ברפואה הסינית המסורתית בהפרעות נוירו-התפתחותיות.

פרוטוקול

ניתוח פרמקולוגיה רשתית

"אוטיזם" שימש כמילה המפתח לחיפוש במאגר GeneCards (https://www.genecards.org/) אחר מטרות הקשורות לאוטיזם 12,13,14. מטרות שנאספו ממאגרי הנתונים אוחדו לאחר שהוסרו רשומות כפולות. מטרות ידועות של רכיבים פעילים שלא תפסו על ידי תחזיות מסד הנתונים הושלמו בהתבסס על דוחות ספרות¹⁵. מטרות המחלה והיעדים הפוטנציאליים של רכיבי התרופות הוסדרו באופן אחיד לסמלי גנים באמצעות מאגר החלבונים UniProt (https://www.uniprot.org/), ושתי קבוצות היעדים הללו מופו כדי לזהות את היעדים הטיפוליים הפוטנציאליים של KSZZD לאוטיזם¹⁶.

בהתבסס על בסיס הנתונים והפלטפורמת ניתוח של מערכות פרמקולוגיה מסורתית לרפואה סינית (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php), התרכובות הביואקטיביות הפוטנציאליות ב-KSZZD והיעדים המתאימים שלהן נבדקו בהתאם לקריטריונים של זמינות ביולוגית דרך הפה (OB ≥ 0.30) ומדד דמיון תרופות (DL ≥ 0.18)¹⁷. מזהי SMILES של התרכובות נאספו ממסד הנתונים PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), ו-Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/) שימש עוד כדי לחקור את היעדים הפוטנציאליים שאינם כלולים בפלטפורמת TCMSP¹⁸. בהמשך, מאגר הנתונים HERB (http://herb.ac.cn) שימש לסינון משלים בהתאם לכלל החמשת של ליפינסקי, עם הקריטריונים הבאים: משקל מולקולרי (MW ≤ 500 Da), מקדם חלוקת אוקטנול-מים (AlogP ≤ 5), מספר תורמי קשרי מימן (Hdon ≤ 5), מספר קבלי קשרי מימן (Hacc ≤ 10), ומספר הקשרים הניתנים לסיבוב (RBN ≤ 10). לאחר מכן, בוצעה סקר מטרות באמצעות מאגר הנתונים BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) עם הקריטריונים הבאים: סף ציון (≥0.84), ציון יכולת התרופות (≥0.10), וערך P (≤0.05). לבסוף, מסד הנתונים UniProt (https://www.uniprot.org) שימש להמרת שמות היעד שנבחרו לסמלי גנים סטנדרטיים.

היעדים החופפים בין יעדי התרופות לאוטיזם זוהו באמצעות כלי Draw Venn Diagram המקוון (http://bioinformatics.psb.ugent.be). מטרות חופפות אלו יובאו למסד הנתונים STRING (https://string-db.org/) לבניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)¹⁹. המין הוגדר כ-Homo sapiens, ואינטראקציות חלבון-חלבון עם ציוני ביטחון מתחת ל-0.40 סיננו החוצה. הרשת שהתקבלה יובאה לתוכנת Cytoscape 3.10.0 לניתוח חזותי¹⁶, כאשר תרופות, תרכובות ומטרות יוצגו על ידי יהלומים אדומים, עיגולים כחולים ומשולשים ירוקים, בהתאמה, ומשקלי הקצוות שיקפו את דרגת המרכזיות של הצמתים. תוסף CytoNCA שימש לאחר מכן לחישוב ערכי מרכזיות דרגות, לדרג את תרכובות הליבה ולזיהוי תרכובות הליבה העיקריות. ניתוח העשרת ביואינפורמטיקה של הגנים המטרה בוצע באמצעות פלטפורמת Metascape²⁰, כולל ניתוח GO (תהליך ביולוגי, BP; תפקוד מולקולרי, MF; רכיב תאי, CC) וניתוח מסלולי KEGG.

עגינה מולקולרית

חלבוני הקולטנים הקשורים לאוטיזם שזוהו לעיל עובדו מראש לפני העגינה על ידי תיקון שאריות חסרות, אופטימיזציה של מצב הפרוטונציה והסרת מולקולות מים גבישיות לשמירה על שלמות מבנית של הקולטן. שיטת העגינה החצי-גמישה במודול^{CDOCKER 21} שימשה לאחר מכן. שאריות בטווח של 10 Å מהליגנד הקו-קריסטלי הוגדרו ככיס הפעיל, וקשירת הקולטנים ליגנד דומה באזור זה.

תוצאות העגינה הוערכו תוך שימוש באנרגיית האינטראקציה של CDOCKER כמדד המפתח, כאשר ערכי אנרגיה נמוכים יותר מצביעים על קשירה יציבה יותר בין הליגנד לקולטן. אמינות מצב העגינה הוערכה על ידי השוואת קונפורמציית הקישור המרחבית של רכיב הליבה לזו של הליגנד הקו-קריסטלי בכיס הפעיל. הקומפלקס עם אנרגיית הקשירה האופטימלית והאינטראקציה החזקה ביותר נבחר כקונפורמציה הראשונית לסימולציה הדינמיקה המולקולרית הבאה.

סימולציית דינמיקה מולקולרית

בהתבסס על ממצאי העגינה המולקולרית, בוצעה סימולציה של דינמיקה מולקולרית כדי לחקור את מנגנון הקשר בין קומפלקס הקוורצטין ל-TNF-α. גישה זו מדמה תנועה מולקולרית ואינטראקציות ברמה האטומית ומנתחת שינויים דינמיים בחלבונים, ליגנדים והסביבה הסובבת, ובכך מספקת מידע על שינוי קונפורמציה מולקולרי, יציבות קישור ודינמיקת חלבון-ליגנאד. קומפלקס הקולטן-ליגנד הומס באמצעות מודל המים TIP3P, עם מרחק בופר של לפחות 12 Å בין הקומפלקס לגבול המערכת, כדי להבטיח פתרון מלא ולהפחית את השפעות הגבול. הריכוז היוני הוגדר ל-0.154 מ', ויוני Na⁺ ו-Cl⁻ נוספו כדי לנטרל את מטען המערכת. לשיפור דיוק הסימולציה, אומץ שדה כוח חלבוני Amber14SB²² , המתאר ביעילות אינטראקציות בין-מולקולריות לא קשורות ומצבי קישור ומתאים במיוחד למחקרים מורכבים של חלבון-ליגנד²³.

למזעור אנרגיה ראשוני, שיטת הירידה התלולה ביותר הופעלה במשך 5000 צעדים להסרת מגעים לא סבירים וקונפורמציות באנרגיה גבוהה, תוך שימוש בסף התכנסות של 10 kJ/mol/nm להבטחת הרפיית פרמטרי שדה הכוח. שיטת הגרדיאנט הצמוד הופעלה לאחר מכן במשך 2,000 שלבים כדי לאופטימיזציה נוספת של המצב התרמודינמי ולהבטיח יציבות מערכת²⁴.

במהלך שיווי משקל, בוצעה לראשונה סימולציית אנסמבל NVT ל-100 ps, עם צעד זמן של 2 fs. המערכת חוממה בהדרגה ל-300 K כדי להפחית את השפעת המבנה ההתחלתי ולהגיע לאיזון תרמודינמי. האנסמבל הועבר לאחר מכן ל-NPT, ובוצעה איזון נוסף של 100 פס"ס בלחץ קבוע של בר אחד לייצוב הצפיפות והלחץ. שלב זה שימש להבאת המערכת למצב תרמודינמי יציב לפני סימולציית ייצור²⁵. הסימולציה הפורמלית של דינמיקה מולקולרית בוצעה למשך 20 ננו-שניות, כאשר הטמפרטורה נשמרה על 300 קלווין, לחץ של בר אחד, וצעד זמן של 2 fs. המסלול נשמר כל 10 ps. כדי להבטיח יציבות ודיוק סימולציה, פרמטרים פיזיקליים, כולל טמפרטורה, לחץ ונפח, נבדקו באופן קבוע כדי לוודא שהם נשארים בטווחים הצפויים.

סריקה גמישה של אלנין

בהתבסס על הקונפורמציה היציבה שהושגה מסימולציית דינמיקה מולקולרית, בוצעה סריקת אלנין על כל שאריות חומצות האמינו ברדיוס של 3 Å מממשק קישור הליגנד. בהליך זה, שאריות המטרה מוחלפות באופן שיטתי באלנין, ובכך חותכות את שרשרת הצד תוך שמירה על מבנה השרשרת הראשית והסרת אינטראקציות ספציפיות המתווכות בשרשרת הצדדית. משקל התרומה של כל שארית לאפיניות הקישור נמדד על ידי חישוב השינוי באנרגיית הקישור החופשית בין הקומפלקסים מסוג פרא למוטנטים. בניגוד למודלים סטטיים מסורתיים, מחקר זה הציג מנגנון הרפיה גמיש בשרשרת צדדית, שאפשר לסביבה סביב אתר המוטציה לעבור הרפיה מבנית ולדמות בצורה ריאליסטית יותר את התגובה הדינמית של ממשק הקישור. ניתוח זה נועד לזהות שאריות מועמדות לנקודות חמות השומרות על יציבות מורכבת, ולספק טביעת אצבע אנרגטית לאופטימיזציה של תרכובות עופרת המיועדות לחלבונים הקשורים לאוטיזם.

ניסויים בבעלי חיים

בעלי חיים ניסיוניים

נבחרו חולדות Sprague-Dawley (SD) בריאות בדרגת SPF (שלושה זכרים ושלוש נקבות, בני 3 חודשים), שנולדו וגודלו בתנאים זהים. טמפרטורת החדר נשלטה ב-18–22 מעלות צלזיוס, הלחות היחסית נשמרה ב-60%–70%, ומחזור האור היה 12 שעות: 12 שעות (אור: חושך). כל הניתוחים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של בית החולים הראשון של העם של זוני (מספר אישור: LunShen (2025)-2-362).

הזדווגות בעלי חיים, זיהוי הריון וקיבוץ

כל העכברים הוזנו באופן אדפטיבי בסביבה עם SPF במשך שבוע לאחר הרכישה. עכברוש נקבה וזכר אחד היו כלואים יחד בשעה 18:00 בכל אחר הצהריים. בדיקת פקק וגינלי בוצעה בשעה 8:00 בבוקר למחרת (12 שעות לאחר הכלוב). נוכחות פקק וגינלי נחשבה להזדווגות מוצלחת, ואותו יום סומן כיום הריון 0.5 (GD0.5). חולדות בהריון אוחסנו בכלובים נפרדים. משקל הגוף של חולדות בהריון נמדד ונועד מדי יום. משקל הגוף של חולדות בהריון עלה ברצף, עם עלייה יומית ממוצעת של 2–5 גרם, ומשקל הגוף הכולל יכול היה לעלות בכ-30% לפני הלידה. לאחר כ-10 ימי הריון, הייתה בולטת אסימטרית טיפוסית בצורת אגס של הבטן, וניתן היה להרגיש גושים קשים של עוברים במישוש, שהובחנה מהיקף הבטן האחיד והרך שנגרם מהשמנה.

הקמת מודלים והקמת קבוצת בקרה:

בקבוצת המודל, שתי חולדות בהריון נבחרו באקראי והוזרקו לתוך-פריטונית בתמיסת VPA (600 מ"ג/ק"ג) פעם אחת ביום ההריון 12.5 (GD12.5). VPA ניתנה באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית אחת במינון של 600 מ"ג/ק"ג ביום ההריון ה-12.5. משטר זה נבחר בהתבסס על מחקר פורץ דרך של שניידר ופרז'בלוצקי²⁶, שקבעו כי חשיפה ל-VPA בנקודת זמן הריון ספציפית זו משחזרת הן את התכונות הנוירואנטומיות והן ההתנהגותיות של ASD בבני אדם. פרוטוקול זה הפך מאז למודל הסטנדרטי ואומת בעקביות במחקרים פרמקולוגיים אחרונים באמצעות פרמטרים זהים²⁷. בקבוצת הביקורת הריקה, נבחרה חולדה בהריון אחת והוזרק תוך-פריטונית בנפח שווה של 0.9% תמיסת מלח תקינה באותו זמן. חולדות בהריון ילדו באופן טבעי, ויום הלידה של הצאצא נרשם כיום 0 לאחר הלידה (PND0). כל הצאצאים של העכברים גמלו והוחזקו בנפרד לפי מגדר ב-PND21.

קיבוץ הצאצאים והתערבות

ב-PND28, 12 גורים זכרים נבחרו באקראי מצאצאי חולדות הרות שנחשפו ל-VPA (6 בקבוצת המודל ו-6 בקבוצת ההתערבות של הקוורצטין), ו-6 גורים זכרים נבחרו באקראי מצאצאי חולדות הרות שנחשפו למלחים (6 בקבוצת הריק). הובטח שלא יהיה הבדל משמעותי במשקל הגוף בין הגורים בכל קבוצה. צאצאים שנולדו לעכברים בהריון שטופלו במי מלח תקינים הוקצו לקבוצת הריק, אלו שנולדו לעכברים בהריון שטופלו ב-VPA לקבוצת המודל, ואלו שנולדו לחולדות הרות שטופלו ב-VPA לקבוצת ההתערבות של קוורצטין.

התערבות רציפה בוצעה במשך 4 שבועות החל מ-PND28. בקבוצת ההתערבות בקוורצטין, תוספי קוורצטין ניתן תוך-קיבה בשעה קבועה כל יום במינון של 100 מ"ג/ק"ג/יום. מינון זה נבחר בהתבסס על הראיות המשולבות הבאות: (i) מחקר קודם שערך מינון זיהה 100 mg/kg כמנה האופטימלית להקלה על התנהגויות חרדה ולהפחתת ציטוקינים פרו-דלקתיים במודל עכברוש נוירודלקתי המושרה על ידי LPS²⁸; (ii) קוורצטין במינון 50 מ"ג/ק"ג הוכח כמונע ליקויים באינטראקציה חברתית ונזק מוחי חמצוני בעכברוש אוטיזם שנגרם על ידי VPA במודל²⁹; ו-(iii) קוורצטין דרך הפה הוכח לאחרונה כמפחית רמות TNF-α במוח ומשפר התנהגויות דמויות אוטיזם בדגם³⁰ בעכבר אוטיסטי שנגרם מחומצה פרופיונית. ביחד, אימות עצמאי זה תומך בבחירת 100 מ"ג/ק"ג כדי להבטיח מעורבות איתנה של מסלול הדלקתי המתווך על ידי TNF-α במודל ה-ASD המושרה על ידי VPA לאחר הלידה הנוכחי. בקבוצות הבלנק והמודל ניתנה תמיסת תמי מלח רגילה של 0.5% CMC-Na באופן תוך-קיבה בכל יום. לכל בעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ומים במהלך תקופת ההתערבות, ומשקל גופם נמדד מדי שבוע כדי להתאים את נפח הטיפול בהתאם למשקל גופם.

מבחן שדה פתוח

לאחר 4 שבועות של התערבות (בערך PND56), בוצעה בדיקת שטח פתוח להערכת פעילות ספונטנית ורמות חרדה. מבחן השדה הפתוח (OFT) הוא ניסוי התנהגותי קלאסי להערכת התנהגות הקשורה לחרדה בבעלי חיים ניסיוניים. המדדים שנמדדו היו יכולת התנועה הספונטנית של חולדות בסביבה פתוחה והזמן שבילו במרכז השדה הפתוח. מכשיר ה-OFT לחולדות היה בגובה 30 ס"מ, אורך 50 ס"מ ורוחב 50 ס"מ בתחתית, עם קירות פנימיים לבנים, וחולק באופן מלאכותי ל-16 רשתות קטנות, כולל 4 רשתות באזור הפנימי ו-12 רשתות באזור החיצוני. אתר הניסוי נשמר בשקט כדי למנוע גירוי קולי שעלול להשפיע על דיוק תוצאות הניסוי. כל עכברוש הונח במרכז תחתית הקופסה, והקלטת וידאו ותזמון בוצעו בו זמנית. שדה הראייה של המצלמה כיסה את כל השדה הפתוח ותיעד את התנועה הספונטנית של העכברים ואת מספר המעברים בין הרשתות. כל בדיקה נמשכה 5 דקות, ולאחר מכן הופסקה ההקלטה. הקיר הפנימי והתחתית של הקופסה הפתוחה נוקו ב-75% אלכוהול כדי למנוע מהצואה וריח הגוף שנותר על ידי בעל חיים אחד להשפיע על תוצאות הבדיקות של החיה הבאה. הניתוח חזר על עצמו לאחר החלפת העכברים עד שכל העכברים השלימו את הבדיקה.

שיטת זיהוי פתולוגית

לאחר קיבוע עם 4% פאראפורמלדהיד, רקמת המוח עברה התייבשות גרדיאנטית באמצעות מייבש אוטומטי מלא: 75% אתנול לשעתיים, 85% אתנול לשעה, 95% אתנול לשעה, ואתנול מוחלט I-IV למשך 20 דקות כל אחד. לאחר מכן ניקו את הרקמות עם חומר ניקוי I למשך 25 דקות וסוכן ניקוי II למשך 30 דקות, ואחריהם הטמעת פרפין. חתכים בעובי 5 מיקרון פורקו עם תמיסת הסרת שעווה I ו-II למשך 30 דקות כל אחד והודרו מחדש באתנול גרדיאנטי. החלקים צובקו בהמטוקסילין במשך 5–10 דקות, הובדלו באלכוהול חומצה כלורית למשך 3 שניות, וצבעו במים אלקליים כדי להפוך לכחול. לאחר מכן צובעו בצבע נגד באאוזין מסיס באלכוהול למשך 3 דקות, יובשו באתנול גרדיאנטי, נוקו, הוסרו עם מדיום התקנה ניטרלי, ונצפו תחת מיקרוסקופ.

זיהוי רמות TNF-α בסרום וברקמת המוח

לאחר המתן האחרון, נאסף דם אאורטה בטני מחולדות וצנטריפוגה ב-3,000 r/min בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות, ונאסף הסופרנטנט בסרום. בינתיים, ננתקו רקמות היפוקמפוס וקורטיקלית, והוספה PBS מקוררת מראש ביחס של 1:9 להומוגניזציה מכנית. ההומוגנט עבר צנטריפוגה ב-12,000 r/min בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות כדי לאסוף את הסופרנטנט. שיטת BCA שימשה לכימות חלבוני רקמה. בהתאם להוראות ערכת ELISA, הדגימות לבדיקה והנוגדנים הביוטיניליים נוספו למיקרופלטה ברצף. לאחר דגירה ושטיפה, נוסף ודוגר קומפלקס אבידין-פרוקסידאז. לאחר שטיפה נוספת, נוספה תמיסת המצע להתפתחות צבע, התגובה הסתיימה בתמיסת עצירה, והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. ריכוזי TNF-α בסרום (pg/mL) וברקמת המוח (pg/mg prot) חושבו באמצעות עקומת הסטנדרטית.

ניתוח סטטיסטי

פונקציית RANDBETWEEN ב-Microsoft Excel שימשה לאקראיות את העכברים וליצירת מספרים אקראיים להקצאת חולדות. כל הנתונים הניסיוניים במחקר זה הובאו לידי ביטוי כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). לפני ניתוח סטטיסטי, בוצעו תחילה בדיקות נורמליות (מבחן שפירו-וילק) ובדיקת הומוגניות שונות (מבחן לוון) על נתוני כל קבוצה. עבור נתונים שתאמו את התפלגות הנורמלית וההומוגניות של השנות, נעשה שימוש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA חד-כיווני). אם ההבדל היה מובהק סטטיסטית, שיטת LSD שימשה בהשוואות מרובות נוספות. ערך של *p < 0.05, **p < 0.01, ו-***p < 0.001 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

ניתוח תוצאות מחקר הפרמקולוגיה הרשתית על KSZZD בטיפול באוטיזם

בסך הכל נאספו 15,770 מטרות הקשורות לאוטיזם ממאגר GeneCards. מטרות עם ציון רלוונטיות ≥ 4.21 נבחרו כמטרות פוטנציאליות לאוטיזם, מה שהוביל ל-1014 יעדי מחלה. 827 היעדים של KSZZD הצטלבו עם 1,014 יעדי אוטיזם, והושגו 125 יעדים משותפים. ההמחשה בוצעה באמצעות פלטפורמת SRplot³¹ (https://www.bioinformatics.com.cn/), וצוירה דיאגרמת ון, המוצג באיור 1A

דיון

שאלה קריטית היא מדוע נבחר קוורצטין, ולא רכיבים מרכזיים אחרים, לאימות ניסויי והאם הוא יכול לייצג את ההשפעות ההוליסטיות של KSZZD. בחירה זו התבססה על קווי הראיות המתכנסים הבאים: (i) במודל עכברוש שהושרה על ידי VPA לפני הריון, קוורצטין מנע באופן משמעותי ליקויים באינטראקציה חברתית ונזק מוחי חמצוני²⁹; (ii) במודל אוטיזם מושרה חומצה פרופיונית, קוורצטין דרך הפה הפחית את רמות TNF-α במוח ושיפר התנהגויות דמויות אוטיזם³⁰; ו-(iii) במודל דלקת עצבית המושרה ...

חומרים

```html

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5% CMC-Na normal saline solution	Not specified in manuscript	Not specified	Vehicle used for blank/model groups and quercetin suspension.
0.9% normal saline	Not specified in manuscript	Not specified	Vehicle for blank-control maternal injections.
4% Paraformaldehyde in PBS	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	Used for fixation of brain tissue.
75% alcohol	Not specified in manuscript	Not specified	Used to clean the open-field apparatus between animals.
Absolute ethanol	Not specified in manuscript	Not specified	Used for tissue dehydration before embedding.
Alkaline water	Not specified in manuscript	Not specified	Used to blue hematoxylin-stained sections.
Amber14SB protein force field	Not specified in manuscript	Not applicable	Protein force field used for molecular dynamics simulations.
BATMAN-TCM database	Not specified in manuscript	Not applicable	Online target-screening database: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Used for protein quantification of tissue homogenates.
Bluing reagent	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	Used after hematoxylin staining to blue nuclei.
CDOCKER module	Not specified in manuscript	Not applicable	Semi-flexible docking module used for molecular docking.
Clearing / dewaxing reagent	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	Can be used for clearing and deparaffinization in histology workflows.
CytoNCA plugin	Not specified in manuscript	Not applicable	Cytoscape plugin used for degree centrality analysis.
Cytoscape software	Not specified in manuscript	Version 3.10.0	Used for network visualization and protein-protein interaction analysis.
Discovery Studio software	Not specified in manuscript	Versions 2019 and 2021	Used for receptor preprocessing, docking, and alanine scanning.
Draw Venn Diagram online tool	Not specified in manuscript	Not applicable	Online tool for Venn diagrams: http://bioinformatics.psb.ugent.be
Eosin-Y (alcoholic)	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	Used for cytoplasmic counterstaining in H&E staining.
Fully automatic dehydrator	Not specified in manuscript	Not specified	Used for gradient dehydration of fixed brain tissue.
GeneCards database	Not specified in manuscript	Not applicable	Online database used to retrieve autism-related targets: https://www.genecards.org/
GraphPad Prism software	Not specified in manuscript	Version 9.5	Used for statistical analysis and graphing.
Hematoxylin staining solution	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	Used for nuclear staining in H&E staining.
HERB database	Not specified in manuscript	Not applicable	Online database used for supplementary compound screening: http://herb.ac.cn
Hydrochloric acid alcohol	Not specified in manuscript	Not specified	Used for differentiation during H&E staining.
Metascape platform	Not specified in manuscript	Not applicable	Online platform used for GO and KEGG enrichment analysis.
Microplate reader	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	Used for absorbance reading at 450 nm.
Microscope	Not specified in manuscript	Not specified	Used to observe H&E-stained brain sections.
Microsoft Excel software	Microsoft	Not specified	Used to randomize rats with the RANDBETWEEN function.
Mounting medium	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	4111	Used for coverslipping and permanent mounting of stained sections.
Open field test apparatus	Not specified in manuscript	Not specified	50 cm × 50 cm × 30 cm box used for behavioral testing.
Paraffin	Not specified in manuscript	Not specified	Used for paraffin embedding of brain tissue.
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010023	Used as pre-cooled buffer for tissue homogenization.
PLIP interaction fingerprinting	Not specified in manuscript	Not applicable	Used for protein-ligand interaction fingerprint analysis.
PubChem database	Not specified in manuscript	Not applicable	Online database used to retrieve SMILES identifiers: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Quercetin	Not specified in manuscript	Not specified	Administered by gavage at 100 mg/kg/day.
Rat TNF-α ELISA Kit	Invitrogen	ERA56RB	Suitable for serum and tissue homogenate TNF-α detection.
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 16R, 75004383	Used for serum and tissue homogenate centrifugation.
Schrödinger Suite software	Schrödinger, LLC	Version 2024	Used to construct the molecular dynamics simulation system.
SPF-grade Sprague-Dawley rats	Not specified in manuscript	Not specified	3 male and 3 female rats used for animal model establishment.
SPSS software	Not specified in manuscript	Version 25.0	Used for statistical analysis.
SRplot platform	Not specified in manuscript	Not applicable	Online platform used for visualization: https://www.bioinformatics.com.cn/
STRING database	Not specified in manuscript	Version 12.0	Used to construct the protein-protein interaction network: https://string-db.org/
SwissTargetPrediction platform	Not specified in manuscript	Not applicable	Online platform used for target prediction: http://swisstargetprediction.ch/
TCMSP database	Not specified in manuscript	Not applicable	Online platform used for bioactive compound screening: http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
TIP3P water model	Not specified in manuscript	Not applicable	Water model used for molecular dynamics simulation.
UniProt protein database	Not specified in manuscript	Not applicable	Used to standardize target names to Gene Symbol: https://www.uniprot.org/
Valproic acid (VPA) solution	Not specified in manuscript	Not specified	Administered intraperitoneally at 600 mg/kg on gestational day 12.5.
Video recording system/camera	Not specified in manuscript	Not specified	Used to record rat movement during the open field test.

```