SMART (טכנולוגיית שחזור אוטומטית של שוימו): פלטפורמה חישובית משולבת לייעול תהליך המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית

סיכום

פרוטוקול זה מדגים תהליך קריו-אלקטרון מיקרוסקופי שלב אחר שלב באמצעות פלטפורמת תוכנה משולבת (SMART) שמחברת רכישת נתונים, שחזור תלת-ממדי ובניית מודלים אטומיים בממשק דפדפן אחד. כדוגמה מייצגת, מבנה TRPML1 האנושי נקבע ברזולוציה של 2.38 Å.

תקציר

מיקרוסקופיה קריואלקטרונית (קריו-EM) הפכה לכלי מרכזי בביולוגיה מבנית, אך תהליכי העבודה הנוכחיים דורשים בדרך כלל מספר חבילות תוכנה מיוחדות לרכישת נתונים, שחזור תלת-ממדי (3D) ובניית מודלים אטומיים, מה שמוביל לצינורות מפורקים ולהתערבות ידנית תכופה. כאן אנו מציגים את SMART (טכנולוגיית שחזור אוטומטית של שוימו), פלטפורמת תוכנה משולבת המשלבת שלושה מודולים—DataSmart לאיסוף נתונים אוטומטי, CryoSmart לעיבוד תמונה ושחזור תלת-ממדי, ו-ModelSmart לבניית מודלים אטומיים מבוססת למידה עמוקה—במסגרת ממשק אחיד נגיש לדפדפן. פרוטוקול זה מספק הוראות שלב אחר שלב להפעלת שלושת המודולים. תהליך העבודה כולל ניווט אוטומטי של דגימות ורכישת נתונים, תיקון תנועה, הערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF), בחירת חלקיקים, סיווג דו-ממדי (2D), שיפור תלת-ממדי, שיפור מפה ויצירת מודלים אטומיים. כדוגמה מייצגת, יישמנו את כל תהליך העבודה כדי לקבוע את מבנה TRPML1 האנושי, ערוץ קטיון ליזוזומי חדיר Ca²⁺, והשגנו רזולוציה גלובלית של 2.38 Å לפי תקן זהב של קורלציה פורייה (FSC) בקריטריון 0.143. שלושת המודולים (DataSmart, CryoSmart ו-ModelSmart) הוחלו ברצף על אותו מאגר נתונים TRPML1 במסגרת מחקר זה. הפרוטוקול תוכנן להיות נגיש למשתמשים עם רמות שונות של חוויית קריו-EM.

מבוא

מיקרוסקופיה אלקטרונית קריו: אבולוציה טכנולוגית והשפעה ביולוגית. קביעת מבנה חלבוני תלת-ממדי נותרה אתגר מרכזי בביולוגיה מולקולרית, שכן התפקוד הביולוגי קשור באופן הדוק לסידור המרחבי של שאריות חומצות האמינו. הבהרת תצורות מבניות אלו חיונית לפענוח מנגנונים אנזימטיים, אינטראקציות ליגנדים ונתיבי איתות תאיים ברזולוציה אטומית. דחף זה הוביל להתפתחויות טרנספורמטיביות בקריו-EM, שהפכה לטכניקת ביולוגיה מבנית מאומצת באופן נרחב ^1,2.

ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) באמצעות Cryo-EM משמש כגישה עוצמתית להשגת תובנות ביולוגיות בין סוגי דגימות מגוונים על ידי פתרון מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים מבודדים³. אלה כוללים וירוסים, חלבוני ממברנה, מרכבים הליקליים ומתחמים מקרומולקולריים דינמיים והטרוגניים נוספים, המשתרעים על פני טווח רחב של גדלים מולקולריים — מכ-50 קילו-דלטון ועד עשרות מגה-דלטון.

Cryo-EM SPA הפכה לטכניקת יסוד לפתרון הארכיטקטורות התלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של מקרומולקולות ביולוגיות, הכוללת שלושה שלבים חישוביים תלויים זה בזה: רכישת נתונים, שחזור תלת-ממדי ובניית מודלים אטומיים (איור 1).

במהלך איסוף הנתונים, דגימות מזגוגות מצולמות בתנאי מינון נמוך כדי ליצור סרטי מיקרוגרף, ולוכדים אלפי הקרנות חלקיקים במצבים כמעט טבעיים. מערכי נתונים גולמיים אלו מעובדים לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים של יישור וסיווג איטרטיביים לשחזור מפות צפיפות נפחיות. לבסוף, מודלים אטומיים נבנים ומעודנים כדי להתאים לצפיפות, ומבהירים אינטראקציות מולקולריות ברזולוציה קרובה לאטום.

הניתוח לעיל מראה כי תפוקת קריו-EM מייצגת רק את נקודת ההתחלה של הצינור המבני. המרת נתונים גולמיים אלה למודלים אטומיים ניתנים לפרשנות דורשת שרשרת של כלים חישוביים מתמחים. לכן, תוכנה משמשת כגשר קריטי שממיר נתונים גולמיים למודלים אטומיים.

אקוסיסטם תוכנות קריו-EM מפוצל: כלים ומגבלות נוכחיים. תהליכי עבודה מודרניים בקריו-EM נשענים על מגוון כלים מתמחים של תוכנה, שכל אחד מהם מתייחס לשלבים נפרדים:

רכישת נתונים. בעוד שחבילות תוכנה רבות לרכישת נתוני קריו-EM זמינות לציבור—כולל Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ ו-Auto-EMation¹¹—כלים אלו מפיקים בעיקר נתוני סרטים גולמיים עם יכולות עיבוד מוגבלות לאחר הרכישה. שלבי זרימת עבודה קריטיים, כמו הגדרת פרמטרים, התאמת תבנית, עדיין דורשים פעולות ידניות עתירות עבודה, ולעיתים דורשות יותר מדי פרמטרים לכל מאגר נתונים. הסתמכות זו על התערבות מקצועית מציגה אתגרים בשחזור וחוסר יעילות בתהליכי עבודה, במיוחד בתרחישים בעלי תפוקה גבוהה.

שחזור תלת-ממדי. קריו-EM חוותה התקדמות משמעותית בתוכנות שחזור תלת-ממדי, המאפשרות רזולוציה כמעט אטומית של מקרומולקולות ביולוגיות. בין הכלים הנפוצים ביותר נמצאים RELION, cryoSPARC ו-EMAN2, שלכל אחד מהם יתרונות ומגבלות ייחודיים. RELION משתמש בגישה בייסיאנית לשיפור איטרטיבי, מצטיין בטיפול במערכי נתונים הטרוגניים ובהשגת שחזורים ברזולוציה גבוהה¹². עם זאת, עוצמת החישוב והעקומת הלמידה התלולה שלה מחייבות לעיתים קרובות התערבות מומחה. cryoSPARC, המשתמש בהאצת GPU ולמידה עמוקה, מקצר משמעותית את זמן העיבוד והוא ידידותי למשתמש¹³. EMAN2 מספקת חבילת מכלול מקיפה לבחירת חלקיקים ושחזור תלת-ממדי, אך דורשת כיוון ידני נרחב וחסרה יכולות משוב בזמן אמת¹⁴. בעוד שכלים אלו מצטיינים בהיבטים מסוימים של שחזור תלת-ממד, הם נשארים מוגבלים לפונקציות בודדות, ללא אינטגרציה עם רכישת נתונים במעלה הזרם או מידול אטומי במורד הזרם. לדוגמה, RELION ו-cryoSPARC דורשים העברת נתונים ידנית מתוכנת בקרת מיקרוסקופ, מה שמוביל לחוסר יעילות ושגיאות פוטנציאליות. יתרה מזאת, אף אחד מהכלים הללו אינו מספק הערכת איכות בזמן אמת במהלך איסוף הנתונים או מעבר חלק לבניית מודלים אטומיים, מה שמוביל לתהליכי עבודה מפוצלים שמקשים על קצב התפוקה והשחזור.

השלב החישובי הסופי בקביעת מבנים מבוססת קריו-EM הוא בניית מודל אטומי, שבו קואורדינטות מולקולריות מותאמות באופן איטרטיבי במפות צפיפות משוחזרות כדי להבהיר אינטראקציות ברמת האטום.

בעוד שגישות בניית מודלים קונבנציונליות משתמשות באלגוריתמים למזעור אנרגיה מבוססי פיזיקה — הכוללים פוטנציאלים אלקטרוסטטיים, אינטראקציות ואן דר ואלס ומגבלות גאומטריית קשר קוולנטי — הן עדיין תלויות מאוד בהתערבות ידנית למיקום מודל ראשוני, פרשנות צפיפות ואימות סטריאוכימי 15,16,17,18 . הסתמכות זו על אוצרות מומחים לא רק מגבילה את קצב התפוקה אלא גם יוצרת הטיות סובייקטיביות, במיוחד במשטרי רזולוציה נמוכה (< 4 Å) שבהם מאפייני הצפיפות עמומים.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, מתודולוגיות מבוססות למידה עמוקה (DL) צצו כפתרונות טרנספורמטיביים, המנצלים רשתות עצביות לאוטומציה של חילוץ תכונות, אתחול ושיפור מודלים. גישות אלו מראות שיפור בביצועים בטיפול במפות צפיפות רועשות או לא שלמות, תוך הפחתה משמעותית של התערבות ידנית, כפי שניתן לראות במדדים עדכניים המראים ירידה של 40–60% בשלבים התלויים במשתמש לעומת צינורות קונבנציונליים 19,20,21,22.

עם זאת, שיטות אלו דורשות תמיד ייצוא מפות צפיפות מתוכנות שחזור תלת-ממד וייבואן למערכות בניית מודלים. לפני הייבוא, ייתכן שיהיה צורך בשלבים נוספים של עיבוד מוקדם—לעיתים עם כלים צד שלישי—כדי לאופטימיזציה של מפות הצפיפות. תהליך העבודה המקוטע הזה מחייב העברות נתונים חוזרות והמרות פורמטים, מה שיוצר חוסר יעילות. יתרה מזאת, אם תוצאות בניית המודל הראשוניות אינן מספקות, החוקרים חייבים לחזור לשלב השחזור לצורך חישוב מחדש, ואחריו סבב נוסף של בניית מודלים ואימות. מחזורים איטרטיביים כאלה מעכבים משמעותית את התפוקה והיעילות התפעולית של צינורות קביעת מבני קריו-EM.

1.3 SMART: פתרון משולב לקריו-EM מקצה לקצה

למרות התקדמות משמעותית ב-SPA קריו-EM, היעדר פתרונות חישוביים משולבים במלואם ממשיך להקשות על הפוטנציאל שלה לביולוגיה מבנית בעלת תפוקה גבוהה. חבילות תוכנה קיימות, למרות שהן מצטיינות באוטומציה של רכיבי זרימת עבודה מבודדים—כמו רכישת נתונים או שחזור תלת-ממדי—נכשלות לגשר על פערים קריטיים בין איסוף מיקרוגרפים גולמיים, שיפור מפת צפיפות ובניית מודלים אטומיים. פיצול זה מחייב העברת נתונים ידנית, המרות פורמט וכיוונון פרמטרים מיותר, מה שמוביל לחוסר יעילות שמצטבר עם קנה המידה של מערך הנתונים.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, אנו מציגים פלטפורמת תהליך קריו-EM משולבת, פלטפורמת חישוב משולבת שמאחדת את כל צינור ה-SPA של קריו-EM לתהליך עבודה מגובש מונחה בינה מלאכותית. הפלטפורמה המשולבת משלבת שלושה מודולים מרכזיים: DataSmart (רכישת נתונים אוטומטית), CryoSmart (שחזור תלת-ממדי היברידי מבוסס רשת עצבית), ו-ModelSmart (מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה).

שלושת המודולים החישוביים של הפלטפורמה מחוברים באמצעות זרם נתונים סטנדרטי, המאפשר זרימת נתונים יעילה שבה פלט ממודול אחד יכול להנחות התאמות פרמטרים בשלבי עיבוד נוספים. אינטגרציה זו שואפת להפחית את מספר השלבים הידניים והעברת הנתונים הנדרשים בתהליכי קריו-EM קונבנציונליים, ובכך לשפר את הנגישות והיעילות במעבדות ביולוגיה מבנית.

פרוטוקול

קו התאים Expi293F המשמש לביטוי חלבונים עבור חלבון TRPML1 אנושי נרכש מחברת Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (מספר קטלוג: SC0236058). זהות קו התאים אומתה כראוי באמצעות פרופילינג Short Tandem Repeat (STR) (קובץ משלים 1).

הצהרה אתית
מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, בעלי חיים או דגימות שהושגו ישירות מבני אדם או בעלי חיים. חלבון TRPML1 האנושי יוצר על ידי ביטוי רקומביננטי וטוהר במבחנה. קו התאים Expi293F המשמש לביטוי חלבון רקומביננטי הוא קו תאים מוכר ומונצח מסחרי. כתוצאה מכך, לא נדרשו אישור אתי מוסדי והסכמה מדעת בכתב.

הערה: פלטפורמת זרימת העבודה המשולבת של קריו-EM מורכבת משלושה מודולים מרכזיים: מודול רכישת נתונים אוטומטי, מודול שחזור תלת-ממדי היברידי המבוסס על רשת עצבית, ומודול מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה, כאשר הנתונים משמשים כממשק התקשורת בין רכיבי התוכנה הללו, כפי שמודגם באיור 2. מערכת פלטפורמת זרימת העבודה המשולבת של קריו-EM מאמצת ארכיטקטורת דפדפן-שרת (B/S), המאפשרת למשתמשים לבצע את כל הפעולות דרך ממשק ווב, ובכך להבטיח שימושיות ונגישות תפעולית.

1. רכישת נתונים אוטומטית

הערה: פלטפורמת זרימת העבודה המשולבת בקריו-EM מורכבת משלושה מודולים מרכזיים: מודול רכישת נתונים אוטומטית, מודול שחזור תלת-ממדי היברידי המופעל על ידי רשת עצבית, ומודול מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה. הנתונים משמשים כממשק התקשורת בין רכיבי התוכנה הללו (איור 2). המערכת משתמשת בארכיטקטורת Browser-Server (B/S) שמאפשרת את כל הפעולות דרך ממשק אינטרנט.

1. אתחול הפרויקט
   1. צור פרויקט חדש בפלטפורמת תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים.
   2. בחר באפשרות לרשת הגדרות מפרויקט אחרון, אם תרצה. השתמש מחדש בפרמטרים התורשתיים להגדרת מיקרוסקופ אלקטרוני במקום ליצור תצורה חדשה.
2. בדיקת הזזת קרן
   הערה: בצע התאמת הזזת קרן בתוך תוכנת בקרת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM).
   1. בדיקת הגדלה נמוכה (Atlas ו-GridSquare)
      1. פתח את מודול הסינון . רכוש תמונות בהגדלות Atlas ו-GridSquare.
      2. וודא שהתמונות מוארות כראוי וללא הזזת קרן. ודא שמרכז התמונה אינו ממוקם מעל פסי הרשת.
   2. בדיקת הגדלת רכישת נתונים
      1. רכוש תמונות בהגדלת רכישת הנתונים (למשל, 60K או 100K). הערך יישור הקרן.
      2. תקן את הזזת הקרן לפני המשך אם רכישת התמונה נכשלת או אם נצפתה הזזת קרן משמעותית.
   3. בדיקת הגדלה אאוסנטרית של חור
      1. לצלם תמונות בהגדלה של החור/אאוסנטרי (בדרך כלל 8K). כוון את הזזת הקרן עד שנקודת התאורה תהיה ממורכזת אם הקרן לא ממורכזת.
      2. אל תשנה את מיקום הצמצם. ודאו שגודל הצמצם תואם לצמצם שבו השתמשו במהלך איסוף הנתונים.
3. כוונון גובה Z
   1. אוטו-אאוסנטר התאמה
      1. עברו לעמוד הסקרינג . הזז את הבמה לאזור סרט פחמן נקי בהגדלה בגובה החור/אאוצנטרי. פתח את מודול ה-Auto-Eucentric בדף AutoFunction .
      2. לחץ על התחל. עקוב אחרי לוח הלוג לקבלת משוב. עברו לאזור אחר וחזרו על התהליך אם הפעולה נכשלת.
   2. כוונון פוקוס אוטומטי
      1. פתח את מודול האוטופוקוס בדף הפונקציה האוטומטית . לחץ על התחל.
      2. בדוק את הודעות היומן. כוון את הפרמטרים כפי שמצוין או חזר על סעיף 1.3.1 אם פוקוס אוטומטי נכשל.
4. בדיקת יישור הגדלה
   1. בדיקת יישור
      1. אתר תכונה מובחנת בהגדלת הנתונים וקבל תמונה. רכוש תמונה בהגדלת Hole/EucentricHeight.
      2. השווה את האזורים המרכזיים בשתי התמונות. המשך לכיול אם נצפה חוסר יישור בין הגדלות הנתונים והגדלות החור.
      3. בדקו יישור בין הגדלות Hole ו-GridSquare אם ההגדלות Data ו-Hole מיושרות. המשך ללא כיול אם כל רמות ההגדלה מיושרות.
   2. כיול הזזה בהגדלה
      1. עבור לעמוד הכיול . פתח את מודול Magnification Shift . התחילו בהגדלת הנתונים או בהגדלה הנמוכה ביותר.
      2. רכוש תמונה בהגדלה גבוהה הכוללת תכונה ייחודית. רכוש תמונה מתאימה בהגדלה נמוכה. הערך את ההיסט בין שתי התמונות.
      3. לחץ קליק ימני על המיקום המתאים למרכז התכונה בתמונה בהגדלה נמוכה. בחר לעבור כאן. רכוש מחדש את התמונה בהגדלה גבוהה ווודא יישור.
      4. חזור על ההתאמה במידת הצורך. לחץ על הבא כדי להמשיך לזוג ההגדלה הבא לאחר שהושג היישור. חזור על הליך הכיול עבור כל זוגות ההגדלה הלא מיושרים שנותרו.
5. הכנה לאיסוף נתונים
   1. ביצוע רכישת אטלס, בחירת ריבוע, הדמיה ריבועית ובחירת חורים
      1. פתח את מודול האטלס . השאירו את שדה האריחים ריק כדי להשיג את כל 81 האריחים, או הזינו את מספר האריחים הרצוי להשגה.
      2. נווט לממשק Square Select . לחץ קליק ימני כדי לבחור ריבועים מתאימים.
      3. עבור לעמוד בחירת החור . לחצו על 'הכינו הכל'. עקוב אחרי חלון היומן עד להשלמת רכישת התמונה.
      4. בחר תמונה מרובעת שצולמה מתוך רשימת התמונות. השתמש בפונקציית Find Holes כדי לבצע בחירת חורים אוטומטית כאשר החורים נראים בבירור.
         אזהרה: זיהוי חורים אוטומטי עלול להיכשל ברשתות עם קרח עבה או זיהום פני השטח. אימות ויזואלי של החורים שזוהו לפני הרכישה והשתמשו בשיטת בחירת החורים החצי-אוטומטית כאשר הזיהוי האוטומטי אינו אמין.
      5. השתמש בפונקציית הבחירה מבוססת זרעים כאשר קרח עבה או זיהום מונעים בחירה אוטומטית אמינה (איור 3).
         1. בחר חור מרכזי. בחר שני חורים סמוכים שיוצרים זווית ישרה.
         2. בחר שני חורים רחוקים לאורך הכיוונים המוגדרים על ידי החור השני והשלישי.
         3. לחץ על שלח. הפעל את Move All בעת עיבוד ריבוע נוסף. גרור אחד מחמשת חורי הזרעים לחור שקוף. לחץ על שלח.
   2. הגדרת תבנית
      1. עבור לעמוד הגדרת התבניות . לחץ על רכוש כדי לקבל תמונה. בדוק שהתמונה מכילה חור שלם.
      2. לחץ קליק ימני על אזור היעד ובחר ב-MoveStageTo אם חור מלא אינו נראה. רכוש מחדש את תמונת התבנית. הגדר את מיקום ההדמיה ומיקום המיקוד האוטומטי על ידי גרירת הסימנים המתאימים.
      3. הכניסו את מספר הפריימים לכל חור. הזן את ערך הפוקוס הרצוי (למשל, −1.5 מיקרון). אמת את כל פרמטרי הרכישה (איור 4).
6. בדיקת הזזת קרן מחדש
   1. חזור על סעיף 1.2 לאחר השלמת כל נהלי ההכנה.
7. אסטיגמציה ותיקון תרדמת
   1. תיקון אסטיגמציה
      1. העבר את הבמה לאזור של שכבת פחמן נקייה. כוון את הגובה באמצעות פוקוס אוטומטי לערך הדפוקוס הרצוי (למשל, −1.5 מיקרון). פתח את מודול Autostigmate בדף הפונקציה האוטומטית .
      2. לחץ על התחל. עקוב אחרי פלט ה-Ctffind בלוח הלוג. בדוק את האסטיגמציה וערכי התאמת הרזוליה. חזרו על ההליך באזור אחר אם האסטיגמציה נשארת גבוהה.
   2. תיקון תרדמת
      1. פתח את מודול Autocoma אם תוצאות Autostigmate נשארות לא אופטימליות לאחר ניסיונות מרובים. לחץ על התחל.
8. איסוף נתונים אוטומטי
   1. עבור לעמוד AutoCollect . לחץ על התחל. אפשר למערכת לבצע כיול אוטומטי של AutoEmission ו-AutoZLP .
   2. רכוש נתונים באמצעות הפרמטרים המוגדרים בהגדרות הסינון, רכישת הנתונים וההכנה. עוקבים אחרי תהליך האיסוף האוטומטי (איור 5).
      נקודת עצירה: לאחר סיום איסוף הנתונים, ניתן לאחסן את ערימות הסרטים שנרכשו ולהמשיך את הפרוטוקול בשלב עיבוד התמונה מאוחר יותר מבלי להשפיע על תוצאות המשך הדרך.
9. ניטור מיידי מרחוק
   1. עקב אחרי התקדמות האיסוף באמצעות מודול המעקב מרחוק. בדוק תוצאות תיקון תנועה בזמן אמת שנוצרו באמצעות MotionCor2²³. בדוק מדידות אסטיגמציה בזמן אמת ודיפוקוס.
   2. שתף את כתובת ה-URL של המעקב עם משתמשים מורשים. גישה למידע על מצב האיסוף ואיכות הנתונים ממחשב או מכשיר נייד. סקור דוגמה לפונקציונליות ניטור מרחוק באיור 6.

2. שחזור תלת-ממדי

הערה: השתמש במודול שחזור תלת-ממדי לביצוע שחזור תלת-ממדי ממאגרי נתונים של תמונות שנרכשו בעבר. תהליך העבודה כולל יצירת פרויקטים, ייבוא מיקרוגרפים, הערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF), בחירת חלקיקים, חילוץ חלקיקים, סיווג דו-ממדי, יצירת מודלים ראשונית ושיפור תלת-ממדי (איור 7).

1. יצירת הפרויקט
   1. עבור לדף הבית של מודול השחזור התלת-ממדי. לחץ על פרויקטים כדי לפתוח את דף ניהול הפרויקט. לחץ על פרויקט חדש.
   2. הזן את שם הפרויקט וציין את מיקום האחסון. לחץ על יצירת פרויקט. לחץ על פתח ליד הפרויקט שנוצר לאחרונה. לחצו על ניסוי חדש כדי ליצור ניסוי חדש.
      הערה: פרויקט מייצג סשן עיבוד נתונים כולל, בעוד שניסוי מייצג תהליך עיבוד בודד בתוך הפרויקט. ניתן ליצור מספר ניסויים בתוך פרויקט אחד.
2. ייבוא קבצים
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר ייבוא ולחץ על יצירה. בחר את סוג הקובץ המתאים. ייבא את קבצי ה-.mrc שנוצרו במהלך איסוף הנתונים. הזן את גודל הפיקסלים, מתח התאוצה ומספר המעבדים. לחץ על תור למשימה.
      הערה: כדי לסיים משימה רצה, לחץ על Kill, ואז לחץ על Clear כדי להחזיר את המשימה למצב הבנייה. למשימות שהושלמו או בתור, לחצו על 'ניקוי ' כדי לאפס את סטטוס המשימה.
3. הערכת CTF
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר בהערכת CTF ולחץ על יצירה.
      הערה: מודול השחזור התלת-ממדי תומך במספר אלגוריתמים להערכת CTF. הפרוטוקול הזה משתמש CTFFIND4.
   2. לחץ על כפתור החיבור לחשיפה. בחר את המיקרוגרפים המיובאים לך. הגדר את ניגודיות המשרעת ל-0.1, רזולוציית התאמה מינימלית ל-30 Å. רזולוציית התאמה מקסימלית ל-4 Å, ערך החיפוש המינימלי ל-5,000 Å, ערך חיפוש מיקוד מקסימלי ל-50,000 Å וגודל שלב החיפוש ל-500 Å.
   3. לחץ על תור למשימה.
4. בחירת חלקיקים ידנית
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר בבחירת חלקיקים ואז בחר ב-Blob Picker. לחץ על יצירה. לחץ על כפתור החיבור למיקרוגרפים (חשיפות).
   2. בחר את המיקרוגרפים המיובאים לך. הזן את הפרמטרים הנדרשים. לחץ על תור למשימה. בדוק 3–4 מיקרוגרפים מייצגים. בחר חלקיקים באמצעות כפתור העכבר השמאלי.
   3. בטל בחירת חלקיקים באמצעות כפתור העכבר הנכון. קבעו את טווח קוטר החלקיקים מתוך החלקיקים הנבחרים. קליק , סיימתי לקטוף! להוציא חלקיקים.
      הערה: מדוד חלקיקים לפחות משלושה מיקרוגרפים.
5. קובע גושים
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר בבחירת חלקיקים ואז בחר ב-Blob Picker. לחץ על יצירה. חבר את קלט המיקרוגרפים (חשיפה).
   2. בחר את המיקרוגרפים המיובאים לך. הזן את הפרמטרים הנדרשים. לחץ על תור למשימה.
6. בדוק בחירות חלקיקים
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר בחירות חלקיקים. לחץ על יצירה. חבר את קלט המיקרוגרפים (חשיפה). חבר את קלט החלקיקים.
   2. בחר את הקבצים המתאימים. הזן את הפרמטרים הנדרשים. לחץ על תור למשימה. בדקו 3–4 תמונות מייצגות לאחר סיום העבודה.
   3. אמת את בחירת החלקיקים הנכונה. קליק , סיימתי לקטוף! מיקום פלט.
7. חילוץ חלקיקים ממיקרוגרפים
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר תמצית ממיקרוגרפים. לחץ על יצירה. חבר את קלט המיקרוגרפים (חשיפה). חבר את קלט החלקיקים. בחר את הקבצים המתאימים.
   2. הגדר את גודל קופסת החילוץ ל-2–3 פעמים קוטר החלקיקים. השתמש בגודל קופסת חילוץ של 400 פיקסלים עבור TRPML1. הגדר את גודל הגידול פורייה לרבע עד חצי מגודל קופסת החילוץ.
   3. השתמש בגודל חיתוך פורייה של 100 פיקסלים עבור TRPML1. לחץ על תור למשימה.
      הערה: הפחתת גודל הגידול פורייה מפחיתה את הביקוש החישובי ל-GPU.
8. סיווג דו-ממדי
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר סיווג דו-ממדי. לחץ על יצירה. חבר את קלט החלקיקים.
   2. ייבא את ערימת החלקיקים. הזן את הפרמטרים הנדרשים. לחץ על תור למשימה.
      הערה: בחרו 50–200 כיתות. השתמש בפחות מחלקות למערכי נתונים קטנים ויותר מחלקות למערכי נתונים גדולים יותר.
9. מחלקות דו-ממדיות נבחרות
   1. לחץ על משרה חדשה. בחר שיעורים דו-ממדיים נבחרים. לחץ על יצירה. חבר את קלט החלקיקים. חבר את קלט התבניות.
   2. ייבא את הקבצים הנדרשים. לחץ על תור למשימה. חכה עד שהעבודה תיכנס למצב ההמתנה. לחץ על המתנה.
   3. בחר מחלקות דו-ממדיות ברורות ומוגדרות היטב. לחץ בוצע.
10. יצירת דגמים ראשונית
    1. לחץ על משרה חדשה. בחר ב-Abinit Reconstruction. חבר את קלט החלקיקים. ייבא את החלקיקים הנבחרים.
    2. הכינוס מספר השיעורים הראשונים. הנה את פרמטר הסימטריה. לחץ על תור למשימה.
11. עידון הטרוגני
    הערה: השתמש בשיפור הטרוגני לדגימות הטרוגניות ובעיקול הומוגני לדגימות הומוגניות.
    1. לחץ על משרה חדשה. צור עבודה לשיפור הטרוגני . חבר את קלט החלקיקים. חבר את כניסת הווליום.
    2. בחר את הקבצים המתאימים. הכירו את פרמטרי העידון. ציין את הסימטריה המתאימה (למשל, C1). לחץ על תור למשימה.
12. עידון הומוגני
    1. לחץ על משרה חדשה. צור משימת שיפור הומוגנית . חבר את קלט החלקיקים. חבר את כניסת הווליום.
    2. אפשר לחבר את כניסת המסכה באופן אופציונלי. ייבא את ערימת החלקיקים ואת מחלקת הנפח הטובה ביותר משלב השיפור הקודם. הזן את הפרמטרים הנדרשים.
    3. ציין את הסימטריה המתאימה (למשל, O או C1). לחץ על תור למשימה. לחץ על פלט לאחר סיום העבודה. בדקו את מפת הצפיפות המחודשת בממשק הדפדפן (איור 8).
13. שיפור המפה
    הערה: Map Enhancer משתמש ב-DeepEMhancer²⁴. השתמש בחצאי מפות מתי שאפשר. שינויים פוסט-תרגומיים ומולקולות ליגנד לא נכללו בסט האימון של DeepEMhancer וייתכן שלא ישופרו במדויק. Map Enhancer מבצע חידוד מקומי, הסתרה אוטומטית ודנואיזינג.
    1. לחץ על משרה חדשה. צור משימת משפר מפות. ייבא את הנפח שנוצר במהלך עיבוד הומוגני.
    2. ייבא את המסכה המתאימה. ייבא קבצי מפה דרך אפשרות Map Data Path במידת הצורך. בצע את העבודה.

3. מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה

הערה: מודול מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה מבוסס על מסגרת SMARTFold²⁵ שפותחה בעבר ותומך בבניית מודלים אטומיים לחלבונים וחומצות גרעין (RNA/DNA) ממפות צפיפות קריו-EM.

1. השקת מודול מידול אטומי מבוסס למידה עמוקה
   1. התחבר למערכת מודול מודול אטומי מבוססת למידה עמוקה. פתח את ממשק הגשת המשימות. העלה את מפת צפיפות הקריו-EM בפאנל השמאלי.
   2. הזן את פרמטרי הקלט הנדרשים. הגישו את משימת המידול.
2. העלה את מפת צפיפות הקריו-EM
   1. העלה את מפת הצפיפות בפורמט .mrc, .ccp4 או .map. ודא שגודל הקובץ קטן מ-100MB.
      הערה: אם מפת הצפיפות עולה על 100 MB, הקטין את גודל הקובץ לפני ההעלאה.
      1. חתוך את מפת הצפיפות לאזור העניין באמצעות UCSF ChimeraX²⁶ עם הפקודה: אזור נפח. תדגמו מחדש את המפה לגודל פיקסל גדול יותר.
      2. מרח מסכה רכה להסרת אזורי ממס.
         הערה: בדוק את מפת הצפיפות לפני ההעלאה כדי להבטיח ביצועים מיטביים של המודל ולהפחית את הסיכון לטעויות עיבוד.
3. בדוק והכין את מפת הצפיפות
   1. בצע חיתוך במפת צפיפות.לחיתוך זה מפת הצפיפות תסיר אזורים מיותרים. ודאו שהמפה החתוכה מכילה רק את האזור הנדרש לבניית מודלים.
      הערה: חיתוך מקטין את גודל הקובץ ועוזר למנוע הצפה בזיכרון במהלך יצירת המודלים.
   2. ואז בדוק אם יש Mirror Inversion. בדוק את מפת הצפיפות לאיתור היפוך מראה אפשרי. בחן אזורים α-סליליים במפה. בדוק שהספירלות α מציגות תצורה ימנית וספירלה כלפי מעלה בכיוון נגד כיוון השעון. הפוך את מפת הצפיפות אם מתגלה מבנה מראה.
4. העלאת קובץ הרצף
   1. העלה את קובץ הרצף המתאים. לחילופין, הזן את הרצף ידנית. ספק את כל רצפי החלבון או חומצות הגרעין הכלולים בשחזור.
   2. יש לציין מידע על רצף הטרומרי או הומומרי כאשר זה רלוונטי. הזן את שם החלבון, אם רוצים (שלב אופציונלי).
5. ציין את רזולוציית המפה. הנה התמונה הרזולוציה המדווחת של מפת צפיפות הקריו-EM. בחר את מחיצת המחשוב. בחר את צומת המחשוב של GPU לשימוש ליצירת מודלים.
6. כדי להגדיר משאבי מעבד, הזן את מספר המעבדים שיש להקצה. אל תעלה על שמונה מעבדים. בדוק את כל הקבצים והפרמטרים שהועלו. לחץ על SUBMIT כדי להתחיל יצירת מודל.
7. בדוק את המודל האטומי החזוי
   1. פתח את חלון ההדמיה האינטראקטיבית לאחר סיום העבודה. סובבו את המודל כדי לבדוק תכונות מבניות. התקרב והקטין כדי לבחון פרטים מבניים מקומיים וגלובליים.
   2. בדוק את המודל מכיוונים שונים. הערכת איכות המודל, קונפורמציה מרחבית ותכונות ברמה האטומית. השתמש במודל שנוצר לניתוח ולאימות במורד הזרם.
   3. עיין באיור 9 כדוגמה לממשק ההמחשה.

תוצאות

TRPML1, הידוע גם בשם מוקוליפין-1 (MCOLN1), הוא ערוץ קטיון ליזוזומי החיוני לשמירה על הומאוסטזיס יוני, ויסות תנועת ווסיקולריות ותמיכה באוטופגיה בתאי יונקים^27,28. תפקוד לקוי של TRPML1 הנגרם ממוטציות גנטיות נקשר ישירות למוקוליפידוזיס סוג IV, הפרעת אחסון ניוונית נורודגנרטיבית חמורה המאופיינת בהתפתחות נוירו-תקינה, ניוון רשתית ואנמיה מחוסר ברזל 29,30,31,32.

דיון

הקביעה המבנית של מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרון (קריו-EM) כרוכה במהותה תהליך עבודה ממושך ורב-שלבי, הדורש אינטגרציה הדוקה של כלים חישוביים והסתמכות על התערבות מומחים. הפלטפורמה המשולבת מתמודדת עם אתגר זה על ידי איחוד רכישת נתונים, שחזור תלת-ממדי ומידול אטומי למסגרת אחת משולבת אנכית — צעד לקראת זרימות עבודה קריו-EM יעילות יותר. על ידי הטמעת אלגוריתמים מבוססי בינה מלאכותית לאורך הצינור (למשל למידה עמוקה גיאומטרית לבניית מודלים מונחית צפיפות), הפלטפורמה שואפת להפחית את...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	מודול שחזור תלת-ממדי של פלטפורמת ה- SMART; מרשת עצבית היברידית
מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	משמש לאיסוף נתונים; מצויד במסנן אנרגיה
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	מודול איסוף נתונים אוטומטי של פלטפורמת ה- SMART
DeepEMhancer	מקור פתוח	V0.17	עיבוד לאחר נפח קריו-אלקטרונים מבוסס למידה עמוקה; משולב במגבר מפת CryoSmart
גלאי אלקטרונים ישיר	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	מצלמה המשמשת להקלטת סרטים
רשת	Quantifoil	Au R1.2,1.3	רשת דגימת קריו-אלקטרונים
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	מודול דוגמנות אטומית מבוסס למידה עמוקה של פלטפורמת ה- SMART; מרחיב את מסגרת ה- SMARTFold
פלטפורמת SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	פלטפורמת קריו-אלקטרונים משולבת; ארכיטקטורת שרת-דפדפן (B/S); כוללת את מודולים DataSmart, CryoSmart ו- ModelSmart
תוכנת בקרת TEM	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	תוכנת בקרת מיקרוסקופ אלקטרונים לכוונון משמשי הקרן
Topaz	מקור פתוח	V 2.5	כלי בחירת חלקיקים מבוסס למידה עמוקה; משולב כתוסף בתוך CryoSmart
דגימת חלבון TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 אנושי (מוקוליפין-1); הוכן בבית על ידי מחלקת החלבונים והגבישים
מכשיר הקפאה מיידית	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	להכנת דגימה קריו-אלקטרונים
UCSF Chimera X	UCSF, ארה"ב	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	תוכנה לתצוגה, ניתוח ועוד
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	פלטפורמת זרימת עבודה משולבת קריו-אלקטרונים
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	מסגרת למידה עמוקה שיושבת בבסיס ModelSmart
Leginon	משאב לאומי למיקרוסקופיה מולקולרית אוטומטית (NRAMM)	RRID:SCR_016731	תוכנת איסוף נתונים קריו-אלקטרונים אוטומטית
SerialEM	אוניברסיטת קולורדו	RRID:SCR_017293	תוכנת רכישת TEM/קריו-אלקטרונים אוטומטית
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	תוכנת איסוף נתונים קריו-אלקטרונים אוטומטית
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	רכישה אוטומטית קריו-אלקטרונים רב-רשתית
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	תוכנת רכישת מיקרוסקופיה אלקטרונים
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	מערכת רכישה קריו-אלקטרונים אוטומטית
Auto-EMation	אוניברסיטת צינגחואה	N/A	תוכנת רכישה קריו-אלקטרונים אוטומטית
RELION	מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית	RRID:SCR_016274	תוכנת שחזור קריו-אלקטרונים בייסיאנית
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	עיבוד תמונות ושיחזור קריו-אלקטרונים
EMAN2	מכללת רפואה של ביילוור	RRID:SCR_017270	חבילת עיבוד תמונות קריו-אלקטרונים
CTFFIND4	מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית	RRID:SCR_016732	תוכנת הערכת CTF
Gctf	מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית	RRID:SCR_016500	הערכת CTF מואצת GPU
MotionCor2	מכון מדעי רפואה של הווארד יוז / UCSF	RRID:SCR_016499	תוכנת תיקון תנועה
DeepEMhancer	המרכז הלאומי הספרדי לביוטכנולוגיה (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	שיפור מפת קריו-אלקטרונים מבוסס למידה עמוקה
Topaz	אוניברסיטת קליפורניה בברקלי	RRID:SCR_018037	בחירת חלקיקים מבוססת למידה עמוקה
UCSF ChimeraX	אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו	RRID:SCR_015872	תוכנת הדמיה מולקולרית
CTFFIND4	מעבדת Grigorieff	RRID:SCR_016732	התאמת CTF המשמשת בזרימת העבודה של CryoSmart
EMDB-8840	מאגר נתוני מיקרוסקופיה אלקטרונית	גישה: EMD-8840	מפ