שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

סיכום

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

תקציר

RNA לא מקודד ארוך טווח (lncRNAs) הפכו לווסתים חשובים של תהליכים ביולוגיים מגוונים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שמאחורי תפקודי רוב ה-lncRNA עדיין אינם מובנים היטב. זיהוי חלבונים אינטראקטיביים, במיוחד חלבונים קושרים ל-RNA (RBPs), הוא אסטרטגיה מרכזית להבהרת תפקוד ה-lncRNA. מבין הגישות הזמינות, זיהוי מקיף של חלבוני קישור RNA (ChIRP) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה משמש באופן נרחב בשל עיצוב הגלאי הפשוט ותהליך העבודה הפשוט. ChIRP קונבנציונלי מסתמך על קישוריות פרפורמלדהיד (PFA), שלוכדת הן מגעים ישירים עם חלבון RNA והן אינטראקציות עקיפות המתווכות על ידי גורמי גישור. לעומת זאת, קישור צולב UV בשילוב עם תנאי שטיפה מחמירים שומר באופן מועדף אינטראקציות ישירות בין RNA לחלבון. באמצעות ה-lncRNA Tug1 כמודל, הושוו קישור צולב UV ו-PFA במסגרת ChIRP בתאים מתורבתים, מה שהוכיח כי ChIRP מבוסס UV מעשיר אינטראקציות ישירות בין lncRNA. תהליך עבודה זה מבוסס UV הורחב לאחר מכן לאשכי עכברים, שבו רקמות פורקו לתלויות חד-תאיות לפני קישור ה-UV, מה שאפשר זיהוי חלבוני קישור Tug1 בהקשר רקמתי טבעי. השוואה עם אינטראקטומים שמקורם בקו התאים חשפו אינטראקטורים משותפים וספציפיים לרקמה. שתי אינטראקציות ישירות משותפות אומתו באופן עצמאי על ידי שיפור אימונופרפסיפיציה (eCLIP). גישה זו מבוססת UV של ChIRP נקראת cPDiRT (לכידת חלבונים האינטראקציה הישירה עם מטרה RNA). ביחד, cPDiRT מאפשר זיהוי חלבונים הקשורים ל-lncRNA הן בתאים מתורבתים והן ברקמות מקומיות. השילוב של דיסוציאציה של רקמות וקישור צולב UV מספק אסטרטגיה רחבה ליישום לחקר אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון במערכות איברים מגוונות.

מבוא

מחקרים טרנסקריפטומיים בעלי תפוקה גבוהה לאחרונה חשפו אלפי RNA לא מקודדים ארוכים (lncRNAs) המשתתפים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, החל מארגון כרומטין ועד איתות תאיים ^1,2. למרות הביטוי הרחב וחשיבותם התפקודית, המנגנונים המולקולריים של רוב ה-lncRNA נותרו לא מוגדרים היטב. מכשול מרכזי הוא זיהוי שותפי החלבון הפיזיים שלהם, במיוחד חלבוני קישור RNA (RBPs)^3,4,5.

השיטות הנוכחיות הממוקדות ב-RNA מתבססות בעיקר על קישור משולב כימי, אשר לוכד אינטראקציות ישירות ועקיפות בין RNA לחלבון. כתוצאה מכך, גישות אלו מתאימות יותר למיפוי אינטרקטומים גלובלי מאשר לזיהוי מגעים ישירים אמיתיים⁶. זיהוי מקיף של חלבוני קישור ל-RNA ואחריו ספקטרומטריית מסה (ChIRP-MS) הוא טכניקה נפוצה למיפוי אינטראקציות בין lncRNA-RBP בשל עיצוב הגשוש הפשוט שלה וזרימת העבודה היעילה ^7,8. ChIRP-MS קונבנציונלי משתמש בקישוריות צולבת פאראפורמלדהיד (PFA), הלוכדת הן מגעים ישירים עם חלבון RNA והן אסוציאציות עקיפות המתווכות על ידי גורמי גישור ^9,10.

לעומת זאת, קישור צולב UV ב-254 ננומטר מציע יתרון קריטי. הוא מקשר קוולנטית בין RNA לחלבונים רק כאשר הם נמצאים במגע קרוב לאפס (בדרך כלל <1 Å)¹¹. תהליך זה ממיר קשרי מימן לקשרים קוולנטיים יציבים ומאפשר תנאי שטיפה מחמירים עם מלח גבוה שמסירים אינטראקטורים עקיפים שאינם קשורים קוולנטית. כתוצאה מכך, גישות מבוססות UV מספקות ספציפיות גבוהה יותר לאינטראקציות RNA ו-חלבון ישירות מאשר שיטות קישור משולב כימי^12,13. עם זאת, גישות מבוססות UV עדיין לא מנוצלות מספיק במחקרי אינטראקטום lncRNA שמקורם ברקמות, בעיקר בשל חששות מיעילות הקישור החוצה והגבלת חדירת ה-UV.

כדי לחקור אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון בהקשר פיזיולוגי רלוונטי, נבחר ה-lncRNA Tug1 כמערכת מודל. Tug1 מהווה נקודת ייחוס אידיאלית לאימות תהליך אינטראקציה ישירה תואם רקמות בשל הפנוטיפ החמור שלו וההעשרה הגבוהה באשכים. אבלציה גנטית של Tug1 גורמת לעקרות גברית מלאה, פגיעה ביצירת תאי זרע ומורפולוגיית זרע לא תקינה¹⁴. בנוסף, Tug1 תומך בתפקוד תאי סרטולי ובשלמות מחסום האשכים בדיאטה עתירת שומן¹⁵. למרות הפנוטיפים המבוססים הללו, שותפי החלבון הישירים המתווכים את תפקוד Tug1 באשך—איבר המבטא מספר רב של RBP שזוהו לאחרונה^ב-16—נותרו לא ידועים. פער ידע זה משקף במידה רבה את העובדה שרוב שיטות מיפוי האינטראקציה בין lncRNA לחלבונים פותחו עבור מערכות תאים מתורבתות.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, מסגרת ChIRP שונתה על ידי החלפת קישור צולב PFA בקישור צולב UV כדי ללכוד חלבונים שמקשרים ישירות עם Tug1. האינטראקציות המועמדות אומתו באופן עצמאי על ידי הגברת אימונופרציפיטציה של קישור צולב ואחריה ריצוף עמוק (eCLIP-seq)¹⁷. תהליך העבודה הורחב גם ליישומי רקמות על ידי פירוק רקמת אשך עכבר טרייה לתאים בודדים לפני קישור צולב UV. גישה אופטימלית זו נקראה cPDiRT (לכידת חלבונים הפועלים ישירות עם יעד RNA).

יישום cPDiRT ל-Tug1 באשך העכבר מאפשר מיפוי אינטראקציה ישירה בהקשר רקמתי מקומי. ניסויים מקבילים בתאים מתורבתים סיפקו השוואה צמודה בין פרופילי אינטראקציה מבוססי PFA ל-UV. בשילוב עם אימות eCLIP עצמאי, גישה זו יצרה סט של שותפים מולקולריים בעלי ביטחון גבוה שעשויים לתרום לתפקוד Tug1 במהלך יצירת הזרע. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לכידת חלבונים שמקיימים אינטראקציה ישירה עם lncRNA המטרה הן בתאים מתרבתים והן ברקמות מקומיות. על ידי הגדרת האינטראקטום הישיר של Tug1 באשכים, שיטה זו מקדמת מחקרים מכניים של lncRNA חיוני לפוריות ומספקת פלטפורמה כללית לחקר אינטראקציות בין lncRNA לחלבון ברבייה וברקמות מורכבות אחרות.

פרוטוקול

כל התמיסות הוכנו באמצעות מים אולטרה-טהורים ללא נוקלאז, ללא פרוטאז, וחומרים מגובים. כל החומרים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה (מס' אישור: IACUC-1812003-4) ובוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (המועצה הלאומית למחקר, מהדורה 8). לשמור על עכברים זכרים C57BL/6 (בני 4 שבועות) במחזור של 12 שעות אור/12 שעות חושך עם גישה חופשית למזון ולמים. מזער סבל בעלי חיים על ידי שימוש בבעלי החיים המועטים ביותר הדרושים להשגת מובהקות סטטיסטית. המתת חסד לעכברים באמצעות שאיפת CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים מאושרים.

1. הכינו בופרים

1. הכינו בופר לליסיס תאים
   1. הכינו בופר פירוק תאים המכיל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.0), 10 מ"מ EDTA, ו-1% SDS.
   2. מיד לפני השימוש, הוסיפו 1 mM PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז ומעכב RNase ייעודי.
      אזהרה: SDS הוא מגרה בעור ובעיניים. הימנע משאיפת אבק או אירוסולים. PMSF רעיל מאוד, פועל כמעכב כולינאסטראז, ואינו יציב בתמיסה מימית. הכינו PMSF מיד לפני השימוש. לבש כפפות ומשקפי בטיחות בעת טיפול בחומרים אלו. לטפל ב-PMSF במכסה אדים כימימי.
2. הכנת בופר היברידיזציה
   1. הכינו בופר היברידיזציה המכיל 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, ו-15% פורמיד.
   2. מיד לפני השימוש, הוסיפו 1 mM PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז ומעכב RNase ייעודי.
      הערה: אחסן פורמיד ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מאור.
      אזהרה: פורמיד הוא טרטוגן וסכנת רבייה. לטפל בפורמיד במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות. הימנעו משאימה ומגע עור.
3. הכנת בופר שטיפה
   1. הכינו בופר שטיפה המכיל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.0), 1 מ' NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS ו-0.5% נתרן דאוקסיכולאט.
   2. הגן על בופר הכביסה מאור בזמן האחסון.
4. הכינו בופר לחראנאאז K (PK)
   1. הכינו בופר PK המכיל 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, ו-0.5% SDS.
   2. הוסף פרוטאינאז K לריכוז סופי של 5% מיד לפני השימוש.

2. תכנון והכנת גשושים

1. גשושי אנטיסנס מעצבים
   1. עיצוב גשושי אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס באמצעות מעצב הגשוש המקוון הזמין^{ב-singlemoleculefish.com 18}.
2. השגת גשושים ביוטיניליים
   1. הזמינו גשושי DNA אנטיסנס המכילים שינוי 3'-BiotinTEG.
3. הכינו את בריכת הגשוש
   1. מדלל כל גלאי בנפרד ל-100 מיקרומטר.
   2. ערבב נפחים שווים של כל הגשושים כדי ליצור מאגר גשושים. לשמור על ריכוז אוליגונוקלאוטידים משולב סופי של 100 מיקרומון.
   3. אחסן את בריכת הגשוש בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: פרמטרי עיצוב הגשוש המומלצים הם כדלקמן: (i) פרוב אחד לכל 100 bp של RNA יעד, (ii) תכולת GC יעד של 45%, (iii) אורך גלאי של 20 nt, ו-(iv) מרווח של 60–80 nt בין הגשושים.
      הערה: אם ה-RNA חורג מגבלת הגודל שהתקבל על ידי מתכנן הגשוש, יש לחלק את הרצף לקטעים קטנים יותר לפני התכנון. החריגו אזורים ואזורים חוזרים עם הומולוגיית רצף נרחבת.

3. ביצוע איסוף תאים, פירוק רקמות וקישוריות צולבות UV

1. הכינו בקרות ללא UV
   1. הכינו דגימות ביקורת במקביל לדגימות ניסיוניות.
   2. השמיטו את שלב הקישור הקרסולי UV מדגימות בקרה.
   3. בצע את כל ההליכים הבאים, כולל סוניקציה, משיכת RNA-חלבון, חילוץ RNA והפקת חלבון, באופן זהה לשתי הקבוצות.
      הערה: השתמש בבקרת ללא UV כדי להבחין בין אינטראקציות RNA-חלבון תלויות UV לבין קישור רקע לא ספציפי.
2. איסוף תאים וביצוע קישור צולב UV
   1. תאים מתורבתים בשטיפה
      1. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את מדיום התרבית שנותרו.
   2. תאי קישור צולב
      1. פזר 3 מ"ל PBS באופן שווה על צלחת תרבית בגודל 15 ס"מ.
      2. הקרנת תאים ב-Crosslinker UV של 254 ננומטר במינון של 4000 mJ/cm².
   3. איסוף תאים מקושרים
      1. אסוף תאים ב-PBS לאחר קישור צולב.
      2. צנטריפוגה את המתלים וזרוק את הסופרנטנט.
      3. שקלו את הכדור ואשרו מסה מינימלית של 500 מ"ג לכל דגימה.
3. נתק רקמת אשכים וביצוע קישור צולב UV
   1. הכינו את האשכים
      1. אשכים מפורקים.
      2. שטוף את הטישו פעמיים עם DMEM.
   2. בצע עיכול קולגנאז
      1. לדוג רקמה ב-DMEM המכילה 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז IV בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–15 דקות.
      2. המשך העיכול עד שצינורות זמניפריים משתחררים.
         הערה: אין לעלות על 15 דקות עיכול.
   3. שטפו את הצינורות המיניפריים
      1. צנטריפוגה את המתלים ב-1000 × גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
      2. הסר את הסופרנטנט.
      3. שטפו את הכדור עם 5–10 מ"ל DMEM.
      4. צנטריפוגה שוב באותם תנאים.
   4. בצע עיכול טריפסין
      1. החזירו את הכדור ל-0.25% טריפסין המכיל 1 מ"ג/מ"ל DNase I.
      2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–15 דקות.
         הערה: אין לעלות על 15 דקות עיכול.
   5. עצור את העיכול האנזימטי
      1. הוסיפו כמות שווה של DMEM בתוספת 10% FBS.
   6. יצירת תלייה חד-תאית
      1. מסנן את המתלים דרך מסננת תא 70 מיקרון.
   7. תאי שטיפה
      1. תאי צנטריפוגה ב-2000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. זרוק את הסופרנטנט.
      3. שטפו את הכדור עם 5–10 מ"ל PBS.
      4. צנטריפוגה שוב באותם תנאים.
   8. תאי אשכים משולבים
      1. להחזיר את המתלה החד-תאי ב-PBS.
      2. פזר את התלייה באופן שווה על צלחת תרבית בגודל 15 ס"מ.
      3. הקרנת תאים ב-Crosslinker UV של 254 ננומטר במינון של 4000 mJ/cm².
   9. איסוף תאים מקושרים
      1. לבקרות ללא UV, הימנעו מקרינה.
      2. לאסוף תאים ב-PBS.
      3. צנטריפוגה את המתלים וזרוק את הסופרנטנט.
      4. שקלו את הכדור ואשרו מסה מינימלית של 500 מ"ג לכל דגימה.
         הערה: מספר העכברים הנדרש לקבלת כ-500 מ"ג של כדורי תאים תלוי בגיל ובתפוקת הרקמות. בערך 10–12 עכברים בני ארבעה שבועות שימשו במחקר זה.

4. לבצע סוניקציה

1. הכינו ליזאטים
   1. החזירו כדורי תא בבופר ליליזה ביחס של 100 מ"ג כדור ל-1 מ"ל בופר.
   2. ערבבו היטב כדי לקבל תלייה הומוגנית.
2. דגימות סוניקייט
   1. סוניקט ליזאט באמצעות סוניקטור אמבט מים או אולטרסוניקטור ממוקד.
   2. המשך בקול עד שהליזאט הופך לברור לעין.
      הערה: אימות פיצול DNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. המשיכו בסוניקציה עד שרוב חלקי ה-DNA נעים בין 1 קילובארט ל-2 קילוב.

5. ביצוע משיכת RNA-חלבון כלפי מטה

1. איסוף דגימות קלט
   1. הסר אליקואטים של ליזאט עבור בקרות קלט.
   2. שמרו כ-10 מיקרוליטר לניתוח RNA ו-10 מיקרוליטר לניתוח חלבונים.
   3. שמרו על דגימות קלט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הליכי ההיברידיזציה והשטיפה.
2. ליזאטים פרקליר
   1. הוסיפו 30 מיקרול של חרוזי מגנטיים שטופו מראש לכל דגימה.
   2. דגרו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב עדין בתנור היברידיזציה.
      הערה: שטוף חרוזים מגנטיים לפני השימוש. הנח אליקווטים חרוזים על מעמד מגנטי למשך דקה אחת או עד שהתמיסה מתבהרת. הסר את תמיסת האחסון לחלוטין. שטפו חרוזים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של בופר ליזיס תאים.
3. הסר חרוזי ניקוי מוקדם
   1. הנח דגימות על מעמד מגנטי.
   2. העבר את הסופרנטנט לצינור טרי.
   3. חזור על ההעברה פעם אחת כדי להבטיח הסרה מלאה של החרוזים שנותרו.
4. היברידיזציה של גשושים
   1. הוסף שני נפחים של בופר היברידיזציה לכל דגימה.
   2. הוסף גלאים ביחס של 1 מיקרוליטר של מלאי גלאי 100 מיקרומום לכל 1 מ"ל ליזאט (טבלה משלימה 1).
5. תגובות הכלאה בדגירה
   1. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה על קצה למשך 12–16 שעות בתנור היברידיזציה.
6. הכינו חרוזי לכידה
   1. שטוף 100 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם בופר ליזיס תאים מיד לפני סיום ההיברידיזציה.
   2. הסר את כל הבופר שנותר אחרי הכביסה הסופית.
7. קומפלקסים קשורים ללכידת פרוב
   1. תגובות היברידיזציה בצנטריפוגות לזמן קצר.
   2. החזירו את החרוזים השטופים ב-1 מ"ל של דגימה היברידית.
8. קומפלקסים של קישור לחרוזים
   1. החזיר את מתלה החרוזים לצינור המקורי.
   2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב למשך 30–40 דקות.
9. חרוזים לשחזור
   1. דגימות צנטריפוגות קצרות.
   2. הניחו צינורות על מעמד מגנטי למשך 1–2 דקות או עד שהתמיסה מתבהרת.
   3. זרוק את הסופרנטנט.
   4. הסר נוזל שנותר באמצעות קצה פיפטה.
      הערה: הימנע מהפרעה לכדור החרוז המגנטי בזמן הסרת נוזלים.
10. קומפלקסים שנתפסו על ידי ווש
    1. הוסף 1 מ"ל של בופר כביסה.
    2. שטפו חרוזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף למשך 5 דקות.
    3. חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים.
       הערה: בופר השטיפה מכיל 1 M NaCl, אשר מפריע לאינטראקציות לא קוולנטיות-חלבון-חלבון וחלבון-RNA תוך שמירה על קישורי הצלב המושרים על ידי UV קוולנטי. תנאים מחמירים אלה מסירים אינטראקטורים עקיפים ורקע לא ספציפי, ובכך מעשירים את שותפי החלבון הישירים¹⁹.
11. חומר רזרבי לניתוח RNA
    1. העבר 1%–10% מהחרוזים השטופים לצינור חדש לניתוח RNA.
    2. השתמשו בשאר החרוזים מיד להפקת חלבון או אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
       הערה: עצרו את הפרוטוקול כאן אם צריך. אחסן דגימות חרוזים בטמפרטורה של מינוס 80°C עד להפקת חלבון.
12. חלבוני אלוט
    1. הוסף בופר דגימה SDS לחרוזים.
    2. רתיחו דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לשחרר חלבונים ולהפיכת קישורים צולבים.
    3. המשך לניתוח ספקטרומטריית מסה.

6. חילוץ RNA

1. עיכול חלבונים
   1. החזירו דגימות RNA הקשורות ל-100 מיקרו ליטר של בופר PK.
   2. כוונן דגימות קלט RNA לנפח סופי של 100 מיקרוליטר באמצעות buffer PK.
2. דגירה עם פרוטנאאז K
   1. דגמו דגימות בטמפרטורה של 50°C למשך 45 דקות עם ערבוב רציף.
3. מנטרל פרוטנאז K
   1. דגימות חום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. הוסף ריאגנט TRIzol
   1. הוסף 500 מיקרוליטר של תגובת טריזול לכל דגימה.
   2. מערבולת ביסודיות.
   3. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: תגובת טריזול מכילה פנול וגואנידין תיוציאנט. לטפל במגיב במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות. הימנעו משאימה ומגע עור. אם יש מגע עור, יש לשטוף מיד עם סבון ומים.
5. ביצוע הפרדת פאזה
   1. הוסיפו 100 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה.
   2. מערבולת ביסודיות.
   3. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שחזור הפאזה המימית
   1. דגימות צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות.
   2. העבר את השלב המימי העליון לצינור טרי.
7. קישור RNA לעמודי טיהור
   1. הוסף נפח שווה של 100% אתנול לשלב המימי.
   2. ערבב היטב.
   3. העמס דגימות על עמודות טיהור RNA.
8. טיהור RNA
   1. בצע ניקוי RNA לפי הוראות היצרן.
   2. RNA אלוט ב-30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
9. אימות העשרת RNA באמצעות qRT-PCR
   1. השתמשו ב-1 מיקרוליטר RNA מושלף בכל תגובה ל-PCR שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR).
   2. העריך את העשרת ה-RNA המטרה ביחס לביקורת.

7. ביצוע ניתוח LC-MS/MS

1. הפרדת חלבונים לפי SDS-PAGE
   1. מערבבים חלבונים שהתקבלו בשלב 5.12 עם 4× בופר דגימה של LDS.
   2. הפרדו חלבונים על ג'ל ביס-טריס של 4%–12%.
   3. צבעי את הג'ל עם ערכת צביעה בכסף.
   4. להסיר את כל מסלול החלבון כרצועה אחת.
2. חלקי ג'ל למס
   1. הסר את רצועת החלבון באמצעות סכין מנתח נקי.
   2. מזער את כמות הג'ל העודף.
   3. חתוך את הג'ל לכ-1 מ"מ³ חתיכות.
   4. העבר חתיכות ג'ל לצינור של 0.5 מ"ל.
3. חלקי ג'ל להסרת צבע
   1. הוסף 100 מיקרו ליטר של תמיסת הסרת צבעים.
   2. מערבולת ל-10 דקות.
   3. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך דקה אחת.
   4. הסר את הסופרנטנט.
   5. חזור על תהליך ההסרה עד שחתיכות הג'ל הופכות לשקופות.
4. הפחתת חלבונים
   1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הפחתה.
   2. דגרו בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   3. דגימות קרות לטמפרטורת החדר.
   4. צנטריפוגה לזמן קצר והסר את הסופרנטנט.
5. חלבוני אלקילט
   1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת אלקילציה.
   2. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך.
   3. הסר את הסופרנטנט.
   4. שטפו חתיכות ג'ל עם 100 מיקרוליטר של בופר עיכול למשך 5 דקות.
6. עיכול חלבונים
   1. הוסף מספיק תמיסת טריפסין כדי לכסות לחלוטין את חתיכות הג'ל.
   2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות.
7. תמצית פפטידים
   1. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת חילוץ.
   2. סוניקייט ל-15 דקות או וורטקס ל-30 דקות.
   3. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך דקה אחת.
   4. העבר את הסופרנטנט לצינור טרי.
   5. חזור על הליך ההוצאה פעמיים.
   6. אסוף את כל התמציות.
   7. תמציות יבשות מאוחסנות בריכוז ואקום למשך כ-1 שעה.
8. ניקוי פפטידים באמצעות StageTip
   1. החזירו פפטידים מיובשים ל-20 מיקרוליטר של חומצה פורמית (FA) של 0.1%.
   2. טעין דגימות על C18 StageTip.
   3. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות.
   4. שטוף את ה-StageTip עם 20 מיקרוליטר של 0.1% FA.
   5. פפטידים אלוטים עם 20 מיקרוליטר של 60% אצטוניטריל/0.1% FA לתוך בקבוקון LC-MS.
   6. ייבשו את האלואוט.
   7. השעתי מחדש פפטידים ב-10 מיקרוליטר של 0.1% FA.
      הערה: עצרו את הפרוטוקול כאן אם צריך. אחסן פפטידים מטוהרים בטמפרטורה של -80°C לפני ניתוח LC-MS/MS.
9. רכישת נתוני LC-MS/MS
   1. שחזור פפטידים בחומצה פורמית של 0.1%.
   2. פפטידים נפרדים בעמוד אנליטי של 75 מיקרון × 250 מ"מ C18 בקצב זרימה של 300 ננוליטר לדקה.
   3. מרח את גרדיאנט הממס B הבא (0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל):
      2%–25% B מעל 0–40 דקות
      25%–40% B במשך 40–48 דקות
      40%–99% B לאורך 50–57 דקות
      החזק על 99% B למשך 3 דקות
   4. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב רכישת נתונים תלויה.
   5. רכוש ספקטרום MS בסריקה מלאה בטווח m/z של 350–1200 ברזולוציה של 70,000.
   6. רכוש חמש עשרה סריקות דיסוציאציה התנגשויות באנרגיה גבוהה (HCD) MS/MS ברזולוציה של 17,500.
   7. הקליטו מיקרוסקאן אחד בכל סריקה.
   8. הגדר את ההחרגה הדינמית ל-30 שניות.
10. נתוני ספקטרומטריית מסה תהליכית
    1. עבד נתונים גולמיים באמצעות MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. חפש ספקטרום מול רצפי חלבון עכבר שהורדו מ-UniProt.
    3. ציין טריפסין כאנזים העיכול.
    4. אפשר מקסימום שני חיתוך שהחמצו.
    5. יש לציין חמצון מתיונין כשינוי משתנה.
    6. יש לציין קרבאמידומתילציה ציסטאין כשינוי קבוע.
    7. קבע את סבילות המסה של קדם-מקור וקטע ל-15 ppm ו-20 ppm, בהתאמה.
    8. לשלוט בשיעור הגילוי השגוי של 1% הן ברמות הפפטיד והן ברמות החלבון.
    9. הערכת שפע חלבונים באמצעות כימות ללא תוויות מבוסס iBAQ.

8. ביצוע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים

1. ניתוח העשרה פונקציונלית
   1. בצע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) באמצעות חבילת clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. השתמש במסד הנתונים GO (v2024-09-20) כמקור להערות ייחוס.
   3. החלו תיקון Benjamini-Hochberg לבדיקות מרובות.
   4. הגדר מובהקות סטטיסטית כערך P מותאם (FDR) < 0.05.

9. ביצוע אימות eCLIP-seq

1. הכינו דגימות eCLIP
   1. בצע חיסון חירוי משופר (eCLIP) כפי שתואר קודם¹⁷.
   2. הכינו דגימות תאים משולבות ב-UV לאימונופרציפיטציה של PABPC1 ו-CCT3.
   3. דגימות Lyse באמצעות מאגר ליזיס eCLIP.
2. קומפלקסים של חלבוני RNA אימונופרסיפיט
   1. הוסף 10 מיקרוגרם נוגדן לכל דגימה.
   2. לכידת קומפלקסים של חלבוני RNA על חרוזים מגנטיים.
   3. אסוף דגימות קלט לפני אימונופרציפיטציה.
3. הכנת ספריות RNA
   1. RNA הקשורים לחלבון דפוספורילאט.
   2. חבר מתאם RNA של 3 רגל כדי להחזיר RNA.
   3. שטוף דגימות עם אימונופרציפיטציה והזנה בתנאים מחמירים.
   4. קומפלקסים של אלוט על ידי הרתיחת החרוזים.
   5. רזולור דגימות על ג'ל גרדיאנט של 4%–12% ביס-טריס.
   6. העבר קומפלקסים מופרדים לממברנת ניטרוצלולוז.
4. שחזור RNA
   1. להסיר אזור ממברנה מותאם לגודל.
   2. לעכל חלבונים באמצעות אוריאה ופרוטונאז K.
   3. לשחזר RNA מהממברנה.
5. יצירת ספריות רצף
   1. תמלול הפוך שחזר RNA ל-cDNA.
   2. לטהר cDNA באמצעות אקסונוקלאז I ותערובת פוספטאז אלקליני של שרימפס.
   3. חבר מתאם DNA לקצה 3' של ה-cDNA באמצעות ליגז RNA של T4.
   4. הגברת ספריות באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה.
   5. ספריות מוגברות נפרדות על ג'ל אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 3%.
   6. לטהר ספריות לפי גודל נבחר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל.
   7. ספריות רצף על פלטפורמת Illumina.
6. ניתוח נתוני eCLIP-seq
   1. נתח נתוני רצף באמצעות צינור ENCODE eCLIP²⁰.
   2. מתאמי גימור ודימרים של מתאם 3' משתמשים ב-cutadapt (v1.14).
   3. יישר קריאות לרכיבי UCSC חוזרים באמצעות STAR (v2.7.6a).
   4. הסר מיפוי קריאות לאלמנטים חוזרים.
   5. יישר את הקריאות שנותרו לגנום ההתייחסות של mm10 (GENCODE vM23).
   6. הסר כפילויות PCR.
   7. זהה אתרי קישור מועשרים באמצעות CLIPPER.
   8. הגדר שיאים משמעותיים כאלה עם העשרת קיפול ≥ 8 ו-P מותאם ≤ 0.001.
   9. זיהוי שיאים ניתנים לשחזור באמצעות סף שיעור גילוי בלתי שכפול (IDR) של 0.01.

תוצאות

כדי לזהות חלבוני קישור ל-Tug1, שולב קישור צולב UV בתהליך העבודה של ChIRP, ויצר שיטה בשם cPDiRT (איור 1). ChIRP קונבנציונלי בוצע לראשונה בתאי GC2 להעשיר חלבונים האינטראקטיביים עם Tug1 (איור 2A, B). ניתוח ספקטרומטריית מסה זיהה יותר מ-190 חלבונים מועשרים יחסית לביקורת שלילית (איור 2C; טבלה משלימה 2). לעומת זאת, cPDiRT-MS שבוצע במינון UV אופטימלי של 40...

דיון

cPDiRT פותח כפרוטוקול מבוסס ChIRP מותאם שמחליף קישור צולב פרפורמלדהיד (PFA) בקישור צולב UV כדי ללכוד באופן סלקטיבי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון. על ידי שילוב דיסוציאציה אנזימטית של רקמת אשכים טרייה לתאים בודדים עם קישור צולב UV, מיפוי אינטראקציה ישירה הורחב מקווי תאים מתורבתים לרקמות מקומיות. ניסויים מקבילים בתאים מתורבתים אפשרו השוואה צמודה בין גישות מבוססות PFA ל-UV, ואינטראקציות שמקורן ב-UV אומתו באופן עצמאי על ידי eCLIP-seq. תוצאות אלו מראות כי ניתן לשלב בהצלחה קישור צולב UV ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	לשימוש בפירוק רקמות והכנת השעיה של תא יחיד
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	לניקוי RNA
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	לסינתזת eCLIP cDNA
Anti-CCT3 Antibody	Abcam	Ab225878	נוגדן עבור eCLIP
Anti-PABPC1 Antibody	Abcam	Ab312314	נוגדן עבור eCLIP
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	לחילוץ RNA
Collagenase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	לפירוק אנזימטי של רקמת האשכים
Dephosphorylation reagents (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	לדה-פוספורילציה של RNA eCLIP
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11965092	לתרבית תאים ולחיץ פירוק רקמות
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	65001	ללכידה של קומפלקסים של חלבון-RNA-גלאי ביוטין
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	להפרדת חרוזים מגנטיים
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	להפרדת חרוזים מגנטיים
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	לכליה של קטיונים דו-ערכיים בחיצי ליזה ושטיפה
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	לטיהור eCLIP cDNA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	להפסקת עיכול הטריפסין
Formamide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	להכנת חיץ הכלאה
Hybridization Oven	TUOHE	LF-I	להכלאה של גלאי ולשטיפת חרוזים
Low-Melting-Temperature Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	להפרדת גודל ספריית eCLIP
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	להפרדת גודל ספריית eCLIP
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	לטיהור RNA
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	להכנת חיץ שטיפה עם מלח גבוה
Nitrocellulose Membrane	GE Healthcare / Amersham	10600002	להעברה של חלבון מערבי eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	לדטרגנט בחיץ שטיפה
Nuclease- and protease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035	להכנת פתרונות נטולי נקלאזות
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	להפרדת גודל eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	להפרדת חלבונים ב-SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	לשטיפת תאים ולהשעיה מחדש
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	מעכב פרוטאז סרין לחיץ ליזה תאי; מתווסף טרי לפני השימוש
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	מעכב פרוטאז רחב-ספקטרום לחיץ ליזה תאי; מתווסף טרי לפני השימוש
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850	לעיכול חלבונים בחילוץ RNA
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	ל-RT-PCR כמותי לאישוש העשרת RNA
RNase/Protease-Free DNase I Solution	Thermo Fisher Scientific	EN0521	לפירוק רקמות
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	לטיהור RNA
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0286	להכנת דגימת חלבון
Shrimp Alkaline Phosphatase	New England Biolabs	M0371S	לטיהור eCLIP cDNA
Silver Stain Kit	Beyotime	P00175	להדמיה של חלבונים בג'לים SDS-PAGE
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	לדטרגנט בחיץ שטיפה
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	לליזה תאית ודנטורציה של חלבונים
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	מעכב RNase מיוחד; מתווסף טרי לפני השימוש
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	לליגציה של מתאם eCLIP
Tris–HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	להכנת חיצי ליזה, הכלאה ושטיפה
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	לחילוץ RNA
Ultrasonic cell crusher	ATPIO	ATPIO-650D	לליזה תאית ושבירת DNA
Ultraviolet Crosslinker	Analytik Jena	UVP CL-1000	לקישור צולב UV של אינטראקציות RNA-חלבון
urea	Sigma-Aldrich	U5128	לפירוק חלבון eCLIP על ממברנה