פרוטוקול זה מתאר הקמה של מודל עכבר לאסתמה אלרגית (AA) המושרה על ידי ovalbumen (OVA), במטרה להעריך את המנגנונים הטיפוליים של Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST) על דלקת דרכי נשימה מסוג 2, באמצעות ויסות של תאי לимפואיד מולדים מקבוצה 2 (ILC2s) בריאות דרך מסלול ה-calcitonin gene-related peptide (CGRP)/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1).
מאמר מחקר
טיפול בהדבקת נקודת הדיקור Kechuanting מקל על דלקת דרכי נשימה מסוג 2 בעכברים עם אסטמה אלרגית על ידי ויסות מספר ה-ILC2s
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הוכח כי טיפול בהדבקת נקודות דיקור Kechuanting (KAST) משפר ביעילות דלקת של דרכי הנשימה בחולים עם אסתמה אלרגית (AA); עם זאת, המכניזמים שבבסיסו נותרו לא ברורים. מחקר זה נועד לחקור את המכניזמים הטיפוליים של KAST במודל עכברים של AA מנקודת מבט נוירו-אימונולוגית. הוקם מודל של אסתמה אלרגית בעכברים שהושרה על ידי אוובומן (OVA), והעכברים טופלו ב-KAST. השפעות ה-KAST על תאים לימפואידיים מולדים מקבוצה 2 (ILC2s) בריאות ועל דלקת של דרכי נשימה מסוג 2 הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה, צביעת hematoxylin-eosin (HE) ואימונוהיסטוכימיה. Western blotting (WB) ו-ELISA שימשו להערכת רמות חלבון הפפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) ברקמות הריאה. ה diberikan CGRP או מעכב לקולטני CGRP, BIBN-4096, בדרך האף לעכברים עם אסתמה אלרגית כדי לבחון את התפקיד הרגולטורי של מסלול CGRP/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1) על ILC2s ועל דלקת של דרכי נשימה מסוג 2. KAST הפחית את מספר ה-ILC2s והקל בדלקת של דרכי נשימה מסוג 2, בליווי ירידה בביטוי CGRP ברקמות הריאה. מתן CGRP תוך-נחיר הגביר את ה-RAMP1+ILC2s ואת סך ה-ILC2s בריאות והחמיר את דלקת דרכי הנשימה מסוג 2. לעומת זאת, מתן תוך-נחיר של BIBN-4096 הפחית את ה-ILC2s הריאתיים והקל בדלקת של דרכי נשימה מסוג 2. KAST מפחית דלקת של דרכי הנשימה באסתמה אלרגית, דבר הקשור קשר הדוק להסדרה חיובית (downregulation) של מסלול CGRP/RAMP1 ולדיכוי עוקב של ILC2s ריאתיים, כפי שנתמך על ידי עיכוב פרמקולוגי.
מבוא
אסטמה אלרגית (AA) היא הפנוטיפ השכיח ביותר של אסטמה, ואחראית ל-60–80% מכל מקרי האסטמה בסין1. היא מאופיינת בשכיחות גבוהה ובשליטה תת-אופטימלית במחלה, הפוגעת קשות באיכות חיי המטופלים ומטילה נטלים כלכליים משמעותיים2,3,4,5. למרות שסטרואידים שנשאפים (ICS) נותרים עמוד השדרה של הטיפול הקליני6, חלק מהמטופלים מראים תגובתיות מוגבלת, ושימוש ממושך קשור לעיתים קרובות לתופעות לוואי ולחוסר יכולת לעצור את התקדמות המחלה7. לכן, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, בטוחות ויעילות, נותר בעדיפות עליונה הן בהקשרי קליניקה והן במחקר. טיפול בהדבקת נקודות דיקור Kechuanting (KAST), יישום חיצוני של הרפואה הסינית המסורתית, מעביר תרכובות פעילות דרך העור (transdermally), מה שעשוי למנוע את אפקט המעבר הראשון בכבד ולמזער תגובות לוואי מערכתיות8,9. מחקרים קליניים הדגימו כי KAST יכול להקל על תסמיני אסטמה, לשקם חלקית את תפקוד הריאות ולשפר את איכות חיי המטופלים10,11,12. במקביל, מטבוליזים של סרום, פרמקולוגיה של רשתות ומחקרים בבעלי חיים באמצעות מודלים של אסטמה מצביעים על כך ש-KAST מפחית דלקת בדרכי הנשימה על ידי הורדת רמות של מתווכי דלקת בסרום ובנוזל שטיפת ברונכ׳י-אלבולארית (BALF), כולל ויסות פחות (downregulating) של ביטוי IgE, IL-4 ו-IL-139,13,14. יחד, ממצאים אלו מספקים ראיות תומכות ליעילות הטיפולית של KAST באסטמה. עם זאת, מנגנוני הפעולה המדויקים שלו נותרים לא ברורים.
מנגנון פתולוגי מרכזי המניע את חזרת ה-AA הוא דלקת דרכי נשימה מסוג 2, שבה תאים לימפואידיים מולדים מקבוצה 2 (ILC2s) ממלאים תפקיד מפתח15. בעקבות גירוי לאלרגן, ILC2s מפרישים ציטוקינים כגון IL-5 ו-IL-13, ובכך מניעים דלקת בדרכי הנשימה16,17. מחקרים הראו כי דילול של ILC2s מקל באופן משמעותי על דלקת דרכי הנשימה בעכברים עם אסתמה, מה שמדגיש את תפקידם המרכזי בהתקדמות המחלה18. באופן בולט, ההפעלה והתפקוד של ILC2s מווסתים באופן הדוק על ידי מנגנונים מרובים, כאשר אינטראקציות נוירו-אימוניות זוכות לתשומת לב גוברת בשנים האחרונות. ראיות חדשות מצביעות על כך שפפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) יכול להיקשר לחלבון RAMP1 (receptor activity-modifying protein 1) על פני השטח של ILC2s, להוביל להפעלתם ולהפרשה עוקבת של ציטוקינים מסוג 2, המגבירה את דלקת דרכי הנשימה ב-AA19,20,21. במחקר הנוכחי, סריקת RNA-sequencing (RNA-seq) ברגישות גבוהה שערכנו זיהתה את CGRP כנוירופפטיד תגובתי קריטי המודר באופן משמעותי על ידי התערבות KAST. לפיכך, תוך התמקדות במסלול CGRP/RAMP1, השתמשנו ב-KAST כהתערבות בעכברי AA כדי לבחון את המנגנונים הפוטנציאליים שלו בויסות פעילות ILC2 ובהקלה על דלקת דרכי נשימה מסוג 2.
פרוטוקול
כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסם על ידי האקדמיות הלאומיות למדעים. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של בית החולים המסופח לאוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית (מספר אישור 2023DW-059-01). רשימה מקיפה של כל החומרים, הריאגנטים, הכלים והתוכנות ששימשו במחקר זה מפורטת בטבלת החומרים.
בעלי חיים ניסייתיים וחלוקה לקבוצות
עכברים נקביים בריאים מסוג BALB/c (דרגת SPF, בני 8–10 שבועות) הושגו מהמרכז לבעלי ניסוי של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית (רישום מס׳ SYXK (Su) 2018-0049). בעלי החיים שהו בתנאים סטנדרטיים עם מחזור אור/חושך של 12 h בטמפרטורה של 24–26 °C. מזון ומים סטריליים סופקו ad libitum, המצע הוחלף באופן קבוע והכלובים נקיים באופן שגרתי. לאחר 7 ימי הסתגלות, העכברים חולקו באופן אקראי לשישה קבוצות (n = 7 לקבוצה): קבוצת ביקורת (Normal), קבוצת מודל, קבוצת CGRP, קבוצת BIBN-4096, קבוצת KAST וקבוצת KAST + CGRP. בעלי החיים הוקצו לקבוצות באופן אקראי באמצעות טבלת מספרים אקראיים שהופקה במחשב. הקצאת הקבוצות הוסתרה מהחוקרים עד להקצאת ההתערבויות. כדי למקסם את ניצול הרקמה, דגימות ריאה מהקוהורט שהוקצה אקראית (n = 7 לקבוצה) הוקצו באופן שיטתי למסלולי עיבוד שונים, כאשר גדלי המדגמים המדויקים שנותחו (n = 5, 4 או 3) עבור בדיקות היסטולוגיות ומולקולריות ספציפיות צוינו במפורש במקראות של האיורים הרלוונטיים. לא הוצאו נתונים מהניתוח.
הכנת פורמולציית KAST
הפורמולציה הוכנה על ידי המחלקה לרוקחות בבית החולים המסונף לאוניברסיטת ננג'ינג לרפואה סינית 22. נעשה שימוש בתשעה צמחי מרפא סיניים מסורתיים: Semen Brassicae (2 חלקים), Rhizoma Corydalis (2 חלקים), Radix Kansui המעובד בחומץ (חלק 1), Asarum (חלק 1), Ephedra (חלק 1), Semen Lepidii (חלק 1), ציפורן (חלק 1), קליפת קינמון (חלק 1), ו-Gleditsia sinensis (חלק 1). כל צמח נטחן לאבקה דקה ועבר דרך נפה של 80-mesh. לכל 100 g של תערובת האבקה, נוספו 70 mL של מיץ ג'ינג'ר טרי ו-30 mL של paraffin נוזלי, ערבוב יסודי, ועיבוד למדבקות של 0.3 g ± 5% בקוטר של 0.5 cm. באופן ספציפי, כל מרכיבי הצמחים והג'ינג'ר הטרי אומתו על ידי הרוקח הראשי Lin-gang Zhao ואוחסנו ב-4 °C בסביבה חשוכה ויבשה לפני השימוש9. כדי להבטיח את השחזור של ההתערבות ואת היציבות בין סדרות ייצור, הוטמע סטנדרט קפדני לבקרת איכות המבוסס על שיטות UPLC-Q-TOF-MS ו-HPLC שפיתח הצוות שלנו, אשר אישרו את הנוכחות העקבית של מרקרי פעילות עיקריים כגון sinapine thiocyanate23. למעשה, המדבקות בגודל 0.5 cm קובעו באמצעות סרט דבק רפואי נושם והיפואלרגני בגודל 2.5 cm × 5.5 cm כדי להבטיח הולכה טרנסדרמלית אופטימלית.
הקמה של מודל העכבר AA
מודל ה-AA הושרה על פי פרוטוקול מבוסס מהספרות באמצעות רגישות ל-OVA ואתגר תוך-אפי (intranasal challenge)24. למעט קבוצת הנקיאים (Normal), כל העכברים עברו רגישות באמצעות הזרקה תוך-בטנית של 200 µL סליין המכיל 100 µg OVA ו-2 mg אלומיניום הידרוקסיד בימים 0 ו-12. מהימים 18 עד 23, העכברים עברו אתגר תוך-אפי פעם ביום עם 50 µg OVA ב-50 µL סליין. מהימים 24 עד 53, OVA ניתן באופן תוך-אפי מדי יומיים. ביום 54, לאחר שקילת העכברים, בוצע המתנסיא (euthanasia) באמצעות נקיעה של צווארו של העכבר, ונאספו רקמות. לאחר מכן, נקבע מקדם הריאה על ידי חלוקת המשקל הכולל של הריאה במשקל הגוף.
התערבויות
מימים 40 עד 53, עכברים בקבוצת ה-KAST ובקבוצת ה-KAST + CGRP גולחו על פני שטח גבי שגודלו 3 cm × 6 cm. מדבקות הונחו מעל נקודות הדיקור הדו-צדדיות Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) ו-Shenshu (BL23), וקובעו באמצעות סרט דבק למשך 1.5 h פעם ביום במשך 14 ימים רצופים. עכברים בקבוצות ה-CGRP וה-KAST + CGRP קיבלו מתן אינטראנזלי של 10 µL של תמיסת Calcitonin/CALCA (בריכוז 1 pg/µL) מדי יום שני, מהיום ה-40 עד היום ה-53. עכברים בקבוצת ה-BIBN-4096 קיבלו מתן אינטראנזלי של 10 µL של תמיסת BIBN-4096 (בריכוז 0.3 mg/mL, אנטגוניסט לקולטן CGRP) מדי יום שני. קבוצות השליטה (Normal) והמודל קיבלו האכלה סטנדרטית ללא התערבות. טיפול ה-KAST ניתן מהיום ה-40 עד היום ה-53, לאחר ביסוס הדלקת דרכי הנשימה האלרגית (החל מהיום ה-40, שהוא 22 ימים לאחר חשיפה ראשונה ל-OVA ביום ה-18). לפיכך, ה-KAST במחקר זה שימש כהתערבות טיפולית ולא כמנעית.
להכנת העור, בוצעה הסרת שיער באזור הגבי השיווי באמצעות מכונה חשמלית. איתור נקודות הדיקור בוצע בהתאם לנהלי ה-Nomenclature and Location of Acupoints for Laboratory Animals - Part 3: Mice (T/CAAM 0002-2020) שפורסמו על ידי ה-Chinese Acupuncture-Moxibustion Society. ארבעה זוגות של נקודות גביות בילטרליות סומנו במדויק והוגדרו כדלקמן: Feishu (BL13: בין הצלעות מתחת לזיז של החוליה החזית השלישית, 3 mm לטרלי לקו האמצע האחורי), Geshu (BL17: מתחת לזיז של החוליה החזית השביעית, 3 mm לטרלי לקו האמצע), Pishu (BL20: מתחת לזיז של החוליה החזית השני עשרה, 3 mm לטרלי לקו האמצע), ו-Shenshu (BL23: מתחת לזיז של החוליה המותנית השנייה, 3 mm לטרלי לקו האמצע). סרט הדבקה של 3M נכרך בחוזקה כדי להשיג היצמדות יציבה, תוך הבטחה שלא תתרחש תזוזה של המדבקה או שחיקה משנית של העור במהלך תקופת ההחזקה של 1.5 h.
מינוני ה-CGRP/CALCA (בנפח של 1 pg/µL, 10 µL לעכבר) וה-BIBN-4096 (בנפח של 0.3 mg/mL, 10 µL לעכבר) נבחרו על בסיס מחקרים שפורסמו25. באופן ספציפי, עבור ההתערבות ב-CGRP, הוכר תמיסת 0.1% BSA על ידי המסה של 1 mg של BSA ב-1 mL של ddH2O, ולאחר מכן ערבוב במערבל Vortex להשגת ריכוז סופי של 1 mg/mL. לפני השחזור, אבקת החלבון הליאופיליזית Calcitonin/CALCA סובבה בצנטריפוגה ב-12,000 × g למשך 30 s ב-4 °C. לאחר מכן, הוספו 20 µL מתמיסת ה-0.1% BSA שהוכנה כדי להשיג תמיסת מלאי בריכוז 1 µg/µL. את המבחנה הפכו בעדינות מספר פעמים (ללא ערבוב במערבל Vortex), סובבו בצנטריפוגה למשך שניות ספורות, והשאירו בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות כדי להבטיח שחזור מלא של החלבון. כדי להכין את תמיסת העבודה בריכוז 1 pg/µL מבלי ליצור נפח גדול מדי בשלב אחד, בוצע דילול סדרה סטנדרטי בשני שלבים: 1 µL מתמיסת המלאי בריכוז 1 µg/µL דוללו תחילה ב-999 µL של תמיסת סליין סטרילית להכנת תמיסה ביניים בריכוז 1 ng/µL, ולאחר מכן 1 µL מתמיסת ביניים זו עורבבו עם 999 µL נוספים של תמיסת סליין סטרילית להשגת תמיסת העבודה הסופית בריכוז 1 pg/µL. תמיסת העבודה נשמרה ב-4 °C, בעוד ששאר המנות (aliquots) נשמרו ב-20 °C- למשך עד 2–3 חודשים. עבור קבוצת ה-BIBN-4096, 1 mg של אבקת BIBN-4096 הומסו ב-333 µL של ddH2O כדי לקבל תמיסת מלאי בריכוז 3 mg/mL, אשר חולקה למנות של 50 µL למבחנה ונשמרה ב-80 °C-. להכנת תמיסת העבודה בריכוז 0.3 mg/mL, כל מנה של 50 µL מתמיסת המלאי עורבבה היטב עם 450 µL של תמיסת סליין סטרילית. מהיום ה-40 עד היום ה-53, נפח של 10 µL של תמיסת CGRP בריכוז 1 pg/µL או תמיסת BIBN-4096 בריכוז 0.3 mg/mL הניתן למנה תוך-אפית (intranasally) לכל עכבר בכל יום שני, תחת ריסון עדין וללא הרדמה.
מדדי תוצאה ושיטות זיהוי
בדיקות התנהגותיות
ביום ה-53, לאחר החשיפה האינטראנזאלית האחרונה, נ monitored ונרשמו תדירויות אירועי השפשוף האפי והעיטוכים באמצעות מערכת וידאו דיגיטלית למשך 10 min. תדירויות ההתנהגות בסרטוני הווידאו נספרו באופן בלתי תלוי על ידי שני חוקרים בשיטת סמיות כפולה. במקרים של אי-הסכמה משמעותית בין הספירות שלהם, חוקר שלישי העריך מחדש את הסרטון, והנתונים בעלי העקביות הגבוהה ביותר נבחרו בסופו של דבר לניתוח סטטיסטי.
מבחן פרובוקציה סימפונית
בתוך 24 שעות לאחר האתגר הסופי, נבחנו תגובתיות דרכי הנשימה באמצעות אצטילכולין (ACh) בערפיל בריכוזים של 0, 5, 10, 20 ו-40 mg/mL (300 µL לכל ריכוז, בערפיל למשך 1 דקה). ערכי Penh (Enhanced pause), מדד חסר יחידות המשמש להצבעה אמפירית על התכווצות דרכי הנשימה ולהערכת תגובתיות יתר של דרכי הנשימה (AHR), נרשמו למשך 5 דקות לאחר כל ערפיל באמצעות פלתיסמוגרפיה לא פולשנית של הגוף כולו. העכברים הותאמו לתא למשך 10 דקות לפני הרשמה. ה-Penh חושב באופן אוטומטי באמצעות התוכנה של מערכת האחסון/הזרמה הידנית המשולבת, בהתאם לנוסחה אמפירית המאזנת בין זמן הנשיפה/שאיפה לבין שיאי הזרימה.
היסטופתולוגיה (צביעת HE)
רקמות ריאה שקובעו ב-4% paraformaldehyde עברו דהידרציה באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת, הבהרה ב-xylene, והטמעה בבלוקים של פראפין באמצעות מעבד אוטומטי. הבלוקים נחתכו לעובי של 4 µm, הצופו באמבט מים בטמפרטורה של 42 °C, והועברו לעלSlides זכוכית. ה-Slides נאפו ב-80 °C למשך 2 h והויבשו למשך לילה לפני קירור לטמפרטורת החדר. לצורך צביעה, החתכים עברו דה-פראפיניזציה ב-xylene (I ו-II, 20 min כל אחד), רהידרציה באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100% I/II ו-75%, 5 min כל אחד), ושטיפה במי ברז. ה-Slides נצבעו ב-hematoxylin למשך 3–5 min, עברו דיפרנציאציה ב-1% acid alcohol, וצביעה כחולה בתמיסת bluing. לאחר שטיפה, החתכים עברו דהידרציה באמצעות אתנול 85% ו-95% (5 min כל אחד) וצביעת נגד ב-eosin למשך 5 min. לבסוף, ה-Slides עברו דהידרציה באתנול מוחלט (I, II, ו-III, 5 min כל אחד), הבהרה ב-xylene (I ו-II, 5 min כל אחד), הטמעה ב-neutral balsam, וייבוש באוויר. תמונות צולמו משדות אקראיים בהגדלה של 200× באמצעות מיקרוסקופ אור ושימוש במערכת CaseViewer. דלקת בריאה ועבוי אפיתליאלי דורגו באופן עיוור בסולם של 0–4: 0, ללא דלקת; 1, תאי דלקת מדי פעם; 2, מעט (<3) מוקדי דלקת; 3, מוקדי דלקת מרובים (≥3); 4, חדירה דיפוזית בכל הריאה. העבוי האפיתליאלי דורג כך: 0, נורמלי; 1, עבוי נראה; 2, עבוי חלקי של דרכי הנשימה; 3, חסימה כמעט מלאה; 4, היעדר מבנה נורמלי. עבור כל קבוצה ניסויית, סה"כ 20 שדות מיקרוסקופיים אקראיים צולמו והוערכו כדי לקבל את ציוני ההיסטופתולוגיה הגולמיים. הנתונים מכל ארבעה שדות חושבו כממוצע כדי להניב נקודת נתון בלתי תלויה אחת, מה שהוביל לגודל מדגם סופי של n = 5 חזרות לקבוצה לצורך ניתוח סטטיסטי. הדירוג בוצע באופן עיוור.
ריצוף RNA (RNA-seq)
RNA כולל הופק מרקמות ריאה של עכברים באמצעות ריאגנט TRIzol בהתאם לפרוטוקול היצרן. טוהר ה-RNA, ריכוזו ושלמותו הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר ופלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה. ספריות טרנסקריפטום הוכנו באמצעות ערכה מסחרית להכנת ספריות ורוצפו בפלטפורמת ריצוף רב-תפוקה כדי להפיק קריאות זוגיות (paired-end) באורך 150 bp. נתוני הגלם עברו בקרת איכות באמצעות תוכנת סינון מתאימה להשגת קריאות נקיות, שמופו לגנום הייחוס באמצעות כלי יישור המזהה אתרי חיבור (splice-aware alignment tool). רמות ביטוי הגנים חושבו כ-FPKM, וספירת הקריאות בוצעה באמצעות כלי לספירת קריאות. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע באמצעות חבילה סטטיסטית ייעודית, כאשר הספים נקבעו לפי |log2 Fold Change| ≥ 1 ומתוקנן p < 0.05.
ELISA
רקמות ריאה טריות של עכברים נשקלו בדיוק והומוגניזות בבופר PBS ביחס קבוע של 20 mg רקמה ל-200 µL בופר. ההומוגנאטים סנטריגוזים במהירות של כ-13,400 × g למשך 10 min ב-4 °C כדי לאסוף את עליון החלבונים. לצורך נורמליזציה, תוכן החלבון הגולמי של העליונים כולובה בשיטת BCA. הליך ה-ELISA בוצע בשלוש חזרות טכניות באמצעות ערכות מסחריות בהתאם לפרוטוקול היצרן. בקצרה, 50 µL של דילול סטנדרטים או 50 µL של דגימות מדוללות מראש (10 µL דגימת חלבון מעורבבת עם 40 µL מדלל דגימות, להשגת דילול סופי של פי 5) הוספו ללוחיות 96-בארים מצופות בנוגדנים. הלוחיות נסגרו ודגרו ב-37 °C למשך 30 min. לאחר חמישה שטיפות עם בופר שטיפה מדולל ביחס של 1:30, הוספו 50 µL של ריאגנט צמידה מקושר לאנזים לכל באר (מלבד בארי השליליים), והתערובת דגרה ב-37 °C למשך 30 min. לאחר חמש שטיפות נוספות, הוספו 50 µL של תמיסת כרומוגן A ו-50 µL של תמיסת כרומוגן B לכל באר, והלוחית דגרה בחושך ב-37 °C למשך 10 min. התגובה הופסקה על ידי הוספת 50 µL של תמיסת עצירה, אשר שינתה את הצבע מכחול לצהוב. הבליעה (ערך OD) של כל באר נמדדה ב-450 nm באמצעות קורא מיקרו-לוחיות תוך 15 min. עקומות סטנדרט שורטטו באמצעות מודל רגרסיה ליניארית או לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים (תוך הבטחת R2 > 0.99), ומהן חושבו ריכוזי חלבוני המטרה בהומוגנאטים של רקמת הריאה.
ציטומטריית זרימה
רקמות ריאה הוצאו, קוצצו ועובדו בעיכול ב-5 mL של RPMI-1640 המכיל 10% FBS, 50 µL Liberase TM ו-5 µL DNase I ב-37 °C למשך 45 דקות תוך ניעור במהירות של 80 rpm. התו suspension שעבר עיכול הועבר דרך מסננת תאים של 400-mesh וסובב בצנטריפוגה ב-300 × g למשך 10 דקות ב-4 °C. המשקע הוסעה ב-2 mL של בופר לליזה של אריתרוציטים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר שטיפה, התאים הוסעה וצבעו ב-Ghost Dye Red 780 (כ-1.25 µL לדגימה) למשך 20 דקות ב-4 °C בחשיכה לצורך הדירה של תאים מתים. בעקבות שטיפה, התאים נחסמו באמצעות 10 µL של FcR Blocking Reagent למשך 10 דקות ב-4 °C. לאחר מכן, התאים עברו צביעה שטחית עם הנוגדנים הבאים המצומדים לפלואורוכרום למשך 30 דקות ב-4 °C: FITC anti-mouse CD45 (כ-0.5 µL), PE anti-mouse/human KLRG1 (כ-1.25 µL), BB700 rat anti-mouse CD90.2 (כ-0.5 µL), ותערובת lineage ביוטינילית המכילה anti-mouse CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (כל אחד 0.5 µL), ו-anti-mouse CD19 (כ-2 µL). לאחר שטיפה, התאים דגרו עם Brilliant Violet 605 Streptavidin (כ-2 µL) למשך 30 דקות ב-4 °C. הנתונים נרכשו בפלטפורמת BD flow cytometer ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. מטריצות פיצוי של זליגת פלואורסצנציה (spillover compensation) נוטרו והותאמו באופן אוטומטי על ידי תוכנת הרכישה המכוילת של המכשיר. אסטרטגיית ה-gating ההיררכית לזיהוי תאי pulmonary ILC2s יושמה ברצף כדלקמן: תחילה בודדו לימפוציטים כוללים באמצעות מורפולוגיה של פיזור קדמי/צדי (FSC-A/SSC-A), ולאחריהם ביצוע הבחנה בין דובלטים באמצעות gating של סינגלטים (FSC-H/FSC-A). תאים חיוניים זוהו לאחר מכן על ידי הדירה של תאים מתים (Ghost Dye-), ולאחר מכן הוחלו בהדרגה gates סטנדרטיים לבחירת אוכלוסיות CD45+ ו-Lineage-. בתוך חלון ה-gating של תאים חיוניים CD45+ Lineage- , הוגדרו וכומתו תאי pulmonary ILC2s באופן מפורש על בסיס gates רצופים ומדורגים של אשכולות CD90.2+ ו-KLRG1+.
אימונופלואורסצנציה (IF)
חתכים קפואים של ריאה הופשרו בטמפרטורת החדר למשך 15–30 min ונשטפו שלוש פעמים עם PBST (PBS המכיל 0.05% Tween-20) למשך 6 min בכל פעם להסרת תרכובת ה-OCT. לאחר ספיגת עודפי נוזלים, שרטטו מחסום הידרופובי סביב הרקמה באמצעות עט אימונוהיסטוכימיה. החתכים הוכשרו בבופר חסימה (blocking) וחדירה (permeabilization) המכיל 0.3% Triton X-100 ו-5% סרום עיזים בטמפרטורה של 37 °C למשך 100 min, ולאחר מכן הוכשרו למשך לילה (16–20 h) ב-4 °C עם הנוגדן הראשוני. למחרת, החתכים הותאמו לטמפרטורת החדר למשך 30 min, נשטפו שלוש פעמים עם PBST, והוכשרו עם נוגדן משני מדתו סגול לצבע פלואורופורי התואם את המין ב-37 °C בחושך למשך 60–90 min. לאחר שלושה שטיפות PBST נוספות, בוצע צביעה נגדית של הגרעינים באמצעות DAPI (מהול ביחס של 1:1 או 2:1 ב-PBS) למשך 8 min בטמפרטורת החדר בחושך. בעקבות סבב סופי של שטיפות PBST (3 × 6 min), החתכים הועמדו על זכוכית באמצעות חומר עיגון למניעת דהייה (anti-fade mounting medium), נחתמו למניעת היווצרות בועות ואוחסנו בחושך. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי בהגדלה של 400×. מספר התאים החיוביים בכל שדה נספר ידנית באמצעות תוכנת Leica LAS X. עבור כל קבוצה ניסיונית, צולמו סך הכל 15 שדות מיקרוסקופיים אקראיים כדי לקבל את ספירת התאים הגולמית. הנתונים מכל שלושה שדות חושבו כממוצע כדי להניב נקודת נתון עצמאית אחת, מה שהוביל לגודל מדגם סופי של n = 5 חזרות לכל קבוצה לצורך ניתוח סטטיסטי. הספירה בוצעה באופן עיוור.
אימונוהיסטוכימיה (IHC)
חתכי פאראפין עברו דה-פאראפיניזציה בשלושה סבבים של xylene (15 דקות כל אחד), רהידרטציה בסדרה מדורגת של ethanol (100% פעמיים, 85% ו-75%; 5 דקות כל אחד), ושטיפה במים מזוקקים. שחזור אנטיגן בוצע בבופר ציטראט (pH 6.0) באמצעות סיר לחץ (3 דקות בלחץ גבוה לאחר רתיחה), ולאחריו קירור ושלושה שטיפות של 5 דקות ב-PBS (pH 7.4). פראוקסידאז אנדוגני נחסם באמצעות 3% H2O2 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר השטיפה, החתכים הוקפו בעט הידרופובי ונחסמו עם 3% goat serum למשך 30 דקות. לאחר מכן, החתכים דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים המדוללים ב-PBS: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300), או anti-IL-13 (1:150). למחרת, החתכים נשטפו ודגרו עם נוגדנים שניוניים המצומדים ל-HRP (anti-mouse עבור IL-4; anti-rabbit עבור IL-5 ו-IL-13) למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. האותות הוויזואלו באמצעות תמיסת DAB שהוכנה טרי לפני השימוש תחת בקרה מיקרוסקופית, והתהליך הופסק באמצעות מי ברז. לבסוף, החתכים נצבעו בצביעה נגדית עם hematoxylin, עברו דיפרנציאציה, הכחלה (bluing), דהידרטציה באמצעות אלכוהולים מדורגים ו-xylene, וסופקסו ב-neutral balsam לבחינה מיקרוסקופית. צפיפות אופטית ממוצעת (IOD/Area) נמדדה באמצעות פלטפורמת תוכנה לניתוח תמונות בהגדלה של 200×. עבור כל קבוצה ניסויית, צולמו סך הכל 15 שדות מיקרוסקופיים אקראיים כדי לקבל את הערכים הגולמיים. הנתונים מכל שלושה שדות חושבו כממוצע כדי להניב נקודת נתון עצמאית אחת, מה שהביא לגודל מדגם סופי של n = 5 חזרות לקבוצה לצורך ניתוח סטטיסטי. הדירוג בוצע על ידי שני צופים מסווגים (blinded).
תסמיך חלבון (Western blot - WB)
להכנת הדגימות, רקמות ריאה של עכברים (כ-30 mg) קצצו דק והומוגניזרו ב-300 µL של באפר ליזיס RIPA מקורר מראש, בתוספת 1% תערובת מעכבי פרוטאז/פוספטאז. ההומוגניזציה בוצעה באמצעות הומוגניזר רקמות ב-60 Hz למשך ארבעה מחזורים (60 s למחזור). לאחר מכן, התמליגים סנטריגו בערך ב-13,400 × g למשך 15 min ב-4 °C לאיסוף תסמיך הליזיס. ריכוזי חלבון כוללים נקבעו באמצעות ערכה סטנדרטית של BCA protein assay. הדגימות נורמלו, ערבוב עם loading buffer בריכוז 5x ביחס נפחים של 4:1, ועברו דנטורציה ב-95 °C למשך 7 min. עבור SDS-PAGE, דגימות חלבון (20 µg לכל נתיב) הועמסו יחד עם ס marker למשקל מולקולרי של חלבון צבוע מראש, הופרדו במתח קבוע של 80 V למשך 20 min, ולאחר מכן המתח הועלה ל-120 V למשך 70 min. החלבונים הועברו בשיטת wet-transfer לממברנות PVDF של 0.22 µm תחת זרם קבוע של 300 mA למשך 120 min באמבט קרח. הממברנות נחסמו עם 5% BSA ב-TBST למשך 1 h בטמפרטורת החדר ודגרו באופן תכף (עד 18 h) ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד CGRP (1:500) ו-GAPDH (1:2000). לאחר שטיפה עם TBST שלוש פעמים (10 min בכל פעם), הממברנות דגרו עם נוגדנים משניים המשורשריים ל-horseradish peroxidase (1:10000) למשך 1–2 h בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שטיפות נוספות, פסי החלבון הודגמו באמצעות תסבירי כימולומינסנציה מוגברים (ECL) במערכת דימוי VILBER Fusion FX. עוצמות הפסים כוונתו באמצעות ImageJ 1.8, וביטוי חלבוני המטרה נורמל לבקרת הפנימית GAPDH.
ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים הניסויים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ניתוח הנתונים והשרטוט הסטטיסטי בוצעו באמצעות פלטפורמת תוכנה סטטיסטית ייעודית. לפני השוואות בין קבוצות, מערכי הנתונים הועמדו באופן שיטתי לבדיקת נורמליות. עבור נתונים בעלי התפלגות נורמלית ושונויות הומוגניות, בוצע ניתוח שונות (ANOVA) חד-כיווני או דו-כיווני רגיל, ולאחריו מבחני post hoc מסוג Tukey, Šídák, Holm-Šídák או Fisher’s LSD להשוואות זוגיות מרובות. בעת השוואת קבוצות מרובות מול קבוצת ביקורת אחת, הוחל מבחן Dunnett. עבור מערכי נתונים עם שונויות הטרוגניות, נעשה שימוש ב-Brown-Forsythe ANOVA, ולאחריו מבחן post-hoc מסוג Dunnett's T3. עבור מערכי נתונים שלא תאמו התפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחן Kruskal-Wallis לא-פרמטרי, ולאחריו מבחן post hoc מסוג Dunn להשוואות מרובות. ערך P < 0.05 נחשב כמעיד על הבדלים מובהקים סטטיסטית. רמות מובהקות שונות מסומנות באופן דינמי כ-*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ו-****p < 0.0001. כל הערכות תוצאות הניסוי, כולל דירוג היסטולוגי, ניתוח ציטומטריה של זרימה וכמותיות של תמונות, בוצעו באופן מסותר (blinded) באופן קפדני.
תוצאות
KAST מפחית את תאי ILC2 הריאתיים ומקל על דלקת דרכי נשימה מסוג 2
כדי לבחון את ההשפעות הטיפוליות של KAST, הוקם מודל עכברים עם AA המושרה על ידי OVA, אשר טופלו במדבקות שהוחלו בנקודות הדיקור Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20), ו-Shenshu (BL23) (איור 1A). לאחר יצירת המודל, עכברי ה-AA הראו ירידה במשקל הגוף, בעוד שעכברי ה-KAST הראו עלייה משמעותית במשקל הגוף בהשוואה לקבוצת המודל (איור 1B). מקדם הריאה, המהווה אינדיקטור לדלקת ריאתית, היה מוגבר בעכברי AA אך פחת באופן ניכר לאחר KAST (איור 1C). הערכות התנהגותיות חשפו עלייה בגירוד באף ובעיטושים בעכברי AA, תסמינים שהוקלו באופן משמעותי על ידי KAST (איור 1D–E). פלתיסמוגרפיה של הגוף כולו הדגימה כי ערכי Penh, המעידים על תגובתיות יתר של דרכי הנשימה, היו מוגברים בעכברי AA אך פחתו בעקבות הטיפול, מה שמעיד על שיפור בתפקוד הריאות (איור 1F). ניתוח היסטופתולוגי עם צביעת HE חשף חדירה של תאי דלקת פרי-ברונכיאלית ופרי-אלבאולרית בקבוצת המודל בהשוואה לבקרות נורמליות. לעומת זאת, חדירת תאי הדלקת פחתה בקבוצת ה-KAST (איור 2A–B). אימונוהיסטוכימיה הראתה כי IL-4, IL-5, ו-IL-13 ממוקמים בעיקר בציטופלזמה של תאי דלקת חודרים ובחלק מתאי האפיתל, עם הצטברות פוטנציאלית בחללים הבינתיים. בהשוואה לבקרות נורמליות, קבוצת המודל הראתה עלייה ניכרת באותות חיוביים ובערכי צפיפות אופטית ממוצעת, אשר פחתו באופן משמעותי בקבוצת ה-KAST (איור 2C–H). ציטומטריה של זרימה הדגימה עוד כי מספר תאי ה-ILC2 היה מוגבר משמעותית בריאותיהם של עכברי AA בהשוואה לבקרות נורמליות, בעוד ש-KAST הפחית באופן ניכר את מספר תאי ה-ILC2 (איור 2I–J).
KAST מקל על דלקת דרכי נשימה מסוג 2 על ידי דיכוי ציר CGRP/RAMP1
הפעלה יתרה של ILC2 מוסדרת על ידי גורמים מרובים. ניתוח RNA-seq גילה כי ביטוי של CGRP עלה באופן משמעותי בעכברי AA, ו-KAST הפחית באופן ניכר את רמות ה-CGRP הריאתיות (איור 3A). Western blot ו-ELISA אישרו רמות חלבון CGRP מוגברות בקבוצת המודל בהשוואה לבקרות, רמות שהופחתו על ידי KAST (איור 3B–D). תוצאות אלו מרמזות כי KAST מחליש את ביטוי ה-CGRP בריאות של AA, ובכך מושפע על תגובות חיסוניות של ILC2. יחד, שינויים אלו בריצוף עם ספיקות גבוהות ובסריקת חלבונים מצביעים על קשר חזק בין ההתערבות הטיפולית ב-KAST לבין הפחתת רמות ה-CGRP הריאתיות בעכברי AA.
כדי לבחון לעומק את תפקידו של CGRP, עכברי AA טופלו ב-CGRP חיצוני, באנטגוניסט לקולטן CGRP שנקרא BIBN-4096, או ב-KAST בשילוב עם CGRP. תוצאות ELISA הראו רמות חלבון CGRP מופחתות באופן משמעותי בקבוצות KAST ו-BIBN-4096, רמות גבוהות בקבוצת CGRP, ורמות גבוהות יותר בקבוצת KAST + CGRP בהשוואה ל-KAST לבדו (איור 4A). ציטומטריה של זרימה גילתה כי מספר תאי ILC2 פחת בקבוצות KAST ו-BIBN-4096, אך עלה בקבוצות CGRP ו-KAST + CGRP ביחס לקבוצת המודל (איור 4B–C). צביעת HE הראתה חדירה מופחתת של תאי דלקת מסביב לנשמיות ולנאדיות בקבוצות KAST ו-BIBN-4096, בעוד שהחדירה החמירה בקבוצות CGRP ו-KAST + CGRP (איור 4D–E). בדיקות ELISA אישרו עוד ירידה ברמות של IL-4, IL-5 ו-IL-13 בקבוצות KAST ו-BIBN-4096, אך עלייה ברמות אלו בקבוצות CGRP ו-KAST + CGRP (איור 4F–H).
מספר תאי ה-RAMP1+ILC2 הריאתיים בקבוצות השונות הוערך באמצעות צביעת אימונופלורסצנציה רב-צבעית. התוצאות הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת הנורמלית, מספר כלל תאי ה-RAMP1+ILC2 ברקמות הריאה של קבוצת המודל עלה באופן משמעותי. בהשוואה לקבוצת המודל, מספר תאי ה-RAMP1+ILC2 הריאתיים עלה באופן משמעותי עוד יותר בקבוצת ה-CGRP, בעוד שחלה ירידה בולטת הן בקבוצת ה-BIBN-4096 והן בקבוצת ה-KAST. באופן בולט, בהשוואה לקבוצת ה-KAST, קבוצת ה-KAST + CGRP הראתה עלייה משמעותית במספר תאי ה-RAMP1+ILC2 הריאתיים, מה שמעיד על כך שהשלמה חיצונית של CGRP הפכה בהצלחה את ההשפעות המעכבות של KAST על אוכלוסיות כלל תאי ה-RAMP1+ILC2 (איור 5A–B).
זמינות נתונים:
מערכי הנתונים הגולמיים המלאים שהופקו ונותחו במהלך המחקר הנוכחי הופקדו במאגר נגיש לציבור. באופן ספציפי, חומרים מקיפים אלה כוללים את כל סריקות הממברנה המלאות והמקוריות עבור בדיקות Western blot (WB), את כל התמונות המיקרוסקופיות הגולמיות והמלאות ברזולוציה גבוהה עבור בדיקות היסטולוגיה (HE ו-IHC) ואימונופלואורסצנציה (IF), וכן מערכי נתונים של חזרות בודדות וגיליונות אקסל של כימות. כל הנתונים הגולמיים זמינים באופן פתוח ב-DOI הקבוע הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. סדר ה-gating עבור ציטומטריית זרימה מופיע ב-איור משלים 1. שתי תמונות blot מלאות הוגשו כ-איורים משלימים 2–3, והנתונים הכמותיים הוגשו ב-טבלה משלימה 1.
איור 1השפעות של KAST על תסמינים ותפקוד ריאות בעכברי AA. (Aפרוטוקול להשראת אסתמה אלרגית באמצעות OVA.B) סטטיסטיקה של משקל גוף של עכברים בכל קבוצה, n = 5. (C) מקדם ריאה של עכברים בכל קבוצה, n = 5. (ד') מספר שפשופי האף בתוך 10 דקות לאחר החשיפה האחרונה, n = 5. (ה) תדירות העיטורים בתוך 10 דקות לאחר החשיפה האחרונה, n = 5. (F) ערכי Penh של עכברים בכל קבוצה לאחר גירוי בריכוזים שונים של אצטילכולין, n = 5. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD).p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני או ANOVA דו-כיווני, ולאחריהן מבחן השוואות מרובות post hoc במידת הצורך. n = חזרות ביולוגיות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ויסות של מספר תאי ILC2 ושל דלקת דרכי נשימה מסוג 2 על ידי KAST בעכברי AA. (A) שינויים מורפולוגיים בריאות שנבחנו באמצעות צביעת HE. סרגל קנה מידה = 50 µm. הגדלה: 200×. ציון הדלקת הוערך באופן מסמיך (blinded). (B) ניתוח סטטיסטי של ציוני דלקת בין קבוצות שונות, n = 5. (C–H) תמונות IHC מייצגות וערכי צפיפות אופטית ממוצעת של ביטוי חלבוני IL-4 (C, D), IL-5 (E, F), ו-IL-13 (G, H) ברקמות ריאה של קבוצות שונות, n = 5. סרגל קנה מידה = 50 µm. הגדלה: 200×. (I) תרשימי זרימה (flow cytometry) מייצגים המראים את ה-gating הסופי של ILC2s ריאתיים בקבוצות Normal, Model ו-KAST. תאים חיים מסוג Singlet סוננו באופן רצופי כ-CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), ולאחר מכן CD90.2+, כאשר ILC2s ריאתיים זוהו בסופו של דבר על ידי ביטוי חיובי של KLRG1+. הנתונים נאספו על פלטפורמת flow cytometry בעלת ביצועים גבוהים ונותחו באמצעות חבילת תוכנה ייעודית לניתוח flow cytometry. (J) ניתוח של ILC2s המיוצג על ידי אחוז תאי CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ מבין התאים החיים, n = 5. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחני השוואה מרובים (post hoc) מתאימים. n = חזרות ביולוגיות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.
איור 3: KAST מעכב את ביטוי ה-CGRP ברקמות הריאה של עכברי AA. (A) מפת חום (Heatmap) של ביטוי גנים בין קבוצות שונות, n = 4. (B) תמונות WB מייצגות של ביטוי CGRP (10 kDa) ו-GAPDH (37 kDa) ברקמות ריאה מכל קבוצה. (C) ניתוח WB של ביטוי חלבון CGRP ברקמות ריאה, מוצג כביטוי CGRP יחסי (יחס CGRP/GAPDH), n = 3. (D) ניתוח ELISA של ביטוי חלבון CGRP ברקמות ריאה, n = 4. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות post hoc. n = חזרות ביולוגיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 4השפעות של KAST על מספר תאי ILC2 ועל דלקת דרכי נשימה מסוג 2 באמצעות CGRP בעכברי AA. (A) ניתוח ELISA של ביטוי חלבון CGRP ברקמות ריאה מקבוצות שונות, n = 4. (Bתרשימי זרימה (flow cytometry plots) מייצגים של תאי ILC2 (CD45⁺ שושלת⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) בכל קבוצה. (Cניתוח של תאי ILC2, כפי שבא לידי ביטוי באחוז ה-CD45⁺ שושלת⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ תאים מתוך תאים חיים, n = 5. (ד') שינויים מורפולוגיים בריאות שנבחנו באמצעות צביעת HE. סרגל קנה מידה = 50 µmהגדלה: 200×. (ה) ניתוח סטטיסטי של מדדי דלקת בין קבוצות שונות, n = 5. (F–Hניתוח ELISA של IL-4ז׳), IL-5 (ג'), ו-IL-13 (הביטוי חלבון ברקמות ריאה מקבוצות שונות, n = 4. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני, ולאחריו מבחני השוואות מרובות post hoc מתאימים. n = חזרות ביולוגיות. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השפעות של KAST על מספר ה-ILC2 ברקמות ריאה באמצעות נתיב ה-CGRP/RAMP1. (A) ספירת תאי RAMP1⁺ ILC2s (המוגדרים כתאים בעלי ביטוי משולש של KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) לכל שדה בהגדלה של 400× ברקמות ריאה, n = 5. (B) צביעה פלואורסצנטית מייצגת של רקמות ריאה. הגרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול), וביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית עבור KLRG1 (סגול), GATA3 (אדום) ו-RAMP1 (ירוק). סרגל קנה מידה = 50 µm. כימות: ספירה ידנית של RAMP1⁺ ILC2s (תאי KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) באופן סמיות באמצעות פלטפורמה ייעודית לניתוח תמונות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן post hoc להשוואות מרובות. n = חזרות ביולוגיות. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.
איור משלים 1: תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגים המראים את אסטרטגיית ה-gating הרצפית לבידוד של ILC2s ריאתיים. ראשית, בוצע gating לאירועים כוללים באמצעות פיזור קדמי (FSC-A) ופיזור צדי (SSC-A). דובלטים הוצאו באמצעות FSC-A לעומת FSC-H כדי לקבל תאים בודדים. תאים חיים זוהו כ-Ghost Dye Red 780⁻ כדי לסנן אוכלוסיות של תאים מתים. לאחר מכן בוצע gating ללוקוציטים על בסיס CD45⁺, ולאחריו בחירה של תאים שליליים לשושלת (Lin⁻). בתוך תת-האוכלוסייה של CD45⁺ Lin⁻, בוצע gating נוסף לתאים CD90.2⁺, ובסופו של דבר הוגדרו ILC2s ריאתיים על פי ביטוי חיובי של KLRG1 (KLRG1⁺).אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.
איור משלים 2: תמונת Western blot נציגה של ביקורת פנימית GAPDH (37 kDa) מדגימות רקמת ריאה של עכבר. הצפיפות האופטית המשולבת של הפסים כומתה באמצעות תוכנת ImageJ לצורך נורמליזציה לאחר מכן.אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.
איור משלים 3: תמונת Western blot מייצגת של חלבון המטרה CGRP (10 kDa) מדגימות רקמת ריאה של עכבר. הביטוי היחסי של CGRP חושב על ידי חלוקת הצפיפות האופטית המשולבת (integrated optical density) של פסי ה-CGRP בערכי הצפיפות האופטית המשולבת התואמים של GAPDH.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
טבלה נלווית 1: ערכי נתונים גולמיים. ערכי נתונים גולמיים ששימשו לשרטוט הגרפים.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
הטיפול ב-AA ניצב בפני מספר מגבלות, הכוללות תופעות לוואי הקשורות לשימוש ממושך בתרופות, שליטה חלקית בתסמינים והישנות תכופה. למרות שהטיפול התרופתי הקונבנציונלי יעיל, הוא מלווה לעיתים קרובות בתוצאות שליליות כגון תלות בסטרואידים26,27. לעומת זאת, KAST מציעה חלופה בטוחה, כלכלית ונוחה לניהול של AA. ראיות קליניות הראו כי KAST יכולה להקל ביעילות על תסמיני אסתמה על ידי ויסות התפקוד החיסוני הריאתי28. במחקר זה, הדגמנו עוד כי KAST מפחיתה דלקת דרכי נשימה מסוג 2 בעכברים עם AA על ידי דיכוי של מסלול ה-CGRP/RAMP1 והפחתה של מספר ה-ILC2s.
חסינות מולדת, ובמיוחד תאי ILC2s, ממלאת תפקיד חיוני ביזום, הגברה ותחזוקה של דלקת דרכי נשימה מסוג 2 ב-AA29. עם חשיפה לאלרגנים, תאי ILC2s מגיבים במהירות לאלרמינים (alarmins) המופרשים מהאפיתליום, ומפרישים כמויות גדולות של IL-5 ו-IL-13 בתוך שעות, ובכך מעוררים תגובות דלקתיות מסוג 230,31. יתרה מכך, תאי ILC2s מקדמים התמיינות של Th2 וסינתזה של IgE, מה שמעצים עוד יותר את התגובות החסוניות האדפטיביות ומחמיר את הדלקת בדרכי הנשימה32. מחקרים הראו כי אבלציה גנטית של ILC2s מקצרת באופן משמעותי את משך הדלקת בדרכי הנשימה במודלים של AA, מה שמדגיש את תפקידם המרכזי בשימור דלקת מסוג 218. תאי ILC2s מווסתים על ידי ציטוקינים (למשל, IL-25, IL-33, TSLP), מתווכי דלקת (למשל, לוקוטריאנים) ונוירופפטידים (למשל, CGRP, VIP, NMU)33. מבין אלה, נוירופפטידים ממלאים תפקידים מכריעים בוויסות החסינות המולדת. Neuromedin U (NMU) מגביר ישירות את פעילות ה-ILC2, ומשרה שחרור מהיר של IL-5 ו-IL-1334. Vasoactive intestinal peptide (VIP) תורם לספיגת חומרי הזנה ולוויסות ציר השעון הביולוגי, מקדם ייצור של IL-5 על ידי ILC2s ושומר על הומיאוסטזיס של אאוזינופילים33. CGRP מגביר באופן ניכר את שחרור ה-IL-5 מתאי ILC2s, ובכך מקדם דלקת בדרכי הנשימה ב-AA. ראוי לציין כי RAMP1, תת-הקולטן של CGRP, מבוטא ברמות גבוהות בהרבה ב-ILC2s בהשוואה לקולטנים של נוירופפטידים אחרים, מה שמרמז כי CGRP הוא הליגנד העוצמתי ביותר להפעלת ILC235. במחקר זה, ניתוח טרנסקריפטומי זיהה את CGRP כאחד הנוירופפטידים בעלי הביטוי השונה ביותר בעכברי AA, ובדיקות ברמת החלבון אישרו את העלייה בביטויו ברקמות הריאה. מתן חיצוני של CGRP הגביר עוד יותר את מספר תאי ה-ILC2 ואת שחרור ציטוקינים מסוג 2, דבר שהחמיר את הדלקת בדרכי הנשימה.
מבחינה מכניסטית, CGRP נקשר ל-RAMP1 על גבי ILC2s כדי לווסת את התגובות החיסוניות הבאות בעקבות זאת. בעוד שחלק מהספרות הקיימת מאפיינת את CGRP כווסת שלילי המגביל את התרחבות ה-ILC2 כדי להגן מפני דלקת יתר20,21, ראיות סותרות מעידות כי CGRP יכול לשתף פעולה עם alarmins כדי לעורר באופן חזק חיסון מולד מקבוצה 2 בתוך מיקרו-סביבות פתולוגיות ספציפיות. נקודות הסיום הניסיוניות שלנו תואמות באופן ספציפי את השלב האחרון של רצף זה, ומראות על ויסות חיובי של חדירת ILC2 ריאתית המונעת על ידי CGRP במיקרו-סביבה אלרגית המושרית על ידי OVA. לעומת זאת, חסימה של מסלול ה-CGRP באמצעות האנטגוניסט לקולטן BIBN-4096 משפרת באופן משמעותי את הדלקת בדרכי הנשימה המתווכת על ידי ILC2. במקום לספק ראיות ישירות למחיקה גנטית, הממצאים שלנו מנצלים וריאציות טרנסקריפטומיות אסוציאטיביות וניסויי התערבות פרמקולוגיים מקבילים (בשימוש ב-CGRP אקסוגני ובאנטגוניסט BIBN-4096) כדי להוכיח שההגנה הטיפולית של KAST נמצאת במתאם הדוק עם דיכוי של מקבצי סיגנלינג CGRP/RAMP1 על גבי ILC2s.
למרות ממצאים מבטיחים אלה, יש להכיר במספר מגבלות מובנות. ראשית, בעוד שמודל העכברים המושרה על ידי OVA מספק תובנות מכניסטיות בעלות ערך, ייתכן שהוא אינו משחזר באופן מלא את הנוף הפתופיזיולוגי והאימונולוגי המורכב של אסתמה אלרגית בבני אדם בשל הבדלים בין-מיניים. שנית, גודל המדגם הקטן יחסית במספר בדיקות ראשוניות מחייב שימוש בקבוצות גדולות יותר כדי להשיג הכללה סטטיסטית רחבה יותר. שלישית, מחקר זה תיעד בראש ובראשונה את ציר הסיגנלינג של CGRP/RAMP1/ILC2, מה שמעיד על כך שנתיבי תקשורת נוירו-אימונית רלוונטיים אחרים ורשתות ציטוקינים חופפות מצריכים חקירה מעמיקה יותר בעתיד. באופן בולט במיוחד, מגבלה טכנית מרכזית היא היעדר קבוצת ביקורת ייעודית להדבקת נקודות דיקור דמי (sham) המשתמשת במדבקות שאינן תרופתיות או במיקומים שאינם נקודות דיקור. כתוצאה מכך, לא ניתן לבודד לחלוטין גורמים מבלבלים לא ספציפיים — כגון עקה מכנית מגילוח, טיפול ניסויי וגירוי הדבקה של המדבקה עצמה — מהתכונות הטיפוליות הספציפיות של KAST. כדי לפתור סייגים אלה, תוכניות המחקר העתידיות שלנו ישלבו בקפידה ביקורות דמי שתוכננו בריגור ואימותים של נתיבים מרובים כדי לבסס עוד יותר את הספציפיות והשחזוריות של ממצאים אלה. בנוגע להפחתה שנצפתה ברמות חלבון CGRP בעקבות התערבות ב-BIBN-4096, חשוב להבהיר כי בעוד ש-BIBN-4096 פועל בעיקר כאנטגוניסט תחרותי המכוון למתחם הקולטן RAMP1/CRLR ולא כמעכב ישיר של סינתזת CGRP, מתן התרופה in vivo עשוי להוביל להפחתה (downregulation) של הצטברות הליגנד ברקמה המקומית. תופעה משנית זו מתווכת ככל הנראה באמצעות שיבוש של לולאת המשוב החיובית הנוירו-אימונית. על ידי חסימת RAMP1 בתאי חיסון מטרה כגון ILC2s, BIBN-4096 מדכא את השחרור של ציטוקינים אפקטורים במורד הזרם, מה שבתורו מפחית את ההפעלה הדלקתית רטרוגרדית של סופי עצבי החישה ותאי נוירואנדוקרינים ריאתיים (PNECs), ובכך מנחית בעקיפין את סינתזת CGRP ובצריתו ברקמה.
לסיכום, הממצאים האמפיריים שלנו מדגימים כי KAST מעצב מחדש ביעילות את המיקרו-סביבה של המערכת החיסונית המולדת בריאות על ידי התמקדות בציר העצבי CGRP/RAMP1. בעוד שאנו מכירים בכך שהשלכה קלינית ישירה דורשת אופטימיזציה זהירה בהינתן ההבדלים הביולוגיים בין מכרסמים לבני אדם, נקודות קצה אלו מספקות בסיס מכניסטי קריטי שהיה חסר עד כה, המבסס את התיאוריה המסורתית "Fei Wai He Pi Mao" (ריאות בשילוב עם העור והשיער). על ידי הצגת פרספקטיבה נוירו-אימונית מזוקקת, פרוטוקול זה מבסס קו בסיס מדעי מהימן להנחיה ותמיכה בתרגומים קליניים עתידיים, פרוספקטיביים ורב-מרכזיים, של טיפולי הדבקת נקודות דיקור בצמחים מסורתיים לניהול של אסתמה אלרגית.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (מס' 82274632), פרויקט טיפוח כישרונות מובילים של מחוז ג'יאנגסו לרפואה סינית מסורתית (מס' SLJ0309), הקרן למדעים טבעיים של מחוז ג'יאנגסו (מס' BK20231381), פרויקט תוכנית הפיתוח של מדע וטכנולוגיה לרפואה סינית מסורתית של מחוז ג'יאנגסו (מס' ZT202205), והמעבדה המרכזית למחקר דיקור ורפואה של משרד החינוך באוניברסיטה לרפואה סינית בננג'ינג (מס' AML202304).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרט נושם רפואי של 3M | 3M, ארה"ב | 1530C | קיבוע פאטץ' (Patch fixation) |
| אצטילכולין כלוריד | Sigma-Aldrich, ארה"ב | A6625 | פרובוקציה ברונכיאלית |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, ארה"ב | G2939BA | הערכת איכות ושלמות של RNA |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | (הזמנה מותאמת אישית) | אימונופלורסנציה (שניונית) |
| אלומיניום הידרוקסיד | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | עזר (Adjuvant) |
| נוגדן Anti-CGRP (ארנב) | Abcam, בריטניה | ab81887 | Western blot / IF (אימונופלואורסצנציה) |
| עכבר BALB/c (נקבה, SPF, גיל 8–10 שבועות, 18–22 גרם) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | מודל חיה |
| BB700 נוגדן עכבר נגד חולדה CD90.2 (קלון 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | ציטומטריה זורמת |
| ציטומטר זרימה BD FACSCanto II | BD Biosciences, ארה"ב | FACSCanto II | ציטומטריה זרימה |
| BIBN-4096 (Olcegepant hydrochloride) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | מעכב קולטן CGRP |
| תערובת ביוטין לשיוך שוברי שושלת (Biotin-Lineage Cocktail) | BD Biosciences, USA | (מותאמים אישית, שיבוטים כפי שתואר) | ציטומטריית זרימה |
| Brilliant Violet 605 Streptavidin | BD Biosciences, USA | 563260 | ציטומטריה זורמת |
| BSA Albumin Fraction V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), גרמניה | 4240GR100 | חסימה |
| חלבון קלציטונין/CALCA | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | התערבות ב-CGRP |
| נוגדן CD11c/ITGAX (ארנב) | Abmart, שנגחאי, סין | MU115408S | אימונופלואורסצנציה |
| בופר לשחזור אנטיגנים מסיטראט | בּוֹסְטֶר, סין | AR0024 | אימונוהיסטוכימיה |
| תמיסת צביעה ב-DAPI | Beyotime, שנגחאי, סין | C1006 | צביעה גרעינית |
| ddH2O (מים מזוקקים פעמיים) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | שחזור חלבון והמסה של אבקה |
| DESeq2 | Bioconductor (חבילת R) | גרסה 1.42.0 | תוכנה לניתוח ביטוי דיפרנציאלי |
| DNase I | Roche Diagnostics, גרמניה | 10104159001 | עיכול רקמת ריאה |
| נוגדן Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, בריטניה | ab150106 | אימונופלואורסצנציה (משנית) |
| מצע ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, סין | – | כימילומנצנציה של Western blot |
| ערכה משופרת לבדיקת חלבון BCA | Beyotime, שנגחאי, סין | P0010 | כימות חלבונים |
| תמיסת צביעה של Eosin Y | Sigma-Aldrich, ארה"ב | HT110216 | היסטולוגיה (צביעת HE) |
| אתנול (מוחלט, בדרגת ניתוח) | Sinopharm Chemical Reagent, סין | 10009218 | התייבשות רקמות והיסטולוגיה |
| נוגדן F4/80 (עכבר, clone C-7) | Santa Cruz Biotechnology, ארה"ב | sc-377009 | אימונופלואורסצנציה |
| fastp | קוד פתוח (GitHub) | גרסה 0.23.4 | תוכנה לבקרת איכות של נתוני גלם מ-RNA-seq |
| FITC anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | ציטומטריה זרימה |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה |
| נוגדן מונוקלונלי ל-GAPDH (עכבר) | Proteintech, ווהאן, סין | 60004-1-Ig | וסטרן בלוט (Western blot) |
| נוגדן GATA3 (עכבר, clone L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | אימונופלואורסצנציה |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | הדרה של תאים מתים |
| נוגדן משני גדי נגד IgG (H+L) של ארנב, שעבר ספיחה הצלבתית (Cross-Adsorbed) | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | אימונופלואורסצנציה (משנית) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, ארה"ב | 10.1.2 | ניתוח סטטיסטי |
| תמיסת המטוקסילין (הריס) | Sigma-Aldrich, ארה"ב | HHS16 | היסטולוגיה (צביעת HE) |
| HISAT2 | אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (מקור פתוח) | גרסה 2.2.1 | תוכנה ליישור גנום ייחוס עבור RNA-seq |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) המשופעל עם HRP | Proteintech, ווהאן, סין | SA00001-1 | וסטרן בלוט (משני) |
| נוגדן Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) מצומד ל-HRP | Proteintech, ווהאן, סין | SA00001-2 | וסטן בלוט (משני) |
| HTSeq-count | EMBL (כלי עזר ב-Python) | גרסה 2.0.3 | כלי לספירת קריאות של מאפיינים גנומיים ב-RNA-seq |
| מימן פראוקסיד (H2O2, תמיסה בריכוז 3%) | Sigma-Aldrich, ארה"ב | H1009 | חסימת פראוקסידאז אנדוגנית |
| iFluor™ נוגדן IgG אנטי-ארנב ממשוואי מסומן ב-488 | Huabio, סין | HA1121 | אימונופלורסנציה (משנית) |
| נוגדן מונוקלונלי ל-IL-4 | Proteintech, ווהאן, סין | 66142-1-Ig | וסטרן בלוט (Western blot) |
| נוגדן IL13 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | וסטן בלוט (Western blot) |
| נוגדן ל-IL5 | Affinity Biosciences, ארה"ב | AF5123 | וסטרן בלוט (Western blot) |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, ארה"ב | – | ריצוף RNA |
| ImageJ | NIH, ארה"ב | 1.8 | כימות Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, ארה"ב | גרסה 6.0 | כימות צפיפות אופטית של תמונה |
| פורמולה צמחית KAST | המחלקה לרוקחות, בית החולים המסונף לאוניברסיטת ננג'ינג לרפואה סינית | – | התערבות |
| נוגדן מונוקלונלי KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | 58-5893-82 | אימונופלואורסצנציה |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, גרמניה | 4.5 | כימות אימונופלורסצנציה |
| מיקרוסקופ קונפוקאלי Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, גרמניה | STELLARIS 8 | דימוי באימונופלואורסצנציה |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, גרמניה | 5401119001 | עיכול רקמת ריאה |
| סמן (סולם חלבונים צבוע מראש) | NCM Biotech, סוז'ו, סין | P9001 | וסטרן בלוט (Western blot) |
| ערכה לבדיקת CGRP בעכברים בשיטת ELISA | Aifang Biotechnology, חנאן, סין | AF2491-A | ELISA (ספיחה אנטיגנית מול סומן אנזימטי) |
| ערכה לבדיקת ELISA של IL-13 בעכברים | Aifang Biotechnology, חונאן, סין | AF-02456M1 | ELISA |
| ערכה לבדיקת ELISA של IL-4 בעכבר | Aifang Biotechnology, חנאן, סין | AF-02448M1 | ELISA |
| ערכה לבדיקת ELISA ל-IL-5 בעכברים | Aifang Biotechnology, חונאן, סין | AF-11729M1 | ELISA |
| תוך הרכבה של בלסם ניטרלי | Sinopharm Chemical Reagent, סין | 10014061 | הצמדת סרטומי היסטולוגיה |
| סרום עיזים נורמלי (לחסימה) | Abcam, UK | ab7481 | חסימה באימונוהיסטוכימיה/IF |
| חומר שיכון OCT | סאקורה, ארה"ב | 4583 | הטמעה של חיתוכי קריו (Cryosection embedding) |
| ערכה להכנה מהירה של ג'ל PAGE בשלב אחד | Vazyme, נאנג'ינג, סין | E303-01 | הכנת ג'ל SDS-PAGE |
| אובאלבומין (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | רגישות/חשיפה חוזרת |
| פאראפורמאלדהיד (4% ב-PBS) | Biosharp, סין | BL539A | קיבוע רקמות |
| PE anti-mouse/human KLRG1 (clone 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | ציטומטריה זורמת |
| תערובת מעכבי פוספטאז (50×) | Beyotime, שנגחאי, סין | P1092 | מיצוי חלבונים |
| תמיסת Poly-L-lysine | בוסטר, סין | AR0003 | ציפוי שקופיות להיסטולוגיה |
| מעכבי פרוטינאז ופוספטאז | NCM Biotech, סוז'ו, סין | P002 | מיצוי חלבונים |
| ממברנת PVDF (0.22 μm) | Merck Millipore, ארה"ב | ISEQ00010 | וסטרן בלוט (Western blot) |
| נוגדן פוליקלונלי ל-RAMP1 (ארנב) | Proteintech, ווהאן, סין | 10327-1-AP | אימונופלואורסצנציה |
| בופר לליזיס (פירוק) של תאי דם אדומים (RBC) | Beyotime, שנחאי, סין | C3702 | הכנת דגימות לציטומטריה עם זרימה |
| בופר ליזיס RIPA (חזק) | Beyotime, שנגחאי, סין | P0013B | מיצוי חלבונים |
| מצע RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | 11875093 | בסיס לעיכול תאי רקמה |
| SuperKine™ תוך קיבוע משופר למניעת דהייה (Enhanced Antifade Mounting Medium) | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | קיבוע לדגימות אימונופלורסצנציה |
| Triton X-100 (חומר דטרגנט) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | חדירותיות לאימונופלורסצנציה |
| ריאגנט TRIzol | Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | 15596026 | מיצוי RNA |
| ערכה להכנת ספריות RNA-seq מדגם VAHTS Universal V10 | Vazyme, נאנג'ינג, סין | NR605-01 | בניית ספרייה ל-RNA-seq |
| מערכת פלתיסמוגרפיה של הגוף השלם | גואנגיוואנדה, בייג'ינג, סין | WBP-4 | תפקודי ריאה (Penh) |
| קסילן (בדרגת ניתוח) | Sinopharm Chemical Reagent, סין | 10023418 | הסרת פראפין ושקיפות |
מקורות
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.