מאמר שיטה

ליפוזומים המופעלים על ידי אור וקרני X להעברה מבוקרת של תרופות ועריכה גנטית

92 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71788

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות לייצור ננו-חלקיקים שומניים (lipid nanoparticles) המשלבים verteporfin, המופעלים על ידי אור נראה או קרינת X, למסירה מבוקרת במרחב ובזמן של ריבונוקלאופרוטאינים של CRISPR-Cas9 וחומרי כימותרפיה, עם רלוונטיות תרגומית פוטנציאלית ליישומים אופתלמולוגיים ואונקולוגיים.

תקציר

טיפול פוטודינמי (PDT) מנצל את הפעלתם של פוטוסנסטיזטורים כדי להפיק מיני Oxygen species ריאקטיביים (ROS), בעיקר חמצן סינגלט. מעבר לרעילות תאית ישירה, ניתן לרתום פוטוכימיה זו לשחרור מטענים לפי דרישה ממערכות נשאים ננו-ליפידיים, דבר המאפשר בקרה מרחבית-זמנית על מסירת טיפול שאינה בר השגה באמצעות ננו-חלקיקים ליפידיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מציג שיטות להכנה ואפיון של שתי פורמולציות נבדלות של ננו-חלקיקים ליפידיים המשלבים verteporfin (VP): (1) ליפוזומים המופעלים על ידי אור, המורכבים מ-DOTAP, DOPE, כולסטרול ו-VP, למסירת קומפלקסים של ריבנוקלאאו-פרוטאין (RNP) של CRISPR-Cas9; ו-(2) ליפוזומים המופעלים על ידי קרני X, המורכבים מ-DOTAP, DOPC, VP וננו-חלקיקי זהב, לשחרור מבוקר של תרופות כימותרפיות. עם הפעלה באורך גל של 690 nm (אור נראה) או על ידי קרינת X קלינית (6 MeV), ה-VP מייצר חמצן סינגלט המחמצן רכיבים ליפידיים לא רוויים, מה שגורם לבלתי-יציבות של ממברון הננו-חלקיק ולשחרור המטענים העטופים. הפרוטוקולים מספקים הנחיות להכנת ליפוזומים באמצעות הידרציה של שכבה דקה (thin-film hydration) ואקסטרוזיה של ממברנה, אפיון פיזיקו-כימי, הערכת שחרור מטענים המופעל על ידי אור וקרני X, השבתה (knockout) של גנים in vitro בתאים אנושיים, ותיקוף in vivo באמצעות מערכת דיווח חזותית כמותית של דגי zebrafish ומודל גידול זנוגרפט בעכברים. תוצאות מייצגות מדגימות השבתה של עד כ-326 סיבי שריר איטיים לכלובי zebrafish באמצעות הפעלה באור, ודיכוי משמעותי של צמיחת גידולים באמצעות שחרור doxorubicin המופעל על ידי קרני X. התקדים הקליני להפעלת verteporfin באורך גל של 689–690 nm בעין מהווה מניע להערכת פלטפורמה זו למסירה אופתלמולוגית, אם כי התפלגות ביולוגית ברשתית, פרמקוקינטיקה ובטיחות בבעלי חיים גדולים טרם נקבעו. שיטות אלו מספקות גישה ניסיונית בעלת פוטנציאל תרגומי לשחרור מבוקר חיצוני של מטענים טיפוליים. 

מבוא

ננו-חלקיקים שומניים (LNPs) הפכו לפלטפורמת ההעברה הבלתי-ויראלית המאומתת ביותר מבחינה קלינית עבור תרופות מבוססות חומצות גרעין, כפי שהוכח בשימוש בהם בחיסוני mRNA נגד COVID-191. עם זאת, LNPs קונבנציונליים משחררים את המטען שלהם עם העלייה לתא באמצעות בריחה אנדוזומלית, ללא בקרה חיצונית על העיתוי, המיקום או ההיקף של שחרור המטען2. היעדר בקרה מרחבית-זמנית זו מגביל את יעילותם ביישומים שבהם שחרור מדויק לפי דרישה הוא יתרון טיפולי, כולל עריכה גנטית ספציפית לאתר, כימותרפיה ממוקדת בגידולים הטרוגניים, והשתקה גנטית מדורגת באיברים נגישים אנטומית כמו העין3,4.

תרפיה פוטודינמית (PDT) מספקת מנגנון מבוסס להשגת השפעות ביולוגיות המופעלות באופן חיצוני. עם הפעלה באורכי גל ספציפיים, פוטו-סנסיטיזטורים (photosensitizers) מייצרים חמצן סינגלט (1O2) ו-ROS אחרים שיכולים לחמצן ביו-מולקולות סמוכות5. ורטפורפין (VP), נגזרת של בנזופורפירין המאושרת קלינית תחת השם Visudyne לטיפול פוטודינמי בנבכיריות של השכבה הכורואידית תת-הפובאה בניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מתאימה במיוחד כמרכיב פוטו-סנסיטיזטורי של ננו-חלקיקים6. VP מופעל קלינית ב-689 nm עבור תרפיה פוטודינמית אופתלמולוגית, דבר המהווה תקדים מבוסס להולכת אור לעין6,7,8. VP פעיל פוטודינמית פי ארבעה בקירוב מנגזרות המטופורפירין של הדור הראשון באורכי גל חודרים לרקמה6.

פונקציונליות כפולה זו, שבה VP משמש בו-זמנית כפוטו-סנסיטייזר מאושר קלינית וכטריגר מגיב לאור לשחרור המטען מהננו-חלקיקים, מהווה את הבסיס המכניסטי לפרוטוקולים המתוארים כאן. כאשר הוא משולב בשכבה הליפידית ביחסים מולריים נמוכים, VP מייצר 1O2 בעת הקרנה, ובהתאם לספרות קודמת, מוצע כי הוא מחמצן שרשראות אציל של פוספוליפידים לא רוויים, מה שגורם לדה-סטביליזציה של הממברנה ושחרור המטען העטוף9. רדיוס הדיפוזיה הקצר של 1O2 (~20 nm בסביבות ביולוגיות) מגביל את דה-סטביליזציית הממברנה לסמיכות המיידית של הפוטו-סנסיטייזר, ובכך ממזער את הנזק למטען תוך כן משבש ביעילות את השכבה הכפולה9,10. יתרה מכך, שיטת ההפעלה באמצעות קרני X מתגברת על מגבלת עומק החדירה לרקמה של אור נראה. כאשר ננו-חלקיקי זהב (3–5 nm) מוטמעים יחד בשכבה הליפידית, הקרנת קרני X קלינית (6 MeV) מגבירה את הפעלת ה-VP באמצעות העברת אנרגיה המתווכת על ידי אלקטרוני אוגר (Auger electrons), ובכך מרחיבה את היכולת ליישום בגידולי רקמה עמוקים11,12. מדידות ישירות של חמצן סינגלט באמצעות Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) מאשרות כי ייצור 1O2 עולה עם מינון קרני X, ומוגבר בערך פי 1.4 על ידי טעינה משולבת של ננו-חלקיקי זהב בהשוואה ל-VP לבדו11.

לפלטפורמה זו רלוונטיות תרגומית מיוחדת עבור תרפיה גנטית אופתלמולוגית. טיפולים נוכחיים ב-anti-VEGF עבור AMD נאווסקולרי דורשים הזרקות תוך-ויטריאליות תכופות, כאשר תוצאות מהעולם האמיתי מראות ירידה תחת תת-טיפול כרוני13,14, בעוד שטיפולים גנטיים מתפתחים מבוססי AAV מפחיתים נטל זה אך מבטאים anti-VEGF באופן קבוע15,16 ולכן לא ניתן לכוונן אותם או להפסיקם, חשש הנובע מהקשר בין דיכוי VEGF מתמשך לבין אטרופיה גיאוגרפית, איסכמיה רטינלית ופיברוזיס17,18. גישה מבוססת CRISPR המופעלת על ידי אור תוך שימוש ב-VP-liposomes עשויה במקום זאת לאפשר נוק-אאוט (knockout) של VEGF-A המוגבל מרחביתית ונשלט על ידי הקלינאי, ובכך לספק בקרה מרחבית וזמנית של הקלינאי על אירוע העריכה הראשוני, תוך שמירה על העמידות של העריכה הגנטית. עיקרון השחרור המופעל זה חל גם על דיסטרופיות רטינליות של גנים גדולים, כגון מחלת סטארגארד (ABCA4)19,20, ועל מלנומה של הענב, שבה המנגנונים התוצאתיים של VP תואמים היטב לביולוגיה של הגידול21,22.

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק שיטות מקיפות וניתנות לשחזור להכנת ננו-חלקיקים ליפידיים המשלבים VP באמצעות שני פורמולציות נפרדות, אחת המופעלת על ידי אור נראה (690 nm) והשנייה על ידי קרינת X, ולהערכת יעילות ההעברה הן במערכות מודל in vitro והן במערכות מודל in vivo. מכיוון שפורמולציות אלו נבדלות בהרכב הליפידים שלהן, באסטרטגיית טעינת המטען ובאופן ההפעלה, הן מוצגות כפרוטוקולים נפרדים. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים הבודקים פלטפורמות של ננו-חלקיקים לשחרור מופעל, אסטרטגיות העברה מבוססות PDT, עריכת גנים בשליטה מרחבית-זמנית, או העברת תרופות עינית ואונקולוגית המופעלת על ידי אור.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים שכללו דגי זברה בוצעו בתנאים סטנדרטיים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים באוניברסיטת מקווירי (ARA: 2015-034). ניסויי קסנוגרפט בעכברים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מקווירי (אישור מס' 2017/001). כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם לחוק מחקר בבעלי חיים משנת 1985 ולתקנות מחקר בבעלי חיים משנת 2010.

חלק א': ליפוזומי VP המופעלים באור להחדרה של CRISPR-Cas9 (מבוסס על Aksoy et al.9)

1. הכנת ליפוזומי VP המופעלים על ידי אור ומכילים CRISPR-Cas9 RNP

  1. המס DOTAP, DOPE, כולסטרול (Chol) ו-VP ב-500 µL של כלורופורם ביחס מולרי של 1:0.94:1:0.06 בתוך בקבוק זכוכית בעל תחתית עגולה9.
    זהירות: כלורופורם הוא רעיל ונדיף. בצע את כל השלבים הכרוכים בכלורופורם במכנס כימיים עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל ומשקפי מגן.
  2. אדה את הכלורופורם תחת זרם של גז ארגון עד להיווצרות שכבת ליפידים דקה על דופן הבקבוק.
  3. הנח את הבקבוק תחת ואקום (למשל, בממיץ או במייבש המחובר למשאבת ואקום) למשך לילה (≥12 h) כדי להסיר לחלוטין שאריות ממס.
  4. הכן את תמיסת ההידרציה על ידי שילוב של sgRNA (ריכוז סופי 0.01 µM) וחלבון Cas9 (ריכוז סופי 0.1 mg/mL) ב-500 µL של מים נקיים מנוקליאזות. בצע דגירה מוקדמת של ה-sgRNA וה-Cas9 בטמפרטורת החדר למשך 5 min כדי לאפשר היווצרות של קומפלקס ribonucleoprotein (RNP) לפני ההידרציה.
    הערה: קומפלקס ה-RNP נטען במהלך שלב ההידרציה, ולא מתווסף לאחר ההיווצרות. דבר זה מבטיח אנקפסולציה בתוך הליבה המימית של הליפוזום.
  5. הידרט את שכבת הליפידים המיובשת על ידי הוספת 500 µL של תמיסת ה-RNP ישירות על השכבה, וערבב עד להומוגנציה של התמיחית. השאר את תמיחית הליפידים המהודרת למשך 2 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הידרציה מלאה של הליפידים.
  6. בצע אקסטרוזיה לתמיחית המולטילמילרית שהתקבלה 11 פעמים דרך ממב soon פוליקרבונט של 200 nm באמצעות מיני-אקסטרודר, כדי להפיק ליפוזומים אונילמילריים בגודל אחיד9.
    הערה: אקסטרוזיה, ולא סוניקציה, היא שיטת הפחתת הגודל עבור פורמולציה זו. העבר את התמיחית מספר אי-זוגי של פעמים (11) כדי להבטיח שהמוצר הסופי יהיה בצד הנגדי של הממברנה ביחס לחומר ההתחלתי, ובכך להפחית זיהום על ידי וסיקולות שלא עברו אקסטרוזיה.
  7. אחסן את ה-VP-liposomes בטמפרטורה של 4°C, מוגנים מאור. השתמש בתוך 48 h מההכנה לפעילות אופטימלית. הגבלה זו של 48 h היא שמרנית: שחרור ה-VP נותר מתחת ל-3% לאורך 96 h ב-10% FBS9.
    הערה: עבור יישומים in vitro ו-in vivo, הכן וטפל בליפוזומים בשימוש בטכניקת סטריליות סטנדרטית, ועקר את התמיחית הסופית על ידי העברה דרך מסנן של 0.22 µm לפני השימוש.

2. אפיון פיזיקו-כימי של ליפוזומי VP

  1. יש לדלל את תרחיף הליפוזומים ביחס של 1:100 במים נקיים מנוקלאז. יש למדוד את הקוטר ההידרודינמי, מדד הפולידיספרסיות (PDI) ואת פוטנציאל זטא באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). יש לבצע את כל מדידות ה-DLS בשלוש חזרות (n = 3 חזרות טכניות) לכל דגימה ולדווח על הערכים כממוצע ± סטיית תקן.
    הערה: מאפיינים צפויים של פורמולציה מוצלחת מחלק A הם קוטר הידרודינמי של 167.5 ± 1.9 nm, PDI < 0.3, פוטנציאל זטא של +28 ± 1.1 mV, ויעילות הכנסה של Cas9 של כ-75.09%. מאפיינים פיזיקו-כימיים מייצגים של פורמולציות מוצלחות מסוכמים בטבלה 1.9
  2. עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM), יש להניח 10 µL של תרחיף ליפוזומים מדולל על גריד נחושת מצופה פחמן. יש לצבוע ב-2% uranyl acetate למשך 20 s. יש לדגיין ב-100 kV9, תוך השגת לפחות 10 תמונות מייצגות לכל סדרה.
פרמטרחלק א': VP-liposome
(מופעל באור)		חלק ב': VP/AuNP-liposome
(מופעל בקרני X)
קוטר הידרודינמי167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
מדד פולידיספרסיות (PDI)<0.3< 0.3 (טיפוסי)
פוטנציאל זטא+28 ± 1.1 mVחיובי (מבוסס DOTAP)
יעילות הכליאהCas9 RNP: 75.09%Doxorubicin: טעינה מרחוק באמצעות ammonium sulphate; כמותה נקבעה לאחר ליסיס ב-0.1% Triton X-100
טעינת ננו-חלקיקי זהבאינו רלוונטי156 ± 24 AuNPs לליפוזום (ICP-MS)
יציבות שחרור המטען<3% שחרור VP במשך 96 h ב-10% FBSיציב במשך 48 h בריכוזי 0%, 10%, 25% ו-50% FBS וב-pH 7.4, 6.0 ו-5.0
תנאי הפעלההקרנת LED, 690 nm, 0.15 mW/cm²הקרנת X-ray קלינית, 6 MeV
מטען עיקריקומפלקס CRISPR-Cas9 RNPDoxorubicin
מודליות הפעלהאור נראהקרינת X-ray
יישום מיועדעריכה גנטית מופעלתשחרור מופעל של תרופות כימותרפיה

טבלה 1: מדדי אפיון פיזיקו-כימי ופרופילי יציבות של שתי פורמולציות ורטפורפין (VP)-ליפוזום. מאפייני פורמולציה מייצגים, פרמטרי טעינה, פרופילי יציבות ותנאי הפעלה עבור פורמולציית VP-ליפוזום המופעלת על ידי אור (חלק א') ופורמולציית VP/AuNP-ליפוזום המופעלת על ידי קרני X (חלק ב'). ערכים אלו מספקים מדדי בקרת איכות צפויים להכנה ואפיון מוצלחים של הפורמולציה, ויכולים לשמש כקריטריונים לייחוס בעת שחזור הפרוטוקולים המתוארים כאן.

3. שחרור מטען המופעל על ידי אור ומדידת חמצן סינגלט

  1. עבור בדיקות שחרור המופעלות באור, הכין ליפוזומים של VP באמצעות אותה פורמולציית ליפידים ופרוטוקול הידרטציה/אקסטרוזיה. העבר 100 µL של ת сусפנזיית הליפוזומים ב-PBS למכשיר דיאליזה התלוי ב-12 mL של PBS תחת ערבוב במהירות של 80 rpm.
  2. הקרן את הדגימות באמצעות מקור אור LED באורך גל של 690 nm בעוצמה של 0.15 mW/cm2 למשך פרקי זמן מוגדרים (2, 4 ו-6 דקות)9.
  3. דגום את התמיסה החיצונית של הדיאליזה בנקודות הזמן 0, 1, 3, 6 ו-24 שעות, וכמת את ה-VP שהשתחרר באמצעות פלואורסצנציה; קבע את כמות ה-VP הכוללת על ידי ליזיס של מנה שקולה באמצעות 0.1% Triton X-100.
  4. חשב את שחרור ה-VP לפי הנוסחה Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, כאשר Ft, F0, ו-Fmax הם ערכי הפלואורסצנציה בזמן t, בקו הבסיס ולאחר ליזיס ב-Triton, בהתאמה (n = 3).
  5. אשר את דה-סטביליזציית הממברנה על ידי מדידת השינוי בקוטר ההידרודינמי באמצעות DLS לפני ואחרי ההקרנה.
    הערה: הגן על כל הדגימות המכילות VP מאור סביבתי לאורך כל שלבי ההכנה והאחסון. השתמש במבנות ענבר או בעטיפת נייר אלומיניום.

4. בדיקת טרנספקציה ובדיקת נוק-אאוט (knockout) של גנים במעבדה (In vitro)

  1. זריעה של תאי HEK293-GFP (או של קו דגם מדווח שווה ערך) בפלטות של 96 באריים בצפיפות המתאימה להגעה לכ-70% התמסגנות (confluency) בזמן הטיפול. גידול התאים בתווך מלא (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin–streptomycin) בטמפרטורה של 37°C וב-5% CO2.
  2. הוספת VP-liposomes המכילים anti-GFP sgRNA/Cas9 RNP לבאריים בריכוז של 50 ug/mL. עבור אנליזה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, יש להדגיר למשך 2 h; עבור אנליזה בציטומטריה של זרימה (flow cytometry), יש להדגיר למשך 1 h.
  3. החלפת התווך בתווך מלא טרי. הקרנה של הבאריים המטופלים באור LED באורך גל של 690 nm בעוצמה של 0.15 mW/cm2. עבור אנליזה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, יש להקרין למשך 2, 4 או 6 min; עבור אנליזה בציטומטריה של זרימה, יש להקרין למשך 4 min. יש לכלול בקרות חשוכות (ליפוזומים ללא הקרנה) ובקרות אור בלבד (הקרנה ללא ליפוזומים).
  4. הערכת ה-knockout של GFP לאחר 48 h מהטיפול באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או ציטומטריה של זרימה.
    הערה: יש לתקף את ה-Guide RNAs לפני השימוש. במחקר המקור, נבדקו Candidates של eGFP guides לבדיקת יעילות חיתוך באמצעות אנליזת RFLP (restriction fragment length polymorphism), והמדריך שנבחר (sg_eGFP_06) השיג 88.24% חיתוך. הסיכון לחיתוך מחוץ למטרה (off-target) הופחת in silico על ידי אישור ייחודיות המדריך (BLASTN מול הגנום הייחוס באמצעות Bowtie/Bowtie2, ללא סבילות ל-mismatch בעשר הבסיסים הראשונות של קציו 3’). לא בוצעה רצף (sequencing) של off-target לכל אורך הגנום, וזהו שלב מומלץ עבור יישום טיפולי9.
  5. למדידת יעילות האנקפסולציה, יש לצנטריפוג  דגימה של ליפוזומים ב-15,000 rpm למשך 1 h בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן לסנן את העלייה (supernatant) דרך מסנן מזרק Whatman Anotop 10 של 20 nm.
  6. כימות של Cas9 חופשי (שאינו מאנקפסול) בתסנן באמצעות BCA protein assay.
  7. חישוב יעילות האנקפסולציה לפי הנוסחה EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, כאשר Ctot הוא סך ה-Cas9 שהוסף ו-Csup הוא ה-Cas9 הבלתי מאנקפסול שהופק מהעלייה. ראו Table 1 למדדי ביצועים מייצגים של הפורמולציה ויעילויות אנקפסולציה צפויות.

5. תיקוף למקרה חי (in vivo): בדיקת נחיה ויזואלית בדג zebrafish

  1. הכינו את תערובת ההזרקה (MasterMix) על ידי שילוב של VP-liposomes המכילים sgRNA המכוון ל-eGFP וחלבון Cas9 ביחסים המפורטים בפרוטוקול המקורי9. תערובת MasterMix סופית בנפח 8 uL מכילה 3.5 uL sgRNA (בריכוז 75 ng/uL), 1.0 uL חלבון Cas9 (בריכוז 500 ng/uL), 2.5 uL VP-liposomes ו-1.0 uL phenol red. עבור תערובת הביקורת, החליפו את הליפוזומים ב-2.5 uL מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water).
  2. הזריקו במיקרו-הזרקה 2 nL מה-MasterMix לתוך התא (לא לתוך החלמון) של עוברי זבוב-זגב (zebrafish) בשלב התא הבודד, באמצעות מערכת מיקרו-הזרקה מכולבת9.
    אזהרה: בצעו את כל העבודה עם זבוב-זגב תחת פרוטוקולי אתיקה מאושרים לבעלי חיים. טיפלו בעוברים בעדינות כדי להמעיט בנזק מכני במהלך ההזרקה.
  3. שעתיים לאחר ההפריה (hpf), הקרינו את העוברים המוזרקים באור LED באורך גל של 690 nm בעוצמה של 0.15 mW/cm2 למשכים מוגדרים (למשל 0, 1, 2 ו-5 דקות) כדי להפעיל את שחרור המטען9.
  4. ב-72 hpf, הרדימו את העוברים ב-Tricaine וקבעו אותם באגרוז בנקודת התכה נמוכה בריכוז 1%. באמצעות קו הדג המדומה (transgenic reporter line) smyhc1:eGFP, כמת את השבתת (knockout) סיבי השריר האיטיים כחסרון של פלואורסצנציית eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך ומיקרוסקופ קונפוקלי.
  5. השיגו תמונות בשיטת focus-stacked וספרו את סיבי השריר האיטיים השליליים ל-eGFP (שהושבתו) לכל עובר, תוך ניתוח של בדרך כלל 16 עוברים לכל קבוצה (למשל ב-Imaris)9.
    הערה: בדיקה זו מספקת קריאה ויזואלית כמותית של יעילות השבתת הגן. בקו הדג smyhc1:eGFP, סיבי השריר האיטיים הם בדרך כלל חיוביים ל-eGFP; השבתה מוצלחת נרשמת כחסרון של פלואורסצנציית eGFP בסיבים אלו9.

חלק ב: ליפוזומים מסוג VP המופעלים על ידי קרני רנטגן להובלת תרופות כימותרפיה (מבוסס על Deng et al.11)

6. הכנת ליפוזומי VP/AuNP המופעלים על ידי קרני X וטעונים בדוקסורוביצין

  1. שלבו 350 µL של DOTAP (100 mg/mL בתוך כלורופורם) ו-370 µL של DOPC (100 mg/mL בתוך כלורופורם) בבבקעת זכוכית בעגון תחתון, והשלימו לנפח כולל של 1.0 mL באמצעות כלורופורם11.
    הערה: בחלק ב' נעשה שימוש ב-DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), ולא ב-DOPE. שתי הפורמולציות נבדלותB בליפיד העזר שלהן, והבחנה זו קריטית לצורך הדירות (reproducibility).
  2. הוסיפו 50 µL של VP (2.3 mg/mL בתוך DMSO) ו-40 µL של ת сусפנזיית ננו-חלקיקי זהב (קוטר 3–5 nm) לתערובת הליפידים. הדבר מניב כ-156 ± 24 ננו-חלקיקי זהב לכל ליפוזום, כפי שכומתה באמצעות ICP-MS11.
    הערה: על ננו-חלקיקי הזהב להיות בקוטר של 3–5 nm כדי להשתלב בתוך השכבה הליפידית הכפולה. חלקיקים גדולים יותר (למשל, 50 nm) לא ישתלבו בממברנה ולא יתווכו את העברת האנרגיה של אלקטרוני Auger הדרושה להפעלה באמצעות קרני X11.
    הערה: הפורמולציה הבסיסית המתוארת כאן אינה מכוונת למטרה ספציפית. במחקר המקור, הוצג שינוי אופציונלי למיקוד פעיל על ידי הכנסה מאוחרת (post-insertion) של DSPE-PEG2000-Folate כדי לכוון את הליפוזומים לתאי גידול המבטאים קולטנים לפולאט; ניתן להוסיף שלב זה מבלי לשנות את מנגנון השחרור של VP/AuNP11.
  3. אדו את הכלורופורם תחת ארגון ויבשו בוואקום למשך לילה, כפי שמתואר בשלבים 1.2–1.3.
  4. הידרטציה של שכבת הליפידים באמצעות 1.0 mL של באפר Ammonium sulphate בריכוז 250 mM (pH 5.5). ערבבו ב-Vortex, השאירו את הס сусפנזיה ההידרטית למשך לילה, ולאחר מכן בצעו אקסטרוזיה 11 פעמים דרך ממברנת פוליקרבונט של 200 nm11.
  5. הסירו Ammonium sulphate חופשי באמצעות דיאליזה כנגד PBS (pH 7.4) בטמפרטורה של 4 C עם ארבעה החלפות באפר, כדי ליצור גרדיאנט של Ammonium sulphate חוצה-ממברנה.
  6. טענו doxorubicin (Dox) על ידי דגירה של הליפוזומים שעברו דיאליזה ביחס משקלי של תרופה-ליפיד של 1:10 בטמפרטורה של 60°C למשך שעה אחת11. גרדיאנט ה-Ammonium sulphate מניע את הצטברות ה-Dox בתוך הליפוזום.
  7. הסירו Dox שאינו מוטמע באמצעות דיאליזה כנגד PBS בטמפרטורה של 4 C עם ארבעה החלפות באפר.
  8. אפיינו את הליפוזומים הטעונים באמצעות DLS (גודל צפוי: ~100–150 nm) ומדדו את יעילות ההטמעה על ידי ליזיס של הליפוזומים עם 0.1% Triton X-100 וכמותת פלואורסצנציית ה-Dox (עירור 485 nm, פליטה 590 nm).
    הערה: פורמולציות מוצלחות של חלק ב' מציגות בדרך כלל קוטר הידרודינמי של כ-100–150 nm, PDI < 0.3, והטמעה של כ-156 ± 24 ננו-חלקיקי זהב לכל ליפוזום. מאפיינים פיזיקו-כימיים מייצגים מסוכמים ב-Table 111.

7. שחרור תרופות בהפעלה באמצעות קרני רנטגן ובדיקת ציטוטוקסיות in vitro

  1. הקרינו ליפוזומים של VP/AuNP הטעונים בקלקאין באמצעות מאיץ ליניארי קליני (אלומת פוטונים של 6 MeV) במינונים מוגדרים (1, 2 ו-4 Gy)11. כמת את שחרור המטען על ידי מדידת פלואורסצנציה של קלקאין (עירור 485 nm, פליטה 510 nm), והשיגו את השחרור הכולל לאחר פירוק עם 0.1% Triton X-100."
  2. עבור בדיקות ציטוטוקסיות, זרעו תאי סרטן מעי גס אנושיים מסוג HCT116 בלוחיות 96 באריות (למשל, 2 × 104 תאים/mL ב-10% FBS).
  3. טפלו בתאים בליפוזומים של VP/AuNP הטעונים ב-Dox והקרינו בקרני X כפי שמתואר לעיל, כולל בקרות של LipoDox בלבד, קרני X בלבד, ובקרות ללא טיפול. העריכו את חיוניות התאים באמצעות בדיקת MTS בנקודות זמן של 0, 2, 4 ו-24 שעות לאחר הקרנה של 4 Gy11.

8. תיקוף in vivo: מודל גידול קסנוגרפט בעכברים

  1. החדירו תחת העור באזור השוק של עכברי BALB/c nude נקבות בני 6–7 שבועות 5 × 106 תאי HCT116 ב-100 µL של מצע McCoy’s 5A נטול סרום11.
  2. כאשר גידולים מגיעים לגודל של כ-100 מ"מ3החדירו תוך-גידולית ליפוזומים של VP/AuNP טעונים ב-Dox (שווה ערך ל-10 מ"ג/ק"ג של Dox) בנפח של 20 מיקרוליטר (µL)11.
  3. 24 שעות לאחר ההזרקה, הקרינו את הגידולים בקרינת רנטגן במינון של 4 Gy (אנרגיה של 6 MeV) באמצעות מאיץ ליניארי קליני, תוך הגנה מתאימה של רקמות שאינן מטרה.
  4. יש לנטר את נפח הגידול בכל יומיים באמצעות קליפרים דיגיטליים. יש לחשב את נפח הגידול לפי הנוסחה V = (π/6) × L × W2, כאשר L הוא הממד הארוך ביותר ו-W הוא הרוחב הניצב11.
  5. בנקודת הסיום של הניסוי, הוצא את הגידולים, קבע אותם בפורמלין 10% עם חוצץ ניטרלי, והכן חיתוכים קריוסטטיים בעובי 6 µm לצורך אנליזה היסטולוגית (H&צביעת E)#38;11.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. נתונים כמותיים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), אלא אם צוין אחרת.
  2. ניתוחים סטטיסטיים עבור מחקרי knockout של גנים בדגי zebrafish בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני, בעוד שהשוואות בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחן t של Student דו-זנבי, כפי שדווח במחקרי המקור. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ- p < 0.05.
  3. עבור מחקרי הליפוזומים המופעלים על ידי קרני X, מערכי נתונים של צמיחת גידול, משקל גוף, שחרור מטען והיסטולוגיה נותחו באמצעות מבחני t של Student כפי שמתואר בפרסום המקורי.
  4. הגדרת ה- n עבור כל ניסוי מופיעה במקראות האיורים המתאימות.
  5. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism גרסה 7.0 (GraphPad Software).
    הערה: פרוטוקול זה משחזר זרימות עבודה ניסיוניות ומערכי נתונים מייצגים ממחקרים שפורסמו בעבר. על הקוראים לעיין בפרסומים המקוריים לקבלת פרטי הניתוח הסטטיסטי המלאים במידת הצורך9,11.

תוצאות

עריכה גנטית בהפעלה באמצעות אור (חלק א'):

בעקבות הפרוטוקול בחלק א', ליפוזומי VP המכילים CRISPR-Cas9 RNP הראו שחרור מטען תלוי-אור. שחרור מינימלי נצפה בתנאי חשיכה, בעוד שהקרנה באורך גל של 690 nm (0.15 mW/cm2) הניבה שחרור תלוי-מינון שהגביר עם זמן ההארה (איור 1A)9. בדיקת reporter של eGFP בדגי zebrafish סיפקה מדד ויזואלי כמותי של יעילות השבב הגנטי (knockout). עוברים שהופעלו באמצעות אור הראו knockout של 308.37 ± 40.21 סיבי שריר איטיים חיוביים ל-eGFP לעובר, בהשוואה ל-53.15 ± 35.38 סיבים בביקורות חשיכה (n = 80), כאשר המספר עלה ל-326.12 ± 36.55 סיבים לאחר 5 דקות של הקרנה (n = 60) (איור 1B,C)9. In vitro, ליפוזומי VP שהופעלו באור השיגו GFP knockdown ברמה דומה לזו של Lipofectamine 2000 (הפחתה של כ-53% לעומת 50%), תוך שהם מספקים באופן ייחודי בקרה מרחבית-זמנית מופעלת-אור (איור 1C)9. ממצאים אלו מדגימים בקרה מרחבית-זמנית, שכן אותה פורמולציה של ננו-חלקיקים הניבה יעילויות knockout שונות באופן ניכר בהתאם לחשיפה לאור (איור 1A–C).

שיטת עריכה גנטית פוטוכימית; CRISPR-Cas9, השראה באמצעות LED, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוצאות ניסיוניות, מדידת עצימות.
איור 1העברה של CRISPR-Cas9 בהפעלה באמצעות אור ונשירה גנטית מרחבית-זמנית בעוברים של דגי זברה. (Aאיור סכמטי של ליפוזומים המכילים ורטפורפין (VP) (ביחס של DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06) המכמיסים קומפלקסים של ריבנוקלאופרוטאין (RNP) מסוג Cas9/sgRNA. בעת הקרנה באור באורך גל של 690 ננומטר, VP מייצר מיני רדוקציה של חמצן (ROS) המערערים את יציבות ממברנת הליפוזום ומעוררים שחרור תוך-תאי של מטען ה-CRISPR-Cas9.B) תמונות פלואורסצנציה נציגות של smyhc1:eGFP עוברים של דגי זברה 72 שעות לאחר ההפריה (hpf) בעקבות טיפול בליפוזומים של VP ומשכי חשיפה גוברים לאור (0, 1, 2 ו-5 דקות; 690 ננומטר, 0.15 מילי-וואט/סמ"ר)2). אובדן פלואורסצנציית eGFP מעיד על נוקאאוט (knockout) של סיבי שריר איטיים. התמונות המוכנסות מציגות תצפיות מוגדלות של האזורים המסוגרים בריבוע. (Cכימות של עוצמת הפלואורסצנציה ומספר סיבי השריר האיטיים שעברו השתקה (knock-out) לכל עובר, המדגימים הפעלה של CRISPR-Cas9 ותהליך השתקת גנים התלויים באור. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ניסויי דגי הזברה נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני (נ = 80 עוברים למדידות עצימות פלואורסצנציה ו- נ" = 60 עוברים לניתוח ספירת סיבים; p < (0.0001). ניסויי תיקוף של HEK293-GFP נותחו באמצעות מבחן דו-זנבי ת-בדיקה (נ" = 4). סרגלי קנה מידה = 500 µm (תמונות סקירה כללית) ו- 100 µm (תמונות מוגדלות). עובד באישור מאקסוי ואחרים (Aksoy et al).9 Copyright © 2020 American Chemical Society. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תוצאות תת-אופטימליות במבחן דגי הזברה עשויות לכלול: (א) פחות מ-50 סיבים פגועים לעובר, המעידים על איכות ליפוזומים נמוכה, פעילות Cas9 לא מספקת, או מינון אור תת-אופטימלי; (ב) תמותת עוברים העולה על 20%, המצביעה על נזק מכני במהלך ההזרקה המיקרוסקופית או פוטוטוקסיות מוגברת של VP; או (ג) סיבים פגועים בביקורות שלא הוקרנו, המעידים על דליפה מוקדמת של המטען מניסוח הליפוזומים.

שחרור תרופות המופעל באמצעות קרני X (חלק ב'):

ליפוזומי VP/AuNP שהוכנו בהתאם לפרוטוקול בחלק ב' הראו שחרור של calcein התלוי במינון בטווח של 1–4 Gy (איור 2A,B)11. במודל של קסנוגרפט HCT116, עכברים שקיבלו ליפוזומי VP/AuNP טעונים ב-Dox ולאחריהם הקרנת X-ray במינון של 4 Gy הראו דיכוי משמעותי של צמיחת הגידול בהשוואה לקבוצות ביקורת של Dox חופשי, הקרנת X-ray לבדה וליפוזומים שלא הוקרנו (איור 2C)11. ניתוח היסטולוגי של חתכי גידול חשף אזורי נמק גדולים יותר בקבוצת הטיפול המשולב, כפי שנבחן באמצעות צביעת H&E (איור 2D).

טיפול בסרטן באמצעות ליפוזומים המכוונים על ידי קרני X; גרפים של שחרור קלסאין, גודל הגידול ואנליזה של נמק.
איור 2שחרור דוקסורוביצין המופעל על ידי קרני X ודיכוי צמיחת גידול. (A(איור סכמטי של ליפוזומים המשלבים ורטפורפין (VP) וננו-חלקיקי זהב (AuNP) המכילים דוקסורוביצין (Dox). חשיפה לקרינת רנטגן מפעילה את ה-VP באמצעות העברת אנרגיה המתווכת על ידי AuNP, מה שיוצר חמצן סינגלט המערער את יציבות השכבה הליפידית הכפולה ומעורר את שחרור המטען. (B(פרופילי שחרור קלסיין מליפוזומים שנחשפו למינוני רנטגן עולים (0–4 Gy), המדגימים שחרור תלוי-מינון של המטען מליפוזומי VP/AuNP. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן מארבע מדידות. (C) מדידות נפח הגידול (שמאל) ומשקל הגוף (ימין) בעכברים הנושאים קסנוגרפט של HCT116 שטופלו ב-PBS, LipoDox, קרני רנטגן בלבד, או LipoDox בהפעלה של קרני רנטגן. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (נ׳ = 4 עכברים לקבוצה). מובהקות סטטיסטית הוערכה באמצעות ה- ת׳-בדיקה (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001). (ד') תמונות מייצגות של צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&חתכי גידול צבועים ב-H&E וניתוח מורפומטרי של שטח הנמק הממוצע בגידול. החיצים מצביעים על אזורי נמק מייצגים. תרשימי קופסה (Box plots) מציגים את החציון ואת הטווח הבין-רבעוני, כאשר השפנים (whiskers) נמתחים עד ל-1.5 × IQR. הנתונים נותחו באמצעות ה- t-בדיקה (נ = 5). סרגל קנה מידה = 50 µmעובד על פי Deng et al.11 תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution 4.0 International. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תוצאות תת-אופטימליות במודל הקסנוגרפט עשויות לכלול: (א) היעדר הבדל בצמיחת הגידול בין קבוצות הליפוזומים שהוקרנו לאלו שלא הוקרנו, דבר המעיד על שחרור לא מספיק בתיווך VP או על שילוב לא הולם של ננו-חלקיקי זהב; או (ב) רעילות סיסטמית (ירידה במשקל > 15%), המצביעה על דליפה של Dox מהליפוזומים לפני הפעלת קרני X.

דיון

מספר שלבים בפרוטוקולים אלה הם קריטיים להצלחה. בחלק A, יש לשמור בדיוק על היחס המולרי של הליפידים (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06), מכיוון שריכוז ה-VP קובע ישירות את עוצמת ייצור ה-1O2 ובשל כך, את יעילות שחרור המטען9. טעינת ה-Cas9/sgRNA RNP במהלך שלב ההידרציה, במקום באמצעות קומפלקסציה לאחר ההיווצרות, חיונית עבור כמיסה של הליבה המימית. אקסטרוזיה דרך ממבנה פוליקרבונט של 200 nm (11 מעברים) מייצרת וזיקולות uniparamellar אחידות; אין להחליף זאת בסוניקציה, שכן היא עלולה לגרום לדנטורציה של חלבון ה-Cas9. בחלק B, גודל ננו-חלקיקי הזהב (3–5 nm) הוא קריטי, שכן החלקיקים חייבים להיות קטנים מספיק כדי להטמיע בתוך השכבה הליפידה הד双ה להעברה יעילה של אנרגיה באמצעות אלקטרוני Auger ל-VP תחת הקרנת X-ray11. שיטת מדרג האמוניום סולפט המשמשת לטעינת Dox דורשת דיאליזה מלאה של אמוניום סולפט חיצוני לפני הוספת התרופה; דיאליזה חלקית תפחית את יעילות הטעינה.

ניתן להתאים את הרכב הליפידים ליישומים שונים תוך שמירה על מנגנון השחרור המתווך על ידי VP. לדוגמה, החלפת חלק מה-DOTAP בליפיד PEGylated (למשל DSPE-PEG2000 בריכוז 5 mol%) עשויה לשפר את זמן הסירקולציה במתן סיסטמי, אם כי הדבר יפחית את המטען החיובי על פני השטח ועשוי להפחית את הספיגה התאית in vitro2. אם מדידות DLS מראות PDI > 0.3, יש להגדיל את מספר מעברי האקסטרוזיה או לוודא את שלמות הממברנה. אם ייצור חמצן סינגלט נמוך למרות שילוב תקין של VP, יש לוודא את אורך הגל ועוצמת ההספק של מקור תאורת ה-LED באמצעות מד הספק מכויל, שכן הפעלת VP תלויה באורך הגל (שיא העירור ב-425 nm עבור פס סורט והפעלה טיפולית ב-689–690 nm עבור פס Q)9. עבור בדיגת דגי zebrafish, אם תמותת העוברים עולה על 20% בקבוצות המטופלות, יש להפחית את נפח ההזרקה או את ריכוז הליפוזומים כדי למזער פוטוטוקסיות הקשורה ל-VP. מסגרת פתרון בעיות מובנית, המקושרת למדדי הייחוס בטבלה 1, היא כדלקמן. PDI > 0.3: הגדלת מספר מעברי האקסטרוזיה ואימות שלמות הממברנה. שחרור מופעל נמוך או חסר למרות שילוב תקין של VP: אישור פלט של 690 nm באמצעות מד הספק מכויל ואימות היחס המולרי של VP. פחות מ-~50 סיבי שריר איטי שנוקאו לכל עובר: הכנה מחדש של הליפוזומים, אישור פעילות RNP, או הגדלת זמן ההקרנה. אובדן אות eGFP בביקרי העדויות שלא הוקרנו: בדיקת תנאי האחסון על ידי שימוש בליפוזומים בתוך 48 h מההכנה ואחסונם ב-4°C בחשיכה, ואימות יציבות הממברנה. במודל Xenograft, היעדר הבדל בין קבוצות ליפוזומים שהוקרנו לאלו שלא הוקרנו מעיד על הצורך לאשר את השילוב של ננו-חלקיקי זהב בגודל 3–5 nm ולאמת את מנת ה-X-ray שניתנה.

המגבלה העיקרית של המודליות המופעלת על ידי אור (חלק א') היא עומק החדירה של אור באורך גל של 690 nm, המגביל את ההפעלה הישירה לרקמות נגישות באופן שטחי או לרקמות שניתן להגיע אליהן באמצעות הולכת אור סיבית5. המודליות המופעלת על ידי קרני X (חלק ב') מתגברת על מגבלת עומק זו, אך דורשת גישה למאיץ ליניארי קליני ומחשיפה רקמות סביבתיות לקרינה מייננת, אם כי במינונים טיפוליים11,12. שתי הפורמולציות מסתמכות כעת על DOTAP, ליפיד קטיוני הקשור לציטוטוקסיות תלוית-מינון, העלולה להגביל את החלון הטיפולי בהגשה סיסטמית2. האופי החולף של עריכה גנומית מתווכת RNP הוא יתרון מבחינת בטיחות, אך משמעותו היא שכיבוי (knockout) חלקי באוכלוסיית תאי מטרה אינו יכול להושלם על ידי מתן מינונים חוזרים באותו אתר ללא administration חוזר של ננו-חלקיקים. בנוסף, פרוטוקולים אלו תוקפו בקווי תאים ובמודלים של בעלי חיים קטנים; מעבר למודלים של בעלי חיים גדולים יותר, ובסופו של דבר ליישום קליני בבני אדם, ידרוש אופטימיזציה של הפורמולציה, מחקרי פרמקוקינטיקה והערכת רעילות פורמלית תחת תנאי GLP. בפרט, פרוטוקול זה אינו כולל נתונים פרמקוקינטיים, נתוני התפלגות ביולוגית או נתוני חדירה לרשתית. אף על פי שחדירת אור דרך רקמות עיניות ורקמות אחרות מאופיינת היטב בספרות כתלויה באורך הגל, בפיגמנטציה ובסוג הרקמה (ניתן לשפרה באמצעות חומרי הבהרה אופטית), מחקרי פרמקוקינטיקה, התפלגות ביולוגית ומסירה לרשתית כמותיים נותרים כשלבים הבאים החשובים לפני שניתן יהיה לבסס טענות טרנסלציוניות.

מערכות LNP קונבנציונליות, כולל אלו המשמשות בחיסוני mRNA, משחררות את המטען באופן פסיבי בעקבות קליטה תאית באמצעות בריחה אנדוזומלית ואינן מציעות שליטה זמנית או מרחבית על המסירה1,2. וקטורים ויראליים כגון AAV מספקים מסירה יעילה של גנים אך מוגבלים על ידי קיבולת אריזה (~4.7 kb), אימונוגניות בעת מתן חוזר, וביטוי קונסטיטוטיבי של הגן המועבר שאינו ניתן לוויסות לאחר המתן3. פלטפורמת ה-VP-liposome נותנת מענה למגבלות אלו על ידי אספקת מנגנון שחרור הניתן לבקרה חיצונית, שאינו תלוי בסוג המטען, תואם למטענים גדולים (חלבונים, קומפלקסים של RNP ומולקולות קטנות), אינו ויראלי ופוטנציאלי למתן חוזר, בכפוף למחקרי אימונוגניות וטוקסיקולוגיה של מנה חוזרת. בניגוד למערכות אופטוגנטיות או כאלו המגיבות תרמית, הגישה המבוססת על VP רתמה פוטו-סנסיטייזר מאושר קלינית עם נתוני בטיחות מבוססים ותשתית לייזר קלינית קיימת, במיוחד ברפואת עיניים, שם לייזר Visudyne של 689 nm הוא כבר ציוד סטנדרטי6. Sang et al. הדגימו עוד כי ננו-חלקיקים היברידיים של ליפיד-פולימר המכילים VP משפרים את יעילות הטיפול הרדיו-דינמי במודלים של סרטן המעי הגס, ובכך אישרו את יכולת ההסתגלות של ייצור ROS המתווך על ידי VP במבני ננו-חלקיקים שונים12.

השיטות המתוארות כאן הן בעלות רלוונטיות מיוחדת לשלושה מצבים אופתלמולוגיים. ב-AMD ניאווסקולרי, נטל ההזרקות של anti-VEGF נשאר מחסום קריטי להשגת תוצאות אופטימליות. נתוני רישום מהעולם האמיתי מראים תת-טיפול ניכר ביחס לפרוטוקולים של ניסויים קליניים (ממוצע של 7.3 לעומת 12 הזרקות בשנה הראשונה, כאשר 38.8% מהמטופלים הפסיקו את הטיפול והרווח בחדות הראייה היה מינימלי)14, כמו כן נצפתה ירידה בראייה לטווח ארוך למרות מינון תכוף23. טיפולים גנומיים מבוססי AAV המפותחים כדי להפחית נטל זה — ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416, ו-4D-150 שהוגדר כ-RMAT (הפחתה של 83% בהזרקות)24 — מבטאים בכל זאת טרנסגנים של anti-VEGF באופן קבוע (constitutively) ולא ניתן לכוון את המינון שלהם או להפסיקם. זהו מקור לדאגה פוטנציאלית לאור ראיות הקושרות דיכוי רציף של VEGF לאטרופיה גיאוגרפית (CATT17; מטא-אנליזה של 4,609 עיניים18; ושכיחות אטרופיה העולה ל-78.3% לאורך שמונה שנים25). מערכת VP-liposome המופעלת על ידי אור ונושאת CRISPR-Cas9 המכוון ל-VEGF-A עשויה במקום זאת לאפשר שביטה (knockout) גנטית מוגבלת מרחבית, ובכך לספק שליטה מרחבית וזמנית של הקלינאי על אירוע העריכה הראשוני, תוך שמירה על העמידות של העריכה הגנטית. מחקרים פרה-קליניים תומכים בהיתכנות של גישה זו. אספקה משותפת של Cas9 mRNA ו-sgRNA המכוון ל-VEGFA באמצעות LNP הפחיתה ניאווסקולריזציה של הכורואיד (CNV) המושרה בלייזר בעכברים26, LNPs מסוג PEG-variant השיגו עריכה גנומית באפיתל הרשת (RPE)27, ו-LNPs מונחי פפטיד העבירו mRNA לפוטורצפטורים בפרימטים28. עם זאת, נכון לתחילת 2026, שום טיפול גנטי רטינלי מבוסס LNP לא נכנס לניסויים קליניים29, מה שמדגיש את ההזדמנות התרגומית. במחלת סטארגארד (Stargardt disease), רצף הקידוד של ABCA4 באורך של כ-6.8 kb עולה על קיבולת האריזה של AAV, מה שמחייב אסטרטגיות של וקטור כפול עם יעילות טרנסדוקציה מופחתת19. מועמדים קליניים כוללים את פלטפורמות ה-dual-AAV מסוג SB-007 ו-VG80130, לצד הטיפול המודיפייר ה-gene-agnostic מסוג OCU410ST31. אספקת חומצות גרעיים לא-ויראלית יכולה לעקוף את מגבלות האריזה של AAV. ננו-חלקיקים מסוג PEG-ECO הנושאי פלסמיד של ABCA4 הפחיתו את הצטברות A2E בעכברים מסוג Abca4-/-20, בעוד שמחקרים נפרדים הדגימו אספקה של מבני DNA רטינליים גדולים32 וביטוי mRNA בתיווך LNP ברקמות עיניות33. מכיוון שטיפול מקומי במקולה ובפובאה מספיק כדי לשמר את הראייה המרכזית, VP-liposomes מתאימים היטב לאספקת ריכוזים גבוהים של מטעני טיפול גנטי במדויק לאזורים אלה. עבור מלנומה של הענב (uveal melanoma), verteporfin פועל באמצעות שלושה מנגנונים משלימים: ציטוטוקסיות בתיווך PDT, עיכוב של מסלול YAP/TAZ (כאשר ביטוי YAP1 נמצא במתאם עם הסמנים המטסטטיים החזקים ביותר, מונוסומיה 3 ואובדן BAP1)21, ומות תאים אימונוגני באמצעות הפעלת cGAS-STING. שילוב של עיכוב YAP בתיווך VP ו-PDT עם טיפול ב-anti-PD-L1 הפך גידולים "קרים" מבחינה אימונולוגית לגידולים פעילים אימונולוגית, תוך דיכוי ניכר של צמיחת הגידול והארכת ההישרדות במודלים אורטוטופיים22. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם שיעור התגובה המדווח של 80% עבור PDT מבוסס verteporfin כטיפול ראשוני למלנומה של הכורואיד34. הנגישות האופטית של העין להפעלה באורך גל של 689 nm, יחד עם המיקום המוגדר היטב של רוב המלנומות הענביות, ממצבת את ה-VP-liposomes כפלטפורמה מבטיחה לאספקת טיפול מקומי, תוך הפחתה פוטנציאלית של התחלואה הקשורה לגישות הנוכחיות של ברכיותרפיה ואלוף פרוטונים.

מעבר ליישומים האופתלמולוגיים והאונקולוגיים שנדונו לעיל, פלטפורמת ה-VP-liposome ישימה בכל הקשר טיפולי הדורש שחרור מטען מבוקר חיצונית, לפי דרישה. יישומים פוטנציאליים כוללים עריכה גנטית מופעלת באור במצבים דרמטולוגיים הנגישים להארה טרנס-קוטנאית, שחרור כימותרפיה מופעל על ידי קרני X בסנכרון עם לוחות הזמנים של הפרקציונציה ברדיותרפיה קלינית, ושביטון גנים (gene knockout) בעל דפוס מרחבי למחקרים בביולוגיה התפתחותית. מספר מערכות לעריכה גנטית המופעלות פוטו-אקטיבית הודגמו ברקמות שאינן רטינליות, כולל ה-Mag-ABE, עורך בסיסים המופעל פוטו-אקטיבית לעריכת גנום מבוקרת מרחבית וזמנית in vivo35, ומערכת ננו-חלקיקי upconversion המופעלת על ידי NIR לעריכת CRISPR-Cas9 מבוקרת מרחבית וזמנית ולטיפול פוטו-דינמי36. באופתלמולוגיה, העניין הגובר באסטרטגיות לדיכוי VEGF בר-קיימא מדגיש עוד יותר את הצורך במערכות הולכה המשלבות יעילות טיפולית ארוכת טווח עם בקרה חיצונית על העיתוי והמיקום של הפעילות הביולוגית37. השילוב של שיטות ייצור אלו עם טכנולוגיות הולכה של LNPs לרשתית המופיעות כעת ומערכות עריכה גנטית מופעלות פוטו-אקטיבית, מייצג התכנסות של רכיבים שעברו תיקוף בנפרד, שיישומם המשולב בעין נותר חזית מחקר פתוחה ובעלת פוטנציאל להשפעה גבוהה. עבודה שוטפת בקבוצתנו מכוונת לאופטימיזציה של פורמולציות לנתיבי הולכה סוב-רטינליים ואינטרה-ויטראליים, להערכת פרופילי בטיחות במודלים עיניים של בעלי חיים גדולים, ולהתאמת המודאליות המופעלת על ידי קרני X לשימוש סימולטני עם פרוטוקולי רדיותרפיה סטנדרטיים באונקולוגיה קלינית.

גילויים

Y.A.A. הוא דירקטור ומייסד שותף של EosGene Therapeutics Pty Ltd, המחזיקה בפטנטים הקשורים לטכנולוגיית ננו-חלקיקים ליפידיים המופעלים על ידי אור המתוארת כאן. E.M.G. ו-W.D. הם מייסדים שותפים של EosGene Therapeutics.

תודות

המחברים מודים על המתקנים ועל הסיוע הטכני שסופקו על ידי מתקן דגי הזברה של אוניברסיטת מקווארי (עבודת דגי הזברה) ועל ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מקווארי. עבודה זו נתמכה בחלקית על ידי מרכז המצוינות של ה-ARC לננו-ביופוטוניקה (CE140100003). המחברים מודים גם על תמיכה מצד EosGene Therapeutics Pty Ltd.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ממברנת סינון 20 nm (Anotop 10 או מקבילה לה)Whatman (Cytiva)N/Aמשמשת להפרדה של Cas9 חופשי במהלך מדידות יעילות הכמוס
מקור אור LED 690 nmThorlabsM690L4מקור אור להפעלת שחרור מטען מליפוזומים בתיווך VP; צפיפות הספק ניתנת לכוונון
אנטיביוטיקה–אנטימיקוטיקה (100X)Thermo Fisher Scientific15240062תוסף לתרבית תאים; ריכוז סופי של 1%
גליל גז ארגון ורגולטורN/AN/Aמשמש לאידוי ממס במהלך הכנת סרט ליפידים
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000מערכת אקסטרוזיה ידנית המשמשת עם ממברנות פוליקרבונט 200 nm לסטנדרטיזציה של גודל הליפוזומים
עכברים BALB/c nude (נקבות, 5–6 שבועות)Animal Resources CentreN/Aעכברים עם חסר חיסוני המשמשים למודל גידול קסנוגרפט HCT116
ערכה לבדיקת חלבון BCAThermo Fisher ScientificN/Aמשמשת לכימות Cas9 חופשי ומדידות יעילות הכמוס
מערכת הדמיה Bio-Rad ChemiDoc MPBio-Rad Laboratories12003154מערכת הדמיה לג'לים ול-western blot
CalceinSigma-AldrichC0875צבע פלואורסצנטי לבדיקות שחרור; כיבוי עצמי בריכוזים גבוהים
ספקטרופוטומטר Cary 5000 UV-Vis-NIRAgilent TechnologiesN/Aספקטרוסקופיית בליעה UV-Vis של ליפוזומים ו-verteporfin
תאי CCD841 CoN (תאי אפיתליום נורמליים של מעי אנושי)ATCCCRL-1790שורת תאי אפיתליום נורמליים של המעי; משמשת כביקורת לא-סרטנית
כלורופורםSigma-Aldrich288306ממס אורגני להכנת סרט ליפידים
כולסטרולSigma-AldrichC8667רכיב ממברנת ליפוזום המשמש בניסוח המופעל באור
מאיץ ליניארי קליני (קרן פוטונים 6 MeV)Varian Medical SystemsN/Aמקור קרני X קליני למחקרי הקרה
קליפרים דיגיטלייםN/AN/Aמשמשים למדידת נפח גידול קסנוגרפט
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-Aldrich472301ממס להכנת תמיסת אם של verteporfin
DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375Pרכיב ליפידי המשמש בניסוח המופעל בקרני X
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)Sigma-AldrichP1223ליפיד עזר המשמש בניסוח המופעל באור
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)Avanti Polar Lipids890890Pליפיד קטיוני המשמש בשני הניסוחים
דוקסורוביצין הידרוכלורידSigma-AldrichD1515תרופה כימותרפית המטוענת לליפוזומים המופעלים בקרני X
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120Pליפיד פגילאטד (PEGylated) המשמש בניסוח המופעל בקרני X
מצע DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Thermo Fisher Scientific11965092מצע לתרבית תאי HEK293 ו-PC12
סלקיין מהסוג DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)Thermo Fisher Scientific14190144בופר שטיפה
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141תוסף לתרבית תאים; ריכוז סופי של 10%
ספקטרופלואורומטר Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/Aספקטרוסקופיית פלואורסצנציה לאפיון verteporfin
תוכנה לערימת מיקוד (למשל, Zerene Stacker)N/AN/Aמשמשת להפקת תמונות בערימת מיקוד בהדמיית דגי zebrafish
מייבש בהקפאה (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/Aמשמש לייבוש בוואקום והסרת ממסים
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943RNA מדריך יחיד המכוון ל-eGFP; משמש לאימות knockout
ננו-חלקיקי זהב (3–5 nm, מיוצבים בציטראט)NanoComposixN/Aרדיוסנסיטיזר המשמש בניסוח המופעל בקרני X
GraphPad PrismGraphPad Software7.0ניתוח סטטיסטי והצגת נתונים
תאי HCT116 (קרצינומה קולורקטלית אנושית)ATCCCCL-247שורת תאי סרטן של המעי הגס המשמשת למחקרי in vitro ו-in vivo
תאי HEK293/GFPGenTargetSC001שורת תאים המבטאת GFP באופן יציב, המשמשת לאימות knockout באמצעות CRISPR
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570צבע גרעיני; ריכוז עבודה של 5 µg/mL
תוכנה לניתוח תמונות (למשל, Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/Aמשמשת לכימות סיבי שריר איטיים שעברו knockout
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceתוכנה לניתוח תמונות
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךLeica MicrosystemsDMi3000משמש להדמיית רפורטר ב-zebrafish ולהערכת פלואורסצנציית GFP
מערכת הדמיה In Vivo מסוג IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201מערכת להדמיית פלואורסצנציה in vivo
מיקרוסקופ אלקטרוני חודר JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400הדמיית TEM של ליפוזומים
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP2Leica MicrosystemsN/Aהדמיה קונפוקלית של בליעה תאית
אגרוז בנקודת התכה נמוכהN/AN/Aמשמש להצבת עוברי zebrafish במהלך הדמיה
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019ריאגנט טרנספקציה המשמש כביקורת חיובית
תוכנת Living ImagePerkinElmerN/Aתוכנה לרכישה וניתוח תמונות
מצע McCoy's 5AThermo Fisher Scientific16600082מצע לתרבית תאי HCT116
מערכת מיקרו-הזרקהN/AN/Aמשמשת למיקרו-הזרקה לעוברי zebrafish בשלב של תא אחד
בדיקת MTS להתרבות תאיםPromegaG3582בדיקת חיוניות תאים
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000מדידות ריכוז וטוהר של RNA
מים נטולי נוקלאזThermo Fisher ScientificR0582משמשים להכנת CRISPR-Cas9 RNP
מצע Opti-MEM עם סרום מופחתThermo Fisher Scientific31985070מצע טרנספקציה
פראפורמלהיד (4%)Sigma-AldrichP6148מקבע לניתוח היסטולוגי
תאי PC12 (פאו 크רומוציטומה של חולדה)ATCCCRL-1721שורת תאים דמוית-נוירונלית המשמשת למחקרי בליעה
מסנני ממברנת פוליקרבונט (200 nm)Avanti Polar Lipids610006ממברנות אקסטרוזיה לקביעת גודל ליפוזומים
ערכת RNeasy Plus MiniQIAGEN74134ערכה למיצוי RNA
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002גשוש פלואורסצנצני לזיהוי חמצן סינגלט
מכשירי דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570מכשירי דיאליזה להכנת ליפוזומים וטעינת תרופות
צבע ג'ל לחומצות גרעיניות SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494צבע ג'ל לחומצות גרעיניות
דגי zebrafish מסוג Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2דגי zebrafish טרנסגניים המשמשים לאימות CRISPR in vivo
TNF-α (רקומביננטי אנושי)Life TechnologiesRTNFAIציטוקין המשמש במחקרי השראה של TNFAIP3
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/AsgRNA המכוון ל-TNFAIP3
טריקאין מתנסולפונט (MS-222)N/AN/Aחומר הרדמה לדגי zebrafish המשמש לפני הדמיה
Triton X-100Sigma-AldrichT8787דטרגנט המשמש לליזיס של ליפוזומים ובדיקות שחרור
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36498נוקלאז Cas9 המשמש להכנת CRISPR-Cas9 RNP
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200056ריאגנט לפירוק תאים
Uranyl acetate (2%)Electron Microscopy Sciences22400צבע שלילי להדמיית TEM
VerteporfinSigma-AldrichSML0534-5MGפוטו-סנסיטיזר המוטמע בניסוחי ליפוזומים
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600מדידות פיזור אור דינמי ופוטנציאל זטא

מקורות

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
  2. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
  3. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
  4. Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
  5. Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
  6. Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
  7. Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
  8. Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
  9. Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
  10. Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
  11. Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
  12. Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
  13. Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
  14. Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
  15. Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
  16. Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
  17. Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
  18. Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
  19. Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
  20. Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
  21. Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
  22. Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
  23. Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
  24. Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
  25. Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
  26. Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
  27. Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
  28. Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  29. Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
  30. Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
  31. Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
  32. Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
  33. Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
  34. Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
  35. Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
  36. Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
  37. Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.