שילוב של Sorafenib עם gemcitabine מראה ראיות ראשוניות לעיכוב אדיטיבי של התרבות תאי HepG2, ומראה שינויים קורלטיביים בביטוי של p-ERK ו-VEGF, ומדכא צמיחת גידולי כבד בעכברי NOD/SCID.
מאמר מחקר
הערכת טיפול משולב של Sorafenib ו-Gemcitabine בתאי HepG2 ובמודל קסנוגרפט של עכברי NOD/SCID: מחקר חלוצי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן הכבד נותר סיבה מובילה לתמותה הקשורה לסרטן בשל עמידות לתרופות ואפשרויות טיפול מוגבלות. קיים צורך דחוף לבחון אסטרטגיות טיפוליות לשיפור התוצאות. מחקר פיילוט זה מציג פרוטוקול להערכת ההשפעות הפוטנציאליות והמנגנונים הבסיסיים של שילוב של sorafenib ו-gemcitabine בסרטן הכבד. נעשה שימוש בשורת תאי סרטן הכבד HepG2, והוקם מודל של השתקת גידול זר (xenograft) בעכברי non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID). מוצגים שלבי פרוצדורה מרכזיים הכוללים: (1) תרבית תאי HepG2 וטיפול תרופתי; (2) הקמת בדיקת MTT, דגירה וקריאת בליעה (absorbance); (3) מיצוי חלבונים, SDS-PAGE, העברה (transfer) ו-immunoblotting עבור ERK ו-p-ERK; (4) הקמת xenograft תת-עורי בעכברי NOD/SCID; (5) מדידת גידול וחישוב נפח; ו-(6) אימונוהיסטוכימיה של VEGF בחתכי גידול. מסופקים שלבים קריטיים, טיפים לפתרון בעיות ומפרטי ציוד. השילוב של sorafenib (במינון 3 µmol/L) ו-gemcitabine (במינון 10 µmol/L) השיג שיעור עיכוב של 71.23% ± 6.76% לאחר 72 h, עם q-value של 1.35, מה שמרמז על השפעה סינרגית בזוג מינונים ספציפי זה תחת התנאים שנבדקו. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הטיפול המשולב היה קשור להפחתה בביטוי של p-ERK, לנפח גידול מופחת ולצביעה אימונוהיסטוכימית של VEGF נמוכה יותר באופן איכותי. נתונים אלו מראים קשר מתאמי בין הפחתה בביטוי p-ERK לבין ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית שנצפתה, מבלי לבסס סיבתיות. בתאי HepG2 ובמודל xenograft בעכברי NOD/SCID, השילוב של sorafenib ו-gemcitabine מראה ראיות ראשוניות לפוטנציאל אנטי-פרוליפרטיבי והוא קשור להפחתה בביטוי VEGF; עם זאת, ממצא זה אינו מהווה ראיה ישירה לפעילות אנטי-אנגיוגנית, שכן לא בוצעו אנליזות של צפיפות מיקרו-כלי דם או אנליזות וסקולריות פונקציונליות. פרוטוקול שמיש זה מספק מסגרת מועילה להערכת שילובי תרופות במודלים של HCC וניתן להתאימו למשטרי טיפול ממוקד-כימותרפיה אחרים, אם כי נדרשים מחקרים נוספים לתיקוף המנגנונים והמינונים לפני שניתן יהיה להסיק על השלכות קליניות כלשהן.
מבוא
סרטן הכבד הוא אחד מסוגי הסרטן השכיחים והקטלניים ביותר, וכן אחד הגידולים הממאירים בעלי קצב הגדילה המהיר ביותר1,2. למרות ששיעור ההוצאה של סרטן הכבד נמצא בירידה, הנטל הכולל של סרטן הכבד ממשיך לעלות. נתונים אפידמיולוגיים עולמיים משנת 2022 חשפו כי שיעור ההשערה המתוקנן לגיל של סרטן הכבד במסד הנתונים המקוון של Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 היה 15.0 ל-100,000 תושבים, בעוד ששיעור התמותה המתוקנן לגיל של סרטן הכבד היה 26.7 ל-100,000 תושבים, מה שהופך אותו לגורם השני המוביל לתמותה מסרטן3. כיום, בשל המחסור בטיפול יעיל לסרטן הכבד, יחד עם הופעתו השתרעתית (insidious), רוב המטופלים נמות תוך שנה לאחר האבחנה. Sorafenib היא מעכבת קינאז רב-מטרתית הראשונה שאושרה לשימוש קליני, המכוונת לקולטני טירוזין קינאז כגון קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR), קולטן גורם גדילה שמקורו בטבקיות (PDGFR), וקינאזים מסוג סרין/תריונין4,5. Sorafenib, מעכבת מולטי-קינאז המ diberikan דרך הפה, מפעילה השפעות נוגדות פרוליפרציה ונוגדות אנגיוגנזה בסרטן הכבד על ידי התמקדות במסלולי גורמי גדילה מרובים. מבחינה היסטורית, sorafenib הייתה הטיפול המערכתי הראשון בקו ראשון שאושר על ידי ה-FDA עבור מטופלים עם סרטן כבד מתקדם או בלתי ניתן לכריתה6. עם זאת, נוף הטיפול הנוכחי בקו ראשון עבור קרצינומה של תאי הכבד (HCC) מתקדמת התרחב משמעותית. האפשרויות המומלצות כוללות כיום, בין היתר, את השילוב של מעכבי נקודת בקרה חיסונית atezolizumab בתוספת bevacizumab, lenvatinib, ואת השילוב של אימונותרפיה כפולה durvalumab בתוספת tremelimumab. למרות התקדמויות אלה, sorafenib נותרת אפשרות חשובה בקו ראשון, במיוחד באזורים שבהם שילובי אימונותרפיה אינם זמינים בקלות או שהם מנוגדים. בהתחשב בשימושה הנרחב בסרטן הכבד, תופעות לוואי הקשורות לתרופה עוררו דאגה7. בניתוח מסד הנתונים של מערכת הדיווח על תופעות לוואי של ה-FDA (FAERS) משנת 2006 עד 2023, תופעות הלוואי של sorafenib נגעו בעיקר למערכת העיכול, לעור ולרקמות תת-עוריות, וכן לאי-נוחות פיזית לא ספציפית כגון זיהומים ופציעות7. בעוד שחלק מהמטופלים עם סרטן כבד מתקדם עשויים להפיק תועלת מטיפול ב-sorafenib, רוב המטופלים מפתחים בסופו של דבר עמידות או כישלון טיפולי, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה8,9,10. למרות השימוש בה, sorafenib מועילה לכש-30% בלבד מהמטופלים עם HCC; יתרה מכך, המגיבים מפתחים לעיתים קרובות עמידות בתוך 6 חודשים11. המסלולים המולקולריים המעורבים בעמידות ל-sorafenib כוללים את קינאז מווסת סיגנל חוץ-תאי (ERK)/ERK מאופשר (p-ERK), פרוטאין קינאז B (Akt), פוספו-אינוזיטיד 3-קינאז (PI3K)/AKT/מטרה של רפמיצין ביונקים (mTOR), גורם השראה להיפוקסיה 1α (HIF-1α)/HIF-2α, ומסלולים הקשורים לאוטופגיה, כאשר ERK/p-ERK הודגש ונבחר באופן ספציפי במחקר זה11. Gemcitabine הוא אנלוג של ציטידין שנכנס לגוף כדי לייצר דיפלואורוציטידין דיפוספט ודיפלואורוציטידין טריפוספט, להם השפעות עיכוב שונות על סינתזת DNA12. בגידולי מערכת הכבד והמרה, gemcitabine נבחן כמרכיב בכימותרפיה משולבת. עם זאת, דווח קלינית כי gemcitabine מפגין עמידות תרופתית גבוהה יותר, מה שמגביל את יעילותו של gemcitabine12,13. לפיכך, קביעת משטר התרופות האופטימלי באופן יעיל ואפקטיבי היא מאתגרת ביותר. מחקרים אחרונים הראו כי שילוב של gemcitabine עם sorafenib עשוי להוביל ליעילות טיפולית מוגברת בהתבסס על חיזוי של סמן ביולוגי חדש לstemness של גידול14. עם זאת, למיטב ידיעתנו, שום מחקר לא בחן שילוב זה באופן ספציפי בסרטן הכבד תוך שימוש בתאי HepG2 ובמודל קסנוגרפט של קרצינומה של תאי הכבד בעכברים עם תסמונת סוכרת לא-השמנה/חסר חיסוני משולב חמור (NOD/SCID). לכן, עדיין חסרות ראיות ניסיוניות המעידות ישירות על ההשפעות המצטברות של sorafenib ו-gemcitabine בסרטן הכבד.
הפרוצדורות המתוארות בכתב יד זה נמצאות בשימוש נרחב, אך לעיתים רחוקות מוצגות בפורמט ויזואלי, מפורט ומדורג, המתאים לשחזור על ידי חוקרים בתחילת דרכם. השערנו כי השילוב של sorafenib ו-gemcitabine יעכב באופן אדיטיבי את השגשוג של תאי סרטן הכבד ואת צמיחת הגידול, וכי השפעה זו תהיה קשורה להסדרה של מטה (downregulation) של מסלול ה-ERK/p-ERK ולהפחתה של אנגיוגנזה המתווכת על ידי גורם גדילה של תאי אנדותל וסקולריים (VEGF). מחקר זה נועד לבחון באופן ראשוני את ההשפעה העיכובית של sorafenib בשילוב עם gemcitabine על השגשוג של קו תאי סרטן הכבד HepG2 in vitro ו- in vivo ואת המנגנון העומד מאחוריה (Supplementary Figure 1). החידוש במחקר זה בא לידי ביטוי בשלושה היבטים: (1) זהו המחקר הראשון שבודק את השילוב של sorafenib-gemcitabine באופן ספציפי בסרטן הכבד באמצעות קו התאים הנפוץ HepG2 ומודל עכברים NOD/SCID תואם; (2) הוא חוקר את מסלול ה-ERK/p-ERK, שטרם נחקר מספיק, כמנגנון פוטנציאלי; ו-(3) הוא מספק ראיות ניסיוניות ישירות — ולא תחזיות חישוביות — להשפעה האדיטיבית של שילוב זה בסרטן הכבד. מאפיינים אלו מבדילים עבודה זו מדיווחים קודמים על טיפול משולב שבוצעו בסוגי גידולים אחרים או באמצעות מודלים ניסיוניים שונים, במיוחד בהקשר של משטרי טיפול מבוססי sorafenib.
פרוטוקול
אישור אתי ניתן על ידי ועדת רפואה אתית ורווחת בעלי מעבדה של אוניברסיטת Zhejiang (מספר אישור ZJU20250049).
בעלי חיים וחלוקה לקבוצות
סך הכל 40 עכברות NOD/SCID, בגיל 4–5 שבועות ובמשקל 18–20 g, נרכשו מספק מסחרי מורשה (רישוי מספר SCXK (Shanghai) 2013-0006) ושוכנו בחדרי בעלי חיים ברמה של נטולי פתוגנים ספציפיים (SPF). כל פרוטוקולי בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות הסטנדרטיות. במהלך הניסוי, בעלי החיים קיבלו גישה חופשית למזון ולשתייה, שוכנו בקבוצות (5 עכברים לכל כלוב) בחדר SPF מבוקר היטב, כאשר טמפרטורת החדר נשמרה על 22 ± 2 °C, לחות של 50%–60%, ומחזור אור/חושך של 12/12 h. בעלי החיים קיבלו מזון ומים ad libitum, ומשקל גופם נוטר every 2 weeks. כאשר העכברים הראו כאב מתמשך, קכקסיה, כישורי גידול, כאשר גודל הגידול הגיע לממד מקסימלי של 2 cm, או בעיות בריאות בלתי הפיכות אחרות, בוצע המתה על ידי הזרקה תוך-פריטונית של 0.45% pentobarbital sodium במינון של ≥150 mg/kg למשקל גוף, ולאחר מכן אישור של הפסקת נשימה ודופק, אובדן רפלקס קרנית, או יישום של שיטה פיזית משנית במידת הצורך, בהתאם לקריטריונים לסיום הומני שאושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים. גודל המדגם (n = 10 לקבוצה) נקבע על בסיס ניתוח עוצמה (power analysis) בהנחה של גודל אפקט של 1.2 (נגזר מניסויי פיילוט), α = 0.05, ו-β = 0.20 (עוצמה של 80%), בתוספת מרווח של 20% לנשירה. הליכי השתלת הגידול בוצעו לפני הקצאת הטיפול (ראה להלן להקמת xenograft).
העכברים חולקו באופן אקראי ל-4 קבוצות באמצעות שיטת טבלת המספרים האקראיים לאחר השתלת הגידול ואישור תפיסת הגידול: קבוצת ביקורת, קבוצת sorafenib, קבוצת gemcitabine, וקבוצת שילוב של sorafenib עם gemcitabine, כאשר בכל קבוצה היו 10 עכברים (5 עכברים/כלוב), כדי להקים את מודל גידול השתלה בעכברי NOD/SCID. מכיוון שרקמות גידול במהלך תהליך המודלינג עלולות לגרום למצב כללי גרוע או אף למוות בעכברי NOD/SCID, ובהתחשב בכך שניתוח סטטיסטי דורש בדרך כלל גודל מדגם יעיל, נכללו לפחות 10 עכברים בכל קבוצה. החלוקה האקראית בוצעה על ידי טכנאים עצמאיים והכלובים סומנו; לא הוטבע סמיות (blinding) במהלך מתן התרופות או מדידת הגידולים, דבר המהווה מגבלה משמעותית. שאר דגימות הרקמה, ההערכות הביוכימיות והפתולוגיות בוצעו כולן על ידי צוות מעבדה מסומים. הנתונים נותחו אף הם בסמיות על ידי סטטיסטיקאים שהייתה להם גישה לקבצים מקודדים בלבד עד להשלמת הסטטיסטיקה וחשיפת הנתונים. כל בעלי החיים נכללו בניתוח הסופי. נבחרה דרך מתן תוך-פעטונית (intraperitoneal) עבור שתי התרופות כדי להבטיח ספיגה סיסטמית וזמינות ביולוגית עקבית; מינון פעם ביום התבסס על מחקרי פרמקוקינטיקה קודמים שהראו ריכוזים קבועים בפלזמה במשטר זה. לקבוצת ביקורת הנשאי (vehicle control) הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של תמיסת סליין סטרילית. בקבוצת ה-sorafenib, הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של sorafenib במינון 40 mg/kg. בקבוצת ה-gemcitabine, הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של gemcitabine במינון 100 mg/kg. קבוצת הטיפול המשולב: הומנו תוך-פעטונית 0.2 mL מכל אחת מהתרופות, sorafenib במינון 40 mg/kg ו-gemcitabine במינון 100 mg/kg. כל קבוצה קיבלה טיפול פעם ביום במשך 20 ימים רצופים. כל בעלי החיים נכללו בניתוח הסופי, ולא הוצאו עכברים מהמחקר. לא נצפתה תמותה באף אחת מהקבוצות במהלך תקופת הטיפול בת 20 הימים. לוח הזמנים והמינונים נבחרו על בסיס מחקרים שפורסמו במודלים של סרטן דרכי המרה וכבד. יש לציין כי מתן יומי תוך-פעטוני של gemcitabine עלול לגרום לרעילות. אורך ורוחב הגידולים המשתלים נמדדו מדי יום, ונפח הגידולים המשתלים חושב. לאחר 20 ימים, בעלי החיים הורדמו תחת הרדמה עמוקה והומתו באמצעות שבירת צוואר (cervical dislocation), ורקמות הגידול המשתלות קובעו בפורמלין. משקל הגוף נמדד מדי יומיים לאורך כל המחקר. העכברים נוטרו מדי יום לסימנים קליניים של רעילות, כולל זקיפת שיער (piloerection), תנוחת גב כפוף, ירידה בניידות, שלשול ולתשישות. עם זאת, לא בוצעו בדיקות ביוכימיה של הסרום (למשל, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase ו-creatinine) ובדיקה היסטופתולוגית של איברים מרכזיים. לכן, לא ניתן לשלול רעילות תת-קלינית.
תרופות וריאגנטים
Sorafenib הומס ב-10% dimethyl sulfoxide (DMSO) ואוחסן ב-20 °C-. לפני השימוש, התמיס הופשר ודולל לריכוז סופי של DMSO הנמוך מ-0.5%, דבר שלא השפיע על צמיחת התאים. Gemcitabine הושג ממקור מסחרי. תמיסת ליזיס מסוג Radioimmunoprecipitation assay (RIPA), thiazolyl blue, נוגדנים ראשוניים נגד glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK, ו-VEGF, נוגדנים משניים, מצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עשיר בגלוקוז, סרום בקר עוברי (fetal bovine serum) ושורת התאים HepG2 הושגו ממקורות מסחריים.
סורפניב (Sorafenib) וגמציטבין (gemcitabine) הם סוכנים ציטוטוקסיים. יש לבצע את כל הלימודי ההכנה והטיפול בתרופות בתוך קב不可-בטיחות ביולוגית ייעודית תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן). DMSO, מתנול, קסילן וממסים אורגניים אחרים המשמשים בפרוטוקול זה הם חומרים מסוכנים ויש לטפל בהם תחת מנדף כימי כדי למנוע שאיפה או מגע עם העור. יש לעיין בגיליונות בטיחות החומרים (MSDS) עבור כל הרכיבים לפני השימוש.
תרבית תאים
קו התאים HepG2 הוחיה והוחדר לבקבוקי תרבית תאים, המכילים 10 mL של מצע DMEM עשיר גלוקוז (בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניסילין-סטרפטומייסן, ו-4 mmol/L גלוטמין). התאיםK הודגרו ב-37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO₂. מצע התרבית הוחלף מדי יומיים, והתאים הועברו למצע חדש (passaged) מדי 4 ימים כדי לשמור על צמיחה לוגריתמית. קו התאים HepG2 התקבל ממקור מסחרי; עם זאת, במחקר זה לא בוצעו אימות עצמאי של קו התאים (למשל, פרופיל short tandem repeat) ובדיקה למיקופלסמה.
שיטת MTT לקביעת שיעור עיכוב השגשוג
שיטת ה-3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) שימשה לקביעת שיעור עיכוב השגחה של sorafenib ו-gemcitabine על קו התאים HepG2. תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עוברו בעיכול באמצעות trypsin בריכוז 0.25% למשך 2 דקות, ואת העיכול הפסיקו על ידי הוספה של נפח שווה של מצע גידול מלא. לאחר צנטריפוגה במהירות של 1000 × ג'' במשך 10 דקות, התאים הושעו שוב במדיום מלא. צפיפות התאים כווננה ל-1 × 105 תאים/מ"ל, ו- 200 µL מת сусפנסיות התאים נזרע לכל באער של פלטת 96 באערים. צפיפות זריעה זו נבחרה על בסיס ניסויי אופטימיזציה מקדימים, שבהם נבדקו צפיפויות תאים בטווח שבין 5 × 103 עד 5 × 104 נבדקו 2 תאים לבאר. הצפיפות של × 104 מספר התאים לבאר הוביל לעלייה ליניארית בבליעה (absorbance) לאורך 96 שעות, ושמר על רמת התמזגות (confluence) של פחות מ-80% בנקודת הסיום, כפי שאושש בבדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ הפוך. כדי להבטיח שמדידות ה-MTT יישארו בטווח הליניארי, בוצעו ניסויי פיילוט בכל נקודת זמן עם בארי ביקורת שטופלו בחומר הנשאי (vehicle). המצע הוחלף מדי 48 שעות כדי למנוע דלדול של חומרי תזונה והצטברות של תוצרי לוואי מטבוליים. רמת ההתמזגות נוטרה מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לאחר 96 שעות, בארי הביקורת הגיעו לכ-75%–80% התמזגות, ולא נצפו סימנים גלויים לדלדול חומרי תזונה. לאחר היצמדות התאים, המצע הוסר והתווסף מצע המכיל את התרופה. לקבוצת הביקורת שלא טופלה התווסף מצע ללא תרופה (ביקורת נשא עבור in vivo ניסויים). הניסוי חולק לקבוצת ביקורת ללא טיפול, קבוצת sorafenib, קבוצת gemcitabine וקבוצת טיפול משולב. המנות של sorafenib היו 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Lו- 6 µmol/L, והמינונים של gemcitabine היו 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Lו- 20 µmol/Lהמינונים של סוראפניב (sorafenib) בשילוב עם גמציטבין (gemcitabine) היו 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Lו- 6 µmol/L + 20 µmol/Lהתאים בכל קבוצה תורגלו במשך 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-96 שעות. לאחר התרגול, 20 µL הוסיפו לכל באר 5 מ"ג/מ"ל של MTT, והתאים הוכנסו לאינקובטור תאים למשך 4 שעות. את הנוזל העילאי שפכו בזהירות, ולאחר מכן 150 µL של DMSO הוספה לכל בארה, והלוחית נוערה במשך 10 דקות כדי להמיס לחלוטין את הפורמזאן, וערך הצפיפות האופטית (OD) של כל בארה נמדד באורך גל של 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלייט רב-תכליתי. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים, ובכל קבוצה היו חמש בארות חזרתיות. הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD) של שלושה חזרות ביולוגיות. שיעור עיכוב צמיחת התאים (%) = (1 - OD קבוצת הניסוי /OD קבוצה ללא טיפול）× 100%. האינטראקציה בין שתי התרופות נבחנה על ידי ה- קערך-p, שחושב באמצעות הנוסחה: שאלון = EAB / (EA + EB - EA × EB). כאן, EA ו-EB הם שיעורי העכבה של תרופות A ו-B כאשר נעשה בהן שימוש לבד, ו-EAB הוא שיעור העכבה כאשר שתי התרופות נעשה בהן שימוש יחד. כאשר נא לספק את הטקסט למסירה. גדול מ-1.15, הוא מעיד על אפקט סינרגי בין שתי התרופות; 0.85–1.15 מעידים על אפקט אדיטיבי; ו- נא לספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. ערך הנמוך מ-0.85 מעיד על אפקט אנטגוניסטי. ה- שאלוןשיטת ערך ה- (value-) היא כלי סריקה פשוט ואינה מהווה תחליף לניתוחים קפדניים יותר של סינרגיה. נבדקו רק מספר מצומצם של זוגות מינונים ביחס קבוע, דבר המגביל את חוסנו של הטענה לסינרגיה. לפיכך, המונח "סינרגיה" במחקר זה הכוונה ל- שאלה > 1.15 בזוגות מינונים ובנקודות זמן ספציפיות, ולא לאינטראקציה אדיטיבית (מכמילית) מהודקת לאורך כל מטריצת התגובה למינון.
ניתוח Western blot של ביטוי חלבוני ERK ו-p-ERK
תרבית תאים והקמה של קבוצות ניסויי בוצעו כפי שתואר לעיל. לצורך זיהוי של ERK ו-p-ERK באמצעות Western Blotting, המנה של sorafenib הייתה 3 µmol/L; המנה של gemcitabine הייתה 10 µmol/L; והמנה המשולבת הייתה 3 µmol/L + 10 µmol/L. לאחר 72 h של טיפול, התאים לויסו באמצעות RIPA lysis buffer, וחלבון כולל הופק מכל קבוצה ניסויית. ריכוז החלבון נקבע בשיטת bicinchoninic acid (BCA). כמויות שוות של חלבון (30 µg לכל נתיב) הועמסו והופרדו באמצעות 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) במתח של 120 V למשך 90 min. חלבונים הועברו לממברנות polyvinylidene difluoride (PVDF) (גודל נקבים 0.45 µm) בזרם של 300 mA למשך 90 min בטמפרטורה של 4 °C. לאחר חסימה עם 5% non-fat milk ב-Tris-buffered saline עם 0.1% Tween-20 (TBST) למשך 1 h בטמפרטורת החדר, הממברנות דגרו עם נוגדי גוף ראשוניים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור עדין. לאחר שלושה שטיפות עם TBST (10 min כל אחת), הממברנות דגרו עם נוגדי גוף משניים למשך 1 h בטמפרטורת החדר. פסי חלבון הודגמו באמצעות תסבך enhanced chemiluminescence (ECL) وصולמו באמצעות מערכת דיגיטלית להדמיית ג'לים. זמני החשיפה עברו אופטימיזציה עבור כל נוגד גוף כדי למנוע רוויה. כימות דנסיטומטרי בוצע באמצעות תוכנת ImageJ בעזרת כלי ניתוח הג'לים. עוצמות פסי כל חלבוני המטרה נורמלו ל-GAPDH כבקרת העמסה, וביטוי של p-ERK נורמל בהמשך לביטוי של ERK כולל. לא בוצעו שלבי חסימה נוספים מעבר ל-5% non-fat milk. תוצאות הכימות הוצגו כשינוי במכפלה (fold change) ביחס לקבוצת הביקורת, שנקבעה ל-1.0. כל ניסוי חזר שלוש פעמים באופן בלתי תלוי. אימונובלוטים מייצגים מוצגים להלן.
זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי VEGF בגידולי קסנוגרפט של HepG2 בעכברי NOD/SCID
להקמת השתלה זרה (xenograft): תאי HepG2 בשלב צמיחה לוגריתמי נאספו על ידי טריפסינציה, נשטפו פעמיים במי מלח עם פוספט (PBS) סטרילי, והושהו מחדש ב-DMEM ללא סרום. סך של 2 × 106 תאים ב-0.2 mL של DMEM ללא סרום (ללא Matrigel) הוחדרו תת-עורי לאזור הבת בבית השמאלי (אזור עם אספקה דמית עשירה) של כל עכבר NOD/SCID באמצעות מזרק של 1 mL, כדי להקים מודל השתלה זרה תת-עורית של HepG2 בעכברי NOD/SCID. קליטת הגידול נוטרה מדי יומיים. גודל הגידול נמדד מדי יומיים, וכשקוטר הגידול הגיע ל-0.3–0.5 cm (בסביבות 7–10 ימים לאחר ההזרקה, נקודת זמן זו הוגדרה כנקודת תחילת הטיפול), חולקו העכברים באופן אקראי ל-4 קבוצות לצורך הניסוי. האורך (L) והרוחב (W) של השתלה הזרה תת-העורית נמדדו מדי יום באמצעות קליפרים דיגיטליים, ונפח הגידול (V) חושב לפי הנוסחה: V = (L × W2) / 2. כל המדידות בוצעו על ידי חוקר שלא היה מודע להקצאת הקבוצות. לאחר 20 ימים, בעלי החיים הורדמו עמוק והורגו על ידי פריקה צווארית, ורקמת השתלה הזרה קובעה בפורמלין נייטרלי מbuffered בריכוז 10% למשך 24 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוטמעה בפראפין. חתוכים של רקמה (בעובי 5 µm) נחתכו באמצעות מיקרוטום סיבובי והורכבו על שקופיות זכוכית מצופות poly-L-lysine. עבור אימונוהיסטוכימיה, החתכים עברו דפראפיניזציה בקסילן (שלושה החלפות, 5 min בכל פעם) והורטבו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 70%, 50%; 3 min בכל פעם). שחזור אנטיגן בוצע על ידי חימום החתכים בבופר נתרן ציטראט 10 mM במיקרוגל למשך 15 min, ולאחריו קירור בטמפרטורת החדר למשך 20 min. פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה עם מי חמצן 3% במתנול למשך 10 min בטמפרטורת החדר. קשירה לא ספציפית נחסמה עם סרום עיזים נורמלי 5% ב-PBS למשך 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החתכים הוכשקו עם נוגדן ראשוני anti-VEGF (בדילול 1 : 200) למשך לילה ב-4 °C בתא לח. לאחר שטיפה ב-PBS (שלוש פעמים, 5 min בכל פעם), החתכים הוכשקו עם נוגדן משני של עיזים נגד ארנב המשוייך ל-horseradish peroxidase (HRP) (בדילול 1 : 500) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. האות זוהה באמצעות סובסטרט 3,3′-diaminobenzidine (DAB). החתכים נצבעו בצביעה נגדית של המטוקסילין למשך 30 s, עברו דהידרטציה, הבהרה והורכבו עם כיסויים באמצעות מדיום קיבוע קבוע. הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך בהגדרות שדה בהיר בהגדלה של ×100. תמונות מייצגות מוצגות לצורך הדגמה איכותית.
כל הטיפים, המבחנות ופסולת תרביות התאים המזוהמים נאספו כפסולת ביולוגית מסוכנת ועברו עיקור באוטוקלב לפני השליכה. פסולת כימית, כולל תמיסות המכילות תרופות, DMSO, קסילן ומתנול, נאספה במכלי פסולת נפרדים ומסומנים והושלכה בהתאם לתקנות המוסדיות המקומיות עבור פסולת כימית מסוכנת.
ניתוח סטטיסטי
לניתוח סטטיסטי נעשה שימוש בתוכנת SPSS 19.0. נתונים ניסויים הוצגו כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות עבור ניסויי in vitro, וכממוצע ± סטיית תקן (SD) מ-n = 10 עכברים לקבוצה עבור ניסויי in vivo. להשוואות בין שתי קבוצות נעשה שימוש במבחני t לא מזווגים דו-זנביים. להשוואות בין מספר קבוצות נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו במבחן post hoc של Tukey. דווחו ערכי p < 0.05, p < 0.01, ו-p < 0.001.
תוצאות
ההשפעה המעכבת של sorafenib ו-gemcitabine על שגשוג תאי HepG2
סורפניב (Sorafenib) וגמציטאבין (gemcitabine) עיכבו את התרבות תאי HepG2 באופן תלוי מינון, כפי שמוצג ב-Table 1. הטיפול המשולב הראה שיעורי עיכוב גבוהים באופן מובהק בכל נקודות הזמן בהשוואה לטיפול בודד. בדיקת MTT מודדת פעילות מטבולית, אשר נמצאת במתאם עם מספר התאים אך אינה מודדת באופן ישיר התרבות או ציטוטוКСיות. לכן, יש לפרש את המונח "עיכוב התרבות" כהפחתה בהמרת MTT. ראוי לציין כי השילוב של סורפניב בריכוז 3 µmol/L וגמציטאבין בריכוז 10 µmol/L השיג את אפקט העיכוב הבולט ביותר, מה שמדגיש את פוטנציאל השילוב כמשטר טיפולי יעיל נגד סרטן הכבד. בדיקה נוספת הדגימה אפקט אדיטיבי של סורפניב וגמציטאבין על תאי HepG2. Table 2 מציגה את ערכי ה-q, המעידים על אינטראקציות סינרגטיות פוטנציאליות בין שתי התרופות. בולט במיוחד כי השילוב של 3 µmol/L סורפניב פלוס 10 µmol/L גמציטאבין הראה ערכי q הגבוהים מ-1.15 במספר נקודות זמן, מה שמרמז על קשר בין ביטוי מופחת של p-ERK לבין האפקט האנטי-פרוליפרטיבי שנצפה, אם כי נתונים אלו אינם מוכיחים סיבתיות. ממצאים אלו מצביעים על כך שנדרשת בדיקה נוספת במודלים נוספים של סרטן הכבד לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות לגבי הפוטנציאל הטיפולי. הסינרגיה לא נצפתה בכל זוגות המינונים; תחת זאת, היא הייתה מוגבלת לשילוב ריכוזים ספציפי אחד.
איור 1 ממחיש כי שיעור עיכוב השגשוג התאי בקבוצת ה-sorafenib ובקבוצת הטיפול המשולב הגיע לשיאו לאחר 72 h. הטיפול המשולב, במיוחד במינון של 3 µmol/L sorafenib ו-10 µmol/L gemcitabine, הוביל לשיעור עיכוב גבוה באופן ניכר בהשוואה לטיפולים בחומרים בודדים.
השפעת sorafenib ו-gemcitabine על ביטוי ERK ו-p-ERK
איור 2A מראה כי אין שינוי משמעותי בביטוי חלבון ERK בכל הקבוצות. עם זאת, ביטוי p-ERK פחת באופן משמעותי בקבוצת ה-sorafenib ובקבוצת הטיפול המשולב, כאשר הירידה הגדולה ביותר נצפתה בקבוצה המשולבת. נתונים אלו מדגימים קשר בין רמות p-ERK מופחתות לבין הטיפול המשולב, אך אינם קובעים כי הפחתה ב-p-ERK מתווכת ישירות את האפקט האנטי-פרוליפרטיבי. כימות דנסיתומטרי, נורמליזציה של p-ERK ל-ERK כולל ול-GAPDH, מידע על חזרות ביולוגיות והשוואות סטטיסטיות לא בוצעו. לפיכך, ה-immunoblots המוצגים הם מייצגים ואיכותיים בלבד.
השפעת sorafenib ו-gemcitabine על נפח קסנוגרפטים תת-עוריים של סרטן כבד מושתל בעכברי NOD/SCID
לא היה הבדל מובהק בנפח השתלי הקסנוגראפט התת-עוריים בין הקבוצות לפני הטיפול (p = 0.367). לאחר הטיפול, נפח הגידול פחת באופן מובהק בהשוואה לקבוצת הביקורת, וקבוצת הטיפול המשולב הייתה קטנה באופן מובהק מאלו שבקבוצות הסורפניב (sorafenib) והגמציטאבין (gemcitabine) (p < 0.001), כפי שמוצג ב-איור 2B. יש לפרש תוצאות אלו בזהירות, כיוון שלא נאספו נתוני רעילות או פרמקוקינטיקה כדי לאשר שההבדלים שנצפו אינם מושפעים מתחלואה הקשורה לתרופות או מהבדלים בחשיפה הסיסטמית.
השפעת סורפניב וגמציטבין על ביטוי VEGF בסרטן כבד מושתל בעכברי NOD/SCID
איור 2C מציג את הניתוח האימונוהיסטוכימי של ביטוי VEGF ברקמות גידול. קבוצות ה-sorafenib והשילוב הראו צביעה אימונוהיסטוכימית חומה-צהובה מופחתת וביטוי VEGF חלש יותר בניתוח אימונוהיסטוכימי איכותני. ממצא זה מרמז על פוטנציאל אנגיוגני מופחת, אך אינו מדגים באופן ישיר אנגיוגנזה, שכן לא בוצעו ניתוחים של סממני תאי אנדותל או של צפיפות מיקרו-כלי דם. קבוצות ה-gemcitabine והביקורת הראו ביטוי VEGF חזק יותר מבחינה איכותנית. ממצאים איכותניים אלו של VEGF הם קורלטיביים ומייצרים השערות בלבד. ללא ניתוח כמותי או סממנים וסקולריים ישירים, לא ניתן להסיק מסקנה לגבי אנגיוגנזה או סינרגיה באנגיוגנזה.
זמינות נתונים
הנתונים הגולמיים שהופקו ונותחו במהלך מחקר זה כלולים בחומרי העזר (קובץ משלים 1).
איור 1: השפעות של התערבויות שונות על שיעור עיכוב השג proliferace (התרבּות) של תאי HepG2. (A) שיעור עיכוב (%) של sorafenib בנקודות זמן שונות בתאי HepG2. (B(%) שיעור עיכוב של gemcitabine בנקודות זמן שונות בתאי HepG2. (C) שיעור עיכוב (%) של sorafenib בשילוב עם gemcitabine בתאי HepG2. (ד׳) שיעור עיכוב (%) של sorafenib (3 µmol/L) וגמציטאבין (10 µmol/L) לבדו, ובשילוב לאחר 72 שעות של טיפול בתאי HepG2. *p < 0.05, **p < 0.01 לעומת קבוצת ביקורת. כל נתוני שיעור העכבה התקבלו באמצעות בדיקת MTT כפי שמתואר בפרוטוקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 2: ביטוי ERK/p-ERK, נפח גידול וביטוי VEGF בקבוצות המטופלות. (A) ביטוי של ERK ו-p-ERK בתאי HepG2 תחת טיפולים שונים; (B) נפח (mm3) של גידולים בארבע קבוצות לפני ואחרי הטיפול (n = 10 לכל קבוצה). **p < 0.01 مقابل קבוצת הביקורת לאחר הטיפול. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות one-way ANOVA על נפחי סוף הניסוי. (C) תמונות אימונוהיסטוכימיה מייצגות (סרגל קנה מידה = 100 µm) של ביטוי VEGF ברקמות גידול מכל קבוצה (n = 10 לכל קבוצה). תמונות אלו מוצגות לצורך הדגמה איכותית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
| קבוצה (μmol/L) | זמן טיפול (h) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib | 1.5 | 12.41 ± 3.37 | 22.74 ± 4.57 | 29.76 ± 3.48 | 15.77 ± 3.18 |
| 3 | 26.37 ± 6.14 | 33.10 ± 4.39 | 44.71 ± 5.49 | 38.63 ± 5.68 | |
| 4.5 | 34.42 ± 5.26 | 58.91 ± 4.67 | 67.85 ± 5.20 | 54.26 ± 6.07 | |
| 6 | 46.88 ± 6.61 | 67.48 ± 5.70 | 73.57 ± 7.07 | 61.73 ± 6.10 | |
| Gemcitabine | 5 | 3.56 ± 1.41 | 6.17 ± 1.73 | 9.31 ± 1.76 | 11.35 ± 1.95 |
| 10 | 5.89 ± 2.47 | 9.62 ± 2.15 | 14.57 ± 1.94 | 16.58 ± 2.31 | |
| 15 | 14.57 ± 3.38 | 19.53 ± 2.27 | 22.43 ± 2.13 | 24.75 ± 3.25 | |
| 20 | 22.36 ± 4.46 | 28.76 ± 3.92 | 33.18 ± 3.19 | 38.49 ± 4.28 | |
| Sorafenib + Gemcitabine | 1.5 + 5 | 14.13 ± 2.16 | 26.41 ± 3.43 | 37.75 ± 4.75 | 22.04 ± 2.84 |
| 3 + 10 | 38.69 ± 3.94 | 46.26 ± 4.06 | 71.23 ± 6.76 | 62.47 ± 7.20 | |
| 4.5 + 15 | 40.89 ± 4.21 | 74.30 ± 6.98 | 84.82 ± 9.17 | 66.89 ± 7.16 | |
| 6 + 20 | 64.05 ± 6.54 | 80.67 ± 9.79 | 92.22 ± 10.24 | 81.05 ± 9.87 | |
טבלה 1: שיעור עיכוב (%) של sorafenib ו-gemcitabine בתאי HepG2. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים.
| קבוצה (μmol/L） | זמן טיפול (שעות) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| סורפניב + גמציטבין | 1.5 + 5 | 0.91 | 0.96 | 1.04 | 0.87 |
| 3 + 10 | 1.26 | 1.17 | 1.35 | 1.28 | |
| 4.5 + 15 | 0.93 | 1.11 | 1.13 | 1.02 | |
| 6 + 20 | 1.09 | 1.05 | 1.12 | 1.06 | |
טבלה 2: q-value של ההשפעה הסינרגית של sorafenib ו-gemcitabine על תאי HepG2. q > 1.15 מעיד על סינרגיה; 0.85–1.15 מעיד על אדיטיביות; q < 0.85 מעיד על אנטגוניזם. הנתונים נגזרו משלושה ניסויים עצמאיים.
איור משלים 1: המחקר נערך בשני שלבים עיקריים: ניסויי in vitro באמצעות שורת התאים HepG2 וניסויי in vivo באמצעות מודל קסנוגרפט בעכברי NOD/SCID. ב- in vitro, תאי HepG2 טופלו ב-sorafenib, gemcitabine, או שילוב שלהם בריכוזים שונים. השגחה על פרוליפרציית התאים בוצעה באמצעות מבחן MTT, והביטוי של ERK ו-p-ERK נותח בשיטת Western blotting. ב- in vivo, מודל קסנוגרפט הוקם על ידי הזרקה תת-עורית של תאי HepG2 לעכברי NOD/SCID. העכברים חולקו לארבע קבוצות טיפול וקיבלו הזרקות תוך-peritoneali יומיות. נפח הגידול נמדד לאורך תקופת הטיפול. לאחר ההמתה, רקמות הגידול נאספו ונבדקו בצביעה אימונוהיסטוכימית ל-VEGF. כל הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות תוכנת SPSS 19.0.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 1: Raw data.rar.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
לסרטן הכבד יש שיעור תמותה גבוה בשל הופעתו החמקמקה, התקדמותו המהירה והמעטות של הטיפולים היעילים3,15. סרטן כבד בשלב מתקדם מראה לעיתים קרובות עמידות לכימותרפיה ולקרינה, והאפשרויות הנוכחיות, כולל כריתה כירורגית והשתלת כבד, נותרות בלתי מספקות15,16. שילוב של שתי תרופות כימותרפיות או יותר בעלות מנגנוני פעולה שונים פותח היטב ונאמן כי הוא מגביר מאוד את היעילות, מה שעשוי להוות אסטרטגיה חלופית לטיפול במחלה15,16. תרופות ממוקדות למחקר סרטן הכבד כוללות נוגדי גוף Ein-monoclonal (anti-VEGF ו-anti-EGFR), מעכבי טירוזין קינאז ומעכבי mTOR, ואתגר מרכזי הוא האינטגרציה האופטימלית של תרופות קיימות להשגת שיפורים בהישרדות הכללית ובאיכות החיים17. אם ייחקר שילוב של תרופות יעילות ובעלות רעילות נמוכה, הדבר עשוי לסייע בהתגברות על המגבלות הנוכחיות בטיפול בסרטן הכבד. מודל תאים מהעת האחרונה שהראה עמידות כימותרפית ל-gemcitabine העלה כי ניתן להחזיר את הרגישות ל-gemcitabine/sorafenib (מעכבי EGFR)14. ממצא זה מעורר עניין רב עבורנו כיוון שמדובר בנושא מדעי שטרם נחקר. תכנון גורמים חלקי (fractional factorial design) זיהה את השילוב האופטימלי של שלוש תרופות: gemcitabine (1.4 mmol/L), sorafenib (0.03 mmol/L), ו-S-1 (0.185 mmol/L), אשר מעכב באופן משמעותי את השגשוג של cholangiocarcinoma (CCA) ואת צמיחת הגידול על ידי דיכוי מסלול AKT/mTOR והשראת אפופטוזיס18. Awasthi ועמיתיו הראו כי sorafenib עיכב את הפוספורילציה של mitogen-activated protein kinase (MEK), ERK1/2, 70 kDa ribosomal protein S6 kinase (p70S6K) ו-4E-binding protein 1 (4EBP-1) בתאי pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), וכן את שגשוג התאים; כאשר שולב עם gemcitabine, הוא הפגין השפעות אנטי-פרוליפרטיביות ופרו-אפופטוטיות מצטברות בתאים שונים, ובכך האריך באופן משמעותי את תקופת ההישרדות של בעלי חיים הנושאים גידולים19. הטיפול המשולב ב-gemcitabine ו-sorafenib מעכב את תהליך המעבר האפיתלי-מזנכימלי, ומדכא בנוסף את השגשוג, הנדידה וההסתננות של תאי non-small cell lung cancer (NSCLC), תוך השראת מעצר של מחזור התא ואפופטוזיס20. עם זאת, למיטב ידיעתנו, מחקר זה הוא הראשון לבחון שילוב זה באופן ספציפי במודל in vitro המבוסס על HepG2 ובמודל קסנוגרפט תת-עורי של hepatocellular carcinoma.
מחקר זה נועד למלא פער זה על ידי בחינת ההשפעות של שילוב של sorafenib, מעכב קינזה רב-מטרתי, ו-gemcitabine, אנלוג של cytidine, על סרטן כבד הן in vitro והן in vivo. במחקר זה, ל-sorafenib ול-gemcitabine לבד היו השפעות מעכבות על השגשוג של תאי HepG2, וההשפעה המעכבת של השילוב של שני התרופות חזקה משמעותית מזו של תרופה בודדת, מה שמעיד על אפקט אדיטיבי. עם זאת, בדיקת MTT לבדה אינה יכולה להבדיל בין השפעות ציטוסטטיות (עצירת גדילה) להשפעות ציטוטוקסיות (מוות תאי), ואינה מספקת ראיה ישירה למנגנונים אנטי-פרוליפראטיביים. ביניהם, ה-q-value של קבוצת השילוב של sorafenib 3 µmol/L + gemcitabine 10 µmol/L היה גבוה מ-1.15 בכל נקודת זמן, מה שמעיד על אפקט סינרגיסטי. sorafenib ו-gemcitabine לבד או בשילוב לא שינו באופן משמעותי את הביטוי של ERK בתאי HepG2, אך sorafenib לבדו ובשילוב עיכבו באופן משמעותי את הביטוי של p-ERK. השילוב של שתי התרופות עיכב באופן אדיטיבי את הפספורילציה של ERK בתאי HepG2. נתונים אלו מצביעים על קשר בין הפחתה ב-p-ERK לבין האפקט האנטי-פרוליפראטיבי של השילוב, אם כי קשר סיבתי לא הוכח. הסינרגיה לא הייתה תכונה כללית של השילוב בכל התנאים שנבחנו, אלא נצפתה רק ביחס ריכוז ספציפי אחד. תוצאות האימונוהיסטוכימיה ממודל קסנוגרפט של סרטן כבד בעכברי NOD/SCID הראו כי השילוב של sorafenib ו-gemcitabine יכול להפחית באופן משמעותי את הביטוי של VEGF ולהקטין את נפח הגידול. עם זאת, מכיוון שלא נאספו באופן שיטתי נתוני רעילות או משקל גוף, איננו יכולים לשלול את האפשרות שנפח הגידול המופחת נובע בחלקו מתחלואה מושרית תרופתית ולא מאפקטים אנטי-גידוליים ספציפיים. השילוב של sorafenib ו-gemcitabine היה קשור גם להפחתה בביטוי VEGF ברקמות הגידול, כפי שהודגם באימונוהיסטוכימיה. תצפית זו מרמזת על אפקט אנטי-אנגיוגני פוטנציאלי, אך חסרה ראיה ישירה להפחתה בוסקולריזציה (למשל, ניתוח צפיפות מיקרו-כלי דם). לפיכך, התרומה של דה-רגולציה של VEGF לאפקט האנטי-פרוליפראטיבי שנצפה נותרה קורלטיבית. אפקט סינרגיסטי זה מרמז כי טיפול משולב עשוי להתגבר על המגבלות של טיפולים בחומר בודד, המובילים לעיתים קרובות לעמידות לתרופות ולכישלון הטיפול. זיהוי מינון שילוב אופטימלי של sorafenib ו-gemcitabine הוא שלב קריטי לקראת יישום קליני של פרוטוקול טיפולי זה.
המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעה האדיטיבית של sorafenib ו-gemcitabine עשויים להיות קשורים לעכבה של מסלול ה-ERK, כפי שעולה מהירידה המשמעותית בביטוי של p-ERK בקבוצת הטיפול המשולב. ידוע כי מסלול ה-ERK ממלא תפקיד קריטי בשרידות, בשרידה ובתהליכי אנגיוגנזה של תאים, מה שהופך אותו למטרה מרכזית בטיפול בסרטן. התוצאות מצביעות על כך שהטיפול המשולב עשוי לשבש את מסלול ה-ERK ביעילות רבה יותר מאשר טיפולים בחומרים בודדים, דבר המתואם עם הפחתה גדולה יותר בביטוי p-ERK בהשוואה למונו-תראפיה. מחקרי In vivo במודל עכברים NOD/SCID תומכים עוד יותר ביתרונות הטיפוליים הפוטנציאליים של הטיפול המשולב. צפינו הפחתה משמעותית בנפח הגידול וירידה בביטוי VEGF בקבוצת הטיפול המשולב. VEGF הוא מניע מרכזי של אנגיוגנזה ב-HCC, ועכבה שלו קשורה להפחתה בצמיחת הגידול ובגרורות. הדרוג המוגבל (downregulation) של VEGF בתגובה לטיפול המשולב עקבי עם ההשערה שמשטר טיפולי זה עשוי למשקף תהליכים אנגיוגניים; עם זאת, ראיות ישירות לפעילות אנטי-אנגיוגנית לא נבחנו במחקר זה. הקשר שנצפה בין ביטוי מופחת של p-ERK לבין ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של השילוב מרמזת, אך אינה מבססת מנגנון סיבתי. מכיוון שניתוח ה-Western blot בוצע רק בנקודת זמן אחת לאחר חשיפה ממושכת לתרופות, הוא אינו יכול ללכוד שינויים דינמיים מוקדמים בפספורילציה של ERK. יתרה מכך, היעדר כימות דנסיתומטרי, סטטיסטיקה ברמת חזרות ונרמול ל-ERK כולל ולבקרי טעינה (loading controls) מגבילים את הפרשנות. לכן, בעוד שביטוי מופחת של p-ERK נמצא במתאם עם הטיפול המשולב, השאלה האם עכבת מסלול ה-ERK מתווכת באופן ישיר את ההשפעה האדיטיבית נותרה לא מאוששת על ידי הנתונים הנוכחיים. תובנה מנגנונית זו עקבית עם אסטרטגיות מתפתחות המכוונות למסלולים מקבילים או מפצים כדי להתגבר על עמידות ב-HCC.
בעוד שמחקר זה מספק תובנות בעלות ערך לגבי ההשפעות האדיטיביות הפוטנציאליות של sorafenib ו-gemcitabine על סרטן הכבד, יש להכיר במספר מגבלות של מחקר זה. ראשית, גודל המדגם במחקר זה קטן יחסית, מה שעלול להגביל את היכולת להכליל את הממצאים. מחקר קוהורט רחב יותר יהיה נחוץ כדי לאשר את היעילות והבטיחות של הטיפול המשולב באוכלוסיית חולים מגוונת יותר. שנית, מחקר זה השתמש בקו התאים HepG2, המהווה מודל מבוסס למחקרי סרטן הכבד אך עשוי שלא לשקף באופן מלא את ההטרוגניות של סרטן הכבד הנמצאת בחולים. תתי-סוגים שונים של סרטן הכבד ורקעים גנטיים שונים עשויים להגיב באופן שונה לטיפול המשולב. לכן, הממצאים המדווחים כאן עשויים שלא להיות ניתנים להכללה לכל סוגי סרטן הכבד, ואימות באמצעות קווי תאים נוספים (למשל, Huh7 [קו תאי קרצינומה של תאי כבד אנושיים] ו-PLC/PRF/5 [קו תאי קרצינומה של תאי כבד אנושיים, הידוע גם כתאי Alexander], או קסנוגרפטים שמקורם בחולה) נחוץ לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות רחבות יותר. שלישית, ניסויי ה- in vivo נערכו באמצעות מודל עכברים NOD/SCID, החסר מערכת חיסון, ובכך אינו מייצג באופן מלא את מיקרו-הסביבה המורכבת של גידול-מערכת החיסון בסרטן כבד אנושי. מחקרים עתידיים צריכים לשלב מודלים של עכברים בעלי מערכת חיסון תקינה או מערכות אנושיות כדי להבין טוב יותר את ההיבטים האימונולוגיים של הטיפול. רביעי, מחקר זה לא העריך את פרופיל הרעילות או הבטיחות של השילוב בין sorafenib ל-gemcitabine. לא נאספו נתונים על שינויים במשקל הגוף, רעילות של איברים (למשל, בדיקות תפקודי כבד וכליות) או אירועים חריגים בעכברי NOD/SCID. לכן, לא ניתן להסיק מסקנות לגבי הבטיחות או הסבילות לשילוב זה מהנתונים הנוכחיים. חמישי, הטענה לאנטי-אנגיוגנזה היא ראשונית ואין לפרש אותה יתר על המידה. בעוד שביטוי VEGF הופחת באופן איכותי, לא ביצענו כל ניתוח אימונוהיסטוכימי (IHC) כמותי (למשל, H-score, אחוז שטח חיובי, עוצמת צביעה, או ניתוח דיגיטלי עיוור של תמונות על פני שדות מרובים לגידול). יתרה מכך, לא העקבנו אחר צפיפות כלי דם זעירים באמצעות סמנים אנדותליאליים כגון Cluster of Differentiation 31 (CD31) או endomucin, ולא ביצענו בדיקות פונקציונליות של כלי דם. לכן, נתוני ה-VEGF הנוכחיים אינם מוכיחים באופן ישיר הפחתה באנגיוגנזה; הם מראים רק הפחתה קורלטיבית ברמות חלבון VEGF. שישי, לניתוח הסטטיסטי יש מספר מגבלות. נפח הגידול נמדד שוב ושוב באותם עכברים במשך 20 ימים, אך השתמשנו ב-one-way ANOVA רק על נפחי נקודת הסיום, במקום ב-repeated-measures ANOVA או במודל של אפקטים מעורבים (mixed-effects model) המתחשב במתאם זמני. נורמליות והומוגניות של השונות לא נבחנו באופן פורמלי. יתרה מכך, בעוד שמחקר זה זיהה קשר בין הפחתה בביטוי p-ERK לבין האפקט האנטי-פרוליפרטיבי האדיטיבי של sorafenib ו-gemcitabine, לא ניתן להסיק סיבתיות מנתונים אלו. לניתוח ה-Western blot יש מספר מגבלות נוספות: (i) נבדקה רק נקודת זמן אחת מאוחרת (72 h), בעוד שפוספורילציה של ERK היא אירוע סיגנלינג מוקדם וחולף; (ii) מוצגים blot-ים מייצגים ללא כימות דנסitומטרי או ניתוח סטטיסטי על פני חזרות ביולוגיות עצמאיות; (iii) p-ERK לא נורמל ל-ERK כולל, ו-ERK כולל לא נורמל בעקביות לבקרת טעינה (loading control) באופן כמותי. כתוצאה מכך, נתונים אלו הם בעיקר איכותיים ומשמשים ליצירת היפותזות. אימות מכניסטי ודאי ידרוש ניסויי הצלה (rescue experiments) (למשל, הפעלה קונסטיטוטיבית של ERK באמצעות MEK מוטנטי או שימוש במפעילים של ERK) כדי לבדוק האם השבת רמות p-ERK מפחיתה את האפקט האנטי-פרוליפרטיבי של השילוב. מגבלה מרכזית היא המחסור באימות מולקולרי מעמיק. לא בחנו את p-VEGFR, p-AKT או סמני אפופטוזיס. נתוני מסלול ה-ERK הם איכותיים ואינם מבססים סיבתיות. נדרשים מחקרים נוספים שתוכננו במיוחד להבהרת המנגנון הבסיסי לפני שניתן יהיה להסיק מסקנו מכניסטיות כלשהן. באופן דומה, השתקה מתווכת siRNA של ERK או מעכבים פרמקולוגיים המכוונים למסננים שמעלה (למשל, מעכבי MEK) עשויים לסייע בקביעה האם האפקט שנצפה הוא אכן תלוי-ERK. ניסויי אימות אלו היו מעבר למסגרת של מחקר ראשוני זה, אך הם מייצגים כיוון קריטי למחקר עתידי. מסלולים מרכזיים אחרים המעורבים בפרוליפרציה והישרדות של גידולים, כגון PI3K/AKT או גורמים תחתונים קשורים, לא נבחנו ועשויים לתרום גם הם לאפקטים שנצפו. הממצאים לגבי ביטוי VEGF במחקר זה הם ראשוניים ומשמשים ליצירת היפותזות. הצביעה האימונוהיסטוכימית המופחתת של VEGF מספקת רמז חשוב למודולציה פוטנציאלית של מסלולים אנגיוגנתיים, אך אינה מהווה הוכחה חלוטה למנגנון אנטי-אנגיוגני. אנו מזהירים את הקוראים במפורש כי VEGF IHC לבדו, במיוחד ללא כימות או סממנים וסקולריים מאשרים, אינו יכול לבסס מנגנון אנטי-אנגיוגני. המחסור בניתוח של סממנים של תאי אנדותל ותפקוד וסקולרי הוא אחת המגבלות העיקריות של מחקר זה. לפיכך, נדרש ניתוח מקיף יותר של מסלולי הסיגנלינג המעורבים, כולל התפקיד הפוטנציאלי של קינזות וגורמים אנגיוגנתיים אחרים, כדי להבין במלואו את אופן הפעולה של הטיפול המשולב.
הפרוצדורות המתוארות כאן עברו אופטימיזציה עבור תאי HepG2 ועכברי NOD/SCID. מידת השחזור עשויה להשתנות בין קווי תאים או זני עכברים שונים. גורמים מרכזיים המשפיעים על השחזור כוללים: (1) מספר המעברים של התאים (השתמשו במעבר נמוך מ-20); (2) זמן הדגרה של MTT (סטנדרטיזציה ל-4 h בדיוק); (3) מספרי סדרות (lots) של הנוגנים (יש לתעד עבור כל ניסוי); ו-(4) הכשרת המפעיל של הקליפר (השתמשו באותו מפעיל מסוכך לכל אורך התהליך). אנו ממליצים למשתמשים לבצע ניסויי בקרת חיוביות (למשל, sorafenib לבדו בריכוז 6 µmol/L) כדי לתקף את מערך הניסוי לפני בדיקת שילובים.
מחקר זה הראה באמצעות Western blotting כי טיפול משולב של sorafenib ו-gemcitabine הפחית משמעותית את הביטוי של p-ERK בתאי HepG2, דבר המצביע על ויסות של מסלול השמירה של ERK; עם זאת, נתונים אלו הם איכותיים ואינם מבססים קשר סיבתי. p-ERK משמש באופן נרחב כסמן תפקודי להפעלה של מסלול ERK, והפחתתו (downregulation) מפורשת בדרך כלל כאינדיקציה לפעילות מופחתת של המסלול(11). למרות שלא זיהינו בהמשך שינויים שעתוקיים של גנים מטרה במורד המסלול (כגון c-Fos, c-Myc) באמצעות RT-PCR, ההפחתה שנצפתה ב-p-ERK מספקת תמיכה מתאמת למעורבות של מסלול ERK, ולא ראיה מכניסטית ישירה. מחקרים עתידיים יוכלו לחשוף עוד את פרטי הוויסות של רשת ה-ERK במורד המסלול באמצעות אנליזה של התראנסקריפטום או qPCR ממוקד, ובכך לשפר את ההבנה של מנגנון הטיפול המשולב. בנוסף, מחקר זה התמקד בהשפעות קצר-הטווח של הטיפול המשולב. מחקרי ארוכי-טווח נחוצים כדי להעריך את עמידות התגובה, פיתוח פוטנציאלי של עמידות ורעילות מאוחרת הקשורה לטיפול. לבסוף, מחקר זה לא בחן את הפוטנציאל של שילוב sorafenib ו-gemcitabine עם אסטרטגיות מתפתחות אחרות, כגון אימונותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים, שעלולים להגביר את השפעות הטיפול. מחקר עתידי צריך לבחון שילובי תרופות מרובים כדי לפתח משטרי טיפול יעילים יותר לסרטן הכבד. לסיכום, בעוד שמחקר זה מרמז על אפקט אדיטיבי מבטיח של sorafenib ו-gemcitabine בסרטן הכבד, יש לפרש ממצאים אלו בהקשר של מגבלות המחקר. נדרש מחקר נוסף כדי לתקף תוצאות אלו ולתרגם תובנות אלו לשיפור בתוצאות הקליניות ולבדיקת תופעות לוואי פוטנציאליות בחולי סרטן הכבד.
לסיכום, מחקר זה מספק ראיות ראשוניות לכך ששילוב של sorafenib ו-gemcitabine מראה פעילות אנטי-פרוליפרטיבית והוא קשור להפחתה בביטוי של VEGF בתאי HepG2 ובמודל קסנוגרפט של עכברי NOD/SCID. עם זאת, נתוני ה-VEGF הם איכותיים ואינם מדגימים באופן ישיר השפעות אנטי-אנגיוגניות; לפיכך, כל טענה לפעילות אנטי-אנגיוגנית נותרת לא מבוססת בשלב זה. למרות שהנתונים מראים קשר בין הפחתה בביטוי של p-ERK לבין ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של השילוב, מנגנונים סיבתיים טרם נקבעו. בהתחשב במגבלות ה-Western blot שצוינו כאן, התפקיד המכניסטי של מסלול ה-ERK בשילוב זה נותר השערתי בשלב זה. השילוב של sorafenib ו-gemcitabine מצדיק מחקר נוסף, כולל ניסויי הצלה (rescue experiments) של המסלול ובדיקה במודלים נוספים של סרטן הכבד, כדי לקבוע האם עיכוב של מסלול ה-ERK הוא אכן מתווך מרכזי של הסינרגיה שנצפתה. יש להעריך את הרלוונטיות הקלינית של sorafenib בתוספת gemcitabine אל מול הסטנדרטים המודרניים במחקרים פרה-קליניים וקליניים עתידיים, במיוחד בהקשר של גידולים העמידים ל-sorafenib או במצבים שבהם sorafenib נותר כאופציה קלינית.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
למחברים אין תודות.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת לדימות ג'לים דיגיטלית | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| מצע DMEM עם תכולת גלוקוז גבוהה | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| נוגדן מונוקלונלי לארנב ל-ERK | סנטה קרוז, ארה"ב | sc-94 | |
| סרום עגל עוברי | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., סין | 11011-8611/11011-8615 | |
| מיקרוסקופ פלוורסצנציה הפוך | Olympus, יפן | IX73 | |
| נוגדן פוליקלונלי משפחת ארנב ל-GAPDH | סנטה קרוז, ארה"ב | sc-25778 | |
| גמציטאבין | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| נוגדן משני עיז שנגד ארנב | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., סין | D111018 | |
| תוכנת ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health), בתיסדה, מרילנד, ארה"ב | גרסה 1.8.0_112 | |
| קורא מיקרופלייטים | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| נוגדן מונוקלונלי משפחת ארנב ל-p-ERK | סנטה קרוז, ארה"ב | 9106 | |
| צנטריפוגה מקוררת | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| בופר ליזיס RIPA | המכון למחקר בטכנולוגיה ביולוגית Biyuntian, סין | P0013B | |
| מיקרוטום סיבובי | Leica, גרמניה | CM3050 | |
| סורפניב (Sorafenib) | חברת Bayer, גרמניה | 284461-73-0 | |
| תיאזוליל כחול (MTT) | Sigma, ארה"ב | M5655 | |
| מדגרה לשלושה גזים | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| נוגדן חד-סגולי (monoclonal) של ארנב ל-VEGF | BioLegend, USA | B199116 |
מקורות
- Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
- Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
- Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
- Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
- Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
- Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
- Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
- Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
- Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
- Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
- Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
- Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
- Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
- Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
- Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
- Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
- Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
- Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
- Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
- Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.