הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

הערכת טיפול משולב של Sorafenib ו-Gemcitabine בתאי HepG2 ובמודל קסנוגרפט של עכברי NOD/SCID: מחקר חלוצי

73 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71790

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שילוב של Sorafenib עם gemcitabine מראה ראיות ראשוניות לעיכוב אדיטיבי של התרבות תאי HepG2, ומראה שינויים קורלטיביים בביטוי של p-ERK ו-VEGF, ומדכא צמיחת גידולי כבד בעכברי NOD/SCID.

תקציר

סרטן הכבד נותר סיבה מובילה לתמותה הקשורה לסרטן בשל עמידות לתרופות ואפשרויות טיפול מוגבלות. קיים צורך דחוף לבחון אסטרטגיות טיפוליות לשיפור התוצאות. מחקר פיילוט זה מציג פרוטוקול להערכת ההשפעות הפוטנציאליות והמנגנונים הבסיסיים של שילוב של sorafenib ו-gemcitabine בסרטן הכבד. נעשה שימוש בשורת תאי סרטן הכבד HepG2, והוקם מודל של השתקת גידול זר (xenograft) בעכברי non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID). מוצגים שלבי פרוצדורה מרכזיים הכוללים: (1) תרבית תאי HepG2 וטיפול תרופתי; (2) הקמת בדיקת MTT, דגירה וקריאת בליעה (absorbance); (3) מיצוי חלבונים, SDS-PAGE, העברה (transfer) ו-immunoblotting עבור ERK ו-p-ERK; (4) הקמת xenograft תת-עורי בעכברי NOD/SCID; (5) מדידת גידול וחישוב נפח; ו-(6) אימונוהיסטוכימיה של VEGF בחתכי גידול. מסופקים שלבים קריטיים, טיפים לפתרון בעיות ומפרטי ציוד. השילוב של sorafenib (במינון 3 µmol/L) ו-gemcitabine (במינון 10 µmol/L) השיג שיעור עיכוב של 71.23% ± 6.76% לאחר 72 h, עם q-value של 1.35, מה שמרמז על  השפעה סינרגית בזוג מינונים ספציפי זה תחת התנאים שנבדקו. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הטיפול המשולב היה קשור להפחתה בביטוי של p-ERK, לנפח גידול מופחת ולצביעה אימונוהיסטוכימית של VEGF נמוכה יותר באופן איכותי. נתונים אלו מראים קשר מתאמי בין הפחתה בביטוי p-ERK לבין ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית שנצפתה, מבלי לבסס סיבתיות. בתאי HepG2 ובמודל xenograft בעכברי NOD/SCID, השילוב של sorafenib ו-gemcitabine מראה ראיות ראשוניות לפוטנציאל אנטי-פרוליפרטיבי והוא קשור להפחתה בביטוי VEGF; עם זאת, ממצא זה אינו מהווה ראיה ישירה לפעילות אנטי-אנגיוגנית, שכן לא בוצעו אנליזות של צפיפות מיקרו-כלי דם או אנליזות וסקולריות פונקציונליות. פרוטוקול שמיש זה מספק מסגרת מועילה להערכת שילובי תרופות במודלים של HCC וניתן להתאימו למשטרי טיפול ממוקד-כימותרפיה אחרים, אם כי נדרשים מחקרים נוספים לתיקוף המנגנונים והמינונים לפני שניתן יהיה להסיק על השלכות קליניות כלשהן.

מבוא

סרטן הכבד הוא אחד מסוגי הסרטן השכיחים והקטלניים ביותר, וכן אחד הגידולים הממאירים בעלי קצב הגדילה המהיר ביותר1,2. למרות ששיעור ההוצאה של סרטן הכבד נמצא בירידה, הנטל הכולל של סרטן הכבד ממשיך לעלות. נתונים אפידמיולוגיים עולמיים משנת 2022 חשפו כי שיעור ההשערה המתוקנן לגיל של סרטן הכבד במסד הנתונים המקוון של Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 היה 15.0 ל-100,000 תושבים, בעוד ששיעור התמותה המתוקנן לגיל של סרטן הכבד היה 26.7 ל-100,000 תושבים, מה שהופך אותו לגורם השני המוביל לתמותה מסרטן3. כיום, בשל המחסור בטיפול יעיל לסרטן הכבד, יחד עם הופעתו השתרעתית (insidious), רוב המטופלים נמות תוך שנה לאחר האבחנה. Sorafenib היא מעכבת קינאז רב-מטרתית הראשונה שאושרה לשימוש קליני, המכוונת לקולטני טירוזין קינאז כגון קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR), קולטן גורם גדילה שמקורו בטבקיות (PDGFR), וקינאזים מסוג סרין/תריונין4,5. Sorafenib, מעכבת מולטי-קינאז המ diberikan דרך הפה, מפעילה השפעות נוגדות פרוליפרציה ונוגדות אנגיוגנזה בסרטן הכבד על ידי התמקדות במסלולי גורמי גדילה מרובים. מבחינה היסטורית, sorafenib הייתה הטיפול המערכתי הראשון בקו ראשון שאושר על ידי ה-FDA עבור מטופלים עם סרטן כבד מתקדם או בלתי ניתן לכריתה6. עם זאת, נוף הטיפול הנוכחי בקו ראשון עבור קרצינומה של תאי הכבד (HCC) מתקדמת התרחב משמעותית. האפשרויות המומלצות כוללות כיום, בין היתר, את השילוב של מעכבי נקודת בקרה חיסונית atezolizumab בתוספת bevacizumab, lenvatinib, ואת השילוב של אימונותרפיה כפולה durvalumab בתוספת tremelimumab. למרות התקדמויות אלה, sorafenib נותרת אפשרות חשובה בקו ראשון, במיוחד באזורים שבהם שילובי אימונותרפיה אינם זמינים בקלות או שהם מנוגדים. בהתחשב בשימושה הנרחב בסרטן הכבד, תופעות לוואי הקשורות לתרופה עוררו דאגה7. בניתוח מסד הנתונים של מערכת הדיווח על תופעות לוואי של ה-FDA (FAERS) משנת 2006 עד 2023, תופעות הלוואי של sorafenib נגעו בעיקר למערכת העיכול, לעור ולרקמות תת-עוריות, וכן לאי-נוחות פיזית לא ספציפית כגון זיהומים ופציעות7. בעוד שחלק מהמטופלים עם סרטן כבד מתקדם עשויים להפיק תועלת מטיפול ב-sorafenib, רוב המטופלים מפתחים בסופו של דבר עמידות או כישלון טיפולי, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה8,9,10. למרות השימוש בה, sorafenib מועילה לכש-30% בלבד מהמטופלים עם HCC; יתרה מכך, המגיבים מפתחים לעיתים קרובות עמידות בתוך 6 חודשים11. המסלולים המולקולריים המעורבים בעמידות ל-sorafenib כוללים את קינאז מווסת סיגנל חוץ-תאי (ERK)/ERK מאופשר (p-ERK), פרוטאין קינאז B (Akt), פוספו-אינוזיטיד 3-קינאז (PI3K)/AKT/מטרה של רפמיצין ביונקים (mTOR), גורם השראה להיפוקסיה 1α (HIF-1α)/HIF-2α, ומסלולים הקשורים לאוטופגיה, כאשר ERK/p-ERK הודגש ונבחר באופן ספציפי במחקר זה11. Gemcitabine הוא אנלוג של ציטידין שנכנס לגוף כדי לייצר דיפלואורוציטידין דיפוספט ודיפלואורוציטידין טריפוספט, להם השפעות עיכוב שונות על סינתזת DNA12. בגידולי מערכת הכבד והמרה, gemcitabine נבחן כמרכיב בכימותרפיה משולבת. עם זאת, דווח קלינית כי gemcitabine מפגין עמידות תרופתית גבוהה יותר, מה שמגביל את יעילותו של gemcitabine12,13. לפיכך, קביעת משטר התרופות האופטימלי באופן יעיל ואפקטיבי היא מאתגרת ביותר. מחקרים אחרונים הראו כי שילוב של gemcitabine עם sorafenib עשוי להוביל ליעילות טיפולית מוגברת בהתבסס על חיזוי של סמן ביולוגי חדש לstemness של גידול14. עם זאת, למיטב ידיעתנו, שום מחקר לא בחן שילוב זה באופן ספציפי בסרטן הכבד תוך שימוש בתאי HepG2 ובמודל קסנוגרפט של קרצינומה של תאי הכבד בעכברים עם תסמונת סוכרת לא-השמנה/חסר חיסוני משולב חמור (NOD/SCID). לכן, עדיין חסרות ראיות ניסיוניות המעידות ישירות על ההשפעות המצטברות של sorafenib ו-gemcitabine בסרטן הכבד.

הפרוצדורות המתוארות בכתב יד זה נמצאות בשימוש נרחב, אך לעיתים רחוקות מוצגות בפורמט ויזואלי, מפורט ומדורג, המתאים לשחזור על ידי חוקרים בתחילת דרכם. השערנו כי השילוב של sorafenib ו-gemcitabine יעכב באופן אדיטיבי את השגשוג של תאי סרטן הכבד ואת צמיחת הגידול, וכי השפעה זו תהיה קשורה להסדרה של מטה (downregulation) של מסלול ה-ERK/p-ERK ולהפחתה של אנגיוגנזה המתווכת על ידי גורם גדילה של תאי אנדותל וסקולריים (VEGF). מחקר זה נועד לבחון באופן ראשוני את ההשפעה העיכובית של sorafenib בשילוב עם gemcitabine על השגשוג של קו תאי סרטן הכבד HepG2 in vitro ו- in vivo ואת המנגנון העומד מאחוריה (Supplementary Figure 1). החידוש במחקר זה בא לידי ביטוי בשלושה היבטים: (1) זהו המחקר הראשון שבודק את השילוב של sorafenib-gemcitabine באופן ספציפי בסרטן הכבד באמצעות קו התאים הנפוץ HepG2 ומודל עכברים NOD/SCID תואם; (2) הוא חוקר את מסלול ה-ERK/p-ERK, שטרם נחקר מספיק, כמנגנון פוטנציאלי; ו-(3) הוא מספק ראיות ניסיוניות ישירות — ולא תחזיות חישוביות — להשפעה האדיטיבית של שילוב זה בסרטן הכבד. מאפיינים אלו מבדילים עבודה זו מדיווחים קודמים על טיפול משולב שבוצעו בסוגי גידולים אחרים או באמצעות מודלים ניסיוניים שונים, במיוחד בהקשר של משטרי טיפול מבוססי sorafenib.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אישור אתי ניתן על ידי ועדת רפואה אתית ורווחת בעלי מעבדה של אוניברסיטת Zhejiang (מספר אישור ZJU20250049).

בעלי חיים וחלוקה לקבוצות

סך הכל 40 עכברות NOD/SCID, בגיל 4–5 שבועות ובמשקל 18–20 g, נרכשו מספק מסחרי מורשה (רישוי מספר SCXK (Shanghai) 2013-0006) ושוכנו בחדרי בעלי חיים ברמה של נטולי פתוגנים ספציפיים (SPF). כל פרוטוקולי בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות הסטנדרטיות. במהלך הניסוי, בעלי החיים קיבלו גישה חופשית למזון ולשתייה, שוכנו בקבוצות (5 עכברים לכל כלוב) בחדר SPF מבוקר היטב, כאשר טמפרטורת החדר נשמרה על 22 ± 2 °C, לחות של 50%–60%, ומחזור אור/חושך של 12/12 h. בעלי החיים קיבלו מזון ומים ad libitum, ומשקל גופם נוטר every 2 weeks. כאשר העכברים הראו כאב מתמשך, קכקסיה, כישורי גידול, כאשר גודל הגידול הגיע לממד מקסימלי של 2 cm, או בעיות בריאות בלתי הפיכות אחרות, בוצע המתה על ידי הזרקה תוך-פריטונית של 0.45% pentobarbital sodium במינון של ≥150 mg/kg למשקל גוף, ולאחר מכן אישור של הפסקת נשימה ודופק, אובדן רפלקס קרנית, או יישום של שיטה פיזית משנית במידת הצורך, בהתאם לקריטריונים לסיום הומני שאושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים. גודל המדגם (n = 10 לקבוצה) נקבע על בסיס ניתוח עוצמה (power analysis) בהנחה של גודל אפקט של 1.2 (נגזר מניסויי פיילוט), α = 0.05, ו-β = 0.20 (עוצמה של 80%), בתוספת מרווח של 20% לנשירה. הליכי השתלת הגידול בוצעו לפני הקצאת הטיפול (ראה להלן להקמת xenograft).

העכברים חולקו באופן אקראי ל-4 קבוצות באמצעות שיטת טבלת המספרים האקראיים לאחר השתלת הגידול ואישור תפיסת הגידול: קבוצת ביקורת, קבוצת sorafenib, קבוצת gemcitabine, וקבוצת שילוב של sorafenib עם gemcitabine, כאשר בכל קבוצה היו 10 עכברים (5 עכברים/כלוב), כדי להקים את מודל גידול השתלה בעכברי NOD/SCID. מכיוון שרקמות גידול במהלך תהליך המודלינג עלולות לגרום למצב כללי גרוע או אף למוות בעכברי NOD/SCID, ובהתחשב בכך שניתוח סטטיסטי דורש בדרך כלל גודל מדגם יעיל, נכללו לפחות 10 עכברים בכל קבוצה. החלוקה האקראית בוצעה על ידי טכנאים עצמאיים והכלובים סומנו; לא הוטבע סמיות (blinding) במהלך מתן התרופות או מדידת הגידולים, דבר המהווה מגבלה משמעותית. שאר דגימות הרקמה, ההערכות הביוכימיות והפתולוגיות בוצעו כולן על ידי צוות מעבדה מסומים. הנתונים נותחו אף הם בסמיות על ידי סטטיסטיקאים שהייתה להם גישה לקבצים מקודדים בלבד עד להשלמת הסטטיסטיקה וחשיפת הנתונים. כל בעלי החיים נכללו בניתוח הסופי. נבחרה דרך מתן תוך-פעטונית (intraperitoneal) עבור שתי התרופות כדי להבטיח ספיגה סיסטמית וזמינות ביולוגית עקבית; מינון פעם ביום התבסס על מחקרי פרמקוקינטיקה קודמים שהראו ריכוזים קבועים בפלזמה במשטר זה. לקבוצת ביקורת הנשאי (vehicle control) הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של תמיסת סליין סטרילית. בקבוצת ה-sorafenib, הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של sorafenib במינון 40 mg/kg. בקבוצת ה-gemcitabine, הוזרקו תוך-פעטונית 0.2 mL של gemcitabine במינון 100 mg/kg. קבוצת הטיפול המשולב: הומנו תוך-פעטונית 0.2 mL מכל אחת מהתרופות, sorafenib במינון 40 mg/kg ו-gemcitabine במינון 100 mg/kg. כל קבוצה קיבלה טיפול פעם ביום במשך 20 ימים רצופים. כל בעלי החיים נכללו בניתוח הסופי, ולא הוצאו עכברים מהמחקר. לא נצפתה תמותה באף אחת מהקבוצות במהלך תקופת הטיפול בת 20 הימים. לוח הזמנים והמינונים נבחרו על בסיס מחקרים שפורסמו במודלים של סרטן דרכי המרה וכבד. יש לציין כי מתן יומי תוך-פעטוני של gemcitabine עלול לגרום לרעילות. אורך ורוחב הגידולים המשתלים נמדדו מדי יום, ונפח הגידולים המשתלים חושב. לאחר 20 ימים, בעלי החיים הורדמו תחת הרדמה עמוקה והומתו באמצעות שבירת צוואר (cervical dislocation), ורקמות הגידול המשתלות קובעו בפורמלין. משקל הגוף נמדד מדי יומיים לאורך כל המחקר. העכברים נוטרו מדי יום לסימנים קליניים של רעילות, כולל זקיפת שיער (piloerection), תנוחת גב כפוף, ירידה בניידות, שלשול ולתשישות. עם זאת, לא בוצעו בדיקות ביוכימיה של הסרום (למשל, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase ו-creatinine) ובדיקה היסטופתולוגית של איברים מרכזיים. לכן, לא ניתן לשלול רעילות תת-קלינית.

תרופות וריאגנטים

Sorafenib הומס ב-10% dimethyl sulfoxide (DMSO) ואוחסן ב-20 °C-. לפני השימוש, התמיס הופשר ודולל לריכוז סופי של DMSO הנמוך מ-0.5%, דבר שלא השפיע על צמיחת התאים. Gemcitabine הושג ממקור מסחרי. תמיסת ליזיס מסוג Radioimmunoprecipitation assay (RIPA), thiazolyl blue, נוגדנים ראשוניים נגד glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK, ו-VEGF, נוגדנים משניים, מצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עשיר בגלוקוז, סרום בקר עוברי (fetal bovine serum) ושורת התאים HepG2 הושגו ממקורות מסחריים.

סורפניב (Sorafenib) וגמציטבין (gemcitabine) הם סוכנים ציטוטוקסיים. יש לבצע את כל הלימודי ההכנה והטיפול בתרופות בתוך קב不可-בטיחות ביולוגית ייעודית תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן). DMSO, מתנול, קסילן וממסים אורגניים אחרים המשמשים בפרוטוקול זה הם חומרים מסוכנים ויש לטפל בהם תחת מנדף כימי כדי למנוע שאיפה או מגע עם העור. יש לעיין בגיליונות בטיחות החומרים (MSDS) עבור כל הרכיבים לפני השימוש.

תרבית תאים

קו התאים HepG2 הוחיה והוחדר לבקבוקי תרבית תאים, המכילים 10 mL של מצע DMEM עשיר גלוקוז (בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניסילין-סטרפטומייסן, ו-4 mmol/L גלוטמין). התאיםK הודגרו ב-37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO₂. מצע התרבית הוחלף מדי יומיים, והתאים הועברו למצע חדש (passaged) מדי 4 ימים כדי לשמור על צמיחה לוגריתמית. קו התאים HepG2 התקבל ממקור מסחרי; עם זאת, במחקר זה לא בוצעו אימות עצמאי של קו התאים (למשל, פרופיל short tandem repeat) ובדיקה למיקופלסמה.

שיטת MTT לקביעת שיעור עיכוב השגשוג

שיטת ה-3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) שימשה לקביעת שיעור עיכוב השגחה של sorafenib ו-gemcitabine על קו התאים HepG2. תאים בשלב צמיחה לוגריתמי עוברו בעיכול באמצעות trypsin בריכוז 0.25% למשך 2 דקות, ואת העיכול הפסיקו על ידי הוספה של נפח שווה של מצע גידול מלא. לאחר צנטריפוגה במהירות של 1000 × ג'' במשך 10 דקות, התאים הושעו שוב במדיום מלא. צפיפות התאים כווננה ל-1 × 105 תאים/מ"ל, ו- 200 µL מת сусפנסיות התאים נזרע לכל באער של פלטת 96 באערים. צפיפות זריעה זו נבחרה על בסיס ניסויי אופטימיזציה מקדימים, שבהם נבדקו צפיפויות תאים בטווח שבין 5 × 103 עד 5 × 104 נבדקו 2 תאים לבאר. הצפיפות של × 104 מספר התאים לבאר הוביל לעלייה ליניארית בבליעה (absorbance) לאורך 96 שעות, ושמר על רמת התמזגות (confluence) של פחות מ-80% בנקודת הסיום, כפי שאושש בבדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ הפוך. כדי להבטיח שמדידות ה-MTT יישארו בטווח הליניארי, בוצעו ניסויי פיילוט בכל נקודת זמן עם בארי ביקורת שטופלו בחומר הנשאי (vehicle). המצע הוחלף מדי 48 שעות כדי למנוע דלדול של חומרי תזונה והצטברות של תוצרי לוואי מטבוליים. רמת ההתמזגות נוטרה מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לאחר 96 שעות, בארי הביקורת הגיעו לכ-75%–80% התמזגות, ולא נצפו סימנים גלויים לדלדול חומרי תזונה. לאחר היצמדות התאים, המצע הוסר והתווסף מצע המכיל את התרופה. לקבוצת הביקורת שלא טופלה התווסף מצע ללא תרופה (ביקורת נשא עבור in vivo ניסויים). הניסוי חולק לקבוצת ביקורת ללא טיפול, קבוצת sorafenib, קבוצת gemcitabine וקבוצת טיפול משולב. המנות של sorafenib היו 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Lו- 6 µmol/L, והמינונים של gemcitabine היו 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Lו- 20 µmol/Lהמינונים של סוראפניב (sorafenib) בשילוב עם גמציטבין (gemcitabine) היו 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Lו- 6 µmol/L + 20 µmol/Lהתאים בכל קבוצה תורגלו במשך 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-96 שעות. לאחר התרגול, 20 µL הוסיפו לכל באר 5 מ"ג/מ"ל של MTT, והתאים הוכנסו לאינקובטור תאים למשך 4 שעות. את הנוזל העילאי שפכו בזהירות, ולאחר מכן 150 µL של DMSO הוספה לכל בארה, והלוחית נוערה במשך 10 דקות כדי להמיס לחלוטין את הפורמזאן, וערך הצפיפות האופטית (OD) של כל בארה נמדד באורך גל של 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלייט רב-תכליתי. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים, ובכל קבוצה היו חמש בארות חזרתיות. הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD) של שלושה חזרות ביולוגיות. שיעור עיכוב צמיחת התאים (%) = (1 - OD קבוצת הניסוי /OD קבוצה ללא טיפול）× 100%. האינטראקציה בין שתי התרופות נבחנה על ידי ה- קערך-p, שחושב באמצעות הנוסחה: שאלון = EAB / (EA + EB - EA × EB). כאן, EA ו-EB הם שיעורי העכבה של תרופות A ו-B כאשר נעשה בהן שימוש לבד, ו-EAB הוא שיעור העכבה כאשר שתי התרופות נעשה בהן שימוש יחד. כאשר נא לספק את הטקסט למסירה. גדול מ-1.15, הוא מעיד על אפקט סינרגי בין שתי התרופות; 0.85–1.15 מעידים על אפקט אדיטיבי; ו- נא לספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. ערך הנמוך מ-0.85 מעיד על אפקט אנטגוניסטי. ה- שאלוןשיטת ערך ה- (value-) היא כלי סריקה פשוט ואינה מהווה תחליף לניתוחים קפדניים יותר של סינרגיה. נבדקו רק מספר מצומצם של זוגות מינונים ביחס קבוע, דבר המגביל את חוסנו של הטענה לסינרגיה. לפיכך, המונח "סינרגיה" במחקר זה הכוונה ל- שאלה > 1.15 בזוגות מינונים ובנקודות זמן ספציפיות, ולא לאינטראקציה אדיטיבית (מכמילית) מהודקת לאורך כל מטריצת התגובה למינון.

ניתוח Western blot של ביטוי חלבוני ERK ו-p-ERK

תרבית תאים והקמה של קבוצות ניסויי בוצעו כפי שתואר לעיל. לצורך זיהוי של ERK ו-p-ERK באמצעות Western Blotting, המנה של sorafenib הייתה 3 µmol/L; המנה של gemcitabine הייתה 10 µmol/L; והמנה המשולבת הייתה 3 µmol/L + 10 µmol/L. לאחר 72 h של טיפול, התאים לויסו באמצעות RIPA lysis buffer, וחלבון כולל הופק מכל קבוצה ניסויית. ריכוז החלבון נקבע בשיטת bicinchoninic acid (BCA). כמויות שוות של חלבון (30 µg לכל נתיב) הועמסו והופרדו באמצעות 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) במתח של 120 V למשך 90 min. חלבונים הועברו לממברנות polyvinylidene difluoride (PVDF) (גודל נקבים 0.45 µm) בזרם של 300 mA למשך 90 min בטמפרטורה של 4 °C. לאחר חסימה עם 5% non-fat milk ב-Tris-buffered saline עם 0.1% Tween-20 (TBST) למשך 1 h בטמפרטורת החדר, הממברנות דגרו עם נוגדי גוף ראשוניים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור עדין. לאחר שלושה שטיפות עם TBST (10 min כל אחת), הממברנות דגרו עם נוגדי גוף משניים למשך 1 h בטמפרטורת החדר. פסי חלבון הודגמו באמצעות תסבך enhanced chemiluminescence (ECL) وصולמו באמצעות מערכת דיגיטלית להדמיית ג'לים. זמני החשיפה עברו אופטימיזציה עבור כל נוגד גוף כדי למנוע רוויה. כימות דנסיטומטרי בוצע באמצעות תוכנת ImageJ בעזרת כלי ניתוח הג'לים. עוצמות פסי כל חלבוני המטרה נורמלו ל-GAPDH כבקרת העמסה, וביטוי של p-ERK נורמל בהמשך לביטוי של ERK כולל. לא בוצעו שלבי חסימה נוספים מעבר ל-5% non-fat milk. תוצאות הכימות הוצגו כשינוי במכפלה (fold change) ביחס לקבוצת הביקורת, שנקבעה ל-1.0. כל ניסוי חזר שלוש פעמים באופן בלתי תלוי. אימונובלוטים מייצגים מוצגים להלן.

זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי VEGF בגידולי קסנוגרפט של HepG2 בעכברי NOD/SCID

להקמת השתלה זרה (xenograft): תאי HepG2 בשלב צמיחה לוגריתמי נאספו על ידי טריפסינציה, נשטפו פעמיים במי מלח עם פוספט (PBS) סטרילי, והושהו מחדש ב-DMEM ללא סרום. סך של 2 × 106 תאים ב-0.2 mL של DMEM ללא סרום (ללא Matrigel) הוחדרו תת-עורי לאזור הבת בבית השמאלי (אזור עם אספקה דמית עשירה) של כל עכבר NOD/SCID באמצעות מזרק של 1 mL, כדי להקים מודל השתלה זרה תת-עורית של HepG2 בעכברי NOD/SCID. קליטת הגידול נוטרה מדי יומיים. גודל הגידול נמדד מדי יומיים, וכשקוטר הגידול הגיע ל-0.3–0.5 cm (בסביבות 7–10 ימים לאחר ההזרקה, נקודת זמן זו הוגדרה כנקודת תחילת הטיפול), חולקו העכברים באופן אקראי ל-4 קבוצות לצורך הניסוי. האורך (L) והרוחב (W) של השתלה הזרה תת-העורית נמדדו מדי יום באמצעות קליפרים דיגיטליים, ונפח הגידול (V) חושב לפי הנוסחה: V = (L × W2) / 2. כל המדידות בוצעו על ידי חוקר שלא היה מודע להקצאת הקבוצות. לאחר 20 ימים, בעלי החיים הורדמו עמוק והורגו על ידי פריקה צווארית, ורקמת השתלה הזרה קובעה בפורמלין נייטרלי מbuffered בריכוז 10% למשך 24 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוטמעה בפראפין. חתוכים של רקמה (בעובי 5 µm) נחתכו באמצעות מיקרוטום סיבובי והורכבו על שקופיות זכוכית מצופות poly-L-lysine. עבור אימונוהיסטוכימיה, החתכים עברו דפראפיניזציה בקסילן (שלושה החלפות, 5 min בכל פעם) והורטבו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 70%, 50%; 3 min בכל פעם). שחזור אנטיגן בוצע על ידי חימום החתכים בבופר נתרן ציטראט 10 mM במיקרוגל למשך 15 min, ולאחריו קירור בטמפרטורת החדר למשך 20 min. פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה עם מי חמצן 3% במתנול למשך 10 min בטמפרטורת החדר. קשירה לא ספציפית נחסמה עם סרום עיזים נורמלי 5% ב-PBS למשך 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החתכים הוכשקו עם נוגדן ראשוני anti-VEGF (בדילול 1 : 200) למשך לילה ב-4 °C בתא לח. לאחר שטיפה ב-PBS (שלוש פעמים, 5 min בכל פעם), החתכים הוכשקו עם נוגדן משני של עיזים נגד ארנב המשוייך ל-horseradish peroxidase (HRP) (בדילול 1 : 500) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. האות זוהה באמצעות סובסטרט 3,3′-diaminobenzidine (DAB). החתכים נצבעו בצביעה נגדית של המטוקסילין למשך 30 s, עברו דהידרטציה, הבהרה והורכבו עם כיסויים באמצעות מדיום קיבוע קבוע. הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך בהגדרות שדה בהיר בהגדלה של ×100. תמונות מייצגות מוצגות לצורך הדגמה איכותית.

כל הטיפים, המבחנות ופסולת תרביות התאים המזוהמים נאספו כפסולת ביולוגית מסוכנת ועברו עיקור באוטוקלב לפני השליכה. פסולת כימית, כולל תמיסות המכילות תרופות, DMSO, קסילן ומתנול, נאספה במכלי פסולת נפרדים ומסומנים והושלכה בהתאם לתקנות המוסדיות המקומיות עבור פסולת כימית מסוכנת.

ניתוח סטטיסטי

לניתוח סטטיסטי נעשה שימוש בתוכנת SPSS 19.0. נתונים ניסויים הוצגו כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות עבור ניסויי in vitro, וכממוצע ± סטיית תקן (SD) מ-n = 10 עכברים לקבוצה עבור ניסויי in vivo. להשוואות בין שתי קבוצות נעשה שימוש במבחני t לא מזווגים דו-זנביים. להשוואות בין מספר קבוצות נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו במבחן post hoc של Tukey. דווחו ערכי p < 0.05, p < 0.01, ו-p < 0.001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההשפעה המעכבת של sorafenib ו-gemcitabine על שגשוג תאי HepG2

סורפניב (Sorafenib) וגמציטאבין (gemcitabine) עיכבו את התרבות תאי HepG2 באופן תלוי מינון, כפי שמוצג ב-Table 1. הטיפול המשולב הראה שיעורי עיכוב גבוהים באופן מובהק בכל נקודות הזמן בהשוואה לטיפול בודד. בדיקת MTT מודדת פעילות מטבולית, אשר נמצאת במתאם עם מספר התאים אך אינה מודדת באופן ישיר התרבות או ציטוטוКСיות. לכן, יש לפרש את המונח "עיכוב התרבות" כהפחתה בהמרת MTT. ראוי לציין כי השילוב של סורפניב בריכוז 3 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לסרטן הכבד יש שיעור תמותה גבוה בשל הופעתו החמקמקה, התקדמותו המהירה והמעטות של הטיפולים היעילים3,15. סרטן כבד בשלב מתקדם מראה לעיתים קרובות עמידות לכימותרפיה ולקרינה, והאפשרויות הנוכחיות, כולל כריתה כירורגית והשתלת כבד, נותרות בלתי מספקות15,16. שילוב של שתי תרופות כימותרפיות או יותר בעלות מנגנוני פעולה שונים פותח היטב ונאמן כי הוא מגביר מאוד את היעילות, מה שעשוי להוות אסטרטגיה חלופית לטיפול במחלה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

למחברים אין תודות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת לדימות ג'לים דיגיטליתBio-Rad Laboratories, Inc., USA1708280
מצע DMEM עם תכולת גלוקוז גבוההHyClone, USASH30243.01
נוגדן מונוקלונלי לארנב ל-ERKסנטה קרוז, ארה"בsc-94
סרום עגל עובריZhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., סין11011-8611/11011-8615
מיקרוסקופ פלוורסצנציה הפוךOlympus, יפןIX73
נוגדן פוליקלונלי משפחת ארנב ל-GAPDHסנטה קרוז, ארה"בsc-25778
גמציטאביןEli Lilly and Company95058-81-4
נוגדן משני עיז שנגד ארנבShanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., סיןD111018
תוכנת ImageJ המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health), בתיסדה, מרילנד, ארה"ב גרסה 1.8.0_112
קורא מיקרופלייטיםThermo Fisher Scientific Inc., USAMK3
נוגדן מונוקלונלי משפחת ארנב ל-p-ERKסנטה קרוז, ארה"ב9106
צנטריפוגה מקוררתChangsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
בופר ליזיס RIPAהמכון למחקר בטכנולוגיה ביולוגית Biyuntian, סיןP0013B
מיקרוטום סיבוביLeica, גרמניהCM3050
סורפניב (Sorafenib)חברת Bayer, גרמניה284461-73-0
תיאזוליל כחול (MTT)Sigma, ארה"בM5655
מדגרה לשלושה גזיםThermo Fisher Scientific Inc., USA51026402
נוגדן חד-סגולי (monoclonal) של ארנב ל-VEGFBioLegend, USAB199116

מקורות

  1. Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
  2. Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
  3. Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
  4. Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
  5. Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
  6. Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
  7. Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
  8. Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
  9. Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
  10. Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
  11. Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
  12. Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
  13. Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
  14. Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
  15. Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
  16. Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
  17. Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
  18. Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
  19. Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
  20. Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סרטן הכבדסורפניב גמציטאביןעכברי NOD SCIDבדיקת MTTמיצוי חלבוניםSDS PAGEביטוי ERKאימונוהיסטוכימיה של VEGF
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.