הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת נוירונים GABAergic מתאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים על ידי אדם באמצעות ביטוי ASCL1/DLX2 המושרה על ידי דוקסיציקלין ב-AAVS1

86 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71804

⸱

31 ביולי 2026

 , 
1Centre de recherche Azrieli du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neurosciences, Universite de Montreal

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת נוירונים GABAergic מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי שילוב טרנסגנים המושרים על ידי דוקסיציקלין ללוקוס הנמל הבטוח AAVS1. הביטוי היציב וההומוגני של הגנים המועברים מספק גישה יעילה להבדלה ישירה לנוירונים GABAergic תוך הגבלת השתקת הגנים המועברים, בעיה נפוצה בגישות לנטי-ויראליות.

תקציר

תאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים על ידי אדם (hiPSCs) מציעים הזדמנות חסרת תקדים למודל מחלות נוירולוגיות אנושיות במבחנה. יצירה אמינה של אוכלוסיות נוירונים מוגדרות, כגון נוירונים של חומצה גמא-אמינובוטירית (GABAergic), חיונית למחקרים אלו. פרוטוקול זה מפרט שיטה חזקה להבדלת hiPSCs לנוירונים GABAergic באמצעות מערכת הניתנת להשרה דוקסיציקלין. הגישה מתבססת על אינטגרציה יציבה של גנים טרנסג'נדרים המקודדים את גורמי השעתוק ASCL1 ו-DLX2 לאתר האינטגרציה של וירוס אדנו-קשור 1 (AAVS1.) באמצעות נק-אין-בתיווך CRISPR/Cas9. אינטגרציה ממוקדת זו מונעת את השתקת הגנים הטרנסג'ניים שנצפתה לעיתים קרובות באינטגרציה אקראית של לנטיוויראל. הפרוטוקול כולל תחזוקת hiPSCs, תהליך הנוקלאופקציה לאינטגרציה של טרנסגנים, בחירת פורומיצין להעשיר תאים מהונדסים בהצלחה, והליך התמיינות שלב אחר שלב. עם השראת דוקסיציקלין, ה-hiPSC המהונדסים יוצאים במהירות ממחזור התא, רוכשים מורפולוגיה נוירונית ומבטאים סמנים של שושלת GABAergic בתוך 21 ימים. השלבים המרכזיים כוללים אינדוקציה נוירו-בוגרת ובשורה לאחר מכן באמצעות גורמי גדילה ספציפיים, וכן גישות פוטנציאליות לשיפור ההידבקות התאית במהלך הבגרות. שיטה סטנדרטית זו מניבה אוכלוסיות מועשירות של נוירונים מושרים המבטאים סמני שושלת GABAergic, ומספקת כלי חשוב למחקר מדעי המוח ולמידול תאי.

מבוא

תאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים על ידי אדם (hiPSCs) מספקים פלטפורמה ייחודית למידול מחלות נוירולוגיות אנושיות במבחנה. ולחקור את המנגנונים המולקולריים המורכבים שמניעים התפתחות וניוון1. טכנולוגיה זו מאפשרת יצירת מודלים תאיים ספציפיים למטופל לחקור מגוון רחב של מצבים, החל מאנומליות נוירו-התפתחותיות מוקדמות בציליופתיות סינדרומיות2 ועד לשינויים אפיגנומיים עדינים שנצפו במחלת אלצהיימר ספורדית3. כתוצאה מכך, ההבדלה המכוונת של hiPSCs הפכה לאבן יסוד בנוירולוגיה המולקולרית המודרנית.

כדי ללכוד ביעילות את הדקויות של תהליכים נוירולוגיים אנושיים, יצירת תת-סוגים נוירונליים ספציפיים וטהורים היא חיונית. לדוגמה, אוכלוסיות נוירונים מוגדרות נדרשות כדי להבהיר את התפקידים הספציפיים של חלבונים כמו MECP2 בנוירונים אנושיים, או להעריך את הפגיעות הממוקדת של נוירונים חושיים היקפיים לזיהומים ויראליים, כגון SARS-CoV-25. יתרה מזאת, בניית מיקרוסביבות מורכבות ורלוונטיות פיזיולוגית, כמו שילוב מיקרוגליה פונקציונלית באורגנואידים מוחיים תלת-ממדיים, נשענת באופן יסודי על יצירה חזקהוצפויה של שושלות עצביות וגליאליות מובחנות. מבין תת-הסוגים הללו, נוירוני GABAergic מעניינים במיוחד בשל תפקידם המעכב המרכזי במערכת העצבים המרכזית והשלכותם בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריותשונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פרוטוקול אמין, יעיל וניתן לשחזור להבדלה מכוונת של hiPSCs לנוירונים מושרים המבטאים סימני שושלת GABAergic. פרוטוקולי התמיינות מכוונים מסורתיים לנוירונים GABAergic, התלויים במולקולות איתות חיצוניות, יכולים להיות גוזלי זמן, משתנים מאוד, ולגרום לאוכלוסיות תאים הטרוגניות8.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, תכנות קדימה מתווך-פקטורי שעתוק צץ כחלופה חזקה9. פרוטוקול זה משתמש במערכת ביטוי המושרה על ידי דוקסיציקלין כדי להניע את הביטוי של גורמי השעתוק הפרנוירליים ASCL1 ו-DLX210. על ידי מיקוד הטרנסגנים הללו באתר האינטגרציה של וירוס אדנו-קשור 1 (AAVS1.) באמצעות CRISPR/Cas9, שיטה זו עוקפת את הבעיה הנפוצה של השתקת הגנים הטרנסג'ניים הקשורה לאינטגרציה אקראית של לנטיווירוס10. מבנה התורם כולל מדווח פלואורסצנטי, כמו mCherry, למעקב אחר תאים חיוביים לגן טרנסגני לאחר הבחירה. אסטרטגיה זו נועדה לתמוך בביטוי הומוגני יותר של גנים טרנסג'ניים מאשר גישות אינטגרציה אקראית, אם כי יש לאמת יציבות ביטוי ושחזור התמיינות עבור כל קו מהונדס. שיטה סטנדרטית זו מייצרת אוכלוסיות מועשירות של נוירונים מושרים המבטאים סמני שושלת GABAergic תוך כ-21 ימים, פרק זמן קצר יותר מזה של מולקולות קטנות מסורתיות שמתקרבל-8.10. פרוטוקול זה מתאים מאוד לחוקרים הזקוקים לאוכלוסיות נוירונים עקביות וניתנות להרחבה ליישומים במורד הזרם כגון מיקרוסקופיה עתירה, טרנסקריפטומיקה חד-תאית או בדיקות פיזיולוגיות פונקציונליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אזהרה: תרביות hiPSC אנושיות צריכות להיות מטופלות כחומר ביו-מסוכן פוטנציאלית במסגרת נהלי בטיחות ביולוגית מוסדית. בצע את כל הליכי תרבית ה-hiPSC האנושית בארון בטיחות ביולוגי מוסמך מסוג II באמצעות טכניקת סטרילית. כל פסולת המכילה תאים אנושיים, מדיה החשופה לתאים אנושיים וחומר פלסמיד CRISPR/Cas9 צריכה להיות מזוהמת בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המקומיות לפני ההטלה. יש לטפל בדוקסיציקלין, פורומיצין, DMSO וחומרים כימיים נוספים עם כפפות והגנה מתאימה על העיניים והעור, ויש להשליך פסולת לפי נהלי הפסולת הכימית המוסדיים. יש לטפל בתמצית ממברנת הבסיס (BME) בטכניקת סטרילית ולאחסן אותה על קרח לפני השימוש כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת. אגירת חנקן נוזלי וטיפול בקרוביאלי יש לבצע עם כפפות קריוגניות מתאימות, הגנה על הפנים וזהירות כדי למנוע כוויות קרות או פיצוץ בקבוקון במהלך הפשרה.

הערה: לפני עריכה מתווכת CRISPR/Cas9 והבחנה נוירונלית, תרביות hiPSC צריכות לעמוד בקריטריונים מוגדרים מראש לבקרת איכות. תאים חייבים להיות שליליים למיקופלסמה, להציג קריוטיפ תקין או פרופיל שלמות גנומי מקובל, ולשמור על ביטוי חזק של סמנים פלוריפוטנטיים, כולל OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 ו/או SSEA4. התרביות צריכות להציג מורפולוגיה טיפוסית של מושבות hiPSC קומפקטיות, עם יחס גרעיני לציטופלזמה גבוה, גבולות מושבה מוגדרים והבחנה ספונטנית מינימלית. יש להשתמש רק בתרביות המתרבות באופן פעיל בטווח המעבר המומלץ, והתאים לא צריכים לעלות על מספר המעבר המרבי שהוגדר במעבדה, בדרך כלל מתחת למעבר 40, אלא אם אומת אחרת. תרביות המראות מורפולוגיה חריגה, התמיינות ספונטנית מוגזמת, גדילה לקויה, זיהום מאומת או עדויות לאי-יציבות גנומית צריכות להיפסל מניסויי עריכה והבדלה. כל החומרים הנדרשים לפרוטוקול זה, כולל מתכוני מדיה, מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מגיבים ולוחות תרבית

  1. הכינו את מדיום ההקפאה על ידי שילוב של 40 מ"ל תחליפי סרום (KOSR) ו-10 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בצינור קונוסי של 50 מ"ל.
  2. הומוגניזציה של מדיום ההקפאה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
  3. דיללו את תמצית ממברנת הבסיס (BME) במדיום Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) של Dulbecco בריכוז סופי של 80 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: לפני הדילול, בדוק את ריכוז תמיסת ה-BME שהתקבלה באמצעות מספר האצווה באתר הספק.
  4. הוסיפו 1 מ"ל מה-BME המדולל לכל באר לפלטה עם 6 בארות. החזר מיד את ה-BME המקורי ל-4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
  5. הטה את הפלטה כדי לפזר את התמיסה באופן שווה על פני כל פני הבארות. ודא שאין אזורים לא מצופים.
  6. דגרו את הצלחת לפחות 30 דקות בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
    הערה: אין זמן דגירה מקסימלי. אם אתה דגר יותר מיום אחד, ודא שה-DMEM/F-12 לא יתאדה. תמיסת ה-BME המשמשת לבאר אחת ניתנת לשימוש חוזר רק פעם אחת כדי לצפות באר שנייה. המניפולציה של BME בטמפרטורת החדר צריכה להיות קצרה בגלל הפולימריזציה המהירה שלו.

2. תחזוקה ומעבר של hiPSCs

הערה: בפרוטוקול זה, מדיום תחזוקת hiPSC מתייחס ל-mTeSR plus. mTeSR plus הוא המדיום המומלץ לתחזוקה שוטפת, מעבר מטוסים, התאוששות לאחר נוקלופקטון ובחירת פורומיצין.

  1. בצע מעבר HIPSC בערך כל 4–6 ימים כאשר התאים מגיעים ל-60% מפגש המים.
  2. שאפו את מדיום התרבות מהבארות באמצעות פיפטה שואפת.
  3. הוסיפו 1 מ״ל ReLeSR לבאר ודגרו במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  4. שאף את תגובת הדיסוציאציה ודוגר את הפלטה למשך 8 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. הוסיפו בעדינות 1 מ"ל מדיום תחזוקה hiPSC באמצעות פיפטה של 5 מ"ל. אסוף את המתלה של התא בצינור של 50 מ"ל.
  6. מערבבים 10 מיקרוליטר מתלה התא עם 10 מיקרוליטר של טרייפן בלו בצינור מיקרוצנטריפוגה. טעין 10 מיקרו ליטר מהתערובת על סלייד מונה תאים כדי לקבוע את ריכוז התאים הבריא.
  7. שאפו את ציפוי ה-BME מבאר שהוכנה מראש. הוסף 2 מ"ל מדיום תחזוקה של hiPSC בתוספת מעכב קינאז סליל סליל קשור ל-Rho (Rho-27632; 10 מיקרומום סופי).
  8. זרעו 100,000 hiPSCs בבאר, במטרה להכדאיות של >90%. הזיזו את הלוח בתנועה בצורת שמונה כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים.
  9. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  10. אחרי 24 שעות, החלף את המדיום ב-2 מ"ל של mTeSR טרי בתוספת מדיום ללא מעכב ROCK.
    הערה: שינוי חולף במורפולוגיית התא (הארכת התא) צפוי בנוכחות מעכב ROCK. וודא שהתאים מחזירים את המורפולוגיה האופיינית שלהם לאחר הסרתם.

3. גרעין של hiPSCs

  1. העבירו את התאים כאשר המפגש מגיע לכ-60%.
    הערה: בפרוטוקול זה, כ-60% מהמפגש מתמקד בהתפתחות פעילה של מושבות hiPSC המכסות קצת יותר ממחצית משטח הבאר, עם מרווח נראה בין המושבות והבחנה ספונטנית מינימלית. מושבות לא צריכות להיות מגודלות יתר על המידה, מיזוג נרחב או להציג מרכזים צפופים ורב-שכבתיים בזמן הגרעין.
  2. ודאו שמכשיר הנוקלאופקציה מופעל ותוספת הנוקלאופקציה מתווספת לתמיסת הנוקלאופקציה P3. הכינו דלי קרח.
  3. הוסף 110 מיקרו-ליטר מתמיסת הגרעין P3 לצינור מיקרוצנטריפוגה המונח על הקרח.
  4. הוסף לצינור 1 מיקרוגרם של פלסמיד CRISPR/Cas9 ו-1 מיקרוגרם מהפלסמיד התורם המכיל את ASCL1-P2A-DLX2 המושרה דוקסיציקלין. ערבבו בעדינות מבלי להכניס בועות.
  5. הכינו את לוח היעד על ידי שאיפת ה-BME משני בארות מצופים. הוסף 2 מ"ל מדיום תחזוקה hiPSC המכיל מעכב ROCK לכל באר, ודוגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. הפרדה של hiPSCs במפגש של 60% מבאר של לוח בן 6 בארות כפי שמתואר בשלבים 2.2 עד 2.5. העבר את המתלה לצינור סטרילי וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר.
  7. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא לתוך 110 מיקרוליטר של תמיסת נוקלאופקציה P3 המכילה את הפלסמידים. פיפט בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות.
  8. העבר 100 מיקרולטר מהמתלה התא לקובטה נוקלאופקטית המונחת על קרח.
  9. הכנס את הקובטה למכשיר הנוקלאופקטור והפעיל את תוכנית CB-150 ל-hiPSCs.
  10. שלפו מיד את התאים באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק. העבר נפחים שווים של תליית התא לשני הבארות שהוכנו מראש.
  11. פזר את התאים בתנועת צורת שמונה ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  12. אחרי 24 שעות, החלף את המדיום ב-mTeSR פלוס מדיום שחסר מעכב ROCK. בדוק את יעילות הגרעין על ידי צפייה בפלואורסצנציה אם רלוונטי.

4. בחירת אנטיביוטיקה

אזהרה: פורומיצין רעיל. לטפל בציוד מגן אישי מתאים ולהיפטר מהפסולת בהתאם להנחיות המוסדיות.

הערה: לפני בחירת hiPSCs ערוכים, קבעו את ריכוז הפורומיצין האופטימלי לכל קו hiPSC. זרעי hiPSC לא ערוכים ב-100,000 תאים לבאר בלוח מצופה BME עם 6 בארות במדיום תחזוקה של hiPSC בתוספת מעכב ROCK. לאחר 24 שעות, החליפו את המדיום במדיום תחזוקה טרי של hiPSC המכיל פורומיצין ברמות 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ו-1.5 מיקרוגרם/מ"ל. החלפת מדיום המכיל פורומיצין מדי יום ומנטרת את מורפולוגיית התאים וההישרדות באמצעות מיקרוסקופיית ברייטפילד למשך 5 ימים. הריכוז שנבחר אמור להסיר את כל ה-hiPSCs הלא ערוכים בתוך 3–5 ימים תוך מזעור רעילות מופרזת. בפרוטוקול זה, ריכוז הפורומיצין האופטימלי הוא בדרך כלל 0.4–0.6 מיקרוגרם/מ"ל.

  1. המתינו ל-3 מעברים לאחר הגרעין, בדרך כלל כ-1–2 שבועות בהתאם להתאוששות וקצב הגדילה, כדי לאפשר אובדן פלסמידים לא משולבים לפני תחילת הסלקציה.
  2. לבצע מעבר תאים ולזרוע 100,000 תאים בכל באר.
  3. לאחר 24 שעות, מוסיפים פורומיצין בריכוז שנקבע על ידי עקומת ההרג, בדרך כלל 0.4–0.6 מיקרוגרם/מ"ל.
  4. שמרו על בחירת הפורומיצין למשך הזמן שנקבע מראש, בדרך כלל כ-5 ימים.
  5. אימות האוכלוסייה הנבחרת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה כדי להעריך את שיעור התאים החיוביים למדווח.
    הערה: יש להתקדם רק עם אוכלוסיות מאוחדות המציגות ביטוי מדווח הומוגני באופן רחב, רצוי >80–90% תאים חיוביים למדווחים. אם ביטוי המדווח נשאר פסיפס, האריך את הבחירה, חזור על העשרה, או שקול בידוד קלוני לפני ההבדלה.
  6. אשר את המיקוד הנכון של AAVS1. באמצעות PCR לפני התחלת התמיינות נוירונלית.
  7. כאשר נדרש אימות קפדני, יש לאמת מוצרי PCR באמצעות ריצוף סנגר ולהעריך את מספר העתק הטרנסגן באמצעות qPCR, ddPCR או מבחן מספר עותק מתאים אחר.
  8. הערכת אינטגרציה אקראית באמצעות בדיקות מבוססות PCR עבור רצפי עמוד שדרה של פלסמיד או ניתוח אינטגרציה רחב יותר של הגנום, בהתאם ליישום המיועד בהמשך.
  9. אישור שאוכלוסיית ה-hiPSC הנבחרת נשארת שלילית למיקופלסמה, שומרת על מורפולוגיה טיפוסית של מושבות hiPSC, ושומרת על גדילה איתנה לאחר ברירה פורומיצין.
  10. הערכה מחדש של שלמות הגנומית באמצעות קריוטיפינג, מערך SNP או מבחן מאומת אחר, במיוחד כאשר תאים ערוכים ישמשו למידול מחלות, בדיקות פונקציונליות או מחקרים ארוכי טווח.
  11. הערכת השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה של CRISPR/Cas9 באמצעות ריצוף ממוקד של אתרים חזויים מחוץ למטרה או, במידת הצורך, גישות גנומיות רחבות יותר.
    הערה: אין להשתמש בתרביות להבדלה אם הן מראות מורפולוגיה לא תקינה, התאוששות לקויה לאחר ברירה, ביטוי מתמשך של דיווח פסיפס, חריגות גנומיות מאומתות או אינטגרציה נכשלת של AAVS1 . בפרוטוקול זה, hiPSCs מהונדסים נבחרים משמשים כאוכלוסייה מאוחדת וניתן לשמר אותם בהקפאה לפני השראת דוקסיציקלין, ביטוי מדווח, AAVS1. היעד, המורפולוגיה והצמיחה אומתו. הקפאה לאחר השראה של דוקסיציקלין או במהלך הבשלה נוירונית אינה חלק מתהליך העבודה הסטנדרטי ויש לאמת אותה אמפירית לפני השימוש.

5. התמיינות לנוירונים GABAergic

  1. הכן את מספר הבארות המצופות BME. יש לשים לב שזריעה היטב ביום 0 תניב באר אחת של נוירונים GABAergic.
  2. הכינו 6.9 מ"ל מדיום נוירו-אינדוקציה לכל באר, תוך השלמת דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם למ"ל). כלול נפח עודף של 15% כדי להתחשב בטעויות באידוי או בפיפטינג.
    הערה: דוקסיציקלין משמש בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל, החל מהיום 0, ונשמר לאורך כל ההתמיינות וההבשלה. עם כל שינוי מדיום מכין מדיום טרי המכיל דוקסיציקלין כדי לשמור על השראה עקבית של הטרנסגנים. מינון זה נבחר כי הוא יצר ביטוי מדווח חזק והמרת נוירונים יעילה בידינו. בפרוטוקול זה לא בוצעה תגובה פורמלית למינון דוקסיציקלין; לכן, מעבדות המתאימות את השיטה עשויות לבדוק אמפירית 0.1–2 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין אם השראת הטרנסגן נראית תת-אופטימלית.
  3. ביום 0, הפרדו את ה-hiPSCs המהונדסים וזרעו 200,000 תאים לבארות המצופות ב-BME. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
  4. בימים 1, 2 ו-3, שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל של מדיום נוירו-אינדוקציה טרי המכיל דוקסיציקלין.
    הערה: עד היום השלישי, התרחבות התאים צפויה לרדת משמעותית, ומבנים דמויי דנדריטים עשויים להתחיל להופיע. אם נדרש אישור ניסויי ליציאה ממחזור התא, ניתן לבצע צביעת חיסון Ki-67 או שילוב EdU/BrdU ביום 3–4.
  5. ביום הרביעי, הכינו מדיום נוירו-בשלה המכיל גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), גורם נוירוטרופי מקו תאי גליה (GDNF) ונוירוטרופין-3 (NT-3), כל אחד בריכוז סופי של 10 ng/mL, דוקסיציקלין ב-1 מיקרוגרם/מ"ל, ו-PluriSln ב-20 מיקרומטר.
  6. שאפו את המדיום הנוירו-אינדוקציוני. הוסיפו בזהירות 2 מ"ל של מדיום ההתבגרות הנוירובטית טיפה אחר טיפה לאורך דופן הבאר כדי לא להפריע לנוירונים החדשים.
  7. ביום השביעי, שואף את המדיום והוסיף בעדינות 2 מ"ל מדיום נוירו-בשלה המכיל את הנוירוטרופינים והדוקסיציקלין, אך השמטת מעכב הישרדות תאי פלוריפוטנטי.
  8. לתחזוקה ארוכת טווח, החלף את מדיום ההתבגרות הנוירו-סופית לחלוטין כל 3 עד 4 ימים, תוך התאמת התדירות בהתאם לצפיפות התאים.
    הערה: יום 21 הוא נקודת הסיום הסטנדרטית להערכת זהות נוירונלית GABAergic. ביום ה-21, תאים אמורים להציג תכונות נוירונליות GABAergic, כולל DLX1.ביטוי, וממשיכים להבשיל את רשתות האקסונים שלהם. צפיפות זריעה של 200,000 תאים לבאר נבחרה אמפירית ליצירת מושבות מרווחים היטב תוך הימנעות מצפיפות מופרזת ומוות תאי הקשור לבגירה. צפיפויות של 150,000–300,000 תאים לבאר תואמות, כאשר צפיפויות נמוכות מועדפות למורפולוגיה וצפיפויות גבוהות יותר לשחזור חומר. כדי להפחית ניתוק, יש לבצע החלפות תכופות יותר של חצי-בינוני באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר בזרימה נמוכה מבלי להטות את הלוח. במידת הצורך, ניתן לצלוח מחדש תאים פעם אחת לאחר השראת דוקסיציקלין בת 3 ימים, לפני הוספת מדיום הבשלה, באמצעות ציפויים משופרים כמו פולי-אל-ליזין/למינין או למינין-521. יש להימנע ממעבר נוסף לאחר תחילת הבגרות.
  9. תרביות יכולות להישמר מעבר ליום ה-21 לצורך הבשלה ממושכת אם הרשתות נשארות מחוברות, בעלות קיימא וללא התפשטות מושבות דמויות hiPSC. לאחר יום 21, יש לבצע שינויים חצי-בינוניים כל 3–4 ימים עם מדיום נוירו-בשלה טרי המכיל דוקסיציקלין וגורמים נוירוטרופיים.
    הערה: השתמש בתרביות לבדיקות במורד הזרם לאחר שמורפולוגיית הנוירונים ורשתות הנויריטים יציבות, ההיפרדות מינימלית, ואין מושבות בלתי מובחנות נראות. אצלנו, תרביות בדרך כלל משמשות בין יום 21 ליום 35.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מוביל לאוכלוסייה מועשרת של נוירונים מושרים עם תכונות מולקולריות GABAergic. האסטרטגיה מבוססת על החדרה ממוקדת של קלטת ASCL1-P2A-DLX2 המושרה על ידי דוקסיציקלין ללוקוס AAVS1 (איור 1A). לאחר בחירת HiPSCs מהונדסים, השראת דוקסיציקלין משמשת להנעת התמיינות נוירונלית GABAergic, כפי שמתואר בציר הזמן המוצג באיור 1B. לאחר בחירת נוקלאופקציה ופורומיצין, החוקרים צריכים לצפות בביטוי כמעט הומו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היצירה המוצלחת של נוירונים GABAergic נשענת במידה רבה על מספר שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה. שמירה על HiPSCs איכותיים ובלתי מובחנים היא קריטית; התמיינות ספונטנית לפני הגרעין מפחיתה באופן דרסטי את יעילות האינטגרציה ואת טוהר הנוירונים במורד הזרם8. יתרה מזאת, קביעה מדויקת של עקומת ההרג של פורומיצין חיונית כדי להבטיח חיסול מוחלט של תאים לא משולבים ללא עומס מופרז על שיבוטים מהונדסים כראוי. בשלב ההבדלה, טיפול זהיר ועדין בתרבויות, ובמיוחד הוספת מדיה טיפה אחר טיפה על קיר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

התמיכה ניתנה על ידי תוכנית Jump Start ECR של רשת תאי הגזע הקנדית וקרן UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine - Institut Imagine en épilepsie de l'enfant. תיאו רבין נתמך על ידי רשת Odisé.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יחידת ליבה 4D-Nucleofector™LonzaAAF-1002Bלאלקטרופורציה/נוקלאופקציה של hiPSCs.
צלחות תרבית 6-בארותSarstedt83.3920300צלחות מטופלות לתרבית רקמות לתחזוקה והתמיינות של hiPSCs.
BDNF (גורם גדילה נוירוטרופי ממוצא מוחי)STEMCELL Technologies78005חלבון אנושי רקומביננטי לבשלות עצבית; להכין בהתאם להוראות היצרן ולהשתמש בריכוז סופי של 10 ng/mL.
סופר תאים (Countess)Thermo Fisher ScientificC10283משמש לספירת תאים.
צנטריפוגהVWR76468-134להצטברות תאים.
חממת CO2Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i או מקבילחממת תרבית תאים המקיימת 37 °C, אטמוספירה לחה ו-5% CO2.
קריוטוביםThermo Fisher Scientific5000-0020בקבוקונים קריוגניים סטריליים להקפאה של hiPSCs; ניתן להשתמש בבקבוקונים קריוגניים חיצוניים חוטים 1.8–2.0 מ"ל.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractBio-TechneBME001-05מטריצת ציפוי BME סטנדרטית המשמשת בפרוטוקול. לאמת את ריכוז המלאי הספציפי ללוט מתוך תעודת הניתוח של Bio-Techne ולדלל ב-DMEM/F-12 לריכוז עבודה של 80 µg/mL.
DMEM/F-12Wisent319-090-CLמדיום בסיסי המשמש לדילול BME.
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)Sigma-AldrichD2650חומר קריופרוטקטיב המשמש בהכנת מדיום הקפאה.
פלסמיד תורם: קסטה מיעדת AAVS1 של ASCL1-P2A-DLX2 מושרהפלסמיד מותאם אישיתמספר Addgene ממתיןפלסמיד AAVS1 מותאם אישית המכיל קסטת ASCL1-P2A-DLX2 מושרה דוקסיציקלין ואלמנטים של בחירה/דיווח. לספק מפת פלסמיד ורצף מלא כקובץ נלווה או על פי בקשה.
דוקסיציקלין הייקלטSigma-AldrichD9891משמש לגירוי ביטוי ASCL1-P2A-DLX2. להכין פתרון מלאי סטרילי, לחלק למנות, להגן מאור, לאחסן קפוא ולהשתמש בריכוז סופי של 1 µg/mL.
אתנול (70%)Commercial Alcohols / Greenfield GlobalP016EAANלהסטריליזציה בתוך ארון בטיחות ביולוגית; להשתמש באתנול 70% מאושר מוסדי או מקביל.
מיקרוסקופ פלואורסצנטיECHORevolve R4מיקרוסקופ המשמש להדמיה בניגוד פאזה ופלואורסצנטית של ביטוי דוחה ומוֹרפוֹלוֹגיה עצבית.
GDNF (גורם גדילה נוירוטרופי ממוצא גליאלי)STEMCELL Technologies78058חלבון אנושי רקומביננטי לבשלות עצבית; להכין בהתאם להוראות היצרן ולהשתמש בריכוז סופי של 10 ng/mL.
קו hiPSC PGP1EditCo Bioקו hiPSC אנושי PGP1קו hiPSC אנושי זמין מסחרית בעל הסכמה פתוחה המשמש בפרוטוקול זה; להקליט מספר מעבר ומצב QC לפני עריכה והתמיינות.
תוכנת ניתוח תמונותImageJ/Fijiמקור פתוח; יש לדווח על גרסת התוכנה שבה נעשה שימושלהערכת פלואורסצנטיה ועיבוד תמונות מייצגות.
תחליף סרום KnockOut™ (KOSR)Thermo Fisher Scientific10828028משמש בהכנת מדיום הקפאה.
למין-521STEMCELL Technologies200-0117חומר פתרון בעיות אופציונלי בלבד. לא חלק מפרוטוקול הציפוי הסטנדרטי; ניתן להשתמש בו כאלטרנטיבה או ציפוי כפול אם נמשך ניתוק עצבי.
מיכל הקפאה קריוגנית של Liquid nitrogenThermo Fisher ScientificLocator 6 Plus או מקבילאחסון לטווח ארוך של hiPSCs קפואים בשלב האדים או בחנקן נוזלי בהתאם לנהלי הבטיחות הקריוגניים המוסדיים.
מיכל הקפאה קריוגנית של Mr. Frosty™Thermo Fisher Scientific5100-0001להקפאה מבוקרת של תאים ב-80 °C.
mTeSR™ PlusSTEMCELL Technologies100-0276מדיום תחזוקה ללא הזנה עבור hiPSCs.
מדיום הידוק עצביSTEMCELL Technologies08582מדיום הידוק עצבי מסחרי המשמש לגירוי עצבי מוקדם.
מדיום בסיס בשלה עצבית (BrainPhys™ מדיום עצבי)

מקורות

  1. Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.
  2. Barabino A, Flamier A, Hanna R, Héon E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.
  3. Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer’s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.
  4. Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.
  5. Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).
  6. Wogram E, Sümpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.
  7. Marín O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107–20. PubMed PMID: 22251963.
  8. Yang N, Ng YH, Pang ZP, Südhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.
  9. Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.
  10. Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.
  11. Gu J, Rollo B, Liu Z, O’Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדעי העצביםגיליון 233גיליון 233ערך ריקגיליוןhESC/hiPSCדיפרנציאציהCRISPR/Cas9.

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.