מודל מבוסס אמוניום ברזל ציטראט של עומס ברזל עם קריאות הקשורות לפרופטוזיס במיובלסטים C2C12

סיכום

כאן, אנו מציגים מודל מהיר של עומס יתר ברזל מבוסס אמוניום ציטראט במיובלסטים של C2C12, שגורם לעומס ברזל, שינויים מולקולריים הקשורים לפרופטוזיס, ואובדן מוקדם של רגישות לפרוסטטין.

תקציר

פרופטוזיס היא צורה התלויה בברזל של מוות תאי מבוקר, המעורבת בהזדקנות ובמחלות ניווניות. מצאנו בעבר שתאי גזע בשריר מזדקנים מצטברים ברזל תוך-תאי ועוברים מוות פרופטוטי בעת ההפעלה. כאן, אנו מתארים מודל פשוט במבחנה המשתמש בציטראט אמוניום ברזל ליצירת עומס יתר ברזל במיובלסטים C2C12 בעכברים. טיפול בציטראט אמוניום ברזלי הגביר את עומס הברזל התוך-תאי, כפי שמודגם על ידי תמלול גבוה בשרשרת הפריטין העשירה והקלה, עלייה בחלבון פריטין, ושיפור האות מצבע ברזל תאי חי. חשיפה לאמוניום ציטראט (FAC) גרמה גם לשינויים מולקולריים הקשורים לפרופטוזיס, כולל הגברת ביטוי Slc40a1 ו-Hmox1 והפחתת חלבון גלוטתיון פרוקסידאז 4. הירידה הקשורה ל-FAC בגלוטתיון פרוקסידאז 4 הוחזרה חלקית על ידי דפרוקסאמין. לאחר 12 שעות, אמוניום ציטראט פרריק ציטוטוקסי הפחית את חיוניות התאים, והשפעה זו חולצה על ידי פרוסטטין-1, בהתאם לרכיב רגיש לפרופטוזיס של מוות תאים. בנקודות זמן מאוחרות יותר, שונות מוגברת וטווח דינמי מבחן מופחת מגבילים את הפרשנות של מדידות הכדאיות. לכן, פרוטוקול זה מספק מודל מהיר וניתן להרחבה של עומס ברזל מתווך אמוניום ציטראט ברזל, שניתן להשתמש בו לחקר תגובות הקשורות לפרופטוזיס ולבדיקת התערבויות המשנות ברזל או פרופטוזיס בתאי שריר.

מבוא

פרופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מפוקח (RCD), המולקולרי שונה מ-RCD אחרים. הוא התגלה לראשונה באמצעות ארסטין, מולקולה קטנה קטלנית הסלקטיבית ל-RAS (סרקומת עכברים), שנמצא כי גורם למוות תאים לא אפופטוטיים¹. בעבודתם הפורצת הדרך, דיקסון ואחרים תיארו לראשונה את מנגנון הייצור שלו כתלוי בברזל, ולכן טבעו את המונח פרופטוזיס, שפירושו "נפילה (מוות) על ידי ברזל¹." מולקולרית, פרופטוזיס מתבטאת בהצטברות ברזל מופרזת, חמצון שומן מוגבר והצטברות של מיני חמצן תגובתי, מה שמוביל למוות תאים². הוא מובחן באופן ייחודי מעמצה חמצונית וצורות אחרות של RCD בכך שהוא עצמאי מהפעלת קספאז, סימן היכר של אפופטוזיס, והיעדר קינאז חלבון 3 (RIPK3) המזרחן עם אינטראקציה קולטנית (RIPK3) ופסאודו קינאז (MLKL) הדומה לקינאז מעורב, שמופיעים רק בנקרופטוזיס³. יתרה מזאת, ניתן להקל על פרופטוזיס גם באמצעות נוגדי החמצון השומניים פרוסטטין-1 וליפרוקססטטין-1, ודפרוקסאמין שכלטור הברזל⁴. למרות שפרופטוזיס דומה לסוגים אחרים של RCD בכך שכולם מובילים בסופו של דבר למוות תאים, ההצגה שלו מבדילה מכנית מצורות אחרות של RCD.

המחקר על פרופטוזיס צבר תאוצה בעשור האחרון, בעיקר בזכות מאמצים מתמשכים בתחום לזהות סימנים חדשים ולפתח כלים חדשים לחקר המנגנונים הבסיסיים שלו ותרומתו^למחלות האדם. גוף ראיות עדכני מצביע על כך שעומס יתר של ברזל ופרופטוזיס הם תורמים פחות נחקרים לשבריריות הקשורה לגיל ולסרקופניה ^6,7,8. הראינו לאחרונה שתאי גזע שרירים מזדקנים (MuSCs) רגישים באופן ייחודי למוות פרופטוטי הנגרם מדלקת כרונית המדכאת תוכנית גנטית אנטי-חמצונית באמצעות השתקה^{אפיגנטית.} מצאנו ש-MuSCs מבוגרים צוברים רמה חריגה של ברזל יסודי תוך-תאי, בערך פי 30 גבוה יותר מהברזל הבוגר. למרות שפרופטוזיס נקשרה למחלות באיברים ורקמות רבות—בעיקר אלו הקשורות להזדקנות—תפקידה הפיזיולוגי נותר לא ברור ודורש חקירה נוספת.

בעוד שהמחקר הקודם שלנו הראה ש-MuSCs מבוגרים רגישים למוות פרופטוטי בעת ההפעלה, התרומה הספציפית של עומס הברזל לפנוטיפ זה עדיין לא ברורה. כאן, אנו מקימים מודל פשוט של עומס יתר ברזל במיובלסטים C2C12 שטופלו באמוניום ציטראט ברזל (FAC) ושואלים האם עודף ברזל מספיק ליצירת שינויים מולקולריים הקשורים לפרופטוזיס ואובדן חיוניות רגיש לפרוסטטין. תאי C2C12 מספקים מערכת אב שרירי עכברים עם תחזוקה נמוכה, ניתנת להרחבה וזמינה^{בקלות 10}. אנו צופים שגישה זו תספק פלטפורמה מעשית לחקר תגובות לחץ מונעות ברזל בתאי שריר ולבדיקת התערבויות המשנות פנוטיפים הקשורים לפרופטוזיס.

פרוטוקול

1. הכנת תאי C2C12

1. תאי הפשרה
   הערה: כל שלבי תרבית התאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.
   1. הכינו צינור חרוטי המכיל 9 מ"ל מדיום חם ומלא (מדיום Eagle מותאם של Dulbecco עם רמות גבוהות של גלוקוז ופירובט + 10% סרום בקר עוברי + 1% פן/סטרפטוקוקוקוס).
   2. הפשרת בקבוקון אחד של תאי C2C12 קפוא (~1 מיליון) על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של מדיום מלא מחומם מראש לבקבוק מהמלאי הראשי. פיפט למעלה ולמטה לאט.
   3. כאשר המדיה שנוספה לבקבוק ההפשרה מתקררת, יש להוציא אותו ולהוסיף אותו לצינור הקוני. החלף באותו נפח של מדיה חמה מהשפופרת. המשך פיפטינג למעלה ולמטה ולהחליף את המדיה עד שהתאים הקפואים יתרחקו מחדש.
   4. פיפט את תוכן הבקבוקון לתוך צינור חרוטי של המדיום. הפוך כדי לערבב, ואז מוסיפים את התכולה לתבנית של 10 ס"מ שטופלה בתרביות תאים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   5. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם מחוברים. התאים המחוברים ייראו מוארכים, בעוד שתאים צפים הם עגולים ונעים כאשר הלוח זז.
      הערה: בהנחה שהתאים המצופים בריאים, רובם אמורים להיות מחוברים.
   6. שואב את המדיה כדי להסיר תאים מתים ופסולת. מחליף ל-10 מ"ל של מדיה חמה מלאה וחוזר לאינקובטור. תן לו לדגור כל הלילה, או עד שהצלחת מגיעה ל-80% מזל.
2. זריעת תאי C2C12 לטיפול בברזל
   1. לאחר שמגיעים למפגש הרצוי, יש לשאוב את המדיה של התא. הוסף 2 מ"ל PBS בזרם לפלטה, כדי להבטיח שכל המשטח מכוסה; שאיפה.
   2. הוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין לתאים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–10 דקות, או עד שהתאים מתנתקים. לאחר הניתוק, התאים ייראו עגולים תחת מיקרוסקופ, והטריפסין וההשעיה של התא יהיו מעורפלים ומעובים.
   3. מנטרל את הטריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל DMEM חם מלא. השתמש בפיפט סרולוגי כדי לערבב היטב את התמיסה ולשטוף את הצלחת. העבר את תליית התא לצינור קוני.
   4. הפוך בעדינות את הצינור 3–5 פעמים. הסר את הנפח המתאים וספר את התאים בשיטה המועדפת (מונה תאים, המוסיטומטר וכו').
   5. יש להכין תלייה של תאים מספיקה כדי לזרוע את מספר הבארות/לוחות הרצוי עבור n = 3 לכל תנאי: פלטה 10 ס"מ (לכתם מערבי): 100,000 תאים לפלטה, 6 לוחות באר (עבור qPCR): 50,000 תאים לבאר, 96 לוחות באר (לצביעת ברזל גמיש ולומינסנציה): 1,000 תאים לבאר. תן לתאים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
3. יישום טיפול בברזל על תאים זרעים
   1. ביום הטיפול, מוסיפים ציטראט אמוניום ברזל (FAC; נוסחה = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 גרם למול) להשלמת DMEM בריכוזים הבאים בתנאים סטריליים: חמור: 180 מיקרומום (0.0477 mg/mL), ציטוטוקסיק: 1,800 מיקרומום (0.477 mg/mL).
      הערה: יש לשקול להוסיף גם בקרות, כולל, אך לא מוגבל לרכב, דפרוקסמין חמור + 150 מיקרומום (כילטור ברזל), דפרוקסאמין רכב + 150 מיקרומול, ו/או רכב + RSL3 (גורם לפרופטוזיס; בקרה חיובית). בנוסף, ראוי לציין ש-DMEM עשוי להכיל כמות קטנה של ברזל (III) ניטראט נו-אהידראט, מקור לברזל ברזל, בבסיס. הקורא צריך לפרש את ריכוזי ה-FAC שהומלצו לעיל כתוספת לכל ברזל ברזל קיים שכבר קיים במדיום תרבות הרכב.
   2. הפוך כדי לערבב עד ש-FAC מתמוסס במדיה שלמה.
      הערה: מכיוון ש-FAC מסיס במים, אין צורך ב-DMSO או בממס נוסף. הוספת FAC עשויה לשנות את ה-pH של התמיסה, ולכן אם נצפתה שינוי דרמטי בצבע המדיום, מומלץ למדוד pH כדי להבטיח את כדאיות התאים בעת הוספת המדיה המטופלת לתרבית.
   3. שאיפת מדיה מהתאים. הוסיפו את אותו נפח של מדיה מלאה עם תוספת ברזל לתנאי הטיפול, ואת המדיה המלאה הלא מטופלת לבארות/לוחות הרכב. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הטיפול הרצוי לפני המשך לבדיקה המועדפת: בדיקת ברזל גמישה: 2 שעות טיפול ב-FAC, qPCR וכתם מערבי: 12–24 שעות טיפול ב-FAC, בדיקת לומינסנס: 12 שעות טיפול ב-FAC.

2. qPCR

1. בידוד mRNA עבור qPCR
   אזהרה: מגיב חילוץ ה-RNA והכלורופורם מהווים סכנות נשימתיות. לטפל רק בקפוצ'ון אדים עם ציוד מגן מתאים (חלוק מעבדה, כפפות חד-פעמיות עמידות לכימיקלים והגנה על עיניים).
   1. על הספסל, שואבים מדיה מהתאים. שטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי ושאוף היטב את כל הנוזל שנותר.
   2. במכסה אדים, הוסף את תגובת חילוץ ה-RNA לתאים בנפחים הבאים: צלחת 6 בארות: 250 מיקרוליטר/באר, צלחת 10 ס"מ: 1 מ"ל לצלחת.
   3. בעבודה על קרח במכסה האדים, השתמשו במגרד תאים כדי לגרד בעדינות תאים שעברו פירוק. דאג לגרד היטב את כל חלקי הפלטה כדי למקסם את תפוקת ה-RNA.
   4. פיפט הליזאט לצינורות מיקרופוג' סטריליים, מקוררים מראש וללא RNAse. תן להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   5. על כל מ"ל של תגובת החילוץ יש להוסיף 200 מיקרול כלורופורם בתוך מכסה אדים. שקו דגימות נמרצות במשך לפחות 30 שניות כדי לשלב את מגיב החילוץ והכלורופורם. תן להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: לאחר שחלף הזמן, תתרחש הפרדת פאזה, כאשר הפאזה המימית השקופה (המכילה את ה-RNA) נמצאת מעל.
   6. דגימות צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בינתיים, יש לסמן צינורות חדשים עם אוטוקלב, ולהוסיף 500 מיקרו-ליטר (למיליטר של תגובת חילוץ) של איזופרופנול לצינורות על הקרח.
   7. העבר רק את הפאזה המימית לכל צינור מתאים. מערבבים בעדינות באמצעות היפוך, ואז נותנים לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אם צפוי תפוקה נמוכה, הוסף 2 מיקרוליטר גליקובלו כדי לראות את הכדור.
   8. צנטריפוגה ל-15 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: RNA ששקע עשוי להיות נראה בתחתית הצינור.
   9. שפוך בזהירות עודף איזופרופנול לתוך בקבוק פסולת ייעודי. הוסיפו 1 מ"ל של אתנול בדרגה מולקולרית, 100% אתנול בדרגה לצינור, תוך זהירות לא לשחרר את הכדור. צנטריפוגה ל-5 דקות בטמפרטורה של 7,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
   10. שפוך אתנול. הפוך את הצינורות והשאיר את הפקק פתוח מעל מגבת נייר. תן לכדור להתייבש עד שהוא נקי מטיפות (~15–30 דקות).
       הערה: הכדור עלול להפוך לשקופ אם לא מוסיפים גליקובלו.
   11. החזירו את הכדור למים סטריליים וללא RNAse ב-25 מיקרוליטר. כמת את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה נראית ב-UV. נרמול לריכוז אחיד בין דגימות שיאפשר מקסימום של 1 מיקרוגרם RNA ב-16 מיקרוליטר לכל דגימה.
2. סינתזה של cDNA עבור qPCR
   הערה: השלים את כל השלבים על הקרח כדי למקסם את תפוקת ה-RNA/cDNA.
   1. דגימות הפשרה. שטוף את אזור העבודה עם חומר ניקוי RNAse.
   2. הוסף 1 מיקרוגרם RNA מכל דגימה לצינור פס PCR מתאימ.
   3. הוסף 4 מיקרו-ליטר מתערובת cDNA לכל צינור. במידת הצורך, הוסף מים סטריליים כדי להגיע לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. הרץ את התערובות תחת פרמטרי התרמחזור הבאים: 25 מעלות צלזיוס ל-5 דקות, 42 מעלות ל-30 דקות, 85 מעלות ל-5 דקות, 4 מעלות לאינסוף.
3. הרצת qPCR
   1. דילל cDNA 1:10 במים סטריליים לפני ביצוע תגובות נוספות.
      הערה: cDNA יכול להיות מוקפא ב-20- מעלות צלזיוס למשך חודש או -80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
   2. מדלל פריימרים לריכוז של 10 מיקרומום עם מים סטריליים. כלול את הגנים הנכונים של בקרות ו/או ניקיון (למשל, B2M, TBP1).
   3. הכינו תערובות מאסטר לכל גן ניקיון וגן מעניין כך שיהיה מספיק תערובת תגובה כדי להריץ כל תנאי DNA בשלושה עותקים. מתכון התערובת הראשית (לכל תגובה) הוא כדלקמן: 2x תערובת PCR: 10 מיקרוליטר, פריימר קדמי (10 מיקרומ'): 1 מיקרוליטר, פריימר הפוך (10 מיקרומ'): 1 מיקרוליטר, מים סטריליים: 8 מיקרוליטר.
   4. הניחו פלטת תגובה qPCR בבלוק מתכת מקורר עם 96 בארים. הוסף 5 מיקרו-ליטר של cDNA מדולל לכל באר דגימה ו-20 מיקרוליטר של תערובת התגובה הראשית לכל באר. בדקו כל באר כדי לוודא שכולם מקבלים את אותו נפח, כסו את הפלטה באיטום פלטות, והשתמשו בכלי שטוח כדי להחליק בועות.
   5. צנטריפוגה את הפלטה ב-1,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך דקה. הניחו את הפלטה במכונת qPCR, וודאו שהיא נטענת בכיוון הנכון.
   6. בתוכנת qPCR, קבעו זהויות דגימות וגן רלוונטי לכל באר. שקול ליצור תבנית אם מתכננים להריץ כמה עותקים עם אותה הגדרה.
   7. הרץ את תוכנית qPCR (משך: ~1:36 שעות) המוצגת בטבלה 1.
   8. יצא את התוצאות כ-. CSV או . קובץ XLSX. אם מכונת ה-qPCR שבה השתמשו מאפשרת למשתמש לבחור אילו ערכים לייצא, בדוק שערכי ה-CT כלולים בקובץ המייצא.
   9. השתמשו בערכי ה-CT הממוצעים לכל מצב וגן רלוונטי—בהשוואה לערכי ה-CT של גני הניקיון במצב המקביל—כדי לחשב את שינוי הקיפול של כל גן. נרמל את שינוי הקיפול של תנאי הרכב ל-1.0.

3. כתם מערבי

1. בידוד חלבון עבור ווסטרן בלוט
   הערה: בצע את כל השלבים על הקרח כדי למקסם את תפוקת החלבון.
   1. בארון בטיחות ביולוגית, שאיפת מדיום תרבית. שטוף תאים עם מספיק PBS קר כדי לכסות את תחתית צלחת התרבית. שאיפה, ואז חזור על זה.
   2. הוסיפו בופר RIPA בתוספת קוקטיילים של מעכבי פרוטאז ומעכבי פוספטאז כדי למנוע פירוק חלבון. השתמש ב-75 מיקרוליטר של תמיסת RIPA לעיבוד בלוח של 6 בארות, או ב-200 מיקרוליטר תמיסת RIPA בפלטת 10 ס"מ.
   3. בעבודה על קרח, השתמשו במגרד תאים כדי לשחרר בעדינות את התאים המפורקים מהלוח. יש להקפיד במיוחד להסיר תאים מכל חלקי הצלחת, כולל הקצוות. הפתרון ייראה ברור ומעט צמיגי.
   4. מחברים את תאי ה-RIPA לצינורות מיקרופוג' מקוררים. דגימות צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות מקסימלית של 4°C. העבר את הסופרנטנט (חלבון ליזאט) לצינור מקורר מראש. זרוק את הכדור.
   5. כמת את ריכוז החלבון על ידי ביצוע בדיקת ברדפורד או BCA. נרמול דגימות ל-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר במים טהורים מועשרים בקוקטייל פרוטאז ופוספטאז על קרח.
   6. מדלל ליזטים בבופר Laemmli, ומבטיח שריכוזי החלבון הסופיים יהיו אחידים בין הדגימות. רתיחו ליזאטים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפרק את החלבון. לתוצאות הטובות ביותר, השתמש ב-Western bloting מיד לאחר ההכנה. אחרת, יש לאחסן חלבונים בלמלי בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לטווח קצר (≤ חודש) או ב-80- מעלות צלזיוס לטווח ארוך.
2. הכנת ג'לים אקרילאמיד ל-SDS-PAGE
   אזהרה: אקרילאמיד הוא נוירוטוקסין ויש לטפל בו רק בעת לבישת ציוד מגן מתאים (חלוק מעבדה, כפפות עמידות לכימיקלים והגנה על העיניים).
   1. קבעו את החלבונים הרלוונטיים ואת גודל החלבונים על ידי התייעצות באתר החברה לגבי הנוגדנים/ה-Ies שישמשו. השתמשו בגודל החזוי של החלבון(ים) המעניין כדי להחליט איזה אחוז אקרילאמיד צריך להיות הג'ל(ים).
      הערה: 10%-15% אקרילאמיד עובד טוב לרוב המשקלים המולקולריים.
   2. הרכיבו את מעמד הג'ל והמסגרת לפי הוראות היצרן.
   3. לג'ל המתפרק, שלבו אקרילאמיד, מים סטריליים, בופר pH8.8 של 1.5 M Tris/HCl ו-10% נתרן דודציל סולפט בצינור חרוטי בנפחים מתאימים למספר ואחוז האקרילאמיד של הג'לים שיש להכין, לפי טבלה 2, שמפרטת את הרכיבים הנדרשים ל-2 ג'לים. ערבב לפי היפוך.
   4. הוסף 10% תמיסת אמוניום פרסולפט ו-TEMED לתערובת. הפוך לערבב.
   5. הוסף מיד את התמיסה למסגרת יציקת הג'ל, וממלא עד שנפח התמיסה במסגרת יציקת הג'ל יהיה קצת מתחת לכמות הנדרשת כדי להגיע לתחתית המסרק, אם היו מכניסים את המסרק.
   6. מיד הוסיפו 100–200 מיקרול אתנול טהור טיפה מעל ג'ל ההקששה. אם יש צורך להפשיר ו/או לדנטטורציה, יש להשלים זאת במהלך תקופת הדגירה. להפשיר חלבונים על קרח.
      הערה: זה יפזר את התמיסה כך שהג'ל לא יתקשה בצורה לא אחידה.
   7. לאחר שהתקשה, שפכו את האתנול. לג'ל הערימה, יש לשלב אקרילאמיד, מים סטריליים, בופר pH6.8 של 0.5 M Tris/HCl ו-10% נתרן דודציל סולפט בצינור חרוטי בנפחים מתאימים למספר ואחוז האקרילאמיד של הג'לים שיש להכין, לפי טבלה 2, שמפרטת את הרכיבים הנדרשים לשני ג'לים. ערבב לפי היפוך.
   8. הוסף לתערובת תמיסת 10% אמוניום פרסולפט ו-TEMED. ערבב לפי היפוך.
   9. הוסף מיד את תמיסת הערמה למסגרת יציקת הג'ל עד שהנפח מגיע למעלה. הוסיפו את מסרק הג'ל מיד אחרי שמזיגת את הג'ל. יש לנוח ~1 שעה או עד שצורת הבארות לא משתנה כאשר מעמד יציקת הג'ל מתנדנד קלות.
3. טעינת ג'לים
   1. מלאו את תא האלקטרופורזה בבופר ריצה לקו המילוי המתאים למספר הג'לים שיש להריץ.
   2. העבר את מסגרת הג'ל כשהמסרקים עדיין בפנים לתא האלקטרופורזה. הוסיפו עוד בופר ריצה למרווח שבין הג'לים עד שהמאגר מתמלא. משכו בעדינות את המסרקים מהג'לים הטבולים.
   3. פיפט 5–10 מיקרוליטר של סולם לתוך באר אחת מכל ג'ל.
   4. פיפט 5–20 מיקרוליטר של דגימות חלבון ומופקות של למלי לכל באר. הוסף 5–10 מיקרוליטר של 1x בופר למלי לכל בארות ריקות.
      הערה: הנפח שתוסיף עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתבסס על שכיחות החלבון(ים) הרלוונטיים ו/או יעילות הנוגדן.
4. הפעלת SDS-PAGE
   1. חבר את תא האלקטרופורזה לחבילת כוח. הגדרתי לפעול על 150 וולט למשך 45 דקות.
      הערה: בהתאם להגדרה, ייתכן שיידרש יותר זמן או מתח גבוה יותר כדי לבצע מעבר מלא, לכן יש להתאים לפי הצורך.
   2. ברגע שהחלבון נדד לקצה הג'ל (שם ג'ל הקאסטר ומסגרת הג'ל נפגשים בתחתית המכשיר), עצור את הריצה וכבה את פאק הכוח.
5. השלמת העברת חלבון
   הערה: חלק זה פותח באמצעות מכשיר העברת חלבון מהירה.
   1. שפוך בופר העברה למגש ג'ל. הוסיפו ערימת העברה, אחריה ממברנת ניטרוצלולוזה ועוד ערימת העברה לנוזל ליצירת סנדוויץ' עם הממברנה במרכז. ודאו שעריסת הסנדוויצ'ים טבולה לחלוטין בבופר ההעברה.
   2. הפעל את מכשיר העברת החלבון המהירה ובחר את הפרוטוקול המתאים למספר הג'לים וגודל החלבון הרלוונטי.
      הערה: נמצא כי 1.3 אמפר ו-25 וולט ל-10 דקות עובדים היטב, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה.
   3. הסר את ערימת ההעברה העליונה עם מלקחיים ותן לנוזלים עודפים לזרום למגש הג'ל. העבר את הערימה למכשיר העברת החלבון והניח אותו בצורה שטוחה וישרה ככל האפשר; השתמש בגלגלת או בצינור חרוטי כדי להחליק קמטים. חזור על זה עם הממברנה.
   4. השתמשו בכלי קהה כדי להפריד בעדינות את החצי העליון והתחתון של מסגרת היציקה. העבר את הג'ל לממברנה במתקן העברת החלבון.
   5. השתמש במלקחיים כדי להרים את ערימת ההעברה שנותרה ממגש הג'ל. נקנו את עודפי הנוזל, ואז הניחו אותו מעל הממברנה ועל הערימה השנייה. סגור את קופסת הג'ל והפעיל את התוכנית.
6. חסימה וצביעה בנוגדנים
   1. פתח את קופסת הג'ל והשתמש במלקחיים כדי להסיר את הערימה העליונה, ואז להרים את הג'ל. ודא שיש רצועות מהסולם על הממברנה. חתוך את הממברנה כך שתכלול רק את טווח הגודל המעניין.
   2. העבר את הממברנה לקופסת כתמים נקייה. הוסף 5 מ"ל של בופר חוסם, או מספיק כדי לכסות את הממברנה. חסום מתחת לערבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה.
   3. בינתיים, התכוננו לצביעת נוגדנים על ידי הוספת ריכוז המומלץ של נוגדנים ראשוניים ל-5 מ"ל של אלבומין סרום בקר 2% בבופר כביסה לכל ממברנה. צביעה גם לחלבון (או חלבונים) לבית (למשל, GAPDH, β-אקטין).
   4. הסר את התערובת ותשפוך את הבופר החוסמ. הוסף 5 מ"ל מתמיסת הנוגדן הראשית. דגרו בחשכה תחת ערבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (~12–16 שעות).
      הערה: בהמשך, כל השלבים צריכים להתבצע בחושך.
   5. שטוף את הממברנה 3 על 5 דקות תחת ערבוב בטמפרטורת החדר עם בופר כביסה.
   6. הוסף את הריכוז המומלץ של נוגדן משני ל-5% BSA בבופר הכביסה. הכינו 5 מ"ל תמיסה לכל ממברנה.
   7. שפוך עודף בופר. הוסף 5 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית לכל כתם. דגרו בחושך תחת ערבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה.
   8. שטוף את הממברנה 3 על 10 דקות תחת ערבוב בטמפרטורת החדר עם בופר כביסה. תמונה מיידית.
7. זיהוי וניתוח חלבונים מעניינים
   1. תמונות חלבונים באמצעות הפלטפורמה המועדפת.
   2. השתמש ב-ImageJ או בפלטפורמה אחרת כדי לכמת את עוצמת כל רצועה שמעניינת.

4. בדיקת צבע ברזל גמיש

1. צביעת ברזל גמישה
   1. להשלים את כל החלק 1, לזרוע תאים בלוח של 96 בארות תחת טיפול בברזל למשך 2 שעות. יש לוודא שיש לפחות שלושה בארות לכל תנאי טיפול בברזל, וכן בקרות שליליות (רכב; מדיום תרבית + 150 מיקרומום של דפרוקסאמין של כילטור הברזל) וחיובי (מדיום תרבית + 180 מיקרומום FAC + טיפול משותף בצבע ברזל גמיש).
   2. הכינו דילול מספיק של 1:200 של תמיסת המאגר של 1 mM של צבע ברזל גמיש במדיה ללא סרום כדי להגיע ל-200 מיקרו-ליטר לכל באר דגימה.
   3. לשאוב את המדיום התרבותי. שטוף פעמיים עם PBS.
   4. הוסף את תמיסת הצביעה לכל באר ודגרה במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   5. כבס פעם אחת עם PBS. תחליף ב-PBS.
   6. דמיינו את התאים באמצעות ערוץ אדום רחוק של מיקרוסקופ פלואורסצנציה (646/662 ננומטר). שמור וייצא את התמונות כ-. קבצי TIF.
2. ניתוח צביעה
   1. פתח את התמונות ב-ImageJ.
   2. פתח את חלון המדידה על ידי לחיצה על m. בתוך חלון המדידה , תחת תוצאות | הגדר מדידות, בחר שטח, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע. בחר בסדר.
   3. השתמש בכלי הפוליגון כדי לצייר סביב כל תא בתמונה. לחץ על m אחרי כל תא כדי להוסיף את המדידות לחלון המדידה.
   4. לאחר שכל התאים בתמונה, העתק והדביק את כל הערכים לגיליון אלקטרוני. השתמש בכלי המעגל כדי לבצע לפחות שלוש מדידות רקע באזורים שאינם מאוכלסים על ידי תאים.
   5. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את הפלואורסצנציה הכוללת של התא המתוקנת (CTCF) עבור כל תא:
      CTCF = צפיפות משולבת – (שטח התא הנבחר x ערך אפור ממוצע של קריאות רקע)
   6. השווה את ערכי ה-CTCF של התאים המטופלים בברזל לאלו של תאי הרכב. עלייה ב-CTCF מצביעה על עלייה ברמות ברזל יציבות.

5. בדיקת זוהר תאים

1. טיפול בתאים לבדיקת זוהר
   1. השלים את סעיף 1, תוך הבטחת שמספר הבארות תואם ל-n = 3 לכל תנאי שתרצה לכלול. הוסף לפחות שלושה בארות בקרה ללא תאים (רק מדיה מלאה). יש להוסיף 100 מיקרו-ליטר של תאים ומדיה כוללת לכל באר.
   2. לאחר דגירה של תאים לא מטופלים במהלך הלילה, יש ליישם טיפולים ובקרות לפי הצורך. יש לוודא שיש מצב רכב (לא מטופל), מצבים עם FAC בלבד, ציטוטוקסי + 10 מיקרומום פרוסטטין-1 (סוכן אנטי-פרופטוטי), רכב + 1 מיקרומום RSL3, ו/או רכב + 10 מיקרומום פרוסטטין-1 + 1 מיקרומום RSL3. דגרו למשך הזמן הרצוי (12–24 שעות למקסום השפעות הטיפול תוך מניעת מוות מופרז של התאים).
2. השלמת מבחן הלומינסנציה
   1. בעת טיפול בתאים, הפשרה את רכיבי הבופר הזוהר לטמפרטורת החדר. שלב את הרכיבים הנדרשים ואחסן בחושך עד שיהיה מוכן לשימוש. ראו הוראות הערכה לדרישות אחסון טמפרטורה.
   2. לאחר שהתאים סיימו את הטיפול, פעלו לפי הוראות הערכה לטיפול בתאים.
      הערה: זה כנראה יכלול שיווי משקל בטמפרטורת החדר, ואחריו הוספת בופר האור ותקופת דגירה קצרה אחרונה בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת בופר האור, כל השלבים צריכים להתבצע בחושך.
   3. השלים ומקליט את הזוהר באמצעות קורא לוחות או מכשיר דומה.
      הערה: לפרוטוקול זה נעשה שימוש בזמן אינטגרציה של 0.3 שניות.
   4. נרמול ערכי הזוהר של בארות הניסוי לממוצע הזוהר של בארות הבקרה החופשיות מהתאים.
      הערה: ערכי זוהר גבוהים יותר מצביעים על מספר גבוה יותר של תאים חיים.

תוצאות

בהתבסס על מחקרים קודמים שלנו ושל אחרים, השענו כי עלייה בברזל חוץ-תאי תייצר עומס ברזל תוך-תאי בתאי שריר העכברוסים ותאפשר לנו לעקוב אחר תגובות הקשורות לפרופטוזיס בהמשך. לכן פיתחנו את תהליך העבודה C2C12 המתואר באיור 1, שבו תאים נחשפו לריכוזים מוגדרים של אמוניום ציטראט ברזלי למשך 2–24 שעות, בהתאם לבדיקה במורד הזרם.

השלב הראשון באימות המודל שלנו היה לוודא ש-FAC יכול להיכנס לתאים. באמצעות הפריימרים המאומתים המתוארים בטבלה 3, ביצענו qPCR הן לשרשראות הכבדות והן לשרשראות הקלות של פריטין וקבענו כי עלייה בקלט הברזל קשורה לעלייה ברמות mRNA פריטין (איור 2A,B). ברמת החלבון, עלייה דומה ברמות הפריטין נראתה עם עלייה בריכוז ה-FAC, אם כי לא נראה שזה תלוי במינון (איור 2C). באופן דומה, צביעת תאי C2C12 חיים שטופלו ב-FAC הראו כי אלו שטופלו במינון ציטוטוקסי של ברזל—וכן תאים שטופלו במינון חמור וכתם ברזל גמיש במקביל כביקורת חיובית—מציגים מבחינה ויזואלית וכמותית אגירת ברזל מוגברת בהשוואה לתאים שלא טופלו ולמי שנחשף רק לכילאטור הברזל דפרוקסמין (DFO; איור 2D). בסך הכול, תוצאות אלו מצביעות על כך שהברזל שנכנס דרך FAC למדיה התאית אכן נכנס לתאים.

לאחר שקבענו כי FAC מעלה את עומס הברזל התוך-תאי, ניסינו לבדוק האם עומס יתר בברזל מלווה בשינויים מולקולריים ותפקודיים הקשורים לפרופטוזיס. FAC העלה את ביטוי Slc40a1 (פרופורטין) (איור 3A) והגביר את Hmox1 (איור 3B). FAC גם הפחיתה את חלבון GPX4, והפחתה זו בוטלה חלקית על ידי דפרוקסמין (איור 3C). הטיפול ב-RSL3 הניב ירידה דומה ב-GPX4, מה שממקם את תגובת FAC בהקשר מולקולרי רחב יותר הקשור לפרופטוזיס. פונקציונלית, מינון FAC ציטוטוקסי הפחית את החיוניות מבוססת הזוהר ב-12 שעות, ואובדן החיוניות המוקדם הזה הוחלף על ידי פרוסטטין-1 (איור 3D). לעומת זאת, ב-24 שעות, ההפרדה בין התנאים הופכת לפחות בולטת ומשתנה יותר (איור 3E). בעוד שדגימות מטופלות בפרוסטטין-1 נשארות גבוהות יחסית ל-FAC ציטוטוקסי בלבד, טווח הדינמי הכולל של הבדיקה מצטמצם בשלב מאוחר זה. יחד, הנתונים הללו מראים שטיפול ב-FAC גורם לעומס ברזל, שינויים מולקולריים הקשורים לפרופטוזיס, והפחתה רגישה לפרוסטטין בתאי C2C12 בתאי C2C12 הרגישות לפרוסטטין.

איור 1: תקציר גרפי של מודל עומס הברזל. במודל זה, תאי C2C12 מוזרעים ומורשים לדוגרים במשך הלילה לפני הטיפול במינונים פיזיולוגיים משמעותיים שונים של מדיום תרבית מועשר בברזל וניתוח מולקולרי ישיר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: הגברת אגירת הברזל הלא-יציב וסינתזת פריטין לאחר הוספת אמוניום ציטראט ברזל . רמות mRNA של (A) שרשרת כבדה של פריטין ו-(B) שרשרת קלה של פריטין עולות עם הוספת אמוניום ציטראט ברזל למערכת. (C) רמות חלבון FTH1 עולות עם הוספת ברזל ברזל למערכת. (ד) רמות הברזל הגמיש עולות בתאי C2C12 שטופלו בברזל ברזל ברזל לפני ובמקביל לצביעה בצבע ברזל אדום רחוק, בהשוואה לבקרת רכב + דפרוקסאמין. מצב הטיפול המשותף מצביע על טיפול סימולטני עם מדיום תרבית + 180 מיקרומום FAC + צבע ברזל גמיש. פסי השגיאה הם +/- SD. קיצורים: FTH1 = שרשרת כבדה של פריטין; FTL1 = שרשרת קלה של פריטין; DFO = דפרוקסאמין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: שינויים מולקולריים הקשורים לפרופטוזיס והפחתה תלויה בזמן בחיוניות התאים לאחר הוספת FAC. רמות mRNA של (A) פרופורטין (Slc40a1) ו-(B) Hmox1 עולות לאחר טיפול ב-FAC. (ג) חלבון GPX4 יורד לאחר טיפול ב-FAC ובנוכחות RSL3 החיובי בביקורת; דפרוקסמין הופך חלקית את הירידה הקשורה ל-FAC ב-GPX4. (D) זוהר תאי C2C12 לאחר טיפול של 12 שעות ב-FAC, RSL3 ו/או פרוסטטין-1, שנורמל לבארות ללא תאים (רק מדיה). (ה) נורמל זוהר של תאי C2C12 מטופלים לאחר טיפול של 24 שעות ב-FAC, RSL3 ו/או פרוסטטין-1. שורות השגיאה הן +/- SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

במת ההמתנה
1	העלות ל-50 מעלות צלזיוס ב-1.6 מעלות צלזיוס לשנייה, החזק 2 דקות
2	העלות ל-95 מעלות צלזיוס ב-1.6 מעלות צלזיוס לשנייה, החזק 10 דקות
שלב PCR (ריצה x 40)
1	החזק ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות
2	להוריד ל-60 מעלות צלזיוס ב-1.6 מעלות צלזיוס לשנייה, להחזיק דקה אחת
שלב עקומת ההתכה
1	העלות ל-95 מעלות צלזיוס ב-1.6 מעלות צלזיוס לשנייה, החזקה 15 שניות
2	להוריד ל-60 מעלות צלזיוס ב-1.6 מעלות צלזיוס לשנייה, להחזיק דקה אחת
3	העלות ל-95 מעלות צלזיוס ב-0.15 מעלות צלזיוס לשנייה, החזקה לשנייה אחת

טבלה 1: תוכנית qPCR (משך: ~1:36 שעה) בפרוטוקול סעיף 2.

	ג'ל מפרק			ג'ל ערימה
רכיב	10%	12.50%	15%
אקרילאמיד (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
מים סטריליים (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
טריס/HCl, 1.5 מ' pH 8.8 (מ"ל)	4.2			-
טריס/HCl, pH 0.5 M 6.8 (mL)	-			1.25
10% נתרן דודציל סולפט (μL)	166			50
0.1 גרם למ"ל פרסולפט אמוניום (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

טבלה 2: סיכום הרכיבים והנפחים הנדרשים להקמה מוצלחת של ג'לים לפתרון והערימה עבור ווסטרן בלוט. הנפחים הניתנים מספיקים לשני ג'לים וניתן להגדיל אותם בהתאם. האחוזים מציינים את כמות האקרילאמיד בתערובת.  הערה: יש להוסיף APS ו-TEMED אחרונים ורק כשהם מוכנים ליציקה, כי הם יפעילו את תהליך פולימריזציית הג'ל.

גן טארגט	סמל הגן	תפקיד	מינים	רצף קדימה	רצף הפוך
בטא-2-מיקרוגלובולין	B2m	גן ניקיון	עכבר	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
חלבון קופסת הקישור של TATA	המשך	גן ניקיון	עכבר	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
שרשרת כבדה של פריטין	Fth1	תת-יחידה של חלבון אגירת הברזל פריטין	עכבר	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTTTTTA
שרשרת קלה של פריטין	Ftl1	תת-יחידה של חלבון אגירת הברזל פריטין	עכבר	AATGGGGTAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGT
הם אוקסיגנאז 1	Hmox1	ממיר ביליבירדין לבילירובין בנוכחות הם, CO2 וברזל; רמות גבוהות קיימות בפרופטוזיס	עכבר	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
פרופורטין 1	Slc40a1	מעביר עודף ברזל מתוך תאים	עכבר	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG קאקאטגה

טבלה 3: רשימת פריימרים מאומתים של qPCR לגנים להובלת ברזל ופרופטוזיס הרלוונטיים. פריימרים ייחודיים לעכבר בשל השימוש בהם ב-mRNA שמקורו בתאי C2C12.

דיון

מטרת מחקר זה הייתה להקים מודל מעשי במבחנה של עומס יתר ברזל בשרירי עכברים ולהגדיר תנאים שבהם ניתן לזהות באופן אמין תגובות הקשורות לפרופטוזיס. באמצעות תהליך עבודה זה, אנו מראים שטיפול באמוניום ציטראט ברזל מוביל להצטברות ברזל תוך-תאית, מלווה בביטוי מוגבר של פריטין ואות ברזל גמיש מוגבר. עומס ברזל קשור גם לשינויים מולקולריים התואמים ללחץ הקשור לפרופטוזיס, כולל הגברת ביטוי Slc40a1 ו-Hmox1 וירידה בחלבון GPX4. פונקציונלית, חשיפה ל-FAC ציטוטוקסי גורמת להפחתה בחיוניות התאים, אשר נשמרת על ידי פרוסטטין-1 בנקודות זמן מוקדמות, ותומך בנוכחות רכיב רגיש לפרופטוזיס התורם למוות התא הנצפה.

מינון הברזל ומשך הטיפול הם פרמטרים קריטיים המשפיעים ישירות על פרשנות המערכת הזו. בידינו, נקודות זמן מוקדמות (כ-12 שעות) מספקות את ההפרדה הברורה ביותר בין המצבים, ומאפשרות לפרוסטטין-1 להציל ציטוטוקסיות הנגרמת מ-FAC בצורה שניתנת לשחזור. בנקודות זמן מאוחרות יותר (למשל, 24 שעות), הכדאיות הכוללת יורדת והשונות עולה בין תנאים, מה שמפחית את טווח הדינמיקה של הבדיקה. זה תואם לאובדן תאים מצטבר ולהסתגלות של האוכלוסייה ששרדה, כגון עלייה בקיבולת נוגדי החמצון או שינוי בטיפול בברזל.

מתן ברזל ברזל (Fe³⁺) במקום ברזל ברזל (Fe²⁺), וכן ריכוז הברזל ומשך הטיפול, הם גם היבטים קריטיים בפרוטוקול. שימוש בברזל ברזל חיוני כי ברזל ברזל נספג בקלות על ידי טרנספרין, המוביל העיקרי האחראי לייבוא ברזל ברזל¹¹. למרות שברזל ברזל יכול להיספג על ידי מובילים אחרים (ובמיוחד משגר המתכות הדו-ערכיות DMT1), בהקשר זה, ברזל ברזל נראה משולב בצורה יעילה יותר מברזל^{ברזל 12}. הריכוזים של FAC שנבחרו לפרוטוקול זה נבחרו בשל רלוונטיותם הפיזיולוגית ושימושם במודלים דומים קודמים^13,14. משך הטיפול בברזל, שהיה 24 שעות, התבסס גם הוא על מודלים דומים שלנו ושל אחרים. עם זאת, בהקשרים מסוימים (בעיקר צביעת ברזל גמיש ובדיקות זוהר תאים), 24 שעות התגלו כמשך טיפול ארוך מדי. במקרים אלו, טיפול שנמשך 24 שעות גרם למוות תאי משמעותי עד שלא ניתן היה להסיק מסקנות בשל הרס החומר התאי. לדוגמה, RSL3 הוא סוכן פרוקסידציה כל כך חזק שמשך טיפול של 12 שעות הספיק כדי לגרום לחמצון ליפידים, תוך שמירה על השפעות עומס הברזל הנראות בו-זמנית (איור 3C-E). בנוסף, עבור צבע הברזל הגמיש, התאים טופלו ב-FAC רק למשך שעתיים לפני הצביעה (לאחר ניסיון לצבוע לאחר טיפולי ברזל של 2, 4 ו-24 שעות) כדי ללכוד את התגובה הראשונית לעומס יתר של הברזל לפני שיכול היה להתרחש הרס תאי יתר (איור 2D). בסך הכל, נראה כי שינויים ברמת הגנים והחלבון נמדדו בצורה הטובה ביותר לאחר 12–24 שעות של טיפול בברזל, ככל הנראה משום ששינויים אלו לוקחים יותר זמן לפעול, בעוד שצביעה הייתה הטובה ביותר לאחר משך טיפול קצר יותר.

אחרים פיתחו מודלים דומים. קבוצה אחת יצרה מודל C2C12 מטופל בברזל ברזל כדי לחקור את תפקיד ציר p53-Slc7a11 בפרופטוזיס. הם מצאו כי טיפול בברזל ברזל במשך 48 שעות הגביר את פרוקסידציית הליפידים והפחית את רמות Slc7a11 , מה שמעיד על פרופטוזיס¹³. מודל דומה נוסף—הפעם השתמש בתאי C2C12 שטופלו בסולפט ברזל לחקר הקשר בין מסלול ליגז האוביקוויטין Akt-FoxO3-E3 לפרופטוזיס—כלל טיפול בברזל במשך 4^{שעות ו-14} שעות. חוט משותף ביניהם הוא שהם כוללים טיפול בברזל בתאי C2C12 שהתמיילו למיוטבובות, במקום להישאר במצב המיובלסטי הדומה לתאי גזע. דבר זה הופך את המערכת שלנו לרלוונטית במיוחד להצטברות הברזל שנצפתה בעבר ב-MuSCs.

למרות שמדובר בגישה פשוטה לחקור את השפעות עומס הברזל על השריר במבחנה, לשיטה יש מגבלות בכך שהיא שימשה רק בהקשר של תאי C2C12. מחקרים קודמים הראו שתאי גזע בשריר רגישים לעומס יתר של ברזל במהלך ההזדקנות, מה שמרמז ששיטה דומה עשויה להיות תקפה^{בהקשר זה}.

ביחד, מודל זה מראה כי עומס הברזל מספיק כדי לגרום לשינויים מולקולריים שניתנים לשחזור הקשורים לפרופטוזיס ולהפחתה רגישה לפרוסטטין בחיוניות בתאי C2C12. בעוד שבדיקות אורתוגונליות נוספות יכולות לחדד עוד יותר את סיווג מוות התאים בהקשרים מסוימים, התגובות המולקולריות והפרמקולוגיות המשולבות שנצפו כאן תואמות את הלחץ התאים הקשור לפרופטוזיס. אנו צופים שגישה זו תסייע במחקרים מכניים של חוסר ויסות ברזל בהזדקנות ומחלות בשריר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Store at -20 °C. Thaw on ice.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Is a neurotoxin. Handle only when wearing appropriate PPE (lab coat, gloves, eye protection).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerizing agent for acrylamide gel casting as a 10% weight/volume solution in sterile water. Powder is room temperature stable, but solution should be stored long-term at -20 °C and short-term at 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Use at a 1:2000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Follow manufacturer's instructions for use. Be advised that standards must be kept at 4 °C after first use.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Use in preparation of Laemmli buffer.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Store at 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Store in the vapor phase of liquid nitrogen.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Store at -20 °C. Thaw on ice.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Since larger, use for extraction of cells from 10 cm and larger dishes.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Since they have a small head, they are best suited for removing cells from multi-well plates.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Use in a fume hood only, and dispose of waste in a separate container.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Dissolve 1 tablet in 500 µL of sterile water to create a 100× solution.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Model version CBS 170-120 V. Use for cell culture.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO is an iron chelator, so adding it to cells decreases iron content. Dissolve in water for a stock concentration of 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Use in labile iron staining and reconstitution.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Prepare stock solution by adding 50 µL DMSO to a room temperatureerature aliquot. Light sensitive. Stock concentration: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequesters lipid peroxidation byproducts, inhibiting ferroptosis in vitro. Dissolve in DMSO for a stock concentration of 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Use to supplement DMEM for C2C12 cell culture. Added at 10% by volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Use in 6x Laemmli buffer prep.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Use to visualize pellet during RNA purification.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Ready to use. Light sensitive. Stock concentration: 10 mM
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Use to quantify western blot band intensity and corrected total cell fluorescence from microscopy images.
Inverted Light Microscope	Zeiss	415510-1100-000	Use in cell culture applications.
Isopropanol, 99.5%, 1 L bottle	Thermo Fisher Scientific	327270010
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate, 10 /cs	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Use in qPCR.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4311971