הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרשנות של וריאנטים קליניים באמצעות ה-Integrative Genomics Viewer (IGV) עבור פתולוגים מולקולריים

134 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71808

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

תוכנת ה-integrative genomics viewer (IGV) מספקת חלון עשיר ואינטואיטיבי לנתונים העומדים בבסיס זיהוי וריאנטים קליניים (clinical variant calling). כאן אנו מציגים חמישה מקרי בוחן המדגימים כיצד לבצע הבחנה מהירה בין אירועים פתוגניים אמיתיים לבין ארטיפקטים, ובסופו של דבר מחזקים את הביטחון האבחנתי של קלינאים העוסקים באישור סופי (sign-out) מולקולרי של בדיקות ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).

תקציר

הצופה הגנומי האינטגרטיבי (IGV) הוא כלי מרכזי בגנומיקה קלינית, המאפשר ויזואליזציה ופרשנות של נתוני רצף מורכבים. שילוב של ידע קליני יחד עם הערכה ויזואלית של תוצאות הרצף הוא האמצעי העיקרי שבאמצעותו פתולוגים מולקולריים ואנשי מקצוע אחרים מעריכים ומסכמים מקרים. מגוון של כלי תוכנה יכולים לסייע, אך יש להבין את הקשר שלהם לנתונים הבסיסיים וליישם אותו באופן שיטתי. מחקר זה כולל רקע חיוני על סוגי קבצי נתונים של רצף הדור הבא (NGS) (למשל, FASTQ, BAM, VCF) תוך דיון בפורמט ובמטרתם. לאחר מכן, אנו מתארים תכונות של IGV המפיקות דקויות מקבצים אלו. אנו משתמשים בסדרה של מקרים מעשיים נבחרים המבוססים על תיאורים קליניים, שדרכם יקיים הקורא אינטראקציה עם נתוני רצף NGS קליניים באמצעות תוכנת IGV כדי לבחון סוגים שונים של וריאנטים רלוונטיים מבחינה קלינית ביחס לגנום האנושי הייחוס. תיאורים קליניים אלו נבחרים כדי לתאר דוגמאות לכמה מהמורכבויות של פרשנות נתונים גנומיים, וכיצד שימוש ב-IGV כחלק מזרימת עבודה שגרתית יכול לספק מידע פרשני נוסף עבור וריאנטים מעבר לקריאות הווריאנטים של אלגוריתמי תוכנה ביו-אינפורמטיים שגרתיים. בדיקה ויזואלית של וריאנטים גנומיים באמצעות הכלים ב-IGV יכולה לחשוף רמזים הקשריים עדינים (כלומר, תדירות אלל של וריאנט, הטיות גדיל, הקשר ספציפי לרקמה) שיכולים להשפיע על הפרשנות של וריאנטים גנומיים. למרות שמחקר זה מתמקד בשימוש ב-IGV לזיהוי ופרשנות של וריאנטים סומטיים, ניתן להשליך את היישומים המסופקים לשימוש בהקשר של Germline, כולל ניתוח של וריאנטים מורכבים וזיהוי של מוזאיקה.

מבוא

הטיפול האונקולוגי עבר טרנספורמציה בשנים האחרונות הודות לשימוש בטכנולוגיות של רצף הדור הבא (NGS) לצורך קביעת אבחנה, פרוגנוזה ובחירת טיפול1. בדיקות NGS הפכו לסטנדרט הטיפולי במספר סוגי גידולים עבור 1) קביעת אבחנה של גידול המוגדר מולקולרית, 2) שימוש בתוצאות של סמנים ביולוגיים שאינם תלויים בסוג הגידול (tumor-type agnostic) לצורך קבלת החלטות טיפוליות, ו-3) קביעת סיווג סיכונים עבור סוגי גידולים ספציפיים2,3. תוצאות מדויקות ובזמן מבדיקות NGS ומבדיקות לסמנים ביולוגיים אחרים הפכו למרכיב קריטי בטיפול ובתיכנון עבור מטופלים באונקולוגיה.

בדיקות NGS מבוצעות בדרך כלל במעבדות ייחוס גדולות או במעבדות אקדמיות/בבתי חולים, כאשר למוסדות יש מומחיות ומשאבים מספיקים לפיתוח ותחזוקה של בדיקות אלו. ארגון ה-Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) נהגה כרשת שיתופית, המתמקדת בשיתוף ידע אקדמי ובעלויות של ריאגנטים4. מאמץ משמעותי של קונסורציום GOAL כלל מפגשי הדרכה עבור רכיבים קריטיים לבדיקה ודיווח של מחקרים קליניים. אלה פותחו כמפגשי הדרכה מעשיים וכוללים סדנה אינטראקטיבית על ה-integrative genomics viewer (IGV) כדי להדגים את תכונותיו הבסיסיות והמתקדמות ברפואה גנומית.

IGV הוא כלי לוויזואליזציה של נתונים שנועד לאפשר למשתמשים לסקור בקלות נתוני NGS ומאגרי נתונים גדולים אחרים, בהינתן שרוב נתוני ה-NGS הם נרחבים ומסורבלים ללא ממשק משתמש גרפי5. IGV לא תוכנן בתחילה לצורך ניתוח וריאנטים קליניים. עם זאת, בשל קלות השימוש בו עבור כל אנשי המקצוע בתחום המולקולרי, ללא קשר לרמת הניסיון שלהם בביואינפורמטיקה, הוא אומץ באופן נרחב על ידי מעבדות רבות כחלק מתהליך סקירת נתונים מורכב6. מחקר זה נבנה כמנגנון להפצת מידע זה לקהילה הרחבה של אנשי מקצוע במעבדות גנומיקה.

הצורך הקליני בשימוש ב-IGV כחלק מזרימת עבודה קלינית כולל זיהוי שגיאות ריצוף, טיפול במורכבויות בזיהוי וריאנטים גנומיים (variant calling), ושינויים חוזרים אחרים שבהם ויזואליזציה נוספת יכולה לסייע בפרשנות נכונה של הנתונים7. השימוש ב-IGV דורש קבצי ביו-אינפורמטיקה סטנדרטיים שמקורם במחקר NGS8. תכונות הליבה של תוכנת ה-IGV מאפשרות ויזואליזציה של נתוני ריצוף ודורשות הגדרה של מערכת העדפות ואפשרויות עבור פרשנות קלינית של וריאנטים (Supplementary File 1).

תהליך העבודה של ריצוף קריאות קצרות מאופיין בתקני קבצים מסוג FASTQ, binary alignment map (BAM), ו-variant call format (VCF). טכנולוגיית NGS משיגה תפוקה גבוהה על ידי יצירה של מיליוני קריאות קצרות במקביל. בעוד שאסטרטגיה זו מאיצה מאוד את הפקת הנתונים, כל קריאה היא רק מקטע מה-DNA או מה-RNA המקוריים. היא מקובעת למיקום מסוים בתא זרימה של NGS באמצעות רצף האדפטור שלה. מידע על הרצף ועל איכות הבסיסים שמתקבל מעיבוד אופטי נרשם בקובצי FASTQ. קריאות גולמיות אלו הן רצפי נוקלאוטידים יחד עם ציוני האיכות לכל בסיס. לכן, שלב מוקדם בעיבוד קריאות גולמיות הוא יישור (alignment) של כל קריאה לגנום ייחוס8. מכיוון שכל קריאה משויכת למיקום ספציפי בגנום הייחוס עם ההסתברות הגבוהה ביותר ליישור, הקריאות המתאימות לאותו מיקום "נערמות" בכל לוקוס, ונתונים אלו נשמרים בקובץ BAM בהתאם למפרטי sequence alignment mapping (SAM) (זמין בכתובת https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; אישור אחרון: 9/30/2025) (איור 1A). ניתן לבחון מידע זה באופן חזותי באמצעות דפדפן גנומי כגון IGV. כפי שמוצג באיור 1B, השוואה בין הקריאות לבינן או לרצף הייחוס עצמו יכולה להצביע על הבדלים או אי-התאמות בין רצפי הנוקלאוטידים. סיכומים של מיקומי "וריאנטים" אלו בלבד לאורך הגנום כולו נאספים לקובץ VCF, שגודלו עשוי להיות קטן בהרבה מקובץ BAM אך עדיין להכיל את מרבית המידע השימושי הנדרש לבחינת הווריאנטים. מסיבה זו, קובץ ה-VCF הוא בדרך כלל הפלט הסופי של צינורות עיבוד לזיהוי וריאנטים (variant-calling pipelines) (איור 1C). לפיכך, בעוד שקבצי FASTQ מכילים את נתוני הקריאות הגולמיות והאיכות, קובץ ה-BAM מספק תובנה לגבי מידת הביטחון שבה קריאות אלו ממופות לגנום, וקובץ ה-VCF מייצג את ההבדלים בין רצף הייחוס לרצף הדגימה, ובכך מספק כמות נתונים ניתנת לניהול בקלות רבה יותר לצורך בחינה לדיווח פוטנציאלי.

שש הווינייטות הקליניות במחקר זה ממחישות תרחישים אנליטיים נפוצים הקשורים לזיהוי וריאנטים סומטיים במעבדות מולקולריות, כמו גם את הבעיות המסבכות את ההבנה והפרשנות הנכונות של הנתונים הבסיסיים. באופן כללי, וינייטות אלו נבחרו כדי להמחיש תרחישי פרשנות מורכבים יותר וכיצד שימוש בתכונות מתקדמות ב-IGV יכול לתאר טוב יותר מאפיינים גנומיים מקיפים. למרות שמחקר זה מתמקד בפרשנות של וריאנטים סומטיים, תכונות אלו ישימות לשימוש ב-IGV לצורך ויזואליזציה ופרשנות של שינויים בקו הנבט (germline)6. ראוי לציין כי המונחים המשמשים במאמר זה מבוססים על כימיה של sequencing-by-synthesis ו,במקומות המתאימים, מונחים/מושגים מקבילים אחרים עבור פלטפורמות אחרות.

כל תיאור מקרה קליני (vignette) נפתח בהקשר קליני קצר מאוד, ולאחריו הנחיות כיצד לחקור את הווריאנט או הווריאנטים ולפתור את השאלה: איזה ווריאנט קיים (אם בכלל) הוא אמיתי ואיזה (אם בכלל) הוא ארטיפקט. ההקשר הקליני, יחד עם פרטי נתוני הריצוף, חשובים למענה על שאלה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנתונים המוצגים כאן הם תערובת של נתוני NGS סימולטיביים ונתונים ממטופלים אמיתיים. עם זאת, כל נתוני המטופלים עברו דה-אידנטיפיקציה באמצעות שילוב של הסרת תוויות והפקה של קריאות מלוכסון בודד (single-locus read extraction). פרוטוקול זה עומד בהנחיות הרלוונטיות של ועדת אתיקה למחקר בבני אדם בכל המוסדות של המחברים.

1. הורדת הגרסה העדכנית ביותר של Integrative Genomics Viewer (IGV)

הערה: IGV היא תוכנה להורדה בחינם להדמיה של גנומים שונים, כולל הגנום האנושי (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV מתעדכנת מעת לעת כדי לכלול גרסאות חדשות של תמלילים, מאפיינים ומסלולים (tracks), כאשר הגרסה העדכנית ביותר מופיעה בדרך כלל בראש הרשימה.

  1. הורידו לשולחן העבודה את הקובץ הזמין בכתובת ה-URL לעיל, ששמו 'IGV for Windows, Java Included'; פעולה זו עשויה לדרוש הרשאות מנהל, בהתאם למוסד.
  2. בחרו את גרסת בניית הגנום האנושי המתוכננת לשליפה מהדוחות (למשל, hg19 או hg38), המארח בתוך IGV.
    הערה: מחקר זה השתמש ב-IGV 2.19.7. בפרוטוקול זה, הורדה גרסת Windows הכוללת את Java. תוכנת IGV הופעלה עם הקצאת זיכרון ברירת מחדל של 8Gb of RAM. ההגדרות המומלצות בלשונית ההעדפות של IGV ובסעיפים אחרים ב-IGV מתועדות ב-Supplementary File 1.

2. הבנת התיאורים הקליניים והורדת הקבצים הדרושים

  1. גשו למאגר ה-GitHub: כל הקבצים זמינים להורדה במאגר ה-GitHub בכתובת https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
    הערה: עבור כל דוגמה (vignette) קיים קובץ סשן (session file) במאגר ה-GitHub; טעינת קובץ סשן זה מבטלת את הצורך לטעון קבצים בנפרד ולנווט ללוכוס (locus) הרלוונטי, מכיוון שקובץ הסשן מבצע שלבים אלו באופן אוטומטי.
  2. טענו קובץ סשן דרך תפריט הקבצים. לחצו על File > Open Session, ובחרו את קובץ הסשן המתאים.

3. הגדרת עקבת הכיסוי

הערה: ב-IGV, החלון הראשי כולל "coverage track" (מסלול כיסוי). בהקשרים מסוימים, אפילו שבריר קטן של קריאות המכילות וריאנטים סרטניים ספציפיים עשוי להיות בעל משמעות קלינית. בשל כך, השגת עומק קריאה גבוה מאוד באזורי הגנום הנבדקים היא קריטית. אם רק 2% מהקריאות מכילות וריאנט נתון, עשוי להידרש עומק קריאה של מאות או אלפי קריאות כדי לזהות את הווריאנט באופן משכנע – ומכאן המונח "deep sequencing" (ריצוף עמוק).

  1. ודאו שפס הכיסוי (coverage track) מוצג: מהתפריט העליון, לחצו על View > Preferences, ובחרו בלשונית Alignments. בחלק העליון של הלשונית מופיעה תיבה המסומנת כ- 'Show coverage track'. ודאו שהיא מסומנת.
  2. הגדרת סף משמעותי קלינית לווריאנט ברמה נמוכה: נווטו ללשונית Alignments כפי שפורט בשלב 3.1 וגללו למטה עד להופעת התיבה המסומנת כ- Coverage allele-fraction. הגדירו את המספר בתיבה ל-0.01 ולחצו על Save (חלון ההגדרות אמור להיסגר לאחר הלחיצה על Save).

4. הגדרה של קריאות עם soft-clipping

הערה: הגדרה זו היא בעלת ערך רב לזיהוי וריאנטים מבניים גדולים יותר, כגון ארגוני מחדש של גנים, שינויים במספר העותקים, או אירועי הכנסה-מחיקה (insertion–deletion) משולבים. דוגמאות מתקדמות — כגון אלו המתמקדות בהגברות ומחיקות של EGFR — מדגימות כיצד קריאות עם soft-clipped יכולות לאשש את נוכחותם של וריאנטים מבניים שעלולים להתפספס בשיטות סטנדרטיות לקריאת וריאנטים (variant calling).

  1. הפעלת soft-clips: מהתפריט העליון, לחץ על View > Preferences, ובחר בלשונית Alignments. גלול למטה לתיבה Show soft-clipped bases וודא שהיא מסומנת (Supplementary File 1) כדי לחשוף קריאות המיושרות חלקית—אלו שקצוותיהן אינן ממופות באופן נקי לרפרנס ו"נחתכות" ("clipped") החוצה.

5. תיאורי מקרה קליניים

  1. מקרה בוחן מס' 1: הבחנה בין וריאנט פתוגני אמיתי ב- KRAS (הומולוג של אונקוגן נגיף הסרקומה של חולדת קירסטן) לבין ארטיפקט של ריצוף.
    הערה: מקרה A עוסק בגבר בן 65 המאובחן עם אדנוקרצינומה של הריאה, כאשר הערכה היסטולוגית העריכה כ-80% גידול. פרופיל NGS זיהה וריאנט KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), המהווה מוטציית מניעה (driver mutation) ידועה בסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC). וריאנט missense התוצאה KRAS c.34G>T (p.G12C) מופיע בכ-13% מאדנוקרצינומות של הריאה ומקנה זכאות לטיפולים ממוקדים9. מקרה B עוסק באישה בת 54 עם סרקומה ידועה (הערכה של 50% גידול ו-50% רקמה נורמלית). הווריאנט הזהה KRAS c.34G>T (p.G12C) זוהה בדגימה זו. עם זאת, מכיוון ש-KRAS c.34G>T (p.G12C) מדווח לעיתים רחוקות בסרקומה, נוכחותו מעוררת חשד לארטיפקט ריצוף אפשרי. 
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏KRAS.xml)             
      1. טעינת נתונים: בחרו Hg19 בתפריט הנפתח של הגנום וטענו את קובץ ה-bam,‏ kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, ונווטו אל chr12:25,398,281–25,403,833 כדי להתמקד באזור הגן KRAS. שימו לב שקובץ האינדקס (שם זהה לקובץ ה-bam, אך מסתיים ב-.bai) חייב להיות באותה ספריה של קובץ ה-bam.  
      2. בדיקת כיסוי ו-VAF: סקרו את קודון 12 באקסון 2 (NM_004985.5) ולחצו על מיקום הווריאנט במסלול הכיסוי כדי להציג את עומק הקריאה במיקום זה. שימו לב להחלפה של G→T (אירוע transversion), עם VAF של 35%–40%, התואם מאוד למוטציית מניעה קלונלית והטרוזיגוטית (איור 2A), במיוחד בהקשר של צפיפות תאים גידוליים של כ-80%.   
      3. חיפוש הטיות גדיל (StrandBias): הגדירו קידוד צבעים לפי גדיל (ראו קובץ משלים 1, שלב 4) כדי לחשוף התפלגות של כמעט 50:50 בין גדיל קדמי (אדום) לגדיל הפוך (כחול) בדגימת הריאה.  
      4. חזרו על שלבים 5.1.1.1–5.1.1.3 עבור מקרה B, דגימת הסרקומה: טענו את קובץ ה-bam,‏ kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, ושימו לב ל-VAF של <1% ותמיכה כמעט בלעדית בגדיל הקדמי, המצביעים על ארטיפקט של PCR/alignment (איור 2B).
  2. מקרה בוחן מס' 2: פתרון סיווג שגוי של וריאנט רב-נוקלאוטידי (MNV).
    הערה: אישה בת 50 עם מלנומה גרורתית עוברת פרופיל גידול מבוסס NGS. הניתוח מזהה מוטציה פוטנציאלית ב- BRAF (פרוטו-אונקוגן B-Raf, סרין/תראונין קינאז) c.1798_1799delinsAA. בעוד ש- BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) נפוץ יותר בגידולים סולידיים שונים, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) ספציפי יחסית למלנומה, שכן אור UV יכול להשרות מעברים של C > T בתוך די-פירימידינים10. לפי כללי HGVS, שני וריאנטים של נוקלאוטיד בודד (SNVs) ב- cis צריכים להיקרא כ-MNV יחיד. במקרים רבים, צינור עיבוד ביו-אינפורמטיקה עלול לזהות באופן שגוי וריאנט מורכב זה כשני SNVs סמוכים in cis: BRAF c.1798G>A ו- BRAF c.1799T>A. מכיוון שישנם שיקולים טכניים (כלומר, הקשורים ל-variant caller) וביולוגיים (הבחנה בין cis ל- trans), קיים חשש שהמוטציה תדווח באופן שגוי בעת חתימת הדוח, אלא אם תבוצע ויזואליזציה של הנתונים במהלך הביקורת הקלינית.      
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏BRAF.xml)           
      1. טעינת נתונים: בחרו Hg38 בתפריט הנפתח של הגנום וטענו את קובץ ה-bam,‏ kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, ונווטו אל chr7:140,453,136–140,753,336. שימו לב שקובץ האינדקס (שם זהה לקובץ ה-bam, אך מסתיים ב-.bai) חייב להיות באותה ספריה של קובץ ה-bam.
      2. הגדלה (Zoom in) של קודון 600 ב- BRAF: שימו לב לשינוי די-נוקלאוטידי GT→AA בהתבסס על מיקומי מסלול כיסוי סמוכים שהם ירוקים וכחולים ולא אפורים, מה שמתיישב עם p.V600K. 
      3. סריקה עבור שני SNVs בודדים כדי לקבוע אם הם ב- cis או ב- trans: שימו לב ששני ה-SNVs ממופים לאותן קריאות והם ב- cis.  
      4. בדיקת גדיל וכיסוי: הגדירו קידוד צבעים לקריאות כדי להראות תמיכה שווה בקירוב בין גדיל קדמי להפוך (ראו קובץ משלים 1, שלב 4), ו-VAF העולה על 50% התואם למניעה קלונלית. סף של 0.01 במסלול הכיסוי (ראו קובץ משלים 1, שלב 3 להגדרה) מבטיח שסוב-קלונים חלקיים (אם קיימים) יישארו גלויים (איור 2C).  
      5. שימו לב להקשר ולנומנקלטורה של MNV: שני שינויי הנוקלאוטידים סמוכים זה לזה. בהתבסס על קונצנזוס מומחים, הגדירו SNVs במרחק של עד 50 bp הממופים לאותה קריאת רצף כווריאנט "מורכב" או "delins" יחיד11. 
  3. מקרה בוחן מס' 3: בדיקת אינסרציה באקסון 9 של KIT (פרוטו-אונקוגן KIT, קולטן טירוזין קינאז) בגידול סטרומלי של מערכת העיכול (GIST)
    הערה: מטופל גבר בן 58 עם גידול סטרומלי של מערכת העיכול עובר כריתה, והוזמנה בדיקת NGS. התוצאות מראות וריאנט אפשרי ב- KIT. מוטציות ב- KIT הן גורם מניעה שכיח ב-GISTs, המופיעות בכ-75% מהמקרים, והן ניתנות לטיפול ממוקד. אחרי מוטציות מאקטיוating באקסון 11, מוטציות מאקטיוating באקסון 9 של KIT הן גורמי המניעה הנפוצים ביותר שזוהו, אם כי GISTs עם מוטציה באקסון 9 ו-GISTs עם מוטציה באקסון 11 מתנהגים באופן שונה ביחס לרגישות למעכבי טירוזין קינאז12. 
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏KIT.xml)
      1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19 וטענו את קובץ ה-BAM,‏ KITdupmod2.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה. נווטו אל chr4:55,592,144-55,592,257, התואם לחלק מאקסון 9 של הגן KIT.
      2. דחיסת התצוגה: לחצו קליק ימני על מסלול ה-alignment ובחרו  Squished כדי לדחוס את התצוגה (איור 3A).
      3. איתור האינסרציה: זהו את סימון האינסרציה, בצורת ראש חץ, מיד מעל מסלול הכיסוי, הממוקם בין מיקומים 55,592,178 ל-55,592,179, המצביע על אינסרציה קצרה (איור 3B,C).
      4. אינטראקציה עם האינסרציה: לחצו על ראש החץ כדי להרחיב את התצוגה ולחצו על אחת הקריאות עם בסיסים הממלאים את הפער כדי לצפות בפרטים בחלון קופץ. השוו את הרצף שהוכנס לרצף הייחוס כדי לקבוע אם זו כפלה (duplication) (איור 3D,E).
      5. בדיקת הכיסוי: לחצו על מסלול הכיסוי הסמוך מיד לראש חץ האינסרציה כדי להציג את מספר הקריאות התומכות, אותן ניתן להשוות למספר הקריאות הכולל כדי לקבוע את תדירות האלל הווריאנטית (VAF) המשוערת, במקרה זה כ-28%.
      6. בדיקה להטיות גדיל: מיינו את הקריאות לפי גדיל וצפו בבסיסים שנקצצו (soft-clipped) (ראו קובץ משלים 1, סעיף 3) כדי להראות אזור עניין סמוך לאינסרציה בקריאות ההפוכות (איור 3F).
  4. מקרה בוחן מס' 4: בדיקת מחיקה (deletion) באקסון 19 של EGFR (קולטן גורם גדילה אפידרמלי) בסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC).
    הערה: אישה בת 70 עם NSCLC שdiagnostic נחשף לאחרונה עוברת כריתה כירורגית של המסה. NGS הוזמן על נתח רקמה בעל טוהר גידולי מספיק, והתוצאות מראות וריאנט אפשרי ב- EGFR. מוטציות רבות ב- EGFR רגישות למעכבי טירוזין קינאז, ווריאנט זה עשוי להשפיע על הטיפול והפרוגנוזה של המטופלת13.
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏EGFR.xml)
      1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19, טענו את קובץ ה-bam‏ EGFRE746_A750delmod.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה, ונווטו אל chr7:55,242,420-55,242,513, התואם לחלק מאקסון 19 של הגן EGFR.
      2. בדיקת המחיקה באמצעות מסלול הכיסוי: סקרו את מסלול הכיסוי כדי לזהות אזור קטן של כיסוי נמוך שאינו ממוקם בקצוות הקריאות (איור 4A,B). בדיקה של מסלול הכיסוי מראה כיסוי נמוך על חלק קטן מאקסון 19.
      3. בדיקת המחיקה באמצעות הקריאות: הרחיבו את תצוגת ה-alignment כדי להראות קריאות עם פער יישור, המיוצג כקו שחור בתוך הקריאה (איור 4C,D).
      4. שקילת ההקשר הגנומי: בדקו את רצף הנוקלאוטידים של הייחוס המעורב ובסביבה המיידית של המחיקה. העריכו את קריאת המחיקה בהקשר של המיקום בתוך רצף הייחוס, שכן מחיקות באזורי הומופולימר או באזורים חוזרים עשויות לייצג ארטיפקט ריצוף, במיוחד כאשר הן מופיעות בתדירות אלל וריאנטית (VAF) נמוכה. ראו את חלק ה- צפייה במחיקה קטנה ב- קובץ משלים 2 לתיאור מפורט של תהליך העבודה.
  5. מקרה בוחן מס' 5: בדיקת שינויים ב- EGFR במטופל עם גליובלסטומה.
    הערה: אישה בת 77 עם גליובלסטומה מסוג IDH wild-type עוברת בדיקת ריצוף מהדור הבא (NGS). תוצאותיה מצביעות על הגברה פוטנציאלית של מספר העתקים של EGFR וסידור מחדש (rearrangement) פוטנציאלי של EGFRvIII (מחיקה של אקסונים 2–7). הן להגברת EGFR והן לשינויי EGFRvIII יש משמעות פרוגנוסטית וטיפולית בגליובלסטומה. בנוסף, שני שינויים אלה מופיעים לעיתים קרובות יחד, מה שאומר שנוכחותו של אחד עשויה לתמוך בתקינות של השני כאשר הוא מזוהה ברמות נמוכות.
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏copynumber.xml):
      1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg38, טענו את קובץ הסגמנטים, proband.seg, ואת דגימות ההשוואה, c1.seg-c9.seg, על ידי גרירה והשלכה לחלון ה-IGV. נווטו ל-Chr7.
        הערה: קובצי הסגמנטציה שנוצרו מ-CNVKit מסופקים להורדה. תהליך העבודה המלא לשימוש ב-CNVKit ליצירת כימות מספר העתקים הוא מחוץ להיקף מחקר זה. עם זאת, בקצרה, נעשה שימוש ב-CNVKit גרסה 0.9.9 (זמינה להורדה מ-https://github.com/etal/cnvkit) עם ייחוס מאוחד מוכן מראש המורכב מדגימות נורמליות אופלואידיות. הקלט מורכב מקובץ bed המכיל 9,144 מיקומי גששים של שלד CNV, המפוזרים ברחבי הגנום. שיקול חשוב כאן הוא שהפרטים של קלטי צינור עיבוד מספר העתקים והפרמטרים פחות חשובים מהעובדה שהדגימות מעובדות באמצעות הגדרה הזהה עבור כל הדגימות בהרצה. הדבר מקל על זיהוי הטיות סיסטמיות.
      2. הערכת מפת החום (heatmap): השוו את עוצמת הצבע היחסית בין הדגימה המדוברת (אתרו את שורת מפת החום התואמת לדגימה זו, המסומנת כ- proband) לבין דגימות אחרות (c1-9) כדי להבחין בין שינויים אמיתיים במספר העתקים לבין ארטיפקטים.
        הערה: השוואה ויזואלית אנכית של לוקוס בכל הדגימות היא האמצעי לזיהוי חריגות (הבדלים איכותיים המבוססים על הבדלי צבע בין שורות ולא הבדלים כמותיים) בלוקוס נתון בכל דגימה ביחס לרקע. עיינו ב- איור 5 ובסעיף צפייה בשינויים במספר העתקים של קובץ משלים 2 לשלבים מפורטים.
  6. מקרה בוחן מס' 6: בדיקת EGFRvIII במטופל עם גליובלסטומה.
    הערה: לאותה מטופלת יש גם עדות לסידור מחדש של EGFRvIII (מחיקה של אקסונים 2–7). הן להגברת EGFR והן לשינויי EGFRvIII יש משמעות פרוגנוסטית וטיפולית בגליובלסטומה. בנוסף, שני שינויים אלה מופיעים לעיתים קרובות יogether, מה שאומר שנוכחותו של אחד עשויה לתמוך בתקינות של השני כאשר הוא מזוהה ברמות נמוכות.
    1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏egfr_vIII.xml):
      1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19, טענו את קובץ ה-bam של המטופלת, proband.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה, ונווטו לגן EGFR.
      2. ויזואליזציה של נקודות שבירה (breakpoints) של EGFRvIII: התאימו את התצוגה כדי לבחון נקודות שבירה מועמדות באופן אינדיבידואלי (במעלה אקסון 2 ובמורד אקסון 7 עבור EGFRvIII), ובצעו 'מיון לפי בסיס' (sort-by-base)  (או השתמשו בקיצור  Ctrl-s בווינדוס/לינוקס או  Cmd-s במאק) בנקודות השבירה כדי להציג הצטברויות (pileups) של קריאות עם soft-clip.
      3. יישור קריאות ב-BLAT: לחצו קליק ימני על רצף עם soft-clip ובחרו  BLAT sequence (IGV משתמש בברירות המחדל של UCSC, ראו https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html עבור פרמטרי ברירת מחדל של BLAT). לחצו על השורה הראשונה וצפו ב- Blat track המופיע בתחתית סעיף מסלולי ה-IGV.
        הערה: אפילו קריאה בודדת המיושרת לצומת של אקסון 1/אינטרון 1 ולצומת של אינטרון 6/אקסון 7 עשויה להוות ראיה מספיקה ל- EGFRvIII, כל עוד נשללה זיהום צולב מדגימה אחרת כסיבה לקריאה זו. עיינו ב- איור 6 ובסעיף צפייה בסידור מחדש מבני של קובץ משלים 2 לשלבים מפורטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ראוי לציין כי מחקר זה מתמקד בתיאור הדקויות של סקירת וריאנטים ב-IGV לצורך דיווח קליני. הדיווח הקליני הסופי צריך להישען על ה-pipeline המהומק, קריטריוני האיכות ומדיניות הדיווח של כל מעבדה בנפרד. דיון מלא בנושא חשוב זה חורג מהיקפו של המחקר הנוכחי; עם זאת, סטנדרטים והנחיות מומלצים גובשו על ידי ה-American College of Medical Genetics and Genomics וה-Association for Molecular Pathology7, והם מיושמים באופן שוטף במעבדות קליניות.

פירוש מקרה קליני (Clinical Vignette) מס' 1:...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סקירה מדויקת של וריאנטים לצורך דיווח קליני תלויה באלגוריתמים ביו-אינפורמטיים מורכבים ובשילוב של סקירה ויזואלית של וריאנטים מורכבים באמצעות IGV5,6. מחקר זה תוכנן כדי לרכז משאב תמציתי של הגדרות מומלצות להצגה ויזואלית של שינויים גנומיים פשוטים ומורכבים ב-IGV (Supplementary File 1). מחקר זה מתמקד בשינויים סומטיים נפוצים ובאופן הסקירה שלהם ב-IGV.

הפרוטוקול מתחיל בהערכה של מוטציית החלפה פשוטה (איור 2A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו אסירי תודה לכל מפתחי תוכנת ה-IGV וכן למענק ה-NIH המממן כעת את פיתוח ה-IGV: U24CA258406. לא התקבל מימון עבור פיתוח מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BLATחיפוש BLAT בגנוםhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatדף אינטרנט עצמאי של BLAT. ממשק ה-API של BLAT זמין בתוך IGV, ללא צורך בהתקנה נוספת
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitמאגר gitHub ציבורי עם CNVKit להורדה בחינם. הוראות להורדה/הרצה של CNVKit זמינות כאן גם כן.
קובץ מקטעים להשוואה #1 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #2 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #3 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #4 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #5 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #6 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #7 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #8 עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segקבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה עבור ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segקבצי מספר העתקים
רצף הגנום האנושירצף הגנום האנושיhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzקובץ fasta להורדה המכיל את גרסת הגנום האנושי Hg38.  קובץ זה זמין בתוך IGV, ללא צורך בהורדה נוספת
רצף הגנום האנושירצף הגנום האנושיhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzקובץ fasta להורדה המכיל את גרסת הגנום האנושי Hg19. קובץ זה זמין בתוך IGV, ללא צורך בהורדה נוספת
חבילת תוכנת IGVתוכנת IGVhttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeתוכנת IGV גרסה 2.19.7 עם Java (JDK 21), להורדה בחינם. הקישור כאן הוא עבור windows, אם כי קיימים קישורים גם עבור Linux ו-Mac.
קובץ מקטעים עבור מקרה ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segקבצי מספר העתקים
מאגר GitHub של המדריךGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainמאגר GitHub ציבורי עם כל הקבצים הדרושים לשחזור ששת הוויניאטות
ויניאטה #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlקבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #1 מקרה AGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #1 מקרה AGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		קבצי יישור
אינדקס bai עבור ויניאטה #1 מקרה BGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #1 מקרה BGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		קבצי יישור
ויניאטה #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlקבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #2 GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #2 GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		קבצי יישור
ויניאטה #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlקבצי סשן
קובץ אינדקס bai עבור ויניאטה #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiקבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamקבצי יישור
ויניאטה #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlקבצי סשן
קובץ יישור עבור ויניאטה #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamקבצי יישור
אינדקס bai עבור ויניאטה #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiקבצי יישור
ויניאטה #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlקבצי סשן
ויניאטה #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlקבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiקבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamקבצי יישור

מקורות

  1. Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
  2. Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
  3. Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
  4. Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
  5. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
  6. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
  7. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
  8. Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
  9. Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
  10. Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
  11. Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
  12. Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
  13. Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
  14. Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
  15. Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
  16. Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
  17. Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ריצוף מהדור הבאויזואליזציה של נתוני ריצוףזיהוי וריאנטים גנומייםאנליזה של וריאנטים סומטייםפורמט קובץ VCFפורמט קובץ BAMתדירות אלל של וריאנט

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.