פרשנות של וריאנטים קליניים באמצעות ה-Integrative Genomics Viewer (IGV) עבור פתולוגים מולקולריים

Eitan Halper-Stromberg; Suguna Narayan; Vincent Laufer; Melvin Limson; Tracy Busse; Jeremy P. Segal; Dara L. Aisner; Jennifer J.D. Morrissette; Helga Thorvaldsdottir; James T. Robinson; Somak Roy; Melissa Y. Tjota

doi:10.3791/71808

מאמר שיטה

פרשנות של וריאנטים קליניים באמצעות ה-Integrative Genomics Viewer (IGV) עבור פתולוגים מולקולריים

DOI:

10.3791/71808

⸱

14 באוגוסט 2026

Eitan Halper-Stromberg^*¹ , Suguna Narayan^*² , Vincent Laufer^*² , Melvin Limson³ , Tracy Busse³ , Jeremy P. Segal⁴ , Dara L. Aisner⁵ , Jennifer J.D. Morrissette⁶ , Helga Thorvaldsdottir⁷ , James T. Robinson⁸ , Somak Roy⁹ , Melissa Y. Tjota⁴

¹University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, ²University of Michigan, Department of Pathology, ³Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), ⁴University of Chicago, Department of Pathology, ⁵University of Colorado, Department of Pathology, ⁶University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, ⁷Broad Institute of MIT and Harvard, ⁸University of California San Diego, Department of Medicine, ⁹Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוכנת ה-integrative genomics viewer (IGV) מספקת חלון עשיר ואינטואיטיבי לנתונים העומדים בבסיס זיהוי וריאנטים קליניים (clinical variant calling). כאן אנו מציגים חמישה מקרי בוחן המדגימים כיצד לבצע הבחנה מהירה בין אירועים פתוגניים אמיתיים לבין ארטיפקטים, ובסופו של דבר מחזקים את הביטחון האבחנתי של קלינאים העוסקים באישור סופי (sign-out) מולקולרי של בדיקות ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצופה הגנומי האינטגרטיבי (IGV) הוא כלי מרכזי בגנומיקה קלינית, המאפשר ויזואליזציה ופרשנות של נתוני רצף מורכבים. שילוב של ידע קליני יחד עם הערכה ויזואלית של תוצאות הרצף הוא האמצעי העיקרי שבאמצעותו פתולוגים מולקולריים ואנשי מקצוע אחרים מעריכים ומסכמים מקרים. מגוון של כלי תוכנה יכולים לסייע, אך יש להבין את הקשר שלהם לנתונים הבסיסיים וליישם אותו באופן שיטתי. מחקר זה כולל רקע חיוני על סוגי קבצי נתונים של רצף הדור הבא (NGS) (למשל, FASTQ, BAM, VCF) תוך דיון בפורמט ובמטרתם. לאחר מכן, אנו מתארים תכונות של IGV המפיקות דקויות מקבצים אלו. אנו משתמשים בסדרה של מקרים מעשיים נבחרים המבוססים על תיאורים קליניים, שדרכם יקיים הקורא אינטראקציה עם נתוני רצף NGS קליניים באמצעות תוכנת IGV כדי לבחון סוגים שונים של וריאנטים רלוונטיים מבחינה קלינית ביחס לגנום האנושי הייחוס. תיאורים קליניים אלו נבחרים כדי לתאר דוגמאות לכמה מהמורכבויות של פרשנות נתונים גנומיים, וכיצד שימוש ב-IGV כחלק מזרימת עבודה שגרתית יכול לספק מידע פרשני נוסף עבור וריאנטים מעבר לקריאות הווריאנטים של אלגוריתמי תוכנה ביו-אינפורמטיים שגרתיים. בדיקה ויזואלית של וריאנטים גנומיים באמצעות הכלים ב-IGV יכולה לחשוף רמזים הקשריים עדינים (כלומר, תדירות אלל של וריאנט, הטיות גדיל, הקשר ספציפי לרקמה) שיכולים להשפיע על הפרשנות של וריאנטים גנומיים. למרות שמחקר זה מתמקד בשימוש ב-IGV לזיהוי ופרשנות של וריאנטים סומטיים, ניתן להשליך את היישומים המסופקים לשימוש בהקשר של Germline, כולל ניתוח של וריאנטים מורכבים וזיהוי של מוזאיקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול האונקולוגי עבר טרנספורמציה בשנים האחרונות הודות לשימוש בטכנולוגיות של רצף הדור הבא (NGS) לצורך קביעת אבחנה, פרוגנוזה ובחירת טיפול¹. בדיקות NGS הפכו לסטנדרט הטיפולי במספר סוגי גידולים עבור 1) קביעת אבחנה של גידול המוגדר מולקולרית, 2) שימוש בתוצאות של סמנים ביולוגיים שאינם תלויים בסוג הגידול (tumor-type agnostic) לצורך קבלת החלטות טיפוליות, ו-3) קביעת סיווג סיכונים עבור סוגי גידולים ספציפיים²^,³. תוצאות מדויקות ובזמן מבדיקות NGS ומבדיקות לסמנים ביולוגיים אחרים הפכו למרכיב קריטי בטיפול ובתיכנון עבור מטופלים באונקולוגיה.

בדיקות NGS מבוצעות בדרך כלל במעבדות ייחוס גדולות או במעבדות אקדמיות/בבתי חולים, כאשר למוסדות יש מומחיות ומשאבים מספיקים לפיתוח ותחזוקה של בדיקות אלו. ארגון ה-Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) נהגה כרשת שיתופית, המתמקדת בשיתוף ידע אקדמי ובעלויות של ריאגנטים⁴. מאמץ משמעותי של קונסורציום GOAL כלל מפגשי הדרכה עבור רכיבים קריטיים לבדיקה ודיווח של מחקרים קליניים. אלה פותחו כמפגשי הדרכה מעשיים וכוללים סדנה אינטראקטיבית על ה-integrative genomics viewer (IGV) כדי להדגים את תכונותיו הבסיסיות והמתקדמות ברפואה גנומית.

IGV הוא כלי לוויזואליזציה של נתונים שנועד לאפשר למשתמשים לסקור בקלות נתוני NGS ומאגרי נתונים גדולים אחרים, בהינתן שרוב נתוני ה-NGS הם נרחבים ומסורבלים ללא ממשק משתמש גרפי⁵. IGV לא תוכנן בתחילה לצורך ניתוח וריאנטים קליניים. עם זאת, בשל קלות השימוש בו עבור כל אנשי המקצוע בתחום המולקולרי, ללא קשר לרמת הניסיון שלהם בביואינפורמטיקה, הוא אומץ באופן נרחב על ידי מעבדות רבות כחלק מתהליך סקירת נתונים מורכב⁶. מחקר זה נבנה כמנגנון להפצת מידע זה לקהילה הרחבה של אנשי מקצוע במעבדות גנומיקה.

הצורך הקליני בשימוש ב-IGV כחלק מזרימת עבודה קלינית כולל זיהוי שגיאות ריצוף, טיפול במורכבויות בזיהוי וריאנטים גנומיים (variant calling), ושינויים חוזרים אחרים שבהם ויזואליזציה נוספת יכולה לסייע בפרשנות נכונה של הנתונים⁷. השימוש ב-IGV דורש קבצי ביו-אינפורמטיקה סטנדרטיים שמקורם במחקר NGS⁸. תכונות הליבה של תוכנת ה-IGV מאפשרות ויזואליזציה של נתוני ריצוף ודורשות הגדרה של מערכת העדפות ואפשרויות עבור פרשנות קלינית של וריאנטים (Supplementary File 1).

תהליך העבודה של ריצוף קריאות קצרות מאופיין בתקני קבצים מסוג FASTQ, binary alignment map (BAM), ו-variant call format (VCF). טכנולוגיית NGS משיגה תפוקה גבוהה על ידי יצירה של מיליוני קריאות קצרות במקביל. בעוד שאסטרטגיה זו מאיצה מאוד את הפקת הנתונים, כל קריאה היא רק מקטע מה-DNA או מה-RNA המקוריים. היא מקובעת למיקום מסוים בתא זרימה של NGS באמצעות רצף האדפטור שלה. מידע על הרצף ועל איכות הבסיסים שמתקבל מעיבוד אופטי נרשם בקובצי FASTQ. קריאות גולמיות אלו הן רצפי נוקלאוטידים יחד עם ציוני האיכות לכל בסיס. לכן, שלב מוקדם בעיבוד קריאות גולמיות הוא יישור (alignment) של כל קריאה לגנום ייחוס⁸. מכיוון שכל קריאה משויכת למיקום ספציפי בגנום הייחוס עם ההסתברות הגבוהה ביותר ליישור, הקריאות המתאימות לאותו מיקום "נערמות" בכל לוקוס, ונתונים אלו נשמרים בקובץ BAM בהתאם למפרטי sequence alignment mapping (SAM) (זמין בכתובת https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; אישור אחרון: 9/30/2025) (איור 1A). ניתן לבחון מידע זה באופן חזותי באמצעות דפדפן גנומי כגון IGV. כפי שמוצג באיור 1B, השוואה בין הקריאות לבינן או לרצף הייחוס עצמו יכולה להצביע על הבדלים או אי-התאמות בין רצפי הנוקלאוטידים. סיכומים של מיקומי "וריאנטים" אלו בלבד לאורך הגנום כולו נאספים לקובץ VCF, שגודלו עשוי להיות קטן בהרבה מקובץ BAM אך עדיין להכיל את מרבית המידע השימושי הנדרש לבחינת הווריאנטים. מסיבה זו, קובץ ה-VCF הוא בדרך כלל הפלט הסופי של צינורות עיבוד לזיהוי וריאנטים (variant-calling pipelines) (איור 1C). לפיכך, בעוד שקבצי FASTQ מכילים את נתוני הקריאות הגולמיות והאיכות, קובץ ה-BAM מספק תובנה לגבי מידת הביטחון שבה קריאות אלו ממופות לגנום, וקובץ ה-VCF מייצג את ההבדלים בין רצף הייחוס לרצף הדגימה, ובכך מספק כמות נתונים ניתנת לניהול בקלות רבה יותר לצורך בחינה לדיווח פוטנציאלי.

שש הווינייטות הקליניות במחקר זה ממחישות תרחישים אנליטיים נפוצים הקשורים לזיהוי וריאנטים סומטיים במעבדות מולקולריות, כמו גם את הבעיות המסבכות את ההבנה והפרשנות הנכונות של הנתונים הבסיסיים. באופן כללי, וינייטות אלו נבחרו כדי להמחיש תרחישי פרשנות מורכבים יותר וכיצד שימוש בתכונות מתקדמות ב-IGV יכול לתאר טוב יותר מאפיינים גנומיים מקיפים. למרות שמחקר זה מתמקד בפרשנות של וריאנטים סומטיים, תכונות אלו ישימות לשימוש ב-IGV לצורך ויזואליזציה ופרשנות של שינויים בקו הנבט (germline)⁶. ראוי לציין כי המונחים המשמשים במאמר זה מבוססים על כימיה של sequencing-by-synthesis ו,במקומות המתאימים, מונחים/מושגים מקבילים אחרים עבור פלטפורמות אחרות.

כל תיאור מקרה קליני (vignette) נפתח בהקשר קליני קצר מאוד, ולאחריו הנחיות כיצד לחקור את הווריאנט או הווריאנטים ולפתור את השאלה: איזה ווריאנט קיים (אם בכלל) הוא אמיתי ואיזה (אם בכלל) הוא ארטיפקט. ההקשר הקליני, יחד עם פרטי נתוני הריצוף, חשובים למענה על שאלה זו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנתונים המוצגים כאן הם תערובת של נתוני NGS סימולטיביים ונתונים ממטופלים אמיתיים. עם זאת, כל נתוני המטופלים עברו דה-אידנטיפיקציה באמצעות שילוב של הסרת תוויות והפקה של קריאות מלוכסון בודד (single-locus read extraction). פרוטוקול זה עומד בהנחיות הרלוונטיות של ועדת אתיקה למחקר בבני אדם בכל המוסדות של המחברים.

1. הורדת הגרסה העדכנית ביותר של Integrative Genomics Viewer (IGV)

הערה: IGV היא תוכנה להורדה בחינם להדמיה של גנומים שונים, כולל הגנום האנושי (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV מתעדכנת מעת לעת כדי לכלול גרסאות חדשות של תמלילים, מאפיינים ומסלולים (tracks), כאשר הגרסה העדכנית ביותר מופיעה בדרך כלל בראש הרשימה.

הורידו לשולחן העבודה את הקובץ הזמין בכתובת ה-URL לעיל, ששמו 'IGV for Windows, Java Included'; פעולה זו עשויה לדרוש הרשאות מנהל, בהתאם למוסד.
בחרו את גרסת בניית הגנום האנושי המתוכננת לשליפה מהדוחות (למשל, hg19 או hg38), המארח בתוך IGV.
הערה: מחקר זה השתמש ב-IGV 2.19.7. בפרוטוקול זה, הורדה גרסת Windows הכוללת את Java. תוכנת IGV הופעלה עם הקצאת זיכרון ברירת מחדל של 8Gb of RAM. ההגדרות המומלצות בלשונית ההעדפות של IGV ובסעיפים אחרים ב-IGV מתועדות ב-Supplementary File 1.

2. הבנת התיאורים הקליניים והורדת הקבצים הדרושים

גשו למאגר ה-GitHub: כל הקבצים זמינים להורדה במאגר ה-GitHub בכתובת https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
הערה: עבור כל דוגמה (vignette) קיים קובץ סשן (session file) במאגר ה-GitHub; טעינת קובץ סשן זה מבטלת את הצורך לטעון קבצים בנפרד ולנווט ללוכוס (locus) הרלוונטי, מכיוון שקובץ הסשן מבצע שלבים אלו באופן אוטומטי.
טענו קובץ סשן דרך תפריט הקבצים. לחצו על File > Open Session, ובחרו את קובץ הסשן המתאים.

3. הגדרת עקבת הכיסוי

הערה: ב-IGV, החלון הראשי כולל "coverage track" (מסלול כיסוי). בהקשרים מסוימים, אפילו שבריר קטן של קריאות המכילות וריאנטים סרטניים ספציפיים עשוי להיות בעל משמעות קלינית. בשל כך, השגת עומק קריאה גבוה מאוד באזורי הגנום הנבדקים היא קריטית. אם רק 2% מהקריאות מכילות וריאנט נתון, עשוי להידרש עומק קריאה של מאות או אלפי קריאות כדי לזהות את הווריאנט באופן משכנע – ומכאן המונח "deep sequencing" (ריצוף עמוק).

ודאו שפס הכיסוי (coverage track) מוצג: מהתפריט העליון, לחצו על View > Preferences, ובחרו בלשונית Alignments. בחלק העליון של הלשונית מופיעה תיבה המסומנת כ- 'Show coverage track'. ודאו שהיא מסומנת.
הגדרת סף משמעותי קלינית לווריאנט ברמה נמוכה: נווטו ללשונית Alignments כפי שפורט בשלב 3.1 וגללו למטה עד להופעת התיבה המסומנת כ- Coverage allele-fraction. הגדירו את המספר בתיבה ל-0.01 ולחצו על Save (חלון ההגדרות אמור להיסגר לאחר הלחיצה על Save).

4. הגדרה של קריאות עם soft-clipping

הערה: הגדרה זו היא בעלת ערך רב לזיהוי וריאנטים מבניים גדולים יותר, כגון ארגוני מחדש של גנים, שינויים במספר העותקים, או אירועי הכנסה-מחיקה (insertion–deletion) משולבים. דוגמאות מתקדמות — כגון אלו המתמקדות בהגברות ומחיקות של EGFR — מדגימות כיצד קריאות עם soft-clipped יכולות לאשש את נוכחותם של וריאנטים מבניים שעלולים להתפספס בשיטות סטנדרטיות לקריאת וריאנטים (variant calling).

הפעלת soft-clips: מהתפריט העליון, לחץ על View > Preferences, ובחר בלשונית Alignments. גלול למטה לתיבה Show soft-clipped bases וודא שהיא מסומנת (Supplementary File 1) כדי לחשוף קריאות המיושרות חלקית—אלו שקצוותיהן אינן ממופות באופן נקי לרפרנס ו"נחתכות" ("clipped") החוצה.

5. תיאורי מקרה קליניים

מקרה בוחן מס' 1: הבחנה בין וריאנט פתוגני אמיתי ב- KRAS (הומולוג של אונקוגן נגיף הסרקומה של חולדת קירסטן) לבין ארטיפקט של ריצוף.
הערה: מקרה A עוסק בגבר בן 65 המאובחן עם אדנוקרצינומה של הריאה, כאשר הערכה היסטולוגית העריכה כ-80% גידול. פרופיל NGS זיהה וריאנט KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), המהווה מוטציית מניעה (driver mutation) ידועה בסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC). וריאנט missense התוצאה KRAS c.34G>T (p.G12C) מופיע בכ-13% מאדנוקרצינומות של הריאה ומקנה זכאות לטיפולים ממוקדים⁹. מקרה B עוסק באישה בת 54 עם סרקומה ידועה (הערכה של 50% גידול ו-50% רקמה נורמלית). הווריאנט הזהה KRAS c.34G>T (p.G12C) זוהה בדגימה זו. עם זאת, מכיוון ש-KRAS c.34G>T (p.G12C) מדווח לעיתים רחוקות בסרקומה, נוכחותו מעוררת חשד לארטיפקט ריצוף אפשרי.
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏KRAS.xml)
  1. טעינת נתונים: בחרו Hg19 בתפריט הנפתח של הגנום וטענו את קובץ ה-bam,‏ kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, ונווטו אל chr12:25,398,281–25,403,833 כדי להתמקד באזור הגן KRAS. שימו לב שקובץ האינדקס (שם זהה לקובץ ה-bam, אך מסתיים ב-.bai) חייב להיות באותה ספריה של קובץ ה-bam.
  2. בדיקת כיסוי ו-VAF: סקרו את קודון 12 באקסון 2 (NM_004985.5) ולחצו על מיקום הווריאנט במסלול הכיסוי כדי להציג את עומק הקריאה במיקום זה. שימו לב להחלפה של G→T (אירוע transversion), עם VAF של 35%–40%, התואם מאוד למוטציית מניעה קלונלית והטרוזיגוטית (איור 2A), במיוחד בהקשר של צפיפות תאים גידוליים של כ-80%.
  3. חיפוש הטיות גדיל (StrandBias): הגדירו קידוד צבעים לפי גדיל (ראו קובץ משלים 1, שלב 4) כדי לחשוף התפלגות של כמעט 50:50 בין גדיל קדמי (אדום) לגדיל הפוך (כחול) בדגימת הריאה.
  4. חזרו על שלבים 5.1.1.1–5.1.1.3 עבור מקרה B, דגימת הסרקומה: טענו את קובץ ה-bam,‏ kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, ושימו לב ל-VAF של <1% ותמיכה כמעט בלעדית בגדיל הקדמי, המצביעים על ארטיפקט של PCR/alignment (איור 2B).
מקרה בוחן מס' 2: פתרון סיווג שגוי של וריאנט רב-נוקלאוטידי (MNV).
הערה: אישה בת 50 עם מלנומה גרורתית עוברת פרופיל גידול מבוסס NGS. הניתוח מזהה מוטציה פוטנציאלית ב- BRAF (פרוטו-אונקוגן B-Raf, סרין/תראונין קינאז) c.1798_1799delinsAA. בעוד ש- BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) נפוץ יותר בגידולים סולידיים שונים, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) ספציפי יחסית למלנומה, שכן אור UV יכול להשרות מעברים של C > T בתוך די-פירימידינים¹⁰. לפי כללי HGVS, שני וריאנטים של נוקלאוטיד בודד (SNVs) ב- cis צריכים להיקרא כ-MNV יחיד. במקרים רבים, צינור עיבוד ביו-אינפורמטיקה עלול לזהות באופן שגוי וריאנט מורכב זה כשני SNVs סמוכים in cis: BRAF c.1798G>A ו- BRAF c.1799T>A. מכיוון שישנם שיקולים טכניים (כלומר, הקשורים ל-variant caller) וביולוגיים (הבחנה בין cis ל- trans), קיים חשש שהמוטציה תדווח באופן שגוי בעת חתימת הדוח, אלא אם תבוצע ויזואליזציה של הנתונים במהלך הביקורת הקלינית.
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏BRAF.xml)
  1. טעינת נתונים: בחרו Hg38 בתפריט הנפתח של הגנום וטענו את קובץ ה-bam,‏ kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, ונווטו אל chr7:140,453,136–140,753,336. שימו לב שקובץ האינדקס (שם זהה לקובץ ה-bam, אך מסתיים ב-.bai) חייב להיות באותה ספריה של קובץ ה-bam.
  2. הגדלה (Zoom in) של קודון 600 ב- BRAF: שימו לב לשינוי די-נוקלאוטידי GT→AA בהתבסס על מיקומי מסלול כיסוי סמוכים שהם ירוקים וכחולים ולא אפורים, מה שמתיישב עם p.V600K.
  3. סריקה עבור שני SNVs בודדים כדי לקבוע אם הם ב- cis או ב- trans: שימו לב ששני ה-SNVs ממופים לאותן קריאות והם ב- cis.
  4. בדיקת גדיל וכיסוי: הגדירו קידוד צבעים לקריאות כדי להראות תמיכה שווה בקירוב בין גדיל קדמי להפוך (ראו קובץ משלים 1, שלב 4), ו-VAF העולה על 50% התואם למניעה קלונלית. סף של 0.01 במסלול הכיסוי (ראו קובץ משלים 1, שלב 3 להגדרה) מבטיח שסוב-קלונים חלקיים (אם קיימים) יישארו גלויים (איור 2C).
  5. שימו לב להקשר ולנומנקלטורה של MNV: שני שינויי הנוקלאוטידים סמוכים זה לזה. בהתבסס על קונצנזוס מומחים, הגדירו SNVs במרחק של עד 50 bp הממופים לאותה קריאת רצף כווריאנט "מורכב" או "delins" יחיד¹¹.
מקרה בוחן מס' 3: בדיקת אינסרציה באקסון 9 של KIT (פרוטו-אונקוגן KIT, קולטן טירוזין קינאז) בגידול סטרומלי של מערכת העיכול (GIST)
הערה: מטופל גבר בן 58 עם גידול סטרומלי של מערכת העיכול עובר כריתה, והוזמנה בדיקת NGS. התוצאות מראות וריאנט אפשרי ב- KIT. מוטציות ב- KIT הן גורם מניעה שכיח ב-GISTs, המופיעות בכ-75% מהמקרים, והן ניתנות לטיפול ממוקד. אחרי מוטציות מאקטיוating באקסון 11, מוטציות מאקטיוating באקסון 9 של KIT הן גורמי המניעה הנפוצים ביותר שזוהו, אם כי GISTs עם מוטציה באקסון 9 ו-GISTs עם מוטציה באקסון 11 מתנהגים באופן שונה ביחס לרגישות למעכבי טירוזין קינאז¹².
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏KIT.xml)
  1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19 וטענו את קובץ ה-BAM,‏ KITdupmod2.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה. נווטו אל chr4:55,592,144-55,592,257, התואם לחלק מאקסון 9 של הגן KIT.
  2. דחיסת התצוגה: לחצו קליק ימני על מסלול ה-alignment ובחרו Squished כדי לדחוס את התצוגה (איור 3A).
  3. איתור האינסרציה: זהו את סימון האינסרציה, בצורת ראש חץ, מיד מעל מסלול הכיסוי, הממוקם בין מיקומים 55,592,178 ל-55,592,179, המצביע על אינסרציה קצרה (איור 3B,C).
  4. אינטראקציה עם האינסרציה: לחצו על ראש החץ כדי להרחיב את התצוגה ולחצו על אחת הקריאות עם בסיסים הממלאים את הפער כדי לצפות בפרטים בחלון קופץ. השוו את הרצף שהוכנס לרצף הייחוס כדי לקבוע אם זו כפלה (duplication) (איור 3D,E).
  5. בדיקת הכיסוי: לחצו על מסלול הכיסוי הסמוך מיד לראש חץ האינסרציה כדי להציג את מספר הקריאות התומכות, אותן ניתן להשוות למספר הקריאות הכולל כדי לקבוע את תדירות האלל הווריאנטית (VAF) המשוערת, במקרה זה כ-28%.
  6. בדיקה להטיות גדיל: מיינו את הקריאות לפי גדיל וצפו בבסיסים שנקצצו (soft-clipped) (ראו קובץ משלים 1, סעיף 3) כדי להראות אזור עניין סמוך לאינסרציה בקריאות ההפוכות (איור 3F).
מקרה בוחן מס' 4: בדיקת מחיקה (deletion) באקסון 19 של EGFR (קולטן גורם גדילה אפידרמלי) בסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC).
הערה: אישה בת 70 עם NSCLC שdiagnostic נחשף לאחרונה עוברת כריתה כירורגית של המסה. NGS הוזמן על נתח רקמה בעל טוהר גידולי מספיק, והתוצאות מראות וריאנט אפשרי ב- EGFR. מוטציות רבות ב- EGFR רגישות למעכבי טירוזין קינאז, ווריאנט זה עשוי להשפיע על הטיפול והפרוגנוזה של המטופלת¹³.
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏EGFR.xml)
  1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19, טענו את קובץ ה-bam‏ EGFRE746_A750delmod.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה, ונווטו אל chr7:55,242,420-55,242,513, התואם לחלק מאקסון 19 של הגן EGFR.
  2. בדיקת המחיקה באמצעות מסלול הכיסוי: סקרו את מסלול הכיסוי כדי לזהות אזור קטן של כיסוי נמוך שאינו ממוקם בקצוות הקריאות (איור 4A,B). בדיקה של מסלול הכיסוי מראה כיסוי נמוך על חלק קטן מאקסון 19.
  3. בדיקת המחיקה באמצעות הקריאות: הרחיבו את תצוגת ה-alignment כדי להראות קריאות עם פער יישור, המיוצג כקו שחור בתוך הקריאה (איור 4C,D).
  4. שקילת ההקשר הגנומי: בדקו את רצף הנוקלאוטידים של הייחוס המעורב ובסביבה המיידית של המחיקה. העריכו את קריאת המחיקה בהקשר של המיקום בתוך רצף הייחוס, שכן מחיקות באזורי הומופולימר או באזורים חוזרים עשויות לייצג ארטיפקט ריצוף, במיוחד כאשר הן מופיעות בתדירות אלל וריאנטית (VAF) נמוכה. ראו את חלק ה- צפייה במחיקה קטנה ב- קובץ משלים 2 לתיאור מפורט של תהליך העבודה.
מקרה בוחן מס' 5: בדיקת שינויים ב- EGFR במטופל עם גליובלסטומה.
הערה: אישה בת 77 עם גליובלסטומה מסוג IDH wild-type עוברת בדיקת ריצוף מהדור הבא (NGS). תוצאותיה מצביעות על הגברה פוטנציאלית של מספר העתקים של EGFR וסידור מחדש (rearrangement) פוטנציאלי של EGFRvIII (מחיקה של אקסונים 2–7). הן להגברת EGFR והן לשינויי EGFRvIII יש משמעות פרוגנוסטית וטיפולית בגליובלסטומה. בנוסף, שני שינויים אלה מופיעים לעיתים קרובות יחד, מה שאומר שנוכחותו של אחד עשויה לתמוך בתקינות של השני כאשר הוא מזוהה ברמות נמוכות.
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏copynumber.xml):
  1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg38, טענו את קובץ הסגמנטים, proband.seg, ואת דגימות ההשוואה, c1.seg-c9.seg, על ידי גרירה והשלכה לחלון ה-IGV. נווטו ל-Chr7.
    הערה: קובצי הסגמנטציה שנוצרו מ-CNVKit מסופקים להורדה. תהליך העבודה המלא לשימוש ב-CNVKit ליצירת כימות מספר העתקים הוא מחוץ להיקף מחקר זה. עם זאת, בקצרה, נעשה שימוש ב-CNVKit גרסה 0.9.9 (זמינה להורדה מ-https://github.com/etal/cnvkit) עם ייחוס מאוחד מוכן מראש המורכב מדגימות נורמליות אופלואידיות. הקלט מורכב מקובץ bed המכיל 9,144 מיקומי גששים של שלד CNV, המפוזרים ברחבי הגנום. שיקול חשוב כאן הוא שהפרטים של קלטי צינור עיבוד מספר העתקים והפרמטרים פחות חשובים מהעובדה שהדגימות מעובדות באמצעות הגדרה הזהה עבור כל הדגימות בהרצה. הדבר מקל על זיהוי הטיות סיסטמיות.
  2. הערכת מפת החום (heatmap): השוו את עוצמת הצבע היחסית בין הדגימה המדוברת (אתרו את שורת מפת החום התואמת לדגימה זו, המסומנת כ- proband) לבין דגימות אחרות (c1-9) כדי להבחין בין שינויים אמיתיים במספר העתקים לבין ארטיפקטים.
    הערה: השוואה ויזואלית אנכית של לוקוס בכל הדגימות היא האמצעי לזיהוי חריגות (הבדלים איכותיים המבוססים על הבדלי צבע בין שורות ולא הבדלים כמותיים) בלוקוס נתון בכל דגימה ביחס לרקע. עיינו ב- איור 5 ובסעיף צפייה בשינויים במספר העתקים של קובץ משלים 2 לשלבים מפורטים.
מקרה בוחן מס' 6: בדיקת EGFRvIII במטופל עם גליובלסטומה.
הערה: לאותה מטופלת יש גם עדות לסידור מחדש של EGFRvIII (מחיקה של אקסונים 2–7). הן להגברת EGFR והן לשינויי EGFRvIII יש משמעות פרוגנוסטית וטיפולית בגליובלסטומה. בנוסף, שני שינויים אלה מופיעים לעיתים קרובות יogether, מה שאומר שנוכחותו של אחד עשויה לתמוך בתקינות של השני כאשר הוא מזוהה ברמות נמוכות.
1. תהליך עבודה ב-IGV (קובץ Session ‏egfr_vIII.xml):
  1. טעינת נתונים: בחרו את הגנום Hg19, טענו את קובץ ה-bam של המטופלת, proband.bam, וודאו שקובץ האינדקס (שם זהה ל-bam, אך מסתיים ב-.bai) נמצא באותה ספריה, ונווטו לגן EGFR.
  2. ויזואליזציה של נקודות שבירה (breakpoints) של EGFRvIII: התאימו את התצוגה כדי לבחון נקודות שבירה מועמדות באופן אינדיבידואלי (במעלה אקסון 2 ובמורד אקסון 7 עבור EGFRvIII), ובצעו 'מיון לפי בסיס' (sort-by-base) (או השתמשו בקיצור Ctrl-s בווינדוס/לינוקס או Cmd-s במאק) בנקודות השבירה כדי להציג הצטברויות (pileups) של קריאות עם soft-clip.
  3. יישור קריאות ב-BLAT: לחצו קליק ימני על רצף עם soft-clip ובחרו BLAT sequence (IGV משתמש בברירות המחדל של UCSC, ראו https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html עבור פרמטרי ברירת מחדל של BLAT). לחצו על השורה הראשונה וצפו ב- Blat track המופיע בתחתית סעיף מסלולי ה-IGV.
    הערה: אפילו קריאה בודדת המיושרת לצומת של אקסון 1/אינטרון 1 ולצומת של אינטרון 6/אקסון 7 עשויה להוות ראיה מספיקה ל- EGFRvIII, כל עוד נשללה זיהום צולב מדגימה אחרת כסיבה לקריאה זו. עיינו ב- איור 6 ובסעיף צפייה בסידור מחדש מבני של קובץ משלים 2 לשלבים מפורטים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראוי לציין כי מחקר זה מתמקד בתיאור הדקויות של סקירת וריאנטים ב-IGV לצורך דיווח קליני. הדיווח הקליני הסופי צריך להישען על ה-pipeline המהוגן, קריטריוני האיכות ומדיניות הדיווח של כל מעבדה בנפרד. דיון מלא בנושא חשוב זה חורג מהיקפו של המחקר הנוכחי; עם זאת, תקנים והנחיות מומלצים גובשו על ידי ה-American College of Medical Genetics and Genomics וה-Association for Molecular Pathology⁷ והם מיושמים באופן שוטף במעבדות קליניות.

פירוש מקרה קליני מס' 1:

בהתחשב ב-VAF הגבוה, בחלוקת הגדילים המאוזנת ובשכיחות הידועה של KRAS c.34G>T (p.G12C) בסרטן ריאה (איור 2A), הווריאנט במקרה A עשוי להוביל לטיפול ממוקד, ולכן דיווחו הקליני הוא קריטי. למרות זיהוי חיובי של אותו ווריאנט KRAS c.34 G>T במקרה השני (סרקומה) (איור 2B), קיימים מספר סימני אזהרה המעידים על זיהוי חיובי שגוי: (1) שכיחות אלל הווריאנט (VAF) המדווחת היא כ-1%, נתון הנמוך משמעותית ממה שצפוי עבור אירוע מניע (driver event) במדגם שבו תאי גידול מוערכים אפילו ברמה נמוכה (20%) ו-(2) הקריאות התומכות בווריאנט זה מראות הטיית גדיל (strand bias), שכן הן מופיעות כמעט אך ורק בגדיל הקדמי. יחד עם חוסר סבירות ביולוגית לסוג זה של סרטן, הראיות מצביעות על כך שהממצא במקרה B הוא ארטיפקט.

פירוש מקרה קליני מס' 2:

וינייה זו ממחישה מספר שגיאות נפרדות שקלינאיים חייבים להיות מודעים אליהן. ראשית, תוכנות לזיהוי וריאנטים (variant callers) עשויות להגדיר, בצורה נכונה או שגויה, וריאנטים גנטיים סמוכים כשני SNVs או כ-MNV בודד (איור 2C). הדבר נובע מההבדלים במימוש אלגוריתם זיהוי וריאנטים המודע להפלוטיפ (haplotype-aware) בתוכנות לזיהוי וריאנטים סומטיים. רק מספר קטן של תוכנות לזיהוי וריאנטים שפורסמו לאחרונה משלבות תכונה זו¹⁴^,¹⁵. שנית, וריאציות טכניות ומבוססות נומנקלטורה כגון אלו מוזנות למאגרי נתונים חיצוניים על ידי מרכזי ריצוף המשתמשים בצינורות עיבוד (pipelines) ביו-אינפורמטיים שונים. לכן, מאגרים אלו עשויים להכיל מספר דיווחים נפרדים על מה שאמור להירשם כוריאנט גנטי יחיד. אלא אם כן מתבצע תהליך phasing למסד הנתונים באופן תקופתי, הדבר עלול להוביל למגוון השפעות לא רצויות על הפרשנות הקלינית בהמשך. יחד, מקורות שגיאה אפשריים אלו עלולים להוביל לדיווח שגוי למטופל. תרחיש מורכב זה מדגיש את הערך של ויזואליזציה של וריאנטים באמצעות תוכנה באיכות גבוהה כגון IGV.

פירוש מקרה קליני מס' 3:

בהינתן התמיכה של מספר קריאות (multi-read support) בכפילות והמנגנון המוכר של הפעלה קונסטיטוטיבית של KIT עם כפילויות באקסון 9 ב-GIST, ניתן להסיק כי וריאנט KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) זה הוא אמיתי ולא ארטיפקט (איור 3). מוטציות ב-KIT הן מניעים שכיחים ב-GISTs, המתרחשות בכ-90% מהמקרים. אפיון מדויק של הווריאנט הוא קריטי כאן, כיוון שבעוד שמוטציות מפעילות באקסון 11 הן השכיחות ביותר, GISTs עם מוטציה באקסון 9 מתנהגים באופן שונה ביחס לרגישות למעכבי טירוזין קינאז, ובכך משנים את הגישה הטיפולית. בהינתן החשיבות הקלינית של מוטציות ב-KIT ב-GISTs, יש לכלול וריאנט זה בדו"ח הסופי.

פירוש מקרה קליני מס' 4:

בהינתן עקבת הכיסוי, המראה הסטריאוטיפי של מחיקה קצרה ותמיכת הקריאות, וכן המכניזם המוכר של הפעלה קונסטיטואיבית של מחיקות באקסון 19 של EGFR ב-NSCLC, ניתן להסיק כי וריאנט EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) זה הוא אמיתי ואינו ארטיפקט (איור 4). מוטציות רבות ב-EGFR, כולל מחיקה זו הידועה באקסון 19, רגישות מאוד למעכבי טירוזין קינאז. נוכח החשיבות הקלינית של מוטציות EGFR ב-NSCLCs, יש לכלול וריאנט זה בדוח הסופי.

פירוש מקרה קליני מס' 5 ומקרה קליני מס' 6:

תצוגות מפת החום מאשרות את הגברת ה- EGFR, ונקודת השבירה בין אקסונים 1 ו-8, שנבדקה באמצעות BLAT, מאשרת את שני הממצאים בחולה זה (איור 5 ו-איור 6). הגברת EGFR נחשבת בדרך כלל לגורם פרוגנוסטי למחלה אגרסיבית יותר, וסידור מחדש של הגן EGFRvIII הוא סמן ביולוגי ספציפי ל-GBM ומהווה מטרה פוטנציאלית לטיפול¹⁶^,¹⁷.

ניתן לשחזר זרימות עבודה נבחרות באמצעות קבצים השמורים בענף הראשי (main branch) של מאגר ה-GitHub בכתובת https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (עודכן ב-6/9/2026), המכיל שישה קבצי הפעלה (session files), אחד עבור כל דוגמה (vignette), חמישה זוגות של קבצי bam ו-bai, אחד עבור כל דוגמה המשתמשת בקובץ יישור (alignment file), ו-10 קבצי seg עבור דוגמה חמש, המשתמשת בקבצי פלג (segment files) במקום בקובצי יישור.

figure-results-1
איור 1: סטנדרטים של קובצי NGS ותזרימת עבודה של ריצוף. (A) קריאות קצרות (Short reads) המיוצרות על תא זרימה (flow cell) נמעכבות באמצעות מדידות אופטיות ונשמרות בפורמט FASTQ, הכולל הן את נתוני הרצף והן את מדדי האיכות לכל בסיס. קריאות אלו עוברות לאחר מכן מיון ויישור אל גנום ייחוס, מה שמניב קובץ BAM שבו כל קריאה "נערמת" בלוכוס התואם לה. (B) אי-התאמות בין הייחוס לקריאות (למשל, מוטציות נקודתיות, indels קטנים) מזוהות על ידי אלגוריתמים לקריאת וריאנטים (variant-calling). (C) לבסוף, וריאנטים מזוהים אלו נאספים לקובץ VCF, המסכם את מיקומיהם, את הבסיסים של הייחוס/החלופה ונתוני אנוטציה אחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ויזואליזציה מבוססת IGV של KRAS c.34G>T (p.G12C) ושל BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) ויזואליזציה של וריאנט ממשי (KRAS c.34G>T (p.G12C)) ב-IGV, המדגימה עומק קריאה גבוה (אלפי קריאות) וכ-35–40% מהקריאות הנושאות שינוי G→T. הקריאות קדימה (אדום) ואחורה (כחול) מאוזנות, מה שמרמז על מוטציה הטרוזיגוטית אמיתית. (B) ארטיפקט חשוד ברקמה שאינה רלוונטית המראה וריאנט עם תמיכה מינימלית של קריאות (1% VAF). רוב קריאות הווריאנט מופיעות בגדיל קדימה (אדום), מה שמעיד על הטיה של הגדיל (strand bias). (C) וריאנט מורכב BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) הנראה ב-IGV וחושף החלפה של שני בסיסים (GT→AA) ב-cis. אנא לחץ כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ויזואליזציה של הכנסה (insertion) קצרה. (A) תצוגת "Squished" של KIT אקסון 9 ב-IGV מסייעת בזיהוי האזור הרלוונטי. (B) אזור רלוונטי (מלבן אדום) שזוהה באמצעות ויזואליזציה של פס ההכנסה ובסיסים עם soft clipping. (C) הגדרת תצוגת "Expanded" ב-IGV כדי לאפשר ויזואליזציה של ההכנסה. (D) לחיצה על פס ההכנסה (מלבן אדום) מציגה את הרצף שהוכנס. (E) הרצף שהוכנס מושווה לרצף הייחוס כדי לזהות את הבסיסים הכפולים. (F) מיון הקריאות לפי גדיל הקריאה (read-strand), המראה כי בסיסים עם soft clipping תואמים להכנסה בקריאות ההפוכות (reverse reads). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ויזואליזציה של מחיקה (deletion) קטנה. (A) תצוגה "דחוסה" (Squished) של אקסון 19 בגן EGFR המראה את המחיקה הנוכחת במספר רב של קריאות. (B) שימוש במסלול הכיסוי (coverage track) כדי לבחון את מספר הקריאות במיקומים בתוך המחיקה ובסמוך אליה. (C) תצוגה "מורחבת" (Expanded) המראה את המחיקה ומזהה את מספר הבסיסים שנמחקו. (D) השוואה לרצף הייחוס (תיבה אדומה) מזהה את הבסיסים שנמחקו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הדמיה של הגדלה במספר העותקים. (A) קובץ seg מכיל שש עמודות: מזהה דגימה, כרומוזום, התחלה, סיום, סמנים במקטע, וממוצע המקטע. (B) טעינת קובצי seg ישירות ל-IGV מאפשרת הדמיה נוחה. (C) הדמיה של הנתונים במבט רחב של הגנום. כל דגימה תופיע כשורה של נתונים, כאשר הצבעים מציינים ערכים, אדום עבור >0 וכחול עבור <0, כאשר צבעים עזים יותר משקפים ערכים רחוקים יותר מ-0. עם פתיחת הדגימה הרלוונטית ותשע דגימות אקראיות מאותה הרצה, התוצאות מוצגות במפת חום רב-דגימתית עם עשר שורות. הדגימה הרלוונטית מודגשת למטה בתוך התיבה האדומה. (D) צמצום המבט לאזור הלוקוס של EGFR, נראה פס אדום בדגימה הרלוונטית למטה, ופסים לבנים או כחולים עבור הדגימות האקראיות. הבדל צבעים זה בין הדגימה הרלוונטית לדגימות האקראיות בשורות אחרות מדגים כי זיהוי ההגברה בדגימה הרלוונטית הוא מעל הרקע או הרעש בלוקוס זה. (E) הגדלה (Zoom out) לכרומוזום chr7, נצפה ניגוד בין הלוקוס המכיל את EGFR בדגימה שלנו לבין הדגימות האקראיות שבהן הוא אינו מופיע. הגברת EGFR מוצגת כפס אדום דק בדגימה התחתונה. (F) צמצום המבט לאזור הלוקוס של MET , הגברת MET חוזרת במידה משתנה בתשע הדגימות האקראיות לצד הדגימה הרלוונטית, מה שמרמז כי זיהוי הגברה זה הוא ארטיפקט. דבר זה מדגיש את ההבדל במראה בין זיהוי אמיתי של מספר עותקים בלוקוס EGFR לבין ארטיפקט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: הדמיה של ארגון מחדש של גן EGFRvIII.לפני העבודה על מקרה זה, ודאו כי הגדרת ההדמיה של בסיסים עם soft-clipped בוצעה (ראו קובץ משלים 1 לפרטים נוספים). (A) נווטו לצומת המועמד הראשון והגדירו את התצוגה של ערוץ היישור (alignment track) כ-"Squished". (B) התקדמו לאורך הלוקוס, תוך הפעלה חוזרת של קיצור הדרך למיון לפי בסיס, "control-s", עד שערמה (pileup) של קריאות עם soft-clipped דומות תהיה גלויה בחלקו העליון של ערוץ היישור. ככל שמספר הקריאות עם soft-clipped דומות (תיבה אדומה) בערמה גדול יותר, כך רמת הביטחון בארגון מחדש מבני גבוהה יותר. (C) כלי ה-BLAT שולף את הרצף של הבסיסים עם ה-soft-clipped ומזהה היכן בגנום נמצא רצף זה, יחד עם ציון כמותי המודד עד כמה הרצף תואם לרצף ספציפי במסד נתונים יעד. בחירה בשורה מסוימת תנווט לאותו מיקום. (D) שימוש חוזר בפונקציית המיון לפי בסיס "control-s" מדגים שוב ערמת soft-clip, הפעם בצד הנגדי של הקריאות. כדי לוודא שאין בסיסים נוספים בדגימה ביחס לרפרנס hg38, לחצו לחיצה ימנית על קריאה עם רצף בסיסים בעלי soft-clipped ובצעו שוב BLAT לבסיסי ה-soft-clip. הטבלה שמתקבלת מציגה את נקודת השבירה הראשונה של הצומת, הלוקוס שהודמיה בתחילה, צומת exon 1-intron 1. (E) בחירה בשורה העליונה מחזירה לנקודת השבירה הראשונה. הבסיסים בצומת של יישור רפרנס ה-BLAT זהים לבסיסי ה-soft-clipped ששימשו כשאילתה, מה שמעיד על כך שכל רצף הקריאות עם ה-soft-clipped כלול ביישור רצף הרפרנס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הגדרות IGV מומלצות.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תזרימי עבודה תמציתיים.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה מדויקת של וריאנטים לצורך דיווח קליני תלויה באלגוריתמים ביו-אינפורמטיים מורכבים ובשילוב של סקירה ויזואלית של וריאנטים מורכבים באמצעות IGV⁵^,⁶. מחקר זה תוכנן כדי לרכז משאב תמציתי של הגדרות מומלצות להצגה ויזואלית של שינויים גנומיים פשוטים ומורכבים ב-IGV (Supplementary File 1). מחקר זה מתמקד בשינויים סומטיים נפוצים ובאופן הסקירה שלהם ב-IGV.

הפרוטוקול מתחיל בהערכה של מוטציית החלפה פשוטה (איור 2A) ומוטציית החלפה מורכבת (איור 2C), תוך מתן תשומת לב מיוחדת לקביעה האם הממצא שזוהה הוא ממשי או ארטיפקט. לאחר מכן הוא עובר להכנסה פשוטה (איור 3) ומחיקה פשוטה (איור 4), תוך הדגשת האופן שבו שינויים אלו נראים ב-IGV. לבסוף, הוא דן בשינויים גנומיים מורכבים, כולל שינויים במספר העותקים (איור 5) וארגון מחדש מבני (איור 6). תהליכי עבודה תמציתיים המדגישים את השלבים המרכזיים עבור כל אחד מהמאפיינים הללו מסוכמים ב-קובץ משלים 2. מחקר זה נועד להקנות לקורא היכרות עם האופן שבו שינויים גנומיים שונים מופיעים ב-IGV⁵.

ראוי לציין כי IGV אינו משמש ככלי בתוך pipeline לזיהוי עצמאי של וריאנטים. למרות שנושא זה חורג מהיקף כתב יד זה, מומלץ מאוד עבור מעבדות מחקר, ונדרש עבור מעבדות קליניות¹^,⁷, שמדיניות ונהלי המעבדה יתייחסו לווריאנטים שניתן לדווח עליהם בהתבסס על מגבלות תיקוף הבדיקה עבור שכיחות אללית של הווריאנט (variant allele fraction) ועומק כיסוי, לשאלה האם נדרש אישור אורתוגונלי לווריאנטים בנסיבות מסוימות, למורכבויות הכרוכות בגרסאות של תוכנות ביו-אינפורמטיקה, ולשונות ביןתצפיתית בפירוש ויזואלי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לכל מפתחי תוכנת ה-IGV וכן למענק ה-NIH המממן כעת את פיתוח ה-IGV: U24CA258406. לא התקבל מימון עבור פיתוח מחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BLAT	חיפוש BLAT בגנום	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	דף אינטרנט עצמאי של BLAT. ממשק ה-API של BLAT זמין בתוך IGV, ללא צורך בהתקנה נוספת
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	מאגר gitHub ציבורי עם CNVKit להורדה בחינם. הוראות להורדה/הרצה של CNVKit זמינות כאן גם כן.
קובץ מקטעים להשוואה #1 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #2 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #3 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #4 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #5 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #6 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #7 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה #8 עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	קבצי מספר העתקים
קובץ מקטעים להשוואה עבור ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	קבצי מספר העתקים
רצף הגנום האנושי	רצף הגנום האנושי	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	קובץ fasta להורדה המכיל את גרסת הגנום האנושי Hg38. קובץ זה זמין בתוך IGV, ללא צורך בהורדה נוספת
רצף הגנום האנושי	רצף הגנום האנושי	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	קובץ fasta להורדה המכיל את גרסת הגנום האנושי Hg19. קובץ זה זמין בתוך IGV, ללא צורך בהורדה נוספת
חבילת תוכנת IGV	תוכנת IGV	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	תוכנת IGV גרסה 2.19.7 עם Java (JDK 21), להורדה בחינם. הקישור כאן הוא עבור windows, אם כי קיימים קישורים גם עבור Linux ו-Mac.
קובץ מקטעים עבור מקרה ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	קבצי מספר העתקים
מאגר GitHub של המדריך	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	מאגר GitHub ציבורי עם כל הקבצים הדרושים לשחזור ששת הוויניאטות
ויניאטה #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	קבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #1 מקרה A	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #1 מקרה A	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	קבצי יישור
אינדקס bai עבור ויניאטה #1 מקרה B	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #1 מקרה B	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	קבצי יישור
ויניאטה #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	קבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	קבצי יישור
ויניאטה #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	קבצי סשן
קובץ אינדקס bai עבור ויניאטה #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	קבצי יישור
ויניאטה #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	קבצי סשן
קובץ יישור עבור ויניאטה #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	קבצי יישור
אינדקס bai עבור ויניאטה #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	קבצי יישור
ויניאטה #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	קבצי סשן
ויניאטה #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	קבצי סשן
אינדקס bai עבור ויניאטה #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	קבצי יישור
קובץ יישור bam עבור ויניאטה #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	קבצי יישור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VCF BAM

פרשנות של וריאנטים קליניים באמצעות ה-Integrative Genomics Viewer (IGV) עבור פתולוגים מולקולריים

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים