SHMT2: סמן ביולוגי מטבולי וחיסוני של אדנוקרצינומה אגרסיבית של הריאה

Yang Zhang; Yan Nuo; Deyuan Zhang; Silin Wang; Yiping Wei; Chuan Yao

doi:10.3791/71812

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

SHMT2: סמן ביולוגי מטבולי וחיסוני של אדנוקרצינומה אגרסיבית של הריאה

104 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71812

⸱

28 באוגוסט 2026

Yang Zhang^*¹ , Yan Nuo^*¹ , Deyuan Zhang² , Silin Wang¹ , Yiping Wei¹ , Chuan Yao²

¹Department of Thoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi Medical College, Nanchang University, ²Department of Thoracic Surgery, Affiliated Hospital of Jiujiang University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ניתוחים משולבים של מטבולומיקה, טרנסקריפטומיקה, רמת התא הבודד וניתוחים פונקציונליים מזהים את SHMT2 כסמן ביולוגי של תכווץ מטבולי של SGOC, התנהגות אגרסיבית וירידה בתגובה החזויה לאימונותרפיה באדנוקרצינומה של הריאה.

תקציר

מטבוליזם של סרין/גליצין-פחמן-אחד (SGOC) משתנה לעיתים קרובות באדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), אך הקשר שלו להתנהגות הגידול ולתגובה החזויה לאימונותרפיה נותר לא מוגדר במלואו. פרופיל מטבולומי של 23 זוגות של רקמות LUAD ורקמות ריאה נורמליות סמוכות בוצע באמצעות ספקטרומטריית מסות עם יינון בריסוס אלקטרוסטטי חילוצי פנימי. נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים מקוהורט LUAD של The Cancer Genome Atlas (TCGA-LUAD) נותחו כדי להעריך את ביטוי SHMT2, את הפרוגנוזה, גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed ומאפיינים הקשורים למערכת החיסון. תגובה חזויה לחסימת נקודות בקרה חיסוניות הוערכה באמצעות Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE) ו-The Cancer Immunome Atlas (TCIA), ורגישות לתרופות הוסקה באמצעות oncoPredict. נתוני Single-cell RNA-seq שימשו לבחינת ההפצה התאית של SHMT2. תיקוף ניסויי כלל PCR עם שעתוק הפוך כמותי (RT-qPCR), Western blotting, אימונוהיסטוכימיה של Human Protein Atlas (HPA), והשתקת SHMT2 באמצעות RNA בעלת לולאה קצרה (shRNA), ולאחריהם בדיקות פרוליפרציה, ריפוי פצעים ויצירת מושבות. ניתוח מטבולומי זיהה את מטבוליזם הגליצין, הסרין והתראונין כמסלול שמשתנה באופן בולט ב-LUAD. SHMT2 היה בעל ביטוי מוגבר (upregulated) ב-LUAD והיה קשור להישרדות כללית גרועה יותר ומאפיינים קליניקופתולוגיים שליליים. גידולי SHMT2-high הראו העשרה של תוכניות שעתוק הקשורות למחזור התא ול-SGOC, ציוני חיסון וסטרומה נמוכים יותר, ותגובה חזויה מופחתת לאימונותרפיה. ניתוח תאים בודדים הראה העשרה יחסית של ביטוי SHMT2 באוכלוסיות של תאי B. In vitro, SHMT2 היה בביטוי יתר בתאי LUAD, והש탁קתו דיכאה פרוליפרציה, נדידה וצמיחה קלונוגנית. יחד, SHMT2 קשור לתכנון מחדש מטבולי של SGOC, לפנוטיפים גידוליים אגרסיביים ולמצב של נחיתות חיסונית ב-LUAD, מה שתומך ברלוונטיות הפוטנציאלית שלו כסמן ביולוגי; טיפול תרפויטי דורש תיקוף פרמקולוגי ו-in vivo נוסף.

מבוא

LUAD נותר גורם מוביל לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, בשל הטרוגניות מולקולרית ניכרת, נטייה מוקדמת למטסטזיס ועמידות מוגבלת של אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות¹^,². למרות שמעכבי נקודות בקרה חיסוניות (ICIs) עיצבו מחדש את הנוף הטיפולי של LUAD, תועלת קלינית מתמשכת מוגבלת לתת-קבוצה של חולים, ועמידות ראשונית ונרכשת נצפית תכוף³^,⁴. שונות בולטת זו בין חולים מדגישה את הצורך הדחוף להגדיר את הגורמים הביולוגיים המעצבים את המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול והשולטים בתגובה לאימונותרפיה, תוך זיהוי נקודות תורפה הניתנות לניצול כדי לשפר את סטרטיפיקציית החולים ואת תוצאות הטיפול.

תכנות מחדש מטבולי הוא סימן היכר מרכזי של התקדמות ממאירה⁵. בין התוכניות המטבוליות, מטבוליזם של SGOC מקשר בין תשומות גליקוליטיות למטבוליזם של חומצות אמינו וסינתזת נוקלאוטידים, ובכך מספק יחידות פחמן אחת לייצור פורינים/פירימידינים וליצירת תורמי מתיל⁶. מעבר לייצור ביומסה, מטבוליזם של SGOC תורם להומיאוסטזיס של רדוקס ומתממשק עם מחזור המתיונין כדי להשפיע על מתילציה של DNA, RNA והיסטונים, ובכך הוא ממוקם בצומת שבין ת proliferation (שגשוג תאים) לבקרה אפיגנטית⁷^,⁸. Serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), האיזופורמה המיטוכונדריאלית של serine hydroxymethyltransferase, ממירה סרין לגליצין תוך써 יצירת 5,10-methylene-tetrahydrofolate, ומהווה נקודת כניסה מרכזית לאספקת פחמן אחד במיטוכונדריה בתוך רשת ה-SGOC⁹. SHMT2 מועלה באופן חריג במספר סוגי גידולים ממאירים והוא נקשר להגברת proliferation, פלישה, עמידות טיפולית והסתגלות לעקה חמצונית¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. SHMT2 מתממשק גם עם סיגנל דלקתי באמצעות קומפלקס BRISC, אם כי מנגנון חיסוני ישיר המונע על ידי SHMT2 ב-LUAD עדיין לא הוכח¹⁴^,¹⁵. לפיכך, השאלה האם SHMT2 מסמן פנוטיפ מטבולי בעל משמעות קלינית ב-LUAD וכיצד הוא קשור למאפייני מיקרו-סביבה חיסונית ותגובה חזויה לאימונותרפיה, דורשת הערכה משולבת.

היחסיים הדו-כיווניים בין חילוף החומרים של הגידול לבין החסינות נגד הגידול הם מרכזיים בביולוגיה של הסרטן כיום¹⁶. תאי גידול עלולים לפגוע ביכולת החיסונית באמצעות הת depletion תחרותי של רכיבים תזונתיים, הצטברות של מטבוליטים מווסתים-חיסוניים, וצימוד מטבולי-אפיגנטי המשנה את תכניות הבידול והתפקוד של תאי מערכת החיסון⁷^,¹⁶^,¹⁷. חילוף חומרים מוגבר של פחמן אחד עשוי להשפיע על תכניות תלויות-מתילציה ועל הכשירות המטבולית של תאי T, אך הכיוון ועוצמתם של השפעות אלו תלויים בסוג התא ובהקשר התזונתי¹⁷. הבקרה החיסונית האדפטיבית חורגת גם מעבר לתאי T: תאי B, תגובות נוגדנים, הצגת אנטיגן ומבנים לימפואידיים שלישוניים (TLS) נמצאו קשורים ליעילות של אימונותרפיה¹⁸. תצפיות אלו מניעות ניתוח רב-שכבתי שיכול להציב מועמד מטבולי בתוך הקשרים של גידול כולל (bulk-tumor), רמה של תא בודד והקשרים תפקודיים, מבלי להניח שסמינות בין פלטפורמות שונות מוכיחה כשלעצמה סיבתיות.

בניגוד לתכנון המבוסס על מטבוליזניקה בלבד, המזהה מטבוליטים ששונו ללא קביעת מקורם התאי או רלוונטיות פנוטיפית, ובניגוד לתכנון המבוסס על טרנסקריפטומיקה של תאי מאס (bulk-transcriptomics) בלבד, שעשוי להסיק על פעילות של מסלולים ללא תצפית ישירה על שינויים במטבוליטים, תהליך העבודה הנוכחי משלב מטבוליזניקה של רקמות זוגיות, טרנסקריפטומיקה של תאי מאס ושל תאים בודדים, ובדיקות תפקודיות in vitro. התאמה בין שכבות אלו תומכת בתעדוף מועמדים ומפחיתה את התלות בפלטפורמה אנליטית בודדת; עם זאת, הראיות המתקבלות נותרות אסוציאטיביות עבור ויסות חיסוני, אלא אם כן הן תוקפו במערכות של קו-קלטור חיסוני או in vivo.

מטבולומיקה של רקמות מזווגות של LUAD וריאה נורמלית סמוכה שימשה תחילה כדי לזהות שיבושים מטבוליים הקשורים לגליצין. לאחר מכן שולבו נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים מ-TCGA כדי להעריך את SHMT2, אנזים SGOC מיטוכונדרי שנתמך על ידי רלוונטיות של מסלול, ביטוי מוגבר בגידול, קשר פרוגנוסטי וישימות ניסיונית. פרופיל של הסביבה המיקרו-אימונית, מיפוי של תאים בודדים ותיקוף תפקודי in vitro ביססו לאחר מכן מסגרת רב-שכבתית להגדרת היפותזות, המקיפה שינויים מטבוליים, הפרעה בוויסות אנזימטי, התפלגות תאית ופנוטיפ של תאי גידול. מנקודת מבט מעשית, זרימת עבודה זו דורשת רקמות מזווגות שהוקפאו במיKד. זיהוי מטבוליטים באמצעות ספקטרומטריית מסות הוא חצי-כמותי; יש לתקף מטבוליטים מועמדים באופן עצמאי. תחזיות לאימונותרפיה (TIDE/TCIA) והסקות לגבי רגישות לתרופות (oncoPredict) הן הערכות חישוביות מבוססות טרנסקריפטום שאינן מחליפות תיקוף קליני בחלקה של קהלי מטופלים המטופלים ב-ICI בעולם האמיתי, ויש לפרשן ככלי להגדרת היפותזות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת ההגנה על נסייני אדם (IRB) של בית החולים השני המסונף לאוניברסיטת נאנצ'אנג (CDEFYYLK 3-05). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני איסוף הדגימות, בהתאם להצהרת הלסינקי. נתונים גולמיים יוצאו ונותחו באמצעות התוכנה ומשאבי הרשת המפורטים ב- טבלת חומרים.

איסוף רקמה קלינית

דגימות זוגיות של גידול ורקמות ריאה נורמליות תואמות מאזורים מרוחקים נאספו מחולים שעברו כריתה כירורגית בין ינואר ליוני 2024 ואובחנו פתולוגית עם אדנוקרצינומה פולשנית של הריאה. הדגימות הוצאו על ידי המנתח המבצע, עובדו תוך 5 דקות מהכריתה, הוקפאו מיד בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואוחסנו עד לניתוח. מאפיינים קליניקופתולוגיים ללא זיהוי מסופקים ב-טבלה משלימה 1.

ספקטרומטריית מסה עם יינון תרסוסי חשמליים עם מיצוי פנימי (iEESI-MS) להבחנה בין LUAD לבין רקמות ריאה נורמליות

דגימות רקמה (1 mm³) נותחו באמצעות iEESI-MS בעזרת ספקטרומטר מסות היברידי מסוג linear ion trap-electrostatic orbital-trap במצב יונים חיוביים. ממס חילוץ מתנול (100%) הוגש בקצב של 3.0 µL/min עם bias של +5 kV. טווח הסריקה של iEESI-MS¹ היה m/z 50–2,000. ב-iEESI-MS² נעשה שימוש בדיסוציאציה השרהת התנגשויות (collision-induced dissociation) עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 25–35%, חלון בידוד של m/z 2.0, וזמן החרגה דינמי של 30 s. כיול חיצוני יומי לפי פרוטוקול הסטנדרט של המכשיר שמר על שגיאת מסה של <5 ppm. לאחר נורמליזציה של חציונים, טרנספורמציית log₂ ו-autoscaling, בוצע OPLS-DA עם 200 מבחני פרמוטציה. מטבוליטים זוהו באמצעות HMDB, והסריקה של העשרת מסלולים (pathway enrichment) בוצעה באמצעות הערות KEGG.

עיבוד נתוני ספקטרומטריית מסות וזיהוי מטבוליטים

נתוני MS גולמיים נורמלו באמצעות נורמליזציית חציונית (median normalization), ולאחריה ביצוע לוגריתם (log)₂ טרנספורמציה ונרמול אוטומטי (מרכוז ממוצע וחילוק בסטיית התקן של כל משתנה). ניתוח מבדיל של ריבועי מזעורים פחותים חלקיים אורתוגונליים (OPLS-DA) שימש לזיהוי מאפייני m/z מבדילים. מאפיינים נחשבו לדיפרנציאליים כאשר ה-VIP > 1.0, |log₂(FC)| > 0.58, ו- p < 0.05. מאפיינים דיפרנציאליים הועברו לבדיקת MS² ניתוח והערות באמצעות מאגר המטבוליזם האנושי (Human Metabolome Database). לאחר מכן, נעשה שימוש בהעשרה של מסלולים מבוססת KEGG כדי לזהות מסלולים ששונו ולתעדף אנזימים רלוונטיים למסלולים אלו. המטבוליטים הדיפרנציאליים המannotated מופיעים ב- טבלה נלווית 2.

ניתוחי ביטוי של SHMT2, הישרדות וקשר קליני-פתולוגי המבוססים על TCGA

פרופילי ביטוי של RNA-seq ואנוטציות קליניות תואמות עבור TCGA-LUAD הורדו מ-Genomic Data Commons ב-18 בדצמבר 2025; גידולים (n = 542) ודגימות נורמליות (n = 59). ערכי Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM) הומרו ל-log₂(FPKM + 1). רק דגימות עם מידע מלא על הישרדות נכללו בניתוחים הפרוגנוסטיים. ערכי ביטוי של SHMT2 בגידולים ובדגימות נורמליות הושוו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. המטופלים חולקו לקבוצות של SHMT2-high ו-SHMT2-low לפי ערך הביטוי החציוני. הישרדות כללית הוערכה באמצעות ניתוח Kaplan-Meier ומבחן log-rank. קשרים עם שלב tumor-node-metastasis (TNM), גיל ומגדר נבחנו באמצעות מבחני chi-square או Wilcoxon, לפי העניין. עקומות receiver operating characteristic (ROC) תלויות-זמן הופקו עבור הישרדות של שנה אחת, 3 שנים ו-5 שנים. כל המבחנים הסטטיסטיים היו דו-זנביים.

ניתוח ביטוי דיפרנציאלי והעשרה תפקודית (GO/KEGG)

גנים עם ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) בין קבוצות עם ביטוי גבוה של SHMT2 לביטוי נמוך של SHMT2 זוהו באמצעות שימוש בשיעור גילוי שגוי (false-discovery rate) < 0.05 ו- |log₂(FC)| ≥ 1. התוצאות הוצגו כתרשים געש (volcano plot) וכמפת חום (heatmap) של 40 ה-DEGs המובילים עם נורמליזציית z-score לפי שורות. ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-KEGG השתמשו ב-p < 0.05 מתוקנן. אנוטציות של גנים אנושיים התקבלו מ-Ensembl בדצמבר 2025.

חדירה חיסונית, חיזוי תגובה לאימונותרפיה והסקת רגישות לתרופות

מדדי סביבת הגידול המיקרוסקופית (Tumor-microenvironment scores), כולל ImmuneScore, StromalScore ו-ESTIMATEScore, חושבו באמצעות ESTIMATE. הרכב תאי החיסון הוסק באמצעות CIBERSORT עם סט הייחוס LM22 (הורד ב-5 בדצמבר 2025), 1,000 פרמוטציות, ושימור דגימות עם p < 0.05 בדקונבולוציה. השוואות בין קבוצות בוצעו בין גידולים עם ביטוי גבוה של SHMT2 לבין גידולים עם ביטוי נמוך של SHMT2. מתאמי Spearman בין SHMT2 לגנים הקשורים לנקודות בקרה חיסוניות הוצגו כמעטריצת מתאמים. Immunophenoscores הופקו מ-TCIA, ו-TIDE שימש לחיזוי משלים של התגובה לאימונותרפיה. רגישות לתרופות הוסקה באמצעות oncoPredict שאומן על גרסת GDSC מדצמבר 2023 להערכת ערכי IC₅₀. להבדלים בין קבוצות נעשה שימוש במבחני Wilcoxon, ועבור קשרים רציפים נעשה שימוש במתאמי Spearman.

ניתוח scRNA-seq של LUAD

נתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד¹⁹ הורדו ממאגר ה-Gene Expression Omnibus ב-20 בדצמבר 2025 ונותחו. תאים עם 200–6,000 מאפיינים (features) שזוהו ו- < 10% מתמלילי המיטוכונדריה נשמרו. ספירות נורמלו באמצעות LogNormalize עם מקדם קנה מידה של 10,000; נבחרו 2,000 הגנים המשתנים הבולטים ביותר, וכל הגנים עברו סקלינג (scaling). בניתוח רכיבים עיקריים (PCA) נעשה שימוש ב-20 הרכיבים הראשונים, ב-UMAP נעשה שימוש בממדים 1–20, ובקיבוץ (clustering) נעשה שימוש ברזולוציה של 0.5. סוגי התאים סווגו באמצעות התייחדות לאטלס תאי האדם הראשוניים (Human Primary Cell Atlas). פרופורציות של סוגי תאים הושוו בין דגימות גידול לדגימות נורמליות, ונוצרו מטריצות של מתאם ספירמן. התפלגויות של SHMT2 נבחנו על פני סוגי התאים המסווגים. מצבי מחזור התא הוסקו באמצעות cyclone והוצגו באמצעות גרפי רכס (ridge plots).

תרבית תאים

תאי BEAS-2B, H1299 ו-A549 תורבדו ב- 37 °C באינקובטור לח(Humidified incubator) המוגדר ל-5% CO2₂ ולחות יחסית של כ-95%, תוך שימוש במצעים ובתוספים המפורטים ב- טבלת חומרים.

PCR כמותי בזמן אמת עם שעתוק הפוך (RT-qPCR)

RNA כולל הוצא מהתאים באמצעות ריאגנט להפקת RNA מבוסס פנול. ה-RNA שהופק עבר תמלול הפוך ל-cDNA באמצעות תערובת מאסטר לתמלול הפוך. התמלול ההפוך בוצע במערכת של 20 µL עם הסרה של DNA גנומי ב-42 °C למשך 2 min, תמלול הפוך ב-50 °C למשך 15 min, וסיום התגובה ב-85 °C למשך 5 s. PCR כמותי בוצע עם תערובת מאסטר ל-qPCR המבוססת על צבע נקשר ל-DNA במערכת real-time PCR, תוך שימוש ב-95 °C למשך 3 min, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C למשך 10 s ו-60 °C למשך 30 s, ושלב עקומת התכה של 95 °C למשך 15 s, 60 °C למשך 60 s, ו-95 °C למשך 15 s. כל התגובות בוצעו בשלישייה. ביטוי יחסי חושב באמצעות שיטת 2^−ΔΔCt כאשר GAPDH שימש כגן הבית. תמיסות מלאי של פריימרים הוכנו בריכוז של 10 µM במים מזוקקים פעמיים ונשמרו ב-20 °C- בחושך. רצפי הפריימרים מופיעים ב-Supplementary Table 3.

Western blotting

חלבון תאי כולל חולץ באמצעות בופר radioimmunoprecipitation assay על קרח למשך 30 min, וסבב בצנטריפוגה במהירות 12,000 x g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. חלבונים הופרדו בשיטת 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis והועברו לממברנות polyvinylidene fluoride בנחירות של 0.22 µm. הממברנות נחסמו עם 5% (w/v) חלב דל שומן ב-Tris-buffered saline עם 0.1% Tween 20 (TBST) למשך 2 h בטמפרטורת החדר והודגרו למשך הלילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים anti-SHMT2 (1:1,000) ו-anti-GAPDH (1:2,000) המדוללים ב-5% חלב דל שומן‑TBST. לאחר שלושה שטיפות של 8 min כל אחת עם TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20), הודגרו הממברנות עם נוגדנים משניים המצומדים ל-horseradish-peroxidase (1:5,000) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. האותות פותחו באמצעות תסבסיר enhanced chemiluminescence שהוכן מערבוב של נפחים שווים של תמיסות A ו-B, הודגרו למשך 2 min בטמפרטורת החדר בחשכה, ונלכדו באמצעות מערכת דימוי chemiluminescence.

תיקוף אימונוהיסטוכימיה של HPA

דפוסי הביטוי של חלבון SHMT2 ברקמת ריאה נורמלית וב-LUAD הוערכו באמצעות ה-HPA. בוצעה שאילתה עבור "SHMT2" ב-HPA, ותמונות אימונוהיסטוכימיה (IHC) מייצגות והערות פתולוגיות נלוות הורדו לצורך השוואה. כדי למזער הטיות הנובעות מסגפיות נוגדנים, הועדפה עדיפות לנוגדנים עם רמות תיקוף גבוהות יותר ב-HPA. במידת האפשר, תוצאות IHC ממספר נוגדנים הושוו באופן הצלבה (HPA020543 ו-HPA020549).

השתקה של SHMT2 בתאי LUAD

כדי לבחון את התפקיד הפנימי של SHMT2 בתאי גידול ב-LUAD, בוצע knockdown של SHMT2 בתאי H1299 ו-A549 באמצעות shRNA. ה-shRNA נשא על ידי וקטור לנטיוויראלי עם פרומוטר H1 וברירה באמצעות puromycin; פלסמידים לאריזה הועברו בטרנספקציה משותפת במהלך ייצור הווירוס. sh-SHMT2 כוון לאזור המקודד של SHMT2 האנושי, בעוד ש-sh-NC שימש כביקורת שלילית (scrambled). למלאים הווירוסליים שהוכנו היה titer של ≥ 1 x 10⁸ יחידות טרנסדוקציה/mL והם נשמרו ב-80 °C-. התאים הוחדרו עם חלקיקים לנטיוויראליים של sh-SHMT2 או sh-NC כפי שמתואר בטבלת החומרים. לאחר 48 שעות, יעילות ה-knockdown נבחנה באמצעות RT-qPCR ו-western blotting. רק תאים עם השתקה מאושרת של SHMT2 שימשו לבדיקות של פרוליפרציה, נדידה ויצירת מושבות.

בדיקת ת proliferation של תאים

שגשוג תאים הוערך באמצעות מבחן CCK-8. תאי H1299 ו-A549 שעברו טרנספקציה נזרעו בלוחות בעלי 96 בארות בריכוז של 5 x 10³ תאים לכל באר בשש חזרות. בימים 1, 2, 3, 4 ו-5, 10 µL של ריאגנט CCK-8 הוסף לכל באר (10% מנפח מדיום התרבית) ודגרו למשך שעתיים ב- 37 °Cנמדדה בליעה באורך גל של 450 ננומטר, והיא שימשה כמדד לחיוניות התאים.

בדיקת ריפוי פצעים

נדידת תאים הוערכה באמצעות בדיקת ריפוי פצע (wound-healing assay). תאי H1299 ו-A549 שעברו טרנספקציה נזרעו לפלטות בעלות 6 בארות והגודלו עד להגעה ל-90–95% התמגשות (confluence). פצע ליניארי נוצר באמצעות טיפ פחית של פפיטה סטרילית בנפח 200 µL, ותאים שנותקו הוסרו באמצעות שטיפה עדינה ב-phosphate-buffered saline. לאחר מכן, התאים הוחזקו במדיום ללא סרום או עם ריכוז סרום נמוך, ואזור הפצע צולם ב-0 h וב-24 h תחת מיקרוסקופ הפוך. סגירת הפצע נמדדה כמותית באמצעות תוכנת ניתוח התמונות המפורטת בטבלת החומרים, וחושבה כאחוז ההפחתה ביחס לשטח הפצע הראשוני.

בדיקת יצירת מושבות

לניתוח יצירת מושבות, תאי H1299 ו-A549 שעברו טרנספקציה נזרעו לפלטות של 6 בארות בריכוז של 800 תאים לבערה וגודלו במשך כ-10–14 ימים עד להיווצרות מושבות נראות לעין, תוך ניטור מיקרוסקופי במהלך התרבית. המושבות קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ונצבעו ב-0.1% crystal violet למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מושבות המכילות יותר מ-50 תאים נספרו תחת מיקרוסקופ אור.

ניתוח סטטיסטי עבור ניסויי in vitro

כל הניסויים in vitro בוצעו באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקנית. להשוואות בין שתי קבוצות נעשה שימוש במבחן t של Student, וערך p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטבולינומיקה של רקמות חושפת עיצוב מחדש מטבולי נרחב ב-LUAD עם העשרה בולטת של מסלולים הקשורים לגליצין

רקמות גידול ורקמות ריאה נורמליות סמוכות מזווגות מ-23 חולים עם LUAD נסרקו באמצעות iEESI-MS ישיר; מאפייני החולים ואנוטציות של מטבוליטים דיפרנציאליים מופיעים ב-Supplementary Table 1 וב- Supplementary Table 2. לאחר נורמליזציית log₂, ניתוח OPLS-DA הראה הפרדה ברורה בין הפרופילים המטבוליים של הגידול לאלו של הרקמה הנורמלית (R²X = 0...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה השתמש במסגרת רצפית הכוללת גילוי מטבולומי, תיעדוף אנזימים, פרשנות טרנסקריפטומית, הערכת הקשר חיסוני, לוקליזציה ברמת התא הבודד ותיקוף תפקודי של תאי גידול. האנליזות מזהות עיצוב מחדש מטבולי של גליצין ושל SGOC ב-LUAD ומקשרות את SHMT2 לתוצאות שליליות ולתועלת נמוכה יותר מטיפול אימונותרפי כפי שחזו מודלים חישוביים. תיעדוף זה חזק יותר מהסתמכות על שכבת אומיקה בודדת, אך אינו מבסס מנגנון סיבתי חיסוני.

SHMT2 מהווה נקודת כניסה מיטוכונדריאלית מרכזית להמרה של serine ל-glycine וליצירת יחידות פחמן אחת (on...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים למטופלים ולבני משפחותיהם על השתתפותם במחקר זה. המחברים מודים גם לתורמים למסדי הנתונים TCGA, GEO ו-HPA על כך שהפכו את נתוניהם לנגישים לציבור. מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של מחוז ג'יאנגשי (מענק מס' 20223BBG71009) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים מס' 81860379 ו-82160410).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג
תאי A549	CCL-185	ATCC
נוגדן anti-GAPDH	M1310-2	Huaan Biotechnology
נוגדן anti-SHMT2	D197021	Sangon Biotech
תאי BEAS-2B	CRL-9609	ATCC
ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8)	K1018	APExBIO
מאגר נתונים: TCGA / GDC	נגש ב-2025-12-18	המכון הלאומי לסרטן (NCI)
מאגר נתונים: GEO	נגש ב-2025-12-20	NCBI
מאגר נתונים: HMDB	נגש ב-2025-12-12	מאגר המטבולום האנושי
מאגר נתונים: KEGG	נתアクセス ב-2025-12-11	Kanehisa Laboratories
מאגר נתונים: Human Protein Atlas		אטלס החלבונים (Protein Atlas)
מאגר נתונים: GDSC	מהדורה דצמבר 2023	Sanger Institute
מאגר נתונים: Ensembl	2025-12	EMBL-EBI
מאגר נתונים: TCIA	נגש ב-2025-12-10	אטלס האימונום של הסרטן
תאי H1299‏ (NCI-H1299)	CRL-5803	ATCC
נוגדן משני המשורשר ל-HRP	D110087	Sangon Biotech
HiScript II Q Select RT SuperMix	KR116	Tiangen Biotech
מערכת LightCycler 480	5015278001	Roche
חלב דל שומן	ריאגנט מעבדה נפוץ	BD (או כפי שנעשה בו שימוש)
ממברנת PVDF, 0.22 µm	GVHP00010 (או ריאגנט מעבדתי נפוץ)	MilliporeSigma (או כפי שנעשה בו שימוש)
חבילת R: pRoloc	1.40.0	Bioconductor
חבילת R: TCGAbiolinks	2.26.0	Bioconductor
חבילת R: survival	3.4-0	CRAN
חבילת R: survminer	0.4.9	CRAN
חבילת R: timeROC	1.0.4	CRAN
חבילת R: DESeq2	1.38.1	Bioconductor
חבילת R: ggplot2	3.4.4	CRAN
חבילת R: pheatmap	1.0.12	CRAN
חבילת R: clusterProfiler	4.6.2	Bioconductor
חבילת R: org.Hs.eg.db	3.16.0	Bioconductor
חבילת R: estimate	1.0.13	Bioconductor / GitHub
חבילת R: CIBERSORT	1	(סקריפט R עצמאי)
חבילת R: corrplot	0.92	CRAN
חבילת R: TIDE	0.3.0	חבילת R
חבילת R: oncoPredict	1.1.1	CRAN / GitHub
חבילת R: GEOquery	2.66.0	Bioconductor
חבילת R: Seurat	4.3.0	CRAN
חבילת R: SingleR	1.10.0	Bioconductor
חבילת R: scran	1.26.0	Bioconductor
תערובת מאסטר ל-qPCR עם SYBR Green (אוניברסלית)	HY-K0501A	MedChemExpress (MCE)
ריאגנט TRIzol Universal	DP424	Tiangen Biotech

מקורות

Siegel RL, et al. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 2025;75(1):10-45.
Lim ZF, Ma PC. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 2019;12(1):134.
Wang M, Herbst RS, Boshoff C. Toward personalized treatment approaches for non-small-cell lung cancer. Nat Med. 2021;27:1331-1340.
Passaro A, et al. Managing resistance to immune checkpoint inhibitors in lung cancer: treatment and novel strategies. J Clin Oncol. 2022;40:598-609.
Faubert B, Solmonson A, DeBerardinis RJ. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 2020;368:eaaw5473.
Wei S, et al. Targeting serine-glycine-one-carbon metabolism as a vulnerability in cancers. Biomark Res. 2023;11:48.
Kao KC, Vilbois S, Tsai CH, Ho PC. Metabolic communication in the tumour-immune microenvironment. Nat Cell Biol. 2022;24(11):1574-1583.
Wong C, Qian Y, Yu J. Interplay between epigenetics and metabolism in oncogenesis: mechanisms and therapeutic approaches. Oncogene. 2017;36:3359-3374.
Xu M, Pei DS. Serine hydroxymethyltransferase 2: a novel target for human cancer therapy. Invest New Drugs. 2021;39:1671-1681.
Zeng Y, et al. Roles of mitochondrial serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) in human carcinogenesis. J Cancer. 2021;12(19):5888-5894.
Liberati FR, et al. RNA-mediated inhibition of mitochondrial SHMT2 impairs cancer cell proliferation. Cell Death Discov. 2025;11:369.
Fu R, et al. SHMT proteins: an emerging set of serine hydroxymethyltransferase in cancer. Cell Signal. 2025;135:111977.
Zhang Y, et al. SHMT2 promotes cell viability and inhibits ROS-dependent, mitochondrial-mediated apoptosis via the intrinsic signaling pathway in bladder cancer cells. Cancer Gene Ther. 2022;29(10):1514-1527.
Wens M, et al. Metabolic control of BRISC-SHMT2 assembly regulates immune signalling. Nature. 2019;570:460-464.
Ivashkiv LB. IFNγ: signalling, epigenetics and roles in immunity, metabolism, disease and cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2018;18:545-558.
De Martino M, Rathmell JC, Galluzzi L, Vanpouille-Box C. Cancer cell metabolism and antitumour immunity. Nat Rev Immunol. 2024;24:654-669.
Qi Y, et al. One-carbon metabolism shapes T cell immunity in cancer. Trends Endocrinol Metab. 2024;35:961-974.
Huang D, et al. The single-cell immunogenomic landscape of B and plasma cells in early-stage lung adenocarcinoma. Cancer Discov. 2022;12:2545-2563.
Dolgalev I, et al. Inflammation in the tumor-adjacent lung as a predictor of clinical outcome in lung adenocarcinoma. Nat Commun. 2023;14:6479.
Han T, et al. Phosphorylated SHMT2 regulates oncogenesis through m6A modification in lung adenocarcinoma. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2307834.
Lee GY, et al. Comparative oncogenomics identifies PSMB4 and SHMT2 as potential cancer driver genes. Cancer Res. 2014;74:3114-3126.
Bernhardt S, et al. Proteomic profiling of breast cancer metabolism identifies SHMT2 and ASCT2 as prognostic factors. Breast Cancer Res. 2017;19:112.
Yang G, Tan J, Guo J, Wu Z, Zhan Q. Exosome-mediated transfer of circ_0063526 enhances cisplatin resistance in gastric cancer cells via regulating the miR-449a/SHMT2 axis. Anticancer Drugs. 2022;33(10):1047-1057.
Parsa S, et al. The serine hydroxymethyltransferase-2 (SHMT2) initiates lymphoma development through epigenetic tumor suppressor silencing. Nat Cancer. 2020;1:653-664.
Cuthbertson CR, et al. A review of small-molecule inhibitors of one-carbon enzymes: SHMT2 and MTHFD2 in the spotlight. ACS Pharmacol Transl Sci. 2021;4:624-646.
Reina-Campos M, Scharping NE, Goldrath AW. CD8+ T cell metabolism in infection and cancer. Nat Rev Immunol. 2021;21:718-738.
Bacigalupa ZA, Landis MD, Rathmell JC. Nutrient inputs and social metabolic control of T cell fate. Cell Metab. 2024;36:10-20.
Li S, et al. Metabolic regulation of immunity in the tumor microenvironment. Cell Rep. 2025;44(11):116463.
Ouyang Y, et al. S-adenosylmethionine: a metabolite critical to the regulation of autophagy. Cell Prolif. 2020;53(11):e12891.
Wang R, et al. The interaction of innate immune and adaptive immune system. MedComm. 2024;5(10):e714.
Teillaud JL, et al. Tertiary lymphoid structures in anticancer immunity. Nat Rev Cancer. 2024;24:629-646.
Fridman WH, et al. B cells and tertiary lymphoid structures as determinants of tumour immune contexture and clinical outcome. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19:441-457.
Lauss M, Donia M, Svane IM, Jönsson G. B cells and tertiary lymphoid structures: friends or foes in cancer immunotherapy? Clin Cancer Res. 2022;28(9):1751-1758.
Xi Y, et al. Macrophage efferocytosis mediated by the TP63-RAC2 pathway promotes immunosuppressive remodeling in esophageal cancer. Cell Rep Med. 2026;7(1):102529.
Jiang G, et al. SATB2 plays a critical role in pancreatic cancer cell proliferation, migration and T cell cytotoxicity. Cancer Genet. 2025;296-297:53-64.
Liu Y, et al. TRIM29 promotes glioblastoma progression via ubiquitinating NEFL and activating the PI3K/AKT signaling pathway. Cancer Genet. 2025;296-297:88-99.
Zhai H, et al. WDR54 enhances NF-κB signaling to promote progression of hepatocellular carcinoma. Cancer Genet. 2025;298-299:302-314.
Yin H, et al. PLAU serves as a prognostic biomarker correlated with perineural invasion in HNSCC. Cancer Genet. 2025;294-295:145-155.
Liu Z, et al. JAK inhibition in PD-1 immunotherapy and tumor microenvironment. Front Immunol. 2026;17:1790936.
DeNicola GM, et al. NRF2 regulates serine biosynthesis in non-small cell lung cancer. Nat Genet. 2015;47(12):1475-1481.
Zhang W, et al. NRF2-mediated persistent adaptation of oesophageal adenocarcinoma cells to HER2 inhibition. Oncogene. 2025;44(33):2929-2941.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סמן ביולוגי SHMT2 מטבוליזם SGOC פרופיל מטבולימי נקודת בקרה חיסונית ריצוף RNA של תא בודד דיספונקציה חיסונית רגישות לתרופות Western Blotting השתקת SHMT2