מאמר שיטה

ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים ממיס טעונות ב-3BDO לצמיחה מחודשת של שיער בעכברי C57BL/6

74 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71814

⸱

25 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הייצור, האפיון והיישום של מדבקות מיקרו-מחטים ממיס טעונות ב-3BDO למסירת תרופות דרך העור במודל של צמיחה מחודשת של פרווה בעכברים.

תקציר

לטיפולים קונבנציונליים להמראת שיער אנדרוגנית (AGA) יש מגבלות, דבר המניע לחיפוש גישות חלופיות להולכת תרופות. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, האפיון והיישום של מדבקות מיקרו-מחטים (MN) ממיסות העשויות מחומצה היאלורונית/כיטוזן (HA/CS) וטעונות ב-3BDO, במודל של צמיחה מחודשת של שיער בעכברי C57BL/6. השיטה משתמשת בתהליך יציקה דו-שלבי בתבנית פולידימეთילסילוקסן (PDMS) כדי לרכז את ה-3BDO בקצות המחטים, תוך יצירת שכבת גב של HA/CS ללא תרופה. המדבקה מאופיינת באמצעות דימות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), בדיקות מכניות, בדיקות החדרה לעור והמיסות, בדיקות שחרור in vitro, בדיקות אנטי-בקטריאליות, בדיקות ציטוטוקסיות והערכת צמיחה מחודשת של שיער in vivo. עם ההחדרה, קצות ה-MN נמסים ומשחררים 3BDO באופן מקומי. הערכה in vivo הראתה כי לקבוצת ה-MN הטעונה ב-3BDO הייתה צמיחה מחודשת אחידה יותר של שיער בהשוואה לקבוצות ההזרקה התת-עורית והביקורת שנבדקו. פרוטוקול זה תומך גם בהערכת מורפולוגיית המדבקה, ביצועי ההחדרה והביקומיליביליות המקומית. שיטה זו מספקת תהליך עבודה פרה-קליני להערכת הולכה מתווכת-MN של 3BDO ליישומי צמיחה מחודשת של שיער.

מבוא

אלפציה אנדרוגנית (AGA) היא אחת מהפרעות ההשפעה הקליניות השכיחות ביותר, והיא מאופיינת בעיקר כדילול הדרגתי ואיבוד שיער בקרקפת. השכיחות שלה במהלך החיים נותרת גבוהה באופן עקבי בקרב גברים, מה שהופך אותה לסוגיה בריאותית קריטית הדורשת פתרון דחוף1,2. כיום, טיפולים קליניים ל-AGA מסווגים בעיקר להתערבויות פרמקולוגיות ולהשתלה כירורגית, שלשתיהם חסרונות משמעותיים. תרופות טיפוליות מהקו הראשון, כגון finasteride ו-minoxidil, מראות השפעות טיפוליות מסוימות אך הן קשורות לתופעות לוואי מוגדרות כמו דספונקציה מינית, גרד בקרקפת ויובש בקרקפת1,3. למרות שהשתלת שיער יכולה להשיג צמיחה מקומית של שיער, היא מוגבלת על ידי עלויות טיפול גבוהות, כמות שיער לא מספקת באזורי התורם ושיעורי הישרדות משתנים של הש transplanted grafts, מה שמקשה על הפצתה הרחבה בפרקטיקה הקלינית1. בהינתן מגבלות אלו, קיים צורך באסטרטגיות טיפוליות חדשניות המשלבות יעילות, בטיחות והסכמה של המטופל לטיפול.

3BDO הוא מפעיל mTOR מסוג מולקולה קטנה המתחרה עם rapamycin4. הוא נמצא בשימוש נרחב כמעכב אוטופגיה במערכות שונות5,6,7. לדוגמה, טיפול ארוך טווח ב-3BDO עשוי לשפר את תפקודי הזיכרון על ידי הפחתת מספר האוטופגוזומים8. בנוסף, ראיות מצטברות מצביעות על כך ש-3BDO עשוי לפעול באופן עצמאי כמפעיל mTOR. לדוגמה, 3BDO עיכב מוות של תאים אנדותליאליים והתפתחות של טרש Arteriosclerosis בעכברים, ללא תלות בפעילות mTOR9. עם זאת, תפקידו הפוטנציאלי בצמיחת זקיקי שיער לא דווח עד כה. באופן בולט, במחקרינו המקדמיים נמצא כי 3BDO מקדם צמיחה מחדש של שיער. עם זאת, לשיטות מסורתיות להגשה טופית של תרופות יש מגבלות ברורות. השכבה הקרנית (stratum corneum) של העור מגבילה את היעילות הטרנסדרמלית, מה שמקשה על הובלת תרופות לאתר היעד של זקיק השיער בדרמיס. למרות שג'לים טרנסדרמליים יכולים להאריך את זמן השהייה של התרופה, הם עלולים להשאיר שאריות לא רצויות. היעילות הקלינית של שתי אסטרטגיות הטיפול שהוזכרו לעיל נותרת תת-אופטימלית10,11.

מיקרו-מחטים (MNs) הן טכנולוגיה חדשנית וחסרת כאב להולכת תרופות, שיתרונן המרכזי טמון ביכולתן לחדור בקלות את השכבה הקרנית (stratum corneum) ולהביא תרופות באופן מדויק למיקרו-סביבה הפרי-פוליקולרית (perifollicular) בחיבור שבין האפידרמיס לדרמיס. בנוסף, ה-MNs מתאפיינות בשימוש נוח, פולשנות מינימלית ועלות סבירה12,13,14. כדי להתגבר על צוואר הבקבוק בהולכה התת-עורית של 3BDO מקומי, פותח מדבקת MN המשתמשת בחומצה היאלורונית (HA) כמטריצה ובקיטוזן (CS) כרכיב הפונקציונלי. שילוב ה-CS נועד לספק רכיב פונקציונלי בעל פוטנציאל אנטי-בקטריאלי. יתרה מכך, יישום של HA על עור של עכברים עם אלפציה יכול לעודד באופן משמעותי את התפתחות זקיקי השיער15. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את הייצור ואפיון של מערכת MN מסיסה טעונה ב-3BDO ואת יישומה במודל של צמיחת שיער מחדש בעכברי C57BL/6 לאחר הסרת שיער. מודל זה שימושי להערכת תגובות צמיחת שיער לאחר הסרת שיער, אך הוא אינו מהווה כשלעצמו הוכחה ליעילות קלינית עבור AGA.

פרוטוקול

המחקר אושר על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences (W202112030345). כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.

1. ייצור מדבקות 3BDO@MN

  1. הכנת פורמולציית CS/HA
    1. שקלו 1 g של אבקת CS (דרגת דה-אצטילציה ≥ 95%) והוסיפו אותה ל-20 mL של מים מזוקקים, ולאחר מכן ערבבו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 min.
    2. המשיכו להוסיף 0.4 mL של תמיסת חומצה אצטית בריכוז 2% (v/v) (משקל מולקולרי 60.05) והמשיכו בערבוב למשך 2 h.
      אזהרה: חומצה אצטית רכזת היא חומר קורוזיבי. בצעו את הדילול והטיפול במכסורת פירסול (fume hood), והשתמשו בכפפות חד-פעמיות ובמשקפי מגן למניעת מגע עם העור וריריות.
    3. המשיכו בהוספה של 2 g של אבקת HA ולאחר מכן סנטריגו את הפורמולציה המעורבבת ב-1,207 × g (בערך 3,000 rpm) למשך 5 min כדי להבטיח המסה מלאה.
      ​הערה: יש להכין את פורמולציית ה-CS/HA באופן טרי, וניתן לשמרה במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך לא יותר מ-24 h.
  2. הכנת פורמולציית CS/HA טעונה ב-3BDO
    1. הוסיפו את תמיסת ה-3BDO המומסת מראש (2 mg/mL) בתוך dimethyl sulfoxide (DMSO)
      אזהרה: DMSO חודר דרך העור. השתמשו בכפפות במהלך הפעולה כדי למנוע מגע ישיר עם העור, והוסיפו אותה לפורמולציית ה-CS/HA. ערבבו כדי להבטיח המסה מלאה.
    2. סנטריגו את הפורמולציה המעורבבת ב-1,207 × g למשך 5 min כדי להסיר בועות אוויר כלשהן שנלכדו.
      ​הערה: אם בועות נותרות לאחר הסנטריפוגה, הניחו לפורמולציה לעמוד למשך 5 min ולאחר מכן סנטריגו שוב.
  3. ייצור מדבקות 3BDO@MN
    1. השתמשו בתבנית MN מ-polydimethylsiloxane (PDMS), הכוללת מערך של 20 × 20 קצוות קוניים בגובה 600 µm, קוטר בסיס של 250 µm ומרווח (pitch) של 550 µm.
    2. טפלו בפני השטח של תבנית ה-PDMS באמצעות מנקה פלזמה כדי להפוך אותה להידרופילית לחלוטין.
    3. הוסיפו 1 mL של פורמולציית 3BDO@CS/HA לתבנית ה-PDMS MN. הניחו את התבנית בתא ואקום והפעילו ואקום למשך 10 min כדי להקל על חדירת הפורמולציה הצמיגית לתוך המיקרו-חללים.
    4. סנטריגו את התבנית ב-134 × g למשך 5 min ב-RT כדי להבטיח שהפורמולציה ממלאת את כל החללים. השתמשו במגרד מתכת סטרילי כדי להסיר בזהירות שאריות פורמולציה מפני השטח של התבנית, כך שיישאר מישור שטוח לחלוטין.
    5. מרחו את תערובת מטריצת ה-CS/HA ללא 3BDO על פני השטח של התבנית. סנטריגו ב-134 × g למשך 5 min ב-RT כדי ליצור שכבת גיבוי אחידה.
    6. הניחו את התבנית בתנור בטמפרטורה של 36 °C ולחות של 37% וייבשו אותה למשך הלילה (בערך 12–16 h).
    7. קלפו את מדבקת ה-MN המיובשת לחלוטין מהתבנית לאחר שהתבנית התקררה ל-RT.
      הערה: שמרו את מדבקות ה-3BDO@MN המיוצרה במקרר בטמפרטורה של 4 °C עד למועד השימוש.

2. אפיון של מדבקות 3BDO@MN

  1. מקם את מדבקת ה-3BDO@MN שהוכנה על גבי stub באמצעות סרט פחמן מוליך דו-צדדי.
    1. בצע ציפוי בשיטת sputter-coating לדגימה המותקנת בשכבה דקה של זהב (או פלטינה) כדי לשפר את המוליכות החשמלית.
    2. הכנס את ה-stub של הדגימה לתא הוואקום של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם פליטת שדה (FE-SEM).
    3. כוונן את מתח ההאצה ואת מרחק העבודה כדי לקבל דימוי ברזולוציה גבוהה. בחן את מורפולוגיית המערך הכללית ואת טופוגרפיית הפנים העדינה של כל MN.
    4. השג מיקרוגרפיות SEM מייצגות. מדוד את אורך ה-MN ואת קוטר הקצה שלו.
  2. בדיקת חוזק מכני
    1. הנח את מדבקת ה-MN בצורה שטוחה על במת בדיקת הדגימות של מנתח מרקמים (texture analyzer). ודא שהמצע שטוח לחלוטין וקצוות המחטים פונים ישירות כלפי מעלה.
    2. חבר גשושית גלילית שטוחה (בקוטר 25 mm) בבטחה לתא העומס של המכשיר.
    3. הורד את הגשושית אנכית עד שתהיה ממוקמת ממש מעל קצוות ה-MN. הימנע מכל מגע פיזי בין הגשושית לקצוות לפני הבדיקה.
    4. הגדר את פרמטרי הבדיקה הספציפיים בתוכנה: קבע את מהירות הבדיקה כלפי מטה ל-0.05 mm/s, ואת מרחק ההעתקה המיועד ל-0.7 mm.
  3. בדיקת התמוססות
    1. פרס עור גב של חולדה על לוח נתיחה וייבש את פני השטח של העור. שמור על העור שטוח וללא קמטים.
    2. הנח מדבקות MN יבשות כאשר קצוות המחטים פונים כלפי מטה על פני העור, והפעל לחץ אנכי אחיד כדי להבטיח את החדרת ה-MNs אל העור.
    3. הסר את המדבקות מהעור במרווחי זמן שנקבעו מראש (5, 10, 30 ו-60 s) וייבש למשך 5 min.
    4. בחן את המורפולוגיה השארית באמצעות SEM תחת אותם תנאי דימוי.
  4. בדיקות שחרור תרופה In vitro
    1. הוסף 500 µL של סליין בבופר פוספט (PBS) לכל באר בלוח בעל 6 בארות. מקם את ה-MNs הטעונים ב-3BDO בכל באר כך שיהיו במגע עם ה-PBS.
    2. דגור את הלוחות ב-RT. בכל נקודת זמן, אסוף 500 µL של PBS לצורך כימות ריכוז ה-3BDO.
    3. השלם מיד כל באר עם 500 µL של PBS טרי כדי לשמור על תנאי sink.
    4. חשב את האחוז המצטבר של 3BDO ששוחרר בהתבסס על סך טעינת התרופה הראשונית ב-MNs.
  5. בדיקות אנטי-בקטריאליות
    1. הוצא מלאי תאי בקטריות (E. coli ו- Staphylococcus aureus) מאחסון ב-80 °C-, והוסף 10 µL מכל מלאי תאים ל-5 mL של מצע LB.
    2. דגור את המצע המוחדר במנער-דגור (incubator shaker) ב-37 °C וב-250 rpm למשך כ-16 h (במהלך הלילה).
    3. כוונן את תרבית הבקטריות עם מצע LB ל-OD620 ראשוני של 0.01.
    4. דלל את תמיסת המלאי של CS עם מים סטריליים כדי להכין תמיסות CS בשש רמות ריכוז (1, 5, 10, 50, 100 ו-500 mg/mL), עם שלוש חזרות לכל ריכוז.
    5. חלק את הדגימות לשלוש קבוצות: קבוצת blank, קבוצת ביקורת וקבוצת CS. עבור קבוצת ה-blank, הוסף 200 µL של LB. עבור קבוצת הביקורת, הוסף 180 µL של תמיסת בקטריות ו-20 µL של מים סטריליים. עבור קבוצת ה-CS, הוסף 180 µL של תמיסת בקטריות ו-20 µL של תמיסת CS בריכוז המתאים.
    6. דגור ב-37 °C למשך 20 h.
    7. מדוד ורשום את ה-OD620 של כל באר בלוח בעל 96 בארות באמצעות קורא פלטות של בליעה (absorbance plate reader) ב-0 h וב-20 h.
  6. הערכות ציטוטוקסיות
    1. זרע 100 µL של תרחיף תאי אפידרמיס או דרמיס בתוך לוח בעל 96 בארות (2 × 103 תאים לבער).
    2. הוסף 10 µL מהטיפולים הרלוונטיים לבארים הייעודיות כדי להקים ארבע קבוצות: קבוצת ביקורת (מצע תרבית), קבוצת 3BDO (ריכוז סופי של 1 µM), קבוצת תמצית MN, וקבוצת תמצית 3BDO+MN, עם 3 חזרות לכל קבוצה.
    3. דגור ב-37 °C, 5% CO₂ למשך 24 h.
    4. הוסף 10 µL של תמיסת עבודה של Cell Counting Kit-8 (CCK-8) לכל באר.
      הערה: הימנע מיצירת בועות בבארים, שכן הן עלולות להשפיע על קריאות הבליעה.
    5. דגור ב-37 °C, 5% CO₂ למשך 2 h.
    6. קרא את הבליעה ב-450 nm עבור כל הבארים באמצעות ספקטרופוטומטר של לוחות מיקרו.
    7. נתח את הנתונים וחשב את שיעור הישרדות התאים.

3. ניסויי בעלי חיים

  1. הכנה וטיפול בבעלי החיים לניסוי
    1. הרדמה של עכברים זכרים בני 7 שבועות מסוג C57BL/6 באמצעות isoflurane, תוך שמירה על ויסות תרמי במהלך ההרדמה.
      אזהרה: Isoflurane הוא חומר הרדמה נדיף. יש לעבוד בסביבה מאווררת היטב כדי למנוע שאיפה מרובה.
    2. מריחת חומר סיכה אופטלמי לעיני העכברים כדי להגן עליהן מהתייבשות.
    3. גילוח שיער הגב של העכברים באמצעות מכשיר גילוח חשמלי, כך ששטח הגילוח יהיה כ-2 × 2 cm2.
    4. מריחת קרם להסרת שיער, המתנה של 5–10 s, ולאחר מכן ניגוב. ניגוב העור עם תמיסת סליין (saline) להסרת שאריות של קרם להסרת שיער ושיער.
    5. חיתוך מדבקות ה-MN והנחתן בצד.
    6. חלוקה אקראית של העכברים הגלוחים לחמש קבוצות (n = 5 לכל קבוצה) וטיפול באופן הבא:
      1. קבוצת ביקורת ללא טיפול: גילוח השיער בלבד ללא כל טיפול.
      2. קבוצת מדבקת MN ריקה: טיפול בעור הגלוח באמצעות מדבקות MN ללא 3BDO, לפי אותו לוח זמנים כשל קבוצת 3BDO@MN.
      3. קבוצת מדבקת 3BDO@MN: טיפול בעור הגלוח באמצעות מדבקות 3BDO@MN בימים 1, 3, 5, 7, 9, 11 ו-13.
      4. קבוצת הזרקה תת-עורית של PBS: מתן הזרקה תת-עורית של תמיסת PBS לאזור הגב הגלוח של העכברים מדי יום.
      5. קבוצת הזרקה תת-עורית של 3BDO: מתן הזרקה תת-עורית של תמיסת 3BDO לאזור הגב הגלוח של העכברים מדי יום.
    7. הנחת מדבקות 3BDO@MN על העור הגלוח, והפעלת לחץ אנכי אחיד להבטחת חדירת ה-MNs אל העור. קיבוע מדבקות ה-3BDO@MN באמצעות תחבושת אלסטית ושימוש בתפס straight clamp להחזקת התחבושת במקומה.
      ​הערה: לוחות הזמנים השונים למתן התרופה נבחרו בהתאם למאפייני ההגשה השונים של כל אסטרטגיה: מדבקת 3BDO@MN מספקת שחרור ממושך מקומי, בעוד שהזרקה תת-עורית מספקת את ה-3BDO כמינון בולוס (bolus dose).
    8. מעקב אחר העכברים לאורך כל הניסוי כדי לוודא שהם התאוששו לחלוטין מההרדמה.
  2. איסוף דגימות והערכת צמיחת שיער
    1. צילום עור הגב של העכברים מדי יום לתיעוד צמיחת השיער.
    2. הערכת צמיחה מחדש של השיער על ידי מדידת קוטר גבעול השערה, כיסוי השערה וצפיפות השערה ביום 15. כימות אחוז כיסוי השיער באזור המטופל באמצעות תוכנת ImageJ.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג את הייצור והאפיון של מדבקת ה-3BDO@MN. איור 1 מציג את הסכימה של תהליך הייצור של מדבקת ה-3BDO@MN. 3BDO עורבב לתוך פורמולציית ה-CS/HA, ותערובת המטריצה הוספה לאחר מכן לתבנית ה-PDMS MN ועברה צנטריפוגה כדי למלא את קודקודי המחטים. תערובת מטריצת CS/HA ללא 3BDO הוספה למשטח התבנית ועברה צנטריפוגה כדי למלא את שכבת התמיכה. לאחר ייבוש מלא, המדבקות קולפו כדי לקבל את מדבקות ה-3BDO@MN. המורפולוגיה של ה-MNs אופיינה באמצעות SEM, כפי שמוצג ב- איור 2A.

ה-MNs הקוניים נוצרו באופן אחיד במערך של 20 × 20 על פלסטר בגודל 15 × 15 mm, כאשר לכל אחד רוחב בסיס של 250 µm וגובה של 600 µm. קצוות ה-MN עמדו בכוח של 1.2 N, המספיק לחדירה לעור, כפי שהוכח על ידי חורי חדירה ברורים שנצפו באמצעות צביעת hematoxylin and eosin (H&E) (איור 2B,C). עור גב של עכבר שימש לאחר מכן לבדיקת היישום של פלסטרי 3BDO@MN. הפלסטרים נלחצו על עור העכבר למדידת זמן ההמסה, וקצוות ה-MN נמסו לחלוטין בתוך 60 s (איור 2D). במבחן in vitro, פרופיל השחרור של 3BDO מה-MNs הראה כי כ-90% מהתרופה שוחררו (איור 2E). תמצית ה-MN לא הראתה ציטוטוקסיות בתאי אפידרמיס ודרמיס, בעוד ש-1 µM של 3BDO קידמו באופן משמעותי את צמיחת התאים (איור 2F). הפורמולציה המכילה קיטוזן הראתה פעילות אנטי-בקטריאלית תלוית ריכוז נגד E. coli ונגד S. aureus, עם השפעה בולטת יותר בריכוזים העולים על 10 mg/mL (איור 2G,H). תוצאות אלו תומכות בשימוש בקיטוזן כמרכיב פונקציונלי בפורמולציית ה-MN, אם כי יידרשו בדיקות נוספות של הפלסטרים המיוצרים הסופיים כדי לאשר את הביצועים האנטי-בקטריאליים בתנאי יישום.

תוצאות ניסויי בעלי החיים הדגימו כי קבוצת ה-3BDO@MN הראתה פיגמנטציה משמעותית של העור ביום ה-5. ביום ה-15, הקבוצה שקיבלה הזרקות 3BDO הראתה כיסוי שיער של כ-45%, בהשוואה לכ-39% בקבוצת הביקורת, בעוד שקבוצת ה-3BDO@MN הגיעה לכיסוי של כ-90% (איור 3). צמיחת השיער מחדש בקבוצת ה-3BDO@MN הייתה אחידה וצפופה יותר, מה שמעיד על חדירה ושימור טובים יותר של התרופה בהשוואה להזרקה ישירה.

יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שהחדרה של 3BDO באמצעות MN קידמה צמיחה מחודשת של שיער במודל עכברי C57BL/6 שעבר דפיגציה במחקר זה. נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע האם גישה זו יעילה במודלים ספציפיים למחלה של אלופציה אנדרוגנית ותחת תנאי מינון רלוונטיים מבחינה קלינית.

דיאגרמה של תהליך ביו-הדפסה בתלת ממד: ציפוי 3BDOQCS/HA, צנטריפוגה, ייבוש בוואקום, מטריצת CS/HA.
איור 1. איור סכמטי של תהליך הייצור של 3BDO@MNs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמות של מערך מחטים מיקרוסקופיות וגרפים של חיות תאים; מחקר על תכונות אנטי-בקטריאליות של כיטוזן לקטט.
איור 2. ייצור ואפיון של מערכת 3BDO@MN. (A) תמונת SEM המראה את המורפולוגיה של 3BDO@MNs. סרגל קנה מידה = 500 µm. (B) עקומת כוח-העתקה של 3BDO@MNs. (C) חתך רוחבי של עור עכבר שנצבע ב-H&E לאחר החדרת 3BDO@MNs והסרת הבסיס, המאשר חדירה מוצלחת לרקמה. סרגל קנה מידה = 100 µm. (D) תמונות SEM המראות את התמוססות המחטים המיקרוסקופיות ב-5 s, 10 s, 30 s ו-60 s לאחר ההחדרה לעור. (E) פרופיל שחרור מצטבר in vitro של 3BDO מהמחטים המיקרוסקופיות. (F) חיות תאים של תאי אפידרמיס ותאי דרמיס שטופלו ב-3BDO, בתמצית מחטים מיקרוסקופיות, ובתמצית מחטים מיקרוסקופיות המכילה 3BDO לאחר 24 h. (G,H) בליעה באורך גל של 620 nm של סספנסיות של (G) Staphylococcus aureus ו- (H) Escherichia coli שגודלו במצע המכיל כיטוזן בריכוזים שונים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3), והמובהקות הסטטיסטית נותחה באמצעות one-way ANOVA (**p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניסוי צמיחת שיער באמצעות מדבקות מיקרו-מחטים (MN); תוצאות פיגמנטציה וכיסוי שיער בעכברים.
איור 3. השפעות של 3BDO@MNs על צמיחה מחודשת של שיער in vivo. (A) איור סכמטי של ניסויי החיות. (B) תמונות מייצגות של עור הגב של עכברים ביום 0 (גילוח), ביום 5, ביום 10 וביום 15 לאחר הטיפול. (C) ניתוח כמותי של ציוני פיגמנטציה (יחידות שרירותיות) ב(B). (D) ניתוח כמותי של שטח כיסוי השיער (%) באזור המטופל ב(B). (E) שינוי מכפלה יחסי (fold change) של שטח כיסוי השיער באזור המטופל בהשוואה לקבוצת הביקורת. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 5), והמובהקות הסטטיסטית נותחה באמצעות one-way ANOVA (**p < 0.01). אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

כיום, טיפולים קליניים עבור AGA מסווגים בעיקר להתערבויות פרמקולוגיות ולהשתלה כירורגית. במחקר זה, MNs טעונים ב-3BDO קידמו צמיחה מחודשת של שיער במודל עכברים מסוג C57BL/6. עם זאת, לשיטות מסורתיות להולכת תרופות יש מגבלות, כגון התפלגות לא אחידה של התרופה. הפרוטוקול המרכזי במחקר זה הוא שיטה דו-שלבית לייצור MNs טעונים ב-3BDO. HA ו-CS הם הרכיבים העיקריים של ה-MNs. מספר שלבים קריטיים דורשים תשומת לב כדי להבטיח את איכות ה-MNs.

ראשית, כדי למנוע לכוד בועות אוויר בתמיסת הפולימר, נעשה שימוש בתבנית שקוללה מראש כדי להאט את התאיידות הממס במהלך הצנטריפוגציה. שנית, תנאי הייבוש משפיעים באופן ישיר על פריכות הקצוות ועל שלמות שכבת התמיכה. ייבוש למשך 16 h ב-36 °C עם לחות מבוקרת סייע להבטיח קצוות בעלי חוזק מכני מספיק תוך שמירה על הגמישות של שכבת התמיכה ומניעת ייבוש יתר. שלישית, מהירות של 134 × g למשך 5 min מרכזת ביעילות את ה-3BDO באזור הקצה, אך מהירויות גבוהות יותר או זמנים ממושכים יותר עלולים לגרום להשקעת התרופה בבסיס התבנית, ובכך להפחית את יעילות המסירה. עבור הבדיקה in vivo, נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 כמודל לצמיחה מחודשת של שיער. זקיקי השיער של עכברי C57BL/6 מציגים מחזור צמיחת שיער נראה וסנכרוני מאוד, דבר המעניק נוחות ניסויית והופך אותם לאחד המודלים הנפוצים ביותר לחקר מחלות עור16. בגיל של כ-7 שבועות, זקיקי השיער של עכברי C57BL/6 נכנסים באופן טבעי לשלב הטלוגן. לאחר הסרה מלאכותית של השיער מהעכברים, זקיקי השיער נכנסים מיד שוב לשלב האנגן17. הבדיקה in vivo הראתה כי מערכת ה-MN קידמה צמיחה מחודשת ואחידה יותר של שיער בהשוואה להזרקה תת-עורית במודל זה.

מערכת ה-3BDO@MN עשויה להוות אסטרטגיה פרה-קלינית מבטיחה לטיפול בהסרת שיער, על ידי שילוב של מולקולה קטנה להנגשת שיער עם פלטפורמה למסירה טרנסדרמלית זעיר-פולשנית. דווח כי פורמולציות של מיקרו-מחטים בעלות השפעה ממושכת מאפשרות שחרור מבוקר או מתמשך של תרופות, מפחיתות את תדירות המתן ומשפרות את היענות המטופלים, ובכך פותרות חלק מהמגבלות הקשורות לטיפולים טופיים או סיסטמיים קונבנציונליים18,19. בנוסף, אסטרטגיות עדכניות להנגשת שיער בסיוע מיקרו-מחטים, הכוללות מסירת תאי גזע, תומכות עוד יותר בישימות הרחבה של פלטפורמות מיקרו-מחטים בתחום זה20. עם זאת, לפני מעבר ליישום קליני, נדרשים מחקרים נוספים להערכת בטיחות ביולוגית לטווח ארוך, פרופילים פרמקוקינטיים/פרמקודנמיים, אופטימיזציה של המינון, יציבות אחסון וייצור בקנה מידה רחב.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (82273554), הפרויקט לפיתוח מדע וטכנולוגיה של רפואה ובריאות של מחוז שאנדונג (מס' 202304030716), התוכנית הלאומית להכשרה של סטודנטים במיכללות לחדשנות ויזמות של סין (מס' 202410439001), והפרויקט לפיתוח חדשנות במדע וטכנולוגיה של טאי'אן (מס' 2023NS232).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3BDOYuanye Bio-Technology Co., שנגחאי, סין890405-51-3הכנת פורמולציית CS/HA טעונה ב-3BDO
פלטה בעלת 6 בארותCorning Incorporated, ארה"בסימוכין 3516בדיקה אנטיבקטריאלית ובדיקת שחרור תרופות במבחנה (in vitro)
75% אתנולShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004חיטוי
פלטה בעלת 96 בארותCorning Incorporated, USAREF3599הערכות ציטוטוקסיות של תאים ובדיקה אנטיבקטריאלית
עכברי C57BL/6Charles River Laboratories7 שבועותניסויים בבעלי חיים
ערכה לספירת תאים 8 (CCK-8)Dojindo, יפןCK04הערכות ציטוטוקסיות
צנטריפוגהThermo Fisher Scientific75007204צנטריפוגה לניסוחים
קיטוזן (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd9012-76-4הכנת פורמולציית CS/HA
קרם להסרת שיערVeet3059944023307הסרת שיער
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-5הכנת פורמולציית CS/HA טעונה ב-3BDO
מאזניים אלקטרונייםRadwagAS 220.R2שקילת אבקה
Escherichia coli (E. coli)ATCC/בדיקה אנטיבקטריאלית
אבקת חומצה היאלורונית (HA)Bloomage Biotechnology Co. סין9067-32-7הכנת פורמולציית CS/HA
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health)/ניתוח סטטיסטי
מנערת עם אינקובטורThermo Scientific  50163013דגירה בקטריאלית
מאיף איסופלורןגן&Iספקטרומטריית מסות עם מאיץ (AMS)הרדמה של בעלי חיים
מצע LBSigma Life ScienceL3022בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית
מערבל מגנטיHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16ערבוב הפורמולציה
ספקטרופוטומטר ללוחות מיקרו Multiskan SkyHighThermo Fisher Scientific/מדידת OD
תנורShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9260Aייבוש מיקרו-מחטים
Parafilm MAmcor PM-996איטום מחטים זעירות (Microneedles)
תמיסת בופר פוספט (PBS)BiosharpBL302Aבדיקת שחרור תרופות במערכת in vitro
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית
מנתח מרקם (Texture Analyzer) אוניברסלי של TAShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/בדיקת חוזק מכני
תא ואקוםShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDZF-6050ייבוש בוואקום

מקורות

  1. Zhou C, Li X, Wang C, Zhang J. Alopecia areata: an update on etiopathogenesis, diagnosis, and management. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):403-23.
  2. Rudnicka L. Hair loss is a symptom of many complex medical and psychological problems. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023;37(8):1460-1.
  3. Alessandrini A, Bruni F, Piraccini BM, Starace M. Common causes of hair loss: clinical manifestations, trichoscopy and therapy. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(3):629-40.
  4. Zhao X et al. Long noncoding RNA CA7-4 promotes autophagy and apoptosis via sponging MIR877-3P and MIR5680 in high glucose-induced vascular endothelial cells. Autophagy. 2020;16(1):70-85.
  5. Wang L et al. An effective pharmacological hydrogel induces optic nerve repair and improves visual function. Sci China Life Sci. 2024;67(3):529-42.
  6. Wei Y et al. Midline-1 regulates effector T cell motility in experimental autoimmune encephalomyelitis via mTOR/microtubule pathway. Theranostics. 2024;14(3):1168-80.
  7. Gao Y et al. Rheb1 promotes tumor progression through mTORC1 in MLL-AF9-initiated murine acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2016;9:36.
  8. Wei L et al. A butyrolactone derivative 3BDO alleviates memory deficits and reduces amyloid-beta deposition in an AbetaPP/PS1 transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 2012;30(3):531-43.
  9. Meng N et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E1 regulates protein disulphide isomerase translation in oxidized low-density lipoprotein-activated endothelial cells. Acta Physiol (Oxf). 2015;213(3):664-75.
  10. Clavel C et al. Sox2 in the dermal papilla niche controls hair growth by fine-tuning BMP signaling in differentiating hair shaft progenitors. Dev Cell. 2012;23(5):981-94.
  11. Yang CC, Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells. J Dermatol Sci. 2010;57(1):2-11.
  12. Jin Y et al. Multifunctional microneedle patches loaded with engineered nitric oxide-releasing nanocarriers for targeted and synergistic chronic wound therapy. Adv Mater. 2025;37(5):e2413108.
  13. Wu H et al. Ultrasonic hollow microneedle array (USHM) for androgenetic alopecia treatment through modulating the expression of hair-growth-associated genes. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(14):21419-30.
  14. Cao Y et al. Dissolvable microneedle-based wound dressing transdermally and continuously delivers anti-inflammatory and pro-angiogenic exosomes for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2024;42:32-51.
  15. Liu J et al. Medium-molecular weight hyaluronic acid orchestrates hair follicle regeneration via CD44/AKT-driven endogenous ROS activation of beta-catenin. Int J Biol Macromol. 2026;360:151752. doi:10.1016/j.ijbiomac.2026.151752.
  16. Nareswari A et al. Development and validation of a C57BL/6 mouse model of androgenetic alopecia through testosterone propionate induction. Trends Sci. 2026;23(8):12711.
  17. Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.
  18. Vora LK et al. Long-acting microneedle formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2023;201:115055.
  19. Xiang H et al. Dissolving microneedles for alopecia treatment. Colloids Surf B Biointerfaces. 2023;229:113475.
  20. Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bioengineering3BDOWnt cateninAndrogenetic alopeciaHair regenerationMicroneedleTransdermal delivery

מאמרים קשורים