פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתוח מערכות מודל אנושיות רלוונטיות פיזיולוגית שמסכמות את ארכיטקטורת הרקמה ודינמיקת מצב התאים נותר אתגר מרכזי בחקר התפתחות השד ואירועים מוקדמים בקרצינוגנזה. תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות ומערכות תלת-ממדיות רבות אינן מצליחות ללכוד את הארגון המבני ואת הרמזים המיקרו-סביבתיים שמגדירים את בלוטת החלב האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה ניתנת לשחזור ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי מתאי אפיתל ראשוניים המוטמעים במטריצת הידרוג'ל מוגדרת המורכבת מקולגן מסוג I, למינין, פיברונקטין וחומצה היאלורונית. מערכת זו תומכת בהתקדמות תאים בודדים דרך שלבים מרכזיים של מורפוגנזה של שדי, כולל התרחבות אבות, דפוסי אפיתל ויצירת מבנים דמויי יחידת לובולריות סופיות, וכן הופעת תא דמוי מזנכימה, לאורך תקופת תרבית של 21 ימים. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב להכנת הידרוג'ל, זריעת תאים ותנאי תרבית. השיטה תואמת להדמיה בתוכן גבוה ולניתוח כמותי של מספר האורגנידים, התפלגות הגודל ומורכבות האדריכלית. פלטפורמה זו מאפשרת מחקרים מכניים של פלסטיות אפיתל והפרעות סביבתיות, ומספקת מערכת ניתנת להרחבה ורלוונטית ביולוגית לחקר שינויים מוקדמים ברמת הרקמה הקשורים לסיכון לסרטן השד.
מבוא
הבנת התפתחות בלוטות החלב האנושיות והאירועים המוקדמים שמקדים את הרקמה לטרנספורמציה ממאירית דורשת מערכות ניסוי שמסכמות בנאמנות את ארכיטקטורת הרקמה, ההיררכיה התאית והאיתות המיקרו-סביבתי. בעוד שתרבויות אפיתל דו-ממדיות סיפקו תובנות מכניות חשובות, הן חסרות את ההקשר המבני הנדרש למידול ארגון אפיתל ומורפוגנזה1. מערכות תרבית תלת-ממדיות קיימות, כולל אלו המבוססות על תמציות ממברנה בסיסית, קידמו את התחום אך נותרו מוגבלות בשל הרכב משתנה, שליטה לא שלמה על רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, ותמיכה לא עקבית בארכיטקטורת רקמה מסדר גבוה1. בנוסף, מערכות אורגנואידיות רבות המבוססות על תמציות ממברנה בסיסית מוגבלות בשל חוסר יכולתן לתמוך באופן עקבי בהופעת ארגון דמוי רקמה1. במיוחד, מערכות רבות מסתמכות על רכיבים סטרומליים חיצוניים במקום לאפשר התפתחות אנדוגנית של מיקרוסביבות תומכות, ובכך מגבילות את יכולתן למודל אינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימיות המרכזיות להתפתחות רקמות ומחלות. מגבלות אלו מגבילות את המחקר החוזר של תהליכים התפתחותיים, פלסטיות אפיתליאלית והשפעות הפרעות סביבתיות או מולקולריות על ארגון הרקמות.
כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו מודל תלת-ממדי של אורגנואיד שד אנושי המבוסס הידרוג'ל, המאפשר לתאים אפיתליים ראשוניים ליצור מבנים מאורגנים בתוך מטריצה חוץ-תאית מוגדרת 2,3,4,5,8. ההידרוג'ל מורכב מקולגן מסוג I, למינין, פיברונקטין וחומצה היאלורונית – רכיבים שנבחרו על פי תפקידם המוכר בהתפתחות בלוטות השד ובמורפוגנזה האפיתלית. מולקולות המטריקס החוץ-תאיות הללו מפעילות קולטנים תאיים מובחנים, כולל אינטגרינים, קולטני תחום דיסקואידין, CD44 ו-RHAMM, וידועות בכך שמווסתות את הקוטביות האפיתלית, מורפוגנזה מתפצלת, תחזוקת תאי גזע, טרנסדוקציה מכאנוטרנסדוקציה וארגון רקמות בבלוטת השד 6,7. מחקרים קודמים שתיארו את מערכת ההידרוג'ל הזו הראו כי שילוב רכיבי המטריצה החוץ-תאיים הללו שיפר משמעותית את המורפוגנזה של הדוקטל-אובולר ואת הבשלת האפיתל בהשוואה למצבים מבוססי קולגן בלבד או מטריג'ל 3,8. בנוסף, התכונות הפיזיקליות של נוסחת ההידרוג'ל הזו אופיינו בעבר במיקרוסקופיית כוח אטומי, שהראו כי הידרוג'ל המטריצה החוץ-תאית המורכב מציג קשיחות נמוכה יותר ונפיחות מוגברת יחסית לג'לים המכילים קולגן בלבד (מודולוס יאנג: 256.7 ± 20.0 Pa לעומת 559.2 ± 204.0 Pa, בהתאמה), בהתאם לסביבה רכה והידרטית יותר של מטריצה8.
חשוב לציין שמודל זה תומך בהופעת תא דמוי מזנכימה שנוצר לצד מבני אפיתל ומספק תמיכה מבנית ואיתותית אנדוגנית המשקפת יותר את ארגון הרקמות הטבעיות3. הרלוונטיות הפיזיולוגית של מערכת הידרוג'ל זו הוערכה באמצעות השוואות ישירות לתרביות אורגנואידים מסורתיות מבוססות מטריג'ל, תוך שימוש בניתוחים מורפולוגיים וטרנסקריפטומיים. מחקרים קודמים הראו שתרביות הידרוג'ל תמכו ביצירת רקמות דוקטל-לובולריות מאורגנת יותר ובהתמיינות רב-שושלתית מאשר תרביות מבוססות מטריג'ל, תוך שמירה על תגובתיות הורמונלית8. לאחרונה, ניתוחי ריצוף RNA חד-תאיים משולבים שהשוו אורגנואידים שמקורם בהידרוג'ל, אורגנואידים שגדלו במטריג'ל ורקמת השד האנושית הראשונית הראו כי אורגנואידים שגדלים על ידי הידרוג'ל משחזרים בצורה נאמנה יותר את ההיררכיה האפיתלית, המגוון התאים והאינטראקציות האפיתליות–מזנכימליות הקיימות ברקמת השד האנושית המקומית3. לעומת זאת, אורגנואידים שגודלו במטריג'ל הועשרו למצבים בסיסיים היברידיים מתרבים וחסרו אוכלוסיות דמויות סטרומל, בהתאם להרכבה עצמית אפיתלית ולא לאורגניגנזה מכוונת.
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה ליצירת אורגנואידים מרקמה ראשונית של האדם, עם שלבים אופציונליים לדלדול פיברובלסטים ודיסוציאציה לתאים בודדים. מכיוון שפלטפורמה זו תואמת להדמיה חיה, הדמיה בתוכן גבוה, ניתוח מורפומטרי כמותי, מעקב תאים ומחקרים של הפרעות גנטיות, ניתן לשלב אותה עם גישות בהמשך להערכת מספר האורגנידים, גודל, ארכיטקטורה ודינמיקת גדילה. פלטפורמה זו מספקת לכן מערכת ביולוגית רלוונטית לחקר התפתחות השד האנושית, פלסטיות אפיתליאלית, אינטראקציות אפיתל למיקרוסביבה, ותגובות ברמת הרקמה להפרעות התפתחותיות, מולקולריות או סביבתיות.
סקירה סכמטית של תהליך העבודה, הכוללת עיבוד רקמות, הכנת הידרוג'ל, תרבית אורגנואידים, התקדמות התפתחותית וניתוחים במורד הזרם, מוצגת באיור 1, בעוד שמורפולוגיות אורגנואידיות מייצגות שנוצרו באמצעות פלטפורמה זו מוצגות באיור 2.
איור 1. סקירה של תהליך יצירת אורגנידים מבוסס הידרוג'ל. (א) תרשים זרימה המסכם את תהליך הפרוטוקול, כולל איסוף רקמות, עיבוד רקמות, שימור קריופיקציה, שיקום והכנת תאים אופציונלית, הכנת הידרוג'ל, תרבית אורגנואידים, פיתוח אורגנואידים ויישומים אנליטיים בהמשך. (ב) סכמטיקה ויזואלית המתארת את השלבים העיקריים של פרוטוקול יצירת אורגנואידים מבוסס הידרוג'ל, כולל עיבוד והכנת רקמות, התאוששות והכנת תאים אופציונליים, והכנת הידרוג'ל וזריעה אורגנואידית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 2. מורפולוגיות אורגנואידיות מייצגות שנוצרות במערכת ההידרוג'ל המוגדרת. תמונות ברייטפילד מייצגות של אורגנואידים שמקורם ברקמות אנושיות שונות שגודלו במטריצת הידרוג'ל המוגדרת. אורגנואידים של השד שנוצרו מתאי אפיתל יחידים שמקורם בממופלסטיית הפחתה צולמו ביום ה-21 של התרבית. אורגנואידים זנוגרפטים שמקורם בחולה שנוצרו מקטעי גידול צולמו ביום ה-16 של התרבית. אורגנואידים של בלוטות רוק שנוצרו מקטעי אפיתל צולמו ביום השלישי של התרבית. אורגנואידים של כליות שנוצרו מקטעי אפיתל צולמו ביום ה-17 של התרבית. פסי קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רקמות ראשוניות שהיו נזרקות כפסולת רפואית לאחר ניתוח הושגו בהתאם לכל החוקים הרלוונטיים באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדות הביקורת המוסדיות במרכז הרפואי מיין ובמרכז הרפואי טאפטס. כל הרקמות היו אנונימיות לפני ההעברה ולא ניתן היה לקשר אותן למטופלים ספציפיים. מסיבה זו, מחקר זה קיבל מעמד פטור מהוועדה לשימוש בבני אדם כנבדק ניסוי במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס ובאוניברסיטת טאפטס למדעי הבריאות (IRB #13521). כל המטופלים הרשומים למחקר זה חתמו על טופס הסכמה מדעת שהסכים להשתתף במחקר ולפרסום התוצאות.
1. עיבוד והכנת רקמות
הערה: יש לבצע את כל ההליכים הכוללים רקמות אנושיות בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית והאתיות המוסדיות. עיין בשרטוטי זרימת העבודה המוצגים באיורים 1A ו-1B לסקירה חזותית של שלבי הפרוטוקול ותהליך הכנת האורגנידים לפני תחילת ההליך.
- הכינו MEGM באמצעות מדיום בסיסי אפיתל שדי, בתוספת 52 מיקרוגרם/מ"ל של יותרת המוח בקר, 10 ng/mL פקטור גדילה אפידרמלי אנושי, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 500 ng/mL הידרוקורטיזון, 1% (v/v) GlutaMAX, ו-1% (v/v) אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X).
- הכינו את מדיום הדיסוציאציה על ידי הוספת 1.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז A (מאוחסן ב-−20°C) ו-100 U/mL היאלורונידאז (מאוחסן ב-4°C) למדיום גדילה אפיתל של השד (MEGM).
- לקבל רקמת שד אנושית שהושגה מניתוחי שד מניעתיים וממופלסטיות הפחתה בתוך 24 שעות לאחר הכריתה, ללא קיבוע במי מלח מפושט-פוספט (PBS), ונשמרת על 4°C. שקלו את הרקמה במאזן מדויק כדי לקבוע את משקל הרקמה הכולל.
- הניחו את הרקמה בארון בטיחות ביולוגית סטרילי. טחון מכנית את הרקמה לחתיכות בגודל 3–5 מ"מ3 באמצעות סכינים סטריליים. העבר כ-2–3 גרם של רקמה טחונה לצינור חרוטי בגודל 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל מדיום דיסוציאציה לכל צינור.
- דגרו את הצינורות ב-37°C על רוטטור אורביטלי במהירות 8 סל"ד למשך 12–18 שעות לעיכול אנזימטי של הרקמה. יש לשקול את העיכול כמושלם כאשר לא נותרו שברי רקמה גדולים וניתן לראות השעיה הומוגנית של חומר מפורק באופן שווה בכל המדיום.
- אפשר לשברי האפיתל לשקוע בכוח הכבידה למשך 5 דקות. אשר שאין שברים נראים לעין תלויים במדיום ושקיים כדור ברור. דקנט בזהירות והשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
הערה: הסופרנטנט מכיל תאי סטרומל ורכיבי מטריצה, וניתן לשטוף, להשתמש בו או לשמר אותו למחקרים אחרים. - החזירו את הכדור למרחק שטיפה של 10 מ"ל המורכב מ-5% סרום בקר עוברי (FBS) ב-PBS. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגה עם דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים נוספות או עד שהסופרנטנט נקי מפסולת נראית לעין.
- החזירו את הכדור הסופי למדיום הקפאה המורכב מ-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב-MEGM בנפח של 1 מ"ל לגרם משקל רקמה התחלתי.
זהירות: DMSO מזיק במגע או בשאיפה. לטפל בציוד מגן אישי מתאים ולעבוד במכסה בטיחות כימי אם נדרש על פי הנחיות המוסד. - Aliquot 1 מ"ל של המתלים לכל קירור. הניחו את הקריוביאלים בטמפרטורה של −80°C במיכל הקפאה לפני אחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי.
הערה: שלב זה מייצג נקודת עצירה. אחסן דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני המעבר לתנאי אחסון ארוכי טווח.
2. התאוששות והכנת תאים אופציונלית
- הפשרה והתאוששות ראשונית
- הסרת רקמה שמורת מקריאו מאחסון של −80°C לאחר הקפאה של לפחות 24 שעות, או מאחסון החנקן הנוזלי לטווח ארוך. טבלו מיד את הקריוביאל עד הכובע באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והפשרו במהירות למשך דקה אחת כדי למזער את מוות התאים.
הערה: ערבבו בעדינות את הקריוביל במהלך ההפשרה כדי להבטיח התחממות אחידה. - לאחר ההפשרה המלאה, העבר מיד את תוכן הקריוביאל לצינור קוני בקוטר 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל MEGM. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 5 דקות.
- הסרת רקמה שמורת מקריאו מאחסון של −80°C לאחר הקפאה של לפחות 24 שעות, או מאחסון החנקן הנוזלי לטווח ארוך. טבלו מיד את הקריוביאל עד הכובע באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והפשרו במהירות למשך דקה אחת כדי למזער את מוות התאים.
- דלדול פיברובלסטים אופציונלי
הערה: דלדול הפיברובלסטים על ידי ציפוי מוקדם הוא שלב העשרה אופציונלי המשמש להפחתת אוכלוסיות סטרומליות או פיברובלסטים שדבקות במהירות כאשר רצוי אוכלוסייה התחלתית מועשרת יותר באפיתל. שלב זה אינו נדרש להיווצרות אורגנואידים וניתן להתאים אותו בהתאם למטרה הניסויית.- תלה את הכדור ב-10 מ"ל MEGM.
- העבר את הרקמה התלויה לצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ. דגרו ב-37°C באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך 90 דקות כדי לאפשר חיבור פיברובלסטים.
הערה: אין להפריע לצלחת התרבית במהלך הדגירה כדי להבטיח היצמדות יעילה לפיברובלסטים. - אסוף את הסופרנטנט המכיל תאים לא דביקים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל תוך הטיית צלחת התרבית בעדינות לכ-45°. שטפו בעדינות את הצלחת ב-5 מ"ל PBS ומשלבים את השטיפה עם הסופרנטנט שנאסף.
- צנטריפוגה את המתלה המשולב ב-250 × גרם למשך 5 דקות כדי לשחזר חומר מועשר באפיתליאל.
הערה: תאים שנדבקו ללוח מועשרים לפיברובלסטים של בלוטות החלב, וניתן להתרבות בנפרד על ידי הוספת מדיום המורכב מ-DMEM + 10% FBS ואנטיביוטיקה.
- דיסוציאציה אופציונלית לתאים בודדים
- החזירו את הכדור ל-500 מיקרוליטר של תמיסת אנזימי דיסוציאציה מחוממת מראש (37°C) המורכבת מ-0.25% טריפסין. מגיבים חלופיים לדיסוציאציה עשויים לדרוש אופטימיזציה. העבר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לפרק את הדגימה 20 פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לעודד דיסוציאציה.
זהירות: תגובות ניתוק אנזימטי עלולות להיות מזיקות. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים ולהימנע מקשר עין או עור. - דגרו את הצינור ב-37°C למשך 3-5 דקות. פירוק מכני של הדגימה מיד לאחר הדגירה על ידי טריטורציה של 20 פעמים באמצעות פיפטת P1000.
- הוסיפו 1 מ"ל מדיום שטיפה המכיל סרום כדי לנטרל את התגובה האנזימטית. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות.
- החזירו את הכדור לתמיסת דיספאז של 300 מיקרו-ליטר (5 U/mL) ותמיסת DNase של 30 מיקרו-ליטר (1 מ"ג/מ"ל). דגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3–5 דקות.
- מפרקים מכנית את הדגימה על ידי פיפטינג 15–20 פעמים. הוסף 700 מיקרוליטר חומר כביסה המכיל סרום למתלים.
- סנן את תליית התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לצינור נקי. ניתן להשתמש במסננת תא סטנדרטית בנפח 40 מיקרון או במסננת קצה פיפטה Flowmi. מסנני פלומי עשויים להפחית אובדן דגימות כאשר עובדים עם מספר תאים מוגבל.
- קבע את מספר התאים הקיים באמצעות הדרה של טריפאן בלו. מערבבים 10 מיקרוליטר מתלה התא עם טרייפן בלו ביחס של 1:1 והעמיסו 10 מיקרוליטר מהתערובת לתא ספירת תאים או למחסנית ספירה. קבעו את חיוניות התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוסיטומטר.
- צנטריפוגה את המתלה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- החזירו את כדור התא ל-MEGM בריכוז הרצוי לזריעת הידרוג'ל.
הערה: בניסויי זריעה חד-תאיים, הקלטים הטיפוסיים נעים בין כ-1,000–5,000 תאים ל-200 מיקרוליטר הידרוג'ל, בהתאם למטרה הניסויית ולמאפייני דגימת התורם. צפיפויות זריעה נמוכות יותר משמשות בדרך כלל להדמיה חיה ולמחקרי מורפוגנזה כדי להקל על מעקב אחר התפתחות אורגנידים בודדים, בעוד שצפיפויות גבוהות יותר משמשות לרוב לניתוחים מולקולריים בנקודת קצה, כולל איסוף RNA וחלבונים.
- החזירו את הכדור ל-500 מיקרוליטר של תמיסת אנזימי דיסוציאציה מחוממת מראש (37°C) המורכבת מ-0.25% טריפסין. מגיבים חלופיים לדיסוציאציה עשויים לדרוש אופטימיזציה. העבר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לפרק את הדגימה 20 פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לעודד דיסוציאציה.
3. הכנת הידרוג'ל וזריעת אורגנואיד
- הכנת מלאי וחישובי נפח
- יש להניח תמיסת למינין (1.18 מ"ג/מ"ל), תמיסת חומצה היאלורונית (1 מ"ג/מ"ל במים סטריליים), תמיסת פיברונקטין (2 מ"ג/מ"ל במים סטריליים), ו-PBS 1× על הקרח לפני השימוש. אחסן אליקווטים של למינין ופיברונקטין בטמפרטורה של −80°C ואחסן תמיסת חומצה היאלורונית בטמפרטורה של 4°C. הפשרה איטית של רכיבים קפואים על קרח בטמפרטורה של 0°C–4°C לפני השימוש.
- הכינו תמיסת תוסף מטריצה חוץ-תאית בגודל 25×. להכנת 1 מ"ל, יש לשלב 425 מיקרו-ליטר למינין, 250 מיקרוליטר חומצה היאלורונית (חומצה היאלורונית), 250 מיקרו-ליטר פיברונקטין ו-75 מיקרו-ליטר PBS בצינור המנוהל על קרח. ערבבו בעדינות על ידי הפיכת הצינור 3–4 פעמים. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד חודש.
- קבעו את נפח ההידרוג'ל הסופי וההרכב הרצוי לפני ההכנה. יש להכין לפחות 20% נפח עודף כדי להתחשב באובדן חומר במהלך פיפטינג והעברה.
הערה: נוסחת ההידרוג'ל מורכבת מקולגן I, ריכוז סופי של 1× של תוספי מטריצה חוץ-תאיים (ממלאי של 25×), ו-12.5% (v/v) 0.1 N נתרן הידרוקסיד יחסית לנפח הקולגן I לנטרול pH ופולימריזציה.
הערה: הריכוזים הסופיים של הידרוג'ל הם 1.7 מ"ג/מ"ל קולגן I, 20 מיקרוגרם/מ"ל למינין, 20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין, ו-10 מיקרוגרם/מ"ל חומצה היאלורונית. - חשב את נפח הקולגן I (קולגן V) הנדרש באמצעות הנוסחה הבאה:
כאן, Cסופי = 1.7 מ"ג/מ"ל, Vהכולל הוא נפח ההידרוג'ל הסופי הרצוי, ומאגר C הוא ריכוז תמיסת הקולגן. השתמש בריכוזי מלאי קולגן בין 2–12 מ"ג/מ"ל.
הערה: ריכוז מקור הקולגן עשוי להשתנות בין מחזורים. ריכוזים גבוהים יותר מגדילים את הצמיגות ויש לבצע פיפטות לאט. - חשב את הנפח של 0.1 N נתרן הידרוקסיד (VNaOH) באמצעות הנוסחה הבאה:
V NaOH = 0.125 x Vקולגן
הכינו תמיסה עובדת של 0.1 N נתרן הידרוקסיד על ידי דילול 1 N נתרן הידרוקסיד במים סטריליים. - חשב את נפח התוספת של המטריצה החוץ-תאית (VES) באמצעות הנוסחה הבאה:
- חשב את הנפח הנותר שיש למלא במדיום צמיחה באמצעות הנוסחה הבאה:
מדיום גדילה V = V סך הכל - (קולגן V + V NaOH + VES + תאים/רקמות V)
הערה: קבעו את נפח התאים או קטעי הרקמה לכל ניסוי בנפרד. השתמש בטווח טיפוסי של 10–100 מיקרוליטר בתוך הנפח המותר. ספירה מדויקת של קטעים אינה מתבצעת מכיוון שגודל והרכבם משתנים באופן משמעותי בין ההכנות. סטנדרטיזציה של הזרעה באמצעות הערכה ויזואלית של שפע והתפלגות של מקטעים.
- הכנת תערובת מאסטר הידרוג'ל
- מניחים קולגן I, תוסף מטריצה חוץ-תאי, נתרן הידרוקסיד (0.1 ניוטון) ומדיום גדילה על קרח בטמפרטורה של 0°C–4°C. שמור על כל הרכיבים בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
- הוסף את נפח הקולגן I המחושב לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר.
- הוסף את הנפח המחושב של מדיום הצמיחה המקורר מראש לתמיסת הקולגן.
- הוסיפו את הנפח המחושב של 0.1 N נתרן הידרוקסיד כדי לנטרל את התמיסה.
הערה: אופטימיזציה קודמת קבעה שתנאים אלו מייצרים את pH הג'ל המתאים; לכן, אין צורך בבדיקת pH שגרתית של תערובת ההידרוג'ל.
הערה: בצע את כל השלבים הבאים במהירות כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת של קולגן. - ערבבו את התמיסה על ידי ניעור חזק של הצינור בקצב של בערך ניעור אחד בשנייה למשך לפחות 6 שייקים.
- הוסף את הנפח המחושב של תוסף מטריצת חוץ-תאית לתערובת.
- הוסף את הנפח המחושב של תאים בודדים או קטעי רקמה באמצעות פיפטה P1000 או קצה פיפטה רחב-קינה. ערבב מיד על ידי ניעור כפי שמתואר בשלב 3.2.5 וממשיך מיד לשלב הבא.
- השקעת הידרוג'ל
- פיפט את תערובת ההידרוג'ל לכלי גידול בנפח הרצוי לכל באר. השתמש ב-200 מיקרולטר הידרוג'ל לכל באר עבור שקופיות עם 4 בארות, 100 מיקרוליטר לבאר עבור שקופיות עם 8 בארות, ו-20 מיקרוליטר לבאר ללוחות עם 96 בארות.
- פזר את ההידרוג'ל לכרית דקה על פני השטח בעת שימוש במחסניות תא. מקם את קצה הפיפטה בקצה העליון המרכזי של התא היטב וגרר את הקצה על פני השטח תוך כדי פיזור הג'ל ליצירת כרית אחידה. לפלטות עם 96 בארות, מקם את קצה הפיפטה במרכז הבאר תוך שמירה על מגע עם המשטח וחלק את הג'ל במרכז כדי לשמור על מבנה כיפה. הימנע מהזרקת אוויר לג'ל כי זה ייצור בועות.
- דגרו את כלי הגידול בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%CO2 למשך 60 דקות כדי לאפשר פולימריזציה מלאה.
הערה: תנאי הפולימריזציה המתוארים כאן הותאמו לפורמטים של תרביות ששימשו במחקר זה. עשויות להידרש התאמות קלות בזמן הפולימריזציה בהתאם לגאומטריית כלי הגידול, נפח ההידרוג'ל ותנאי הדגירה.
- תרבות ותחזוקה
- הוסף MEGM מחומם מראש לכל באר. כוון את הווליום בהתאם לפורמט התרבות שבו משתמשים.
- נתק בעדינות את ההידרוג'ל משטח התרבית באמצעות קצה פיפטה כדי לאפשר לג'ל לצוף. החלק את קצה הפיפטה סביב היקף הג'ל והרם בעדינות מתחת להידרוגל הפולימריזציה כדי לשחרר אותו מהמשטח.
- החלף את ה-MEGM פעמיים בשבוע במדיום טרי מחומם מראש. שמרו תרביות באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך כ-3–4 שבועות וסיימו תרביות לפני קריסה מוחלטת של הידרוג'ל. זהה הידרוג'לים שהתמוטטו על ידי הופעת מבנים צפופים, אטומים ודמויי פלאג, הנובעים מהתפתחות תאית נרחבת בתוך הג'ל (ראו דוגמאות מייצגות באיור משלים 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה מוביל להיווצרות מבנים אורגנואידיים תלת-ממדיים המציגים מורפולוגיה אפיתלית מאורגנת ותכונות אדריכליות ספציפיות לרקמה. אורגנואידים מתחילים להיווצר תוך 3–7 ימים לאחר הזריעה וממשיכים להתפתח לאורך תקופת הגידול. האפיון הקודם של מערכת הידרוג'ל אורגנואיד זו הראה יצירת אורגניאידים ניתנת לשחזור בקרב תורמים ראשוניים אנושיים עצמאייםרבים 3. במחקר זה, תאי אפיתל ראשוניים שבודדו מ-12 תורמי ממופלסטיה חסרי מחלה, ו-11 מתוך 12 דגימות תורמים יצרו בהצלחה אורגנו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירת אורגנים תלת-ממדיים של שד תלת-ממדי בתוך מיקרו-סביבה מוגדרת של הידרוג'ל התומכת בתכונות מרכזיות של מורפוגנזה חזה3. מספר שלבים הם קריטיים להצלחת שיטה זו. ראשית, יש לשלוט בזהירות בעיבוד רקמות ודיסוציאציה אנזימטית כדי לשמור על חיוניות האפיתל תוך מזעור עיכול יתר, שעלול להפחית את תפוקת התאים ולפגוע במורפוגנזה10. במיוחד, טיפולים אנזימטיים קצרים וסדרתיים, בשילוב עם דיסוציאציה מכנית עדינה, חיוניים לשמירה על אוכלוסיות א...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
סי.קיי. הוא מייסד-שותף ויועץ של נאבריס.
תודות
אנו מודים בהכרת תודה לקרלה מורגה, דניאלה רקונה ומייגן מלוני במאגר הביומדיקל של טאפטס על תמיכה ברקמות. מחקר זה נתמך על ידי קרן Find The Cause Breast Cancer ופרס המדע הקליני והתרגומי NIH של Tufts CTSI (UM1TR0043, G.R.).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-664 | צינורות סטריליים לעיבוד רקמות וצנטריפוגה |
| 40 μm cell strainer | VWR | 732-2757 | התקן סינון להכנת השעיית תאים בודדים |
| 40 μm cell strainer for low volumes | Bel-Art | 136800040 | התקן סינון להכנת השעיית תאים בודדים |
| Automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | מכשיר לספירת תאים וקביעת חיוניות |
| Bovine pituitary extract | Thermo Scientific | 13028014 | תוסף לתווך תאי אפיתל |
| Cell counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | שקופיות עם שתי תאיות לספירת תאים |
| Centrifuge | N/A | N/A | יש להשתמש בצנטריפוגות שולחן עבודה/צנטריפוגות שיהיו בעלות יכולת מהירות של לפחות 500 x g ויכולת לשאת צינורות של 15 mL ו-1.5 mL. |
| Collagen I | Millipore Sigma | 08-115 | חלבון מטריצה חוץ-תאי המשמש ליצירת הידרוג'ל |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | 11088793001 | אנזים המשמש לפירוק רקמות |
| Cryovials | Corning | 976171 | בקבוקונים סטריליים לאחסון קריוגני של דגימות |
| Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates) | Corning | 354104 354108 3603 | פלטפורמות להפקדת הידרוג'ל ותרבית אורגנואידים. |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 317275 | חומר קריופרוטקטנטי המשמש במדיום הקפאה |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | אנזים המשמש לפירוק רקמות משני |
| DNase I | Roche | 10104159001 | אנזים המשמש במהלך פירוק תאים. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437 | תוסף סרום המשמש במדיום שטיפה ונטרול |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | מרכיב חלבון מטריצה חוץ-תאי |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050061 | תוסף לתווך תאי אפיתל |
| Human epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | תוסף לתווך תאי אפיתל |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | תוסף לתווך תאי אפיתל |
| Hyaluronic acid | Millipore Sigma | 385908 | מרכיב מטריצה חוץ-תאי להכנת הידרוג'ל |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | אנזים המשמש לפירוק רקמות |
| Incubator | Thermo Scientific | 3598 | מכשיר המשמש לדגירת רקמות |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | תוסף לתווך תאי אפיתל |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | מרכיב חלבון מטריצה חוץ-תאי |
| Mammary epithelial basal medium | Thermo Scientific | M171500 | מדיום גידול לתאי אפיתל |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | 3451 | צינורות המשמשים לתגובות בנפח קטן |
| Orbital rotator | Thermo Scientific | 400110 | רטטור המשמש לפיזור רקמות במהלך פירוק אנזימטי |
| P1000 pipette | Gilson | P1000 | מכשיר המשמש לערבוב והעברת נפחים של עד 1,000 μL |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | תוסף אנטיביוטי לתווך תאי אפיתל |
| Phosphate-buffered saline | Gibco | 20012-027 | תמיסת חיץ המשמשת לשטיפה ולהשטיפה |
| Precision balance | Mettler Toledo | ML303E | מאזניים המשמשים לשקלול רקמות |
| Serological pipette | Nunc | 170356N | פיפטה המשמשת לקטיף תאי אפיתל לא מודבקים |
| Sodium hydroxide (1 N) | Fisher Chemical | SS261 | חומר ריאגנטי המשמש לנטרול קולגן |
| Sterile scalpels | Bard-Parker | 372615 | כלים המשמשים לקיצוץ מכני של רקמות |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | צבע המשמש להערכת חיוניות תאים |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200056 | ריאגנט אנזימטי המשמש לפירוק תאים |
| Water bath (37 °C) | VWR | 10LA | מכשיר המשמש להפשרה מבוקרת של דגימות |
מקורות
- Rauner G, Gupta PB, Kuperwasser C. From 2D to 3D and beyond: the evolution and impact of in vitro tumor models in cancer research. Nat Methods. 2025;22:1776-87.
- Traugh N, et al. Immune-epithelial interactions via TGF-β orchestrates stem-cell niche formation and morphogenesis [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.1101/2025.05.22.655596. 2025.
- Rauner G, et al. Single-cell organogenesis captures complex breast tissue formation in 3D. Development. 2025. Available from: https://doi.org/10.1242/dev.204813.
- Trepicchio C, et al. DDR1 regulates RUNX1-CBFβ to control breast stem cell differentiation [Preprint]. bioRxiv. 2024. Available from: https://doi.org/10.1101/2024.02.21.581255.
- Rauner G, et al. Breast tissue regeneration is driven by cell-matrix interactions coordinating multi-lineage stem cell differentiation through DDR1. Nat Commun. 2021;12:7116.
- Schedin P, Keely PJ. Mammary gland ECM remodeling, stiffness, and mechanosignaling in normal development and tumor progression. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011;3:a003228.
- Fata JE, Werb Z, Bissell MJ. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 2004;6:1-11.
- Sokol ES, et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Res. 2016;18:19.
- Parrish M, et al. Environmental chemical mixtures reprogram mammary epithelial development to epigenetic states associated with breast cancer [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.64898/2026.04.01.715968. 2026.
- Stingl J, Emerman JT, Eaves CJ. Enzymatic dissociation and culture of normal human mammary tissue to detect progenitor activity. Methods Mol Biol. 2005;290:249-63.
- Antoine EE, Vlachos PP, Rylander MN. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20:683-96.
- Ngo P, Ramalingam P, Phillips JA, Furuta GT. Collagen gel contraction assay. Methods Mol Biol. 2006;341:103-9.
- Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
- Linnemann JR, Meixner LK, Miura H, Scheel CH. An organotypic 3D assay for primary human mammary epithelial cells that recapitulates branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 2017;1612:125-37.
- Bonnans C, Chou J, Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:786-801.
- Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 2009;326:1216-9.
- Hughes CS, Postovit LM, Lajoie GA. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 2010;10:1886-90.
- Sokol ES, et al. Perturbation-expression analysis identifies RUNX1 as a regulator of human mammary stem cell differentiation. PLoS Comput Biol. 2015;11:e1004161.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
