שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

Abstract

פיתוח מערכות מודל אנושיות רלוונטיות פיזיולוגית שמסכמות את ארכיטקטורת הרקמה ודינמיקת מצב התאים נותר אתגר מרכזי בחקר התפתחות השד ואירועים מוקדמים בקרצינוגנזה. תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות ומערכות תלת-ממדיות רבות אינן מצליחות ללכוד את הארגון המבני ואת הרמזים המיקרו-סביבתיים שמגדירים את בלוטת החלב האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה ניתנת לשחזור ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי מתאי אפיתל ראשוניים המוטמעים במטריצת הידרוג'ל מוגדרת המורכבת מקולגן מסוג I, למינין, פיברונקטין וחומצה היאלורונית. מערכת זו תומכת בהתקדמות תאים בודדים דרך שלבים מרכזיים של מורפוגנזה של שדי, כולל התרחבות אבות, דפוסי אפיתל ויצירת מבנים דמויי יחידת לובולריות סופיות, וכן הופעת תא דמוי מזנכימה, לאורך תקופת תרבית של 21 ימים. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב להכנת הידרוג'ל, זריעת תאים ותנאי תרבית. השיטה תואמת להדמיה בתוכן גבוה ולניתוח כמותי של מספר האורגנידים, התפלגות הגודל ומורכבות האדריכלית. פלטפורמה זו מאפשרת מחקרים מכניים של פלסטיות אפיתל והפרעות סביבתיות, ומספקת מערכת ניתנת להרחבה ורלוונטית ביולוגית לחקר שינויים מוקדמים ברמת הרקמה הקשורים לסיכון לסרטן השד.

Introduction

הבנת התפתחות בלוטות החלב האנושיות והאירועים המוקדמים שמקדים את הרקמה לטרנספורמציה ממאירית דורשת מערכות ניסוי שמסכמות בנאמנות את ארכיטקטורת הרקמה, ההיררכיה התאית והאיתות המיקרו-סביבתי. בעוד שתרבויות אפיתל דו-ממדיות סיפקו תובנות מכניות חשובות, הן חסרות את ההקשר המבני הנדרש למידול ארגון אפיתל ומורפוגנזה¹. מערכות תרבית תלת-ממדיות קיימות, כולל אלו המבוססות על תמציות ממברנה בסיסית, קידמו את התחום אך נותרו מוגבלות בשל הרכב משתנה, שליטה לא שלמה על רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, ותמיכה לא עקבית בארכיטקטורת רקמה מסדר גבוה¹. בנוסף, מערכות אורגנואידיות רבות המבוססות על תמציות ממברנה בסיסית מוגבלות בשל חוסר יכולתן לתמוך באופן עקבי בהופעת ארגון דמוי רקמה¹. במיוחד, מערכות רבות מסתמכות על רכיבים סטרומליים חיצוניים במקום לאפשר התפתחות אנדוגנית של מיקרוסביבות תומכות, ובכך מגבילות את יכולתן למודל אינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימיות המרכזיות להתפתחות רקמות ומחלות. מגבלות אלו מגבילות את המחקר החוזר של תהליכים התפתחותיים, פלסטיות אפיתליאלית והשפעות הפרעות סביבתיות או מולקולריות על ארגון הרקמות.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו מודל תלת-ממדי של אורגנואיד שד אנושי המבוסס הידרוג'ל, המאפשר לתאים אפיתליים ראשוניים ליצור מבנים מאורגנים בתוך מטריצה חוץ-תאית מוגדרת 2,3,4,5,8. ההידרוג'ל מורכב מקולגן מסוג I, למינין, פיברונקטין וחומצה היאלורונית – רכיבים שנבחרו על פי תפקידם המוכר בהתפתחות בלוטות השד ובמורפוגנזה האפיתלית. מולקולות המטריקס החוץ-תאיות הללו מפעילות קולטנים תאיים מובחנים, כולל אינטגרינים, קולטני תחום דיסקואידין, CD44 ו-RHAMM, וידועות בכך שמווסתות את הקוטביות האפיתלית, מורפוגנזה מתפצלת, תחזוקת תאי גזע, טרנסדוקציה מכאנוטרנסדוקציה וארגון רקמות בבלוטת השד ^6,7. מחקרים קודמים שתיארו את מערכת ההידרוג'ל הזו הראו כי שילוב רכיבי המטריצה החוץ-תאיים הללו שיפר משמעותית את המורפוגנזה של הדוקטל-אובולר ואת הבשלת האפיתל בהשוואה למצבים מבוססי קולגן בלבד או מטריג'ל ^3,8. בנוסף, התכונות הפיזיקליות של נוסחת ההידרוג'ל הזו אופיינו בעבר במיקרוסקופיית כוח אטומי, שהראו כי הידרוג'ל המטריצה החוץ-תאית המורכב מציג קשיחות נמוכה יותר ונפיחות מוגברת יחסית לג'לים המכילים קולגן בלבד (מודולוס יאנג: 256.7 ± 20.0 Pa לעומת 559.2 ± 204.0 Pa, בהתאמה), בהתאם לסביבה רכה והידרטית יותר של מטריצה⁸.

חשוב לציין שמודל זה תומך בהופעת תא דמוי מזנכימה שנוצר לצד מבני אפיתל ומספק תמיכה מבנית ואיתותית אנדוגנית המשקפת יותר את ארגון הרקמות הטבעיות³. הרלוונטיות הפיזיולוגית של מערכת הידרוג'ל זו הוערכה באמצעות השוואות ישירות לתרביות אורגנואידים מסורתיות מבוססות מטריג'ל, תוך שימוש בניתוחים מורפולוגיים וטרנסקריפטומיים. מחקרים קודמים הראו שתרביות הידרוג'ל תמכו ביצירת רקמות דוקטל-לובולריות מאורגנת יותר ובהתמיינות רב-שושלתית מאשר תרביות מבוססות מטריג'ל, תוך שמירה על תגובתיות הורמונלית⁸. לאחרונה, ניתוחי ריצוף RNA חד-תאיים משולבים שהשוו אורגנואידים שמקורם בהידרוג'ל, אורגנואידים שגדלו במטריג'ל ורקמת השד האנושית הראשונית הראו כי אורגנואידים שגדלים על ידי הידרוג'ל משחזרים בצורה נאמנה יותר את ההיררכיה האפיתלית, המגוון התאים והאינטראקציות האפיתליות–מזנכימליות הקיימות ברקמת השד האנושית המקומית³. לעומת זאת, אורגנואידים שגודלו במטריג'ל הועשרו למצבים בסיסיים היברידיים מתרבים וחסרו אוכלוסיות דמויות סטרומל, בהתאם להרכבה עצמית אפיתלית ולא לאורגניגנזה מכוונת.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה ליצירת אורגנואידים מרקמה ראשונית של האדם, עם שלבים אופציונליים לדלדול פיברובלסטים ודיסוציאציה לתאים בודדים. מכיוון שפלטפורמה זו תואמת להדמיה חיה, הדמיה בתוכן גבוה, ניתוח מורפומטרי כמותי, מעקב תאים ומחקרים של הפרעות גנטיות, ניתן לשלב אותה עם גישות בהמשך להערכת מספר האורגנידים, גודל, ארכיטקטורה ודינמיקת גדילה. פלטפורמה זו מספקת לכן מערכת ביולוגית רלוונטית לחקר התפתחות השד האנושית, פלסטיות אפיתליאלית, אינטראקציות אפיתל למיקרוסביבה, ותגובות ברמת הרקמה להפרעות התפתחותיות, מולקולריות או סביבתיות.

סקירה סכמטית של תהליך העבודה, הכוללת עיבוד רקמות, הכנת הידרוג'ל, תרבית אורגנואידים, התקדמות התפתחותית וניתוחים במורד הזרם, מוצגת באיור 1, בעוד שמורפולוגיות אורגנואידיות מייצגות שנוצרו באמצעות פלטפורמה זו מוצגות באיור 2.

איור 1. סקירה של תהליך יצירת אורגנידים מבוסס הידרוג'ל. (א) תרשים זרימה המסכם את תהליך הפרוטוקול, כולל איסוף רקמות, עיבוד רקמות, שימור קריופיקציה, שיקום והכנת תאים אופציונלית, הכנת הידרוג'ל, תרבית אורגנואידים, פיתוח אורגנואידים ויישומים אנליטיים בהמשך. (ב) סכמטיקה ויזואלית המתארת את השלבים העיקריים של פרוטוקול יצירת אורגנואידים מבוסס הידרוג'ל, כולל עיבוד והכנת רקמות, התאוששות והכנת תאים אופציונליים, והכנת הידרוג'ל וזריעה אורגנואידית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2. מורפולוגיות אורגנואידיות מייצגות שנוצרות במערכת ההידרוג'ל המוגדרת. תמונות ברייטפילד מייצגות של אורגנואידים שמקורם ברקמות אנושיות שונות שגודלו במטריצת הידרוג'ל המוגדרת. אורגנואידים של השד שנוצרו מתאי אפיתל יחידים שמקורם בממופלסטיית הפחתה צולמו ביום ה-21 של התרבית. אורגנואידים זנוגרפטים שמקורם בחולה שנוצרו מקטעי גידול צולמו ביום ה-16 של התרבית. אורגנואידים של בלוטות רוק שנוצרו מקטעי אפיתל צולמו ביום השלישי של התרבית. אורגנואידים של כליות שנוצרו מקטעי אפיתל צולמו ביום ה-17 של התרבית. פסי קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.

Protocol

רקמות ראשוניות שהיו נזרקות כפסולת רפואית לאחר ניתוח הושגו בהתאם לכל החוקים הרלוונטיים באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדות הביקורת המוסדיות במרכז הרפואי מיין ובמרכז הרפואי טאפטס. כל הרקמות היו אנונימיות לפני ההעברה ולא ניתן היה לקשר אותן למטופלים ספציפיים. מסיבה זו, מחקר זה קיבל מעמד פטור מהוועדה לשימוש בבני אדם כנבדק ניסוי במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס ובאוניברסיטת טאפטס למדעי הבריאות (IRB #13521). כל המטופלים הרשומים למחקר זה חתמו על טופס הסכמה מדעת שהסכים להשתתף במחקר ולפרסום התוצאות.

1. עיבוד והכנת רקמות

הערה: יש לבצע את כל ההליכים הכוללים רקמות אנושיות בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית והאתיות המוסדיות. עיין בשרטוטי זרימת העבודה המוצגים באיורים 1A ו-1B לסקירה חזותית של שלבי הפרוטוקול ותהליך הכנת האורגנידים לפני תחילת ההליך.

1. הכינו MEGM באמצעות מדיום בסיסי אפיתל שדי, בתוספת 52 מיקרוגרם/מ"ל של יותרת המוח בקר, 10 ng/mL פקטור גדילה אפידרמלי אנושי, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 500 ng/mL הידרוקורטיזון, 1% (v/v) GlutaMAX, ו-1% (v/v) אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X).
2. הכינו את מדיום הדיסוציאציה על ידי הוספת 1.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז A (מאוחסן ב-−20°C) ו-100 U/mL היאלורונידאז (מאוחסן ב-4°C) למדיום גדילה אפיתל של השד (MEGM).
3. לקבל רקמת שד אנושית שהושגה מניתוחי שד מניעתיים וממופלסטיות הפחתה בתוך 24 שעות לאחר הכריתה, ללא קיבוע במי מלח מפושט-פוספט (PBS), ונשמרת על 4°C. שקלו את הרקמה במאזן מדויק כדי לקבוע את משקל הרקמה הכולל.
4. הניחו את הרקמה בארון בטיחות ביולוגית סטרילי. טחון מכנית את הרקמה לחתיכות בגודל 3–5 מ"מ³ באמצעות סכינים סטריליים. העבר כ-2–3 גרם של רקמה טחונה לצינור חרוטי בגודל 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל מדיום דיסוציאציה לכל צינור.
5. דגרו את הצינורות ב-37°C על רוטטור אורביטלי במהירות 8 סל"ד למשך 12–18 שעות לעיכול אנזימטי של הרקמה. יש לשקול את העיכול כמושלם כאשר לא נותרו שברי רקמה גדולים וניתן לראות השעיה הומוגנית של חומר מפורק באופן שווה בכל המדיום.
6. אפשר לשברי האפיתל לשקוע בכוח הכבידה למשך 5 דקות. אשר שאין שברים נראים לעין תלויים במדיום ושקיים כדור ברור. דקנט בזהירות והשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
   הערה: הסופרנטנט מכיל תאי סטרומל ורכיבי מטריצה, וניתן לשטוף, להשתמש בו או לשמר אותו למחקרים אחרים.
7. החזירו את הכדור למרחק שטיפה של 10 מ"ל המורכב מ-5% סרום בקר עוברי (FBS) ב-PBS. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגה עם דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר.
8. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים נוספות או עד שהסופרנטנט נקי מפסולת נראית לעין.
9. החזירו את הכדור הסופי למדיום הקפאה המורכב מ-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב-MEGM בנפח של 1 מ"ל לגרם משקל רקמה התחלתי.
   זהירות: DMSO מזיק במגע או בשאיפה. לטפל בציוד מגן אישי מתאים ולעבוד במכסה בטיחות כימי אם נדרש על פי הנחיות המוסד.
10. Aliquot 1 מ"ל של המתלים לכל קירור. הניחו את הקריוביאלים בטמפרטורה של −80°C במיכל הקפאה לפני אחסון ארוך טווח בחנקן נוזלי.
    הערה: שלב זה מייצג נקודת עצירה. אחסן דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני המעבר לתנאי אחסון ארוכי טווח.

2. התאוששות והכנת תאים אופציונלית

1. הפשרה והתאוששות ראשונית
   1. הסרת רקמה שמורת מקריאו מאחסון של −80°C לאחר הקפאה של לפחות 24 שעות, או מאחסון החנקן הנוזלי לטווח ארוך. טבלו מיד את הקריוביאל עד הכובע באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והפשרו במהירות למשך דקה אחת כדי למזער את מוות התאים.
      הערה: ערבבו בעדינות את הקריוביל במהלך ההפשרה כדי להבטיח התחממות אחידה.
   2. לאחר ההפשרה המלאה, העבר מיד את תוכן הקריוביאל לצינור קוני בקוטר 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל MEGM. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 5 דקות.
2. דלדול פיברובלסטים אופציונלי
   הערה: דלדול הפיברובלסטים על ידי ציפוי מוקדם הוא שלב העשרה אופציונלי המשמש להפחתת אוכלוסיות סטרומליות או פיברובלסטים שדבקות במהירות כאשר רצוי אוכלוסייה התחלתית מועשרת יותר באפיתל. שלב זה אינו נדרש להיווצרות אורגנואידים וניתן להתאים אותו בהתאם למטרה הניסויית.
   1. תלה את הכדור ב-10 מ"ל MEGM.
   2. העבר את הרקמה התלויה לצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ. דגרו ב-37°C באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך 90 דקות כדי לאפשר חיבור פיברובלסטים.
      הערה: אין להפריע לצלחת התרבית במהלך הדגירה כדי להבטיח היצמדות יעילה לפיברובלסטים.
   3. אסוף את הסופרנטנט המכיל תאים לא דביקים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל תוך הטיית צלחת התרבית בעדינות לכ-45°. שטפו בעדינות את הצלחת ב-5 מ"ל PBS ומשלבים את השטיפה עם הסופרנטנט שנאסף.
   4. צנטריפוגה את המתלה המשולב ב-250 × גרם למשך 5 דקות כדי לשחזר חומר מועשר באפיתליאל.
      הערה: תאים שנדבקו ללוח מועשרים לפיברובלסטים של בלוטות החלב, וניתן להתרבות בנפרד על ידי הוספת מדיום המורכב מ-DMEM + 10% FBS ואנטיביוטיקה.
3. דיסוציאציה אופציונלית לתאים בודדים
   1. החזירו את הכדור ל-500 מיקרוליטר של תמיסת אנזימי דיסוציאציה מחוממת מראש (37°C) המורכבת מ-0.25% טריפסין. מגיבים חלופיים לדיסוציאציה עשויים לדרוש אופטימיזציה. העבר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לפרק את הדגימה 20 פעמים באמצעות פיפטה P1000 כדי לעודד דיסוציאציה.
      זהירות: תגובות ניתוק אנזימטי עלולות להיות מזיקות. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים ולהימנע מקשר עין או עור.
   2. דגרו את הצינור ב-37°C למשך 3-5 דקות. פירוק מכני של הדגימה מיד לאחר הדגירה על ידי טריטורציה של 20 פעמים באמצעות פיפטת P1000.
   3. הוסיפו 1 מ"ל מדיום שטיפה המכיל סרום כדי לנטרל את התגובה האנזימטית. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות.
   4. החזירו את הכדור לתמיסת דיספאז של 300 מיקרו-ליטר (5 U/mL) ותמיסת DNase של 30 מיקרו-ליטר (1 מ"ג/מ"ל). דגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3–5 דקות.
   5. מפרקים מכנית את הדגימה על ידי פיפטינג 15–20 פעמים. הוסף 700 מיקרוליטר חומר כביסה המכיל סרום למתלים.
   6. סנן את תליית התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לצינור נקי. ניתן להשתמש במסננת תא סטנדרטית בנפח 40 מיקרון או במסננת קצה פיפטה Flowmi. מסנני פלומי עשויים להפחית אובדן דגימות כאשר עובדים עם מספר תאים מוגבל.
   7. קבע את מספר התאים הקיים באמצעות הדרה של טריפאן בלו. מערבבים 10 מיקרוליטר מתלה התא עם טרייפן בלו ביחס של 1:1 והעמיסו 10 מיקרוליטר מהתערובת לתא ספירת תאים או למחסנית ספירה. קבעו את חיוניות התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוסיטומטר.
   8. צנטריפוגה את המתלה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. החזירו את כדור התא ל-MEGM בריכוז הרצוי לזריעת הידרוג'ל.
      הערה: בניסויי זריעה חד-תאיים, הקלטים הטיפוסיים נעים בין כ-1,000–5,000 תאים ל-200 מיקרוליטר הידרוג'ל, בהתאם למטרה הניסויית ולמאפייני דגימת התורם. צפיפויות זריעה נמוכות יותר משמשות בדרך כלל להדמיה חיה ולמחקרי מורפוגנזה כדי להקל על מעקב אחר התפתחות אורגנידים בודדים, בעוד שצפיפויות גבוהות יותר משמשות לרוב לניתוחים מולקולריים בנקודת קצה, כולל איסוף RNA וחלבונים.

3. הכנת הידרוג'ל וזריעת אורגנואיד

1. הכנת מלאי וחישובי נפח
   1. יש להניח תמיסת למינין (1.18 מ"ג/מ"ל), תמיסת חומצה היאלורונית (1 מ"ג/מ"ל במים סטריליים), תמיסת פיברונקטין (2 מ"ג/מ"ל במים סטריליים), ו-PBS 1× על הקרח לפני השימוש. אחסן אליקווטים של למינין ופיברונקטין בטמפרטורה של −80°C ואחסן תמיסת חומצה היאלורונית בטמפרטורה של 4°C. הפשרה איטית של רכיבים קפואים על קרח בטמפרטורה של 0°C–4°C לפני השימוש.
   2. הכינו תמיסת תוסף מטריצה חוץ-תאית בגודל 25×. להכנת 1 מ"ל, יש לשלב 425 מיקרו-ליטר למינין, 250 מיקרוליטר חומצה היאלורונית (חומצה היאלורונית), 250 מיקרו-ליטר פיברונקטין ו-75 מיקרו-ליטר PBS בצינור המנוהל על קרח. ערבבו בעדינות על ידי הפיכת הצינור 3–4 פעמים. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד חודש.
   3. קבעו את נפח ההידרוג'ל הסופי וההרכב הרצוי לפני ההכנה. יש להכין לפחות 20% נפח עודף כדי להתחשב באובדן חומר במהלך פיפטינג והעברה.
      הערה: נוסחת ההידרוג'ל מורכבת מקולגן I, ריכוז סופי של 1× של תוספי מטריצה חוץ-תאיים (ממלאי של 25×), ו-12.5% (v/v) 0.1 N נתרן הידרוקסיד יחסית לנפח הקולגן I לנטרול pH ופולימריזציה.
      הערה: הריכוזים הסופיים של הידרוג'ל הם 1.7 מ"ג/מ"ל קולגן I, 20 מיקרוגרם/מ"ל למינין, 20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין, ו-10 מיקרוגרם/מ"ל חומצה היאלורונית.
   4. חשב את נפח הקולגן I (_קולגן V) הנדרש באמצעות הנוסחה הבאה:
      
      כאן, C_סופי = 1.7 מ"ג/מ"ל, V_הכולל הוא נפח ההידרוג'ל הסופי הרצוי, _ומאגר C הוא ריכוז תמיסת הקולגן. השתמש בריכוזי מלאי קולגן בין 2–12 מ"ג/מ"ל.
      הערה: ריכוז מקור הקולגן עשוי להשתנות בין מחזורים. ריכוזים גבוהים יותר מגדילים את הצמיגות ויש לבצע פיפטות לאט.
   5. חשב את הנפח של 0.1 N נתרן הידרוקסיד (V_NaOH) באמצעות הנוסחה הבאה:
      _{V NaOH} = 0.125 x V_קולגן
      הכינו תמיסה עובדת של 0.1 N נתרן הידרוקסיד על ידי דילול 1 N נתרן הידרוקסיד במים סטריליים.
   6. חשב את נפח התוספת של המטריצה החוץ-תאית (V_ES) באמצעות הנוסחה הבאה:
      
   7. חשב את הנפח הנותר שיש למלא במדיום צמיחה באמצעות הנוסחה הבאה:
      _{מדיום גדילה} V = _{V סך הכל} - (_קולגן V + _{V NaOH} + V_ES + _{תאים/רקמות} V)
      הערה: קבעו את נפח התאים או קטעי הרקמה לכל ניסוי בנפרד. השתמש בטווח טיפוסי של 10–100 מיקרוליטר בתוך הנפח המותר. ספירה מדויקת של קטעים אינה מתבצעת מכיוון שגודל והרכבם משתנים באופן משמעותי בין ההכנות. סטנדרטיזציה של הזרעה באמצעות הערכה ויזואלית של שפע והתפלגות של מקטעים.
2. הכנת תערובת מאסטר הידרוג'ל
   1. מניחים קולגן I, תוסף מטריצה חוץ-תאי, נתרן הידרוקסיד (0.1 ניוטון) ומדיום גדילה על קרח בטמפרטורה של 0°C–4°C. שמור על כל הרכיבים בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
   2. הוסף את נפח הקולגן I המחושב לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר.
   3. הוסף את הנפח המחושב של מדיום הצמיחה המקורר מראש לתמיסת הקולגן.
   4. הוסיפו את הנפח המחושב של 0.1 N נתרן הידרוקסיד כדי לנטרל את התמיסה.
      הערה: אופטימיזציה קודמת קבעה שתנאים אלו מייצרים את pH הג'ל המתאים; לכן, אין צורך בבדיקת pH שגרתית של תערובת ההידרוג'ל.
      הערה: בצע את כל השלבים הבאים במהירות כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת של קולגן.
   5. ערבבו את התמיסה על ידי ניעור חזק של הצינור בקצב של בערך ניעור אחד בשנייה למשך לפחות 6 שייקים.
   6. הוסף את הנפח המחושב של תוסף מטריצת חוץ-תאית לתערובת.
   7. הוסף את הנפח המחושב של תאים בודדים או קטעי רקמה באמצעות פיפטה P1000 או קצה פיפטה רחב-קינה. ערבב מיד על ידי ניעור כפי שמתואר בשלב 3.2.5 וממשיך מיד לשלב הבא.
3. השקעת הידרוג'ל
   1. פיפט את תערובת ההידרוג'ל לכלי גידול בנפח הרצוי לכל באר. השתמש ב-200 מיקרולטר הידרוג'ל לכל באר עבור שקופיות עם 4 בארות, 100 מיקרוליטר לבאר עבור שקופיות עם 8 בארות, ו-20 מיקרוליטר לבאר ללוחות עם 96 בארות.
   2. פזר את ההידרוג'ל לכרית דקה על פני השטח בעת שימוש במחסניות תא. מקם את קצה הפיפטה בקצה העליון המרכזי של התא היטב וגרר את הקצה על פני השטח תוך כדי פיזור הג'ל ליצירת כרית אחידה. לפלטות עם 96 בארות, מקם את קצה הפיפטה במרכז הבאר תוך שמירה על מגע עם המשטח וחלק את הג'ל במרכז כדי לשמור על מבנה כיפה. הימנע מהזרקת אוויר לג'ל כי זה ייצור בועות.
   3. דגרו את כלי הגידול בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2 למשך 60 דקות כדי לאפשר פולימריזציה מלאה.
      הערה: תנאי הפולימריזציה המתוארים כאן הותאמו לפורמטים של תרביות ששימשו במחקר זה. עשויות להידרש התאמות קלות בזמן הפולימריזציה בהתאם לגאומטריית כלי הגידול, נפח ההידרוג'ל ותנאי הדגירה.
4. תרבות ותחזוקה
   1. הוסף MEGM מחומם מראש לכל באר. כוון את הווליום בהתאם לפורמט התרבות שבו משתמשים.
   2. נתק בעדינות את ההידרוג'ל משטח התרבית באמצעות קצה פיפטה כדי לאפשר לג'ל לצוף. החלק את קצה הפיפטה סביב היקף הג'ל והרם בעדינות מתחת להידרוגל הפולימריזציה כדי לשחרר אותו מהמשטח.
   3. החלף את ה-MEGM פעמיים בשבוע במדיום טרי מחומם מראש. שמרו תרביות באינקובטור לח עם 5% CO₂ למשך כ-3–4 שבועות וסיימו תרביות לפני קריסה מוחלטת של הידרוג'ל. זהה הידרוג'לים שהתמוטטו על ידי הופעת מבנים צפופים, אטומים ודמויי פלאג, הנובעים מהתפתחות תאית נרחבת בתוך הג'ל (ראו דוגמאות מייצגות באיור משלים 1).

Results

ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה מוביל להיווצרות מבנים אורגנואידיים תלת-ממדיים המציגים מורפולוגיה אפיתלית מאורגנת ותכונות אדריכליות ספציפיות לרקמה. אורגנואידים מתחילים להיווצר תוך 3–7 ימים לאחר הזריעה וממשיכים להתפתח לאורך תקופת הגידול. האפיון הקודם של מערכת הידרוג'ל אורגנואיד זו הראה יצירת אורגניאידים ניתנת לשחזור בקרב תורמים ראשוניים אנושיים עצמאיים^{רבים 3}. במחקר זה, תאי אפיתל ראשוניים שבודדו מ-12 תורמי ממופלסטיה חסרי מחלה, ו-11 מתוך 12 דגימות תורמים יצרו בהצלחה אורגנואידים בתנאי התרבית המתוארים. בין התורמים, המספר החציוני של מבנים אורגנואידיים שנוצרו לכל 100 תאים זרעים היה 1.775 (רווח בר-סמך 95%: 0.45–4.10). למרות שנצפתה שונות משמעותית בין תורמים ביעילות היווצרות אורגנואידים ודינמיקת גדילה, נוצרו מורפולוגיות מורכבות של דוקטל-לובולר ואצינר באופן שחזורי בין התורמים.

אורגנואידים של שד שמקורם בתאי אפיתל בודדים מציגים מורפוגנזה מתקדמת, ויוצרים מבנים מתפצלים ביום ה-21 של התרבית (איור 2). מבנים אלו מאופיינים בהקרנות מוארכות ובארגון רב-תאי. אורגנואידים הציגו שטחים משוערים שנעו בין 10,000–90,000 מיקרון² עד יום 18, עם ערכי מעגליות מתחת ל-0.3, שחושבים כ-4π × (שטח/היקף²)^3.9. אורגנואידים שמקורם בקטעי רקמה יצרו בדרך כלל מבנים העולים על 90,000^{מיקרון רבוע} עד היום ה-18, בעוד אורגנואידים שמקורם במקטעי גידול יצרו מבנים צפופים ובלתי סדירים יותר עם ארגון מופחת והקרנות רדיאליות מוגברות, בהתאם לשינוי בהתנהגות הצמיחה.

אורגנואידים שמקורם בבלוטות רוק ובשברי אפיתל כליות מציגים גם הם מורפולוגיות מובחנות תחת אותם תנאי הידרוג'ל (איור 2). אורגנואידים של בלוטות הרוק יוצרים מבנים דחוסים בנקודות זמן מוקדמות (יום 3), בעוד שאורגנואידים בכליה מפתחים מורפולוגיה מוארכת ואסימטרית ביום ה-17. תצפיות אלו נכללות כדי להדגים את הגמישות הרחבה יותר של מערכת האורגנידים מבוססת הידרוג'ל מעבר לרקמת השד ולהמחיש את יכולתה לתמוך ביצירת אורגנואידים ממקורות רקמות אפיתל מרובים.

צביעת חיסון וניתוחים מולקולריים שבוצעו בעבר^ב-3,5,8 הראו נוכחות של סמני שושלת אפיתליים, כולל הסמנים הלומינליים KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherin, GATA3, JAG1, Notch1 ו-MUC1, וכן הסמנים הבסיסיים או המיואפיתליים KRT5, KRT14, Slug, SOX9 ו-TP63, המצביעים על שימור ההטרוגניות האפיתלית בתוך האורגנואידים. מאפיינים מבניים התואמים לארגון דמוי יחידת לובולריות דוקטלית סופית נצפו במיקרוסקופיה קונפוקלית ושחזור תלת-ממדי, והוגדרו כמבנים המכילים אזורים דוקטליים מוארכים המחוברים לניצנים דמויי לובול או אלוואולרי הסופיים, המזכירים את ארגון יחידות הלובולריות הסופיות הטבעיות של האדם. מבנים אלו גם הציגו ארגון אפיתל שכבתי עם דפוסי תאים לומינליים ובסיסיים, התואמים ניתוחים שפורסמו בעבר בפלטפורמה זו³.

תחום דמוי מזנכימה נצפה בקשר עם ובין מבני אפיתל ואופיין בהתנהגות נדידה ובביטוי של סמנים כגון VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 ו-FAPα. יחד עם ניתוחי מיקרוסקופיה בזמן-לאפס, תצפיות אלו תומכות בהופעת מיקרו-סביבה תומכת בתוך מערכת התרביות³.

חשוב לציין כי פרוטוקול זה נועד לספק מסגרת מתודולוגית גמישה באופן רחב, ולא לקבוע נקודת ייחוס ביולוגית קבועה אחת. תוצאות כמותיות, כולל יעילות היווצרות אורגנואידים, גודל, מורכבות ההסתעפות והרכב התאים, עשויות להשתנות בהתאם למקור התורם, מצב גיל המעבר, חומר ההתחלה (למשל, שברי רקמה לעומת תאים בודדים) ותנאי הניסוי.

תוצאות לא אופטימליות כוללות ירידה ביעילות היווצרות אורגנואיד (<1 אורגנואיד לכל 500 תאים זרועים), פסולת תאית מופרזת, כישלון בפולימריזציה של קולגן או כישלון בהקמת מבנים מאורגנים. תוצאות אלו קשורות בדרך כלל לחיוניות נמוכה של תאים, פירוק רקמות לא שלם, הרכב הידרוג'ל שגוי או ניטרול pH לא תקין.

ניתוח כמותי של התפתחות אורגנואידים יכול להתבצע באמצעות הדמיה חיה ודימות תוכן גבוה למדידת מספר האורגנידים, התפלגות הגודל, התנהגות הסתעפויות, מורכבות מבנית ודינמיקת תאים. מחקרים קודמים שהשתמשו בפלטפורמה זו ביצעו דימות חי לאורך זמן, מעקב תאים, ניתוח מורפומטרי ומחקרים על הפרעות גנטיות כדי לכמת דינמיקת גדילה אורגנית והתנהגות שושלת לאורך זמן ^3,5. ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח התמונה בוצע באמצעות תוכנת NIS-Elements.

איור משלים 1. דוגמה מייצגת של הידרוג'ל שהתמוטט במהלך תרבית אורגנואידים ארוכת טווח ביום ה-18. הידרוג'לים שהתמוטטו נראים כמבנים צפופים, אטומים ודמויי פקק, הנובעים מהתפתחות תאית נרחבת וכיווץ מטריצות. תכונות מורפולוגיות אלו שימשו כקריטריונים לסיום תרביות לפני קריסת הידרוג'ל מלאה. פס סולם = 500 מיקרון. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירת אורגנים תלת-ממדיים של שד תלת-ממדי בתוך מיקרו-סביבה מוגדרת של הידרוג'ל התומכת בתכונות מרכזיות של מורפוגנזה חזה³. מספר שלבים הם קריטיים להצלחת שיטה זו. ראשית, יש לשלוט בזהירות בעיבוד רקמות ודיסוציאציה אנזימטית כדי לשמור על חיוניות האפיתל תוך מזעור עיכול יתר, שעלול להפחית את תפוקת התאים ולפגוע במורפוגנזה¹⁰. במיוחד, טיפולים אנזימטיים קצרים וסדרתיים, בשילוב עם דיסוציאציה מכנית עדינה, חיוניים לשמירה על אוכלוסיות אפיתל תפקודיות. שנית, הכנת הידרוג'ל דורשת שליטה מדויקת בריכוז הקולגן, pH ותזמון¹¹. ניטרול הקולגן מפעיל פולימריזציה; לכן, כל השלבים לאחר הוספת נתרן הידרוקסיד חייבים להתבצע במהירות ועל קרח כדי להבטיח יצירת ג'ל עקבית. פולימריזציה לא שלמה או מתעכבת עלולה לגרום להידרוג'לים בעלי מבנה לקוי או קרוס שאינם תומכים בהתפתחות אורגנואידים. לבסוף, יש לאופטימיזציה אמפירית של צפיפות הזריעה לכל דגימת תורם, שכן עומס רקמה או תאים מופרז עלול להוביל להתכווצות מהירה של הג'ל ולאובדן שלמות מבנית¹².

מספר שיקולים לפתרון תקלות יכולים לשפר את השחזוריות. היווצרות אורגנואידים לקויה עלולה להיגרם מחיוניות נמוכה של תאים, הרכב הידרוג'ל לא אופטימלי, או טיפול לא נכון בג'ל במהלך ההפקדה¹³. הבטחת שמירת מלאי הקולגן בטמפרטורה של 4°C ולא עברה פולימריזציה מוקדמת היא חיונית לאיכות ג'ל עקבית¹¹. בנוסף, ניתוק מוצלח של הידרוגלים מפני השטח לאחר הפולימריזציה מהווה אינדיקציה להיווצרות ג'ל תקינה; אי ניתוק בדרך כלל משקף פולימריזציה לא שלמה או תנאי משטח לא מתאימים¹⁴. שונות בגודל ובמורפולוגיה האורגנית צפויה בין דגימות תורם ומשקפת הטרוגניות ביולוגית ולא כישלון טכני. מחקרים קודמים שהשתמשו בפלטפורמה זו הראו היווצרות אורגנואידים ניתנת לשחזור בקרב קבוצה רחבה של תורמים ראשוניים אנושיים עצמאיים, למרות שונות משמעותית בין תורמים ביעילות היווצרות אורגנואידים ובמורפוגנזה³.

לשיטה זו יש מספר מגבלות. בעוד שהמודל תומך בהופעת תא מזנכימי לצד מבנים אפיתליים, הוא אינו משחזר במלואו את המורכבות של המיקרוסביבה הסטרומלית, החיסונית והוסקולרית בתוך החיים. הרכב ההידרוג'ל, אף שהוא מוגדר, מייצג מטריצה חוץ-תאית פשוטה ואינו יכול ללכוד את כל הרמזים הביומכניים או הביוכימיים הקיימים ברקמה המקומית^15,16. בנוסף, שונות בין תורם לתורם יכולה להשפיע על דינמיקת גדילה אורגנית ומורפולוגיה, מה שמחייב אופטימיזציה אמפירית ליישומים ספציפיים. למרות מגבלות אלו, היכולת של מערכת זו לתמוך בארגון עצמי ובאינטראקציות אפיתל ומזנכימיות אנדוגניות מהווה התקדמות משמעותית לעומת מודלים תרבותיים קיימים^{רבים 3}.

בהשוואה למערכות מבוססות תמצית ממברנה בסיסית נפוצה, גישה זו מספקת שליטה רבה יותר על הרכב המטריצות החוץ-תאיות ומפחיתה שונות הקשורה לחומרים לא מוגדרים¹⁷. מחקרים קודמים שהשוו ישירות את פלטפורמת ההידרוג'ל הזו למערכות אורגנואידיות מבוססות מטריג'ל הראו הבדלים משמעותיים בארגון הרקמות ובהרכב התאים ^3,8. אורגנואידים שגדלו על ידי הידרוג'ל דמו יותר לרקמת השד האנושית הטבעית הן ברמות המורפולוגיות והן ברמות הטרנסקריפטומיות, ושמרו על אוכלוסיות אפיתל רב-שושלתיות, כולל תאים דמויי לומינל, בסיס, אב קדמון ומזנכימלי, בעוד שאורגנידים שגודלו במטריג'ל נשלטו על ידי מצבים היברידיים דמויי בסיס רב-תרבותיים וחסרו אוכלוסיות סטרומליות. בנוסף, בניגוד למערכות קו-קולטורה המתבססות על הוספת תאי סטרומל חיצוניים, מודל זה מאפשר הופעה פנימית של תא תומך דמוי מזנכימה, המאפשר חקר אינטראקציות אפיתליאליות–מיקרוסביבה בהקשר פיזיולוגי רלוונטי יותר ופחות מהונדס מלאכותית. אוכלוסיות מזנכימיות מתפתחות בתוך ההידרוג'לים אושרו בעבר באמצעות הדמיה חי משלימה, צביעת חיסון, וניתוחים טרנסקריפטומיים חד-תאיים³. מחקרים אלו הראו הופעת תאים דמויי סטרומל ניידים מאוד, המבטאים סמנים הקשורים למעבר מזנכימלי ואפיתל למזנכימל, כולל Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 ו-Snail, יחד עם אינטראקציות איתות אפיתליאליות-מזנכימיות הדדיות שזוהו באמצעות ניתוחי ליגנד-קולטן. תכונות אלו הופכות את המערכת למתאימה במיוחד לחקר תהליכים התלויים בארכיטקטורת הרקמה ובתקשורת תא-תא, כולל מורפוגנזה, פלסטיות אפיתליאלית ועיצוב רקמות מוקדם ^4,5.

לפלטפורמה המתוארת יש יישומים רחבים במחקר בסיסי ותרגומי. ניתן להשתמש בה לחקר התפתחות השד האנושית, למודל אירועים מוקדמים בתחילת המחלה, ולהעריך את השפעות הפרעות מולקולריות או סביבתיות על ארגון הרקמות. מחקרים קודמים שהשתמשו בפלטפורמה זו הראו כי הפרעה פונקציונלית של רגולטורים התפתחותיים כמו DDR1 ו-RUNX1 משנה התמיינות שושלת, ארגון אפיתל ומורפוגנזה דוקטלית-לובולרית בתרבות תלת-ממדית ^5,18. התאמה עם הדמיה כמותית וניתוח תוכן גבוה מאפשרת גם חקירה שיטתית של תוצאות פנוטיפיות, כולל שינויים בגודל, במבנה ובמורכבות האורגנית. לכן, שיטה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה ורלוונטית ביולוגית לחקר ארגון רקמות אנושיות וההפרעה שלה בהקשרים רלוונטיים למחלות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות חרוטיים בקוטר 15 מ"ל	VWR	89039-664	צינורות סטריליים לעיבוד רקמות וצנטריפוגה
40 & mu; מסננת תא M	VWR	732-2757	מכשיר סינון להכנת מתלים חד-תאיים
40 & mu; מסננת תא M לנפחים נמוכים	בל-ארט	136800040	מכשיר סינון להכנת מתלים חד-תאיים
מונה סלולרי אוטומטי	ביו-ראד	1450102	המכשיר המשמש לספירת תאים וקביעת כדאיות
תמצית יותרת מוח בקר	תרמו-סיינטיפיק	13028014	תוסף למדיה של תאי אפיתל
שקופיות ספירת תאים	ביו-ראד	145-0011	שקופיות דו-תאיות המשמשות לספירת תאים
צנטריפוגה	לא זמין	לא זמין	צנטריפוגות על שולחן צריכות להיות בעלות מהירות של לפחות 500 x g ואחסון של צינורות של 15 מ"ל ו-1.5 מ"ל.
קולגן I	מיליפור סיגמא	08-115	חלבון מטריצה חוץ-תאית המשמש ליצירת הידרוג'ל
קולגנאז A	סיגמא-אלדריץ'	11088793001	אנזים המשמש לפירוק רקמות
קריוביאלים	קורנינג	976171	מבחנות סטריליות לאחסון קריוגני של דגימות
כלי גידול (למשל, מחסניות תא, לוחות רב-בארים)	קורנינג	354104 354108 3603	פלטפורמות לשקיעת הידרוג'ל ותרבות אורגנואידים.
דימתיל סולפוקסיד	מיליפור סיגמא	317275	מגן קירור המשמש במדיום הקפאה
Dispase II	רוש	4942078001	אנזים המשמש לפירוק רקמות משני
DNase I	רוש	10104159001	אנזים המשמש במהלך דיסוציאציה של תאים.
סרום בקר עוברי	גיבקו	10437	תוסף סרום המשמש במדיות שטיפה ונטרול
פיברונקטין	סיגמא-אלדריץ'	F2006	רכיב חלבון מטריצה חוץ-תאית
GlutaMAX	תרמו-סיינטיפיק	35050061	תוסף למדיה של תאי אפיתל
גורם גדילה אפידרמלי אנושי	סיגמא-אלדריץ'	E9644	תוסף למדיה של תאי אפיתל
הידרוקורטיזון	סיגמא-אלדריץ'	H0888	תוסף למדיה של תאי אפיתל
חומצה היאלורונית	מיליפור סיגמא	385908	רכיב מטריצת חוץ-תאית לנוסחת הידרוג'ל
היאלורונידאז	סיגמא-אלדריץ'	H3506	אנזים המשמש לפירוק רקמות
חממה	תרמו-סיינטיפיק	3598	המכשיר המשמש לדגירה של תרבית רקמות
אינסולין	סיגמא-אלדריץ'	I9278	תוסף למדיה של תאי אפיתל
למינין	גיבקו	23017-015	רכיב חלבון מטריצה חוץ-תאית
מדיום בסיסי אפיתל בשד	תרמו-סיינטיפיק	M171500	מדיום גדילה לתאי אפיתל
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	תרמו-סיינטיפיק	3451	צינורות המשמשים לתגובות בנפח קטן
סיבוב מסלולי	תרמו-סיינטיפיק	400110	רוטטור המשמש לפיזור רקמות במהלך דיסוציאציה אנזימטית
פיפטת P1000	גילסון	P1000	המכשיר המשמש למיקס והעברת נפחים עד 1,000 ו-mu; L
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו-סיינטיפיק	15140122	תוסף אנטיביוטיקה למדיה של תאי אפיתל
סליין ממוגן בפוספט	גיבקו	20012-027	תמיסת בופר המשמשת לשטיפה ושטיפה
איזון דיוק	מטלר טולדו	ML303E	איזון המשמש לשקילת רקמות
פיפטה סרולוגית	נונק	170356N	פיפטה המשמשת לקצירת תאים אפיתליים שאינם דבקים
נתרן הידרוקסיד (1 ניוטון)	פישר כימיקל	SS261	המגיב המשמש לנטרול קולגן
סכינים סטריליים	ברד-פארקר	372615	כלים המשמשים לטחיצת רקמות מכנית
תמיסת טרייפן בלו	גיבקו	15250061	צבע המשמש להערכת קיום התאים
טריפסין (0.25%)	גיבקו	25200056	מגיב אנזימטי המשמש לפירוק תאים
אמבט מים (37 מעלות; C)	VWR	10LA	התקן המשמש להפשרה מבוקרת של דגימות