הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיעת ELISpot לכימות תאים מפרישי נוגדנים ספציפיים לאנטיגן ותאים מפרישי נוגדנים כוללים בדם ובמוח העצם של קופים מסוג Rhesus Macaques מחוסנים

59 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

במאמר זה

סיכום

B-Cell ELISpot היא שיטה מאושרת לכימות העוצמה והעמידות של תאי פלזמה ארוכי-חיים ספציפיים לאנטיגן המפרישים IgG, IgM ו-IgA, כמו גם את סך התאים המפרישים נוגדנים (ASCs), הן בדם (המשקף פלסמבלאסטים קצרי-חיים לאחר חיסון) והן ב-ASCs עמידים יותר במחול השחם.

תקציר

הערכה של אנטיגנים ומעצברים (adjuvants) חדשניים של חיסונים נסמכת באופן מסורתי על מדידת תיתורי נוגדנים, אשר דורשים זמן להתפתח לאחר החסנה. כימות של תאים מפרישי נוגדנים (ASCs) לאחר חיסונים ראשוניים וחיסוני דחף מספק מדד מוקדם ומספק מידע מכניסטי על חסינות הומורלית המושרית על ידי החיסון, ויכול להקל על אופטימיזציה של פורמולציות חיסונים ואסטרטגיות חיסון. כאן מתואר פרוטוקול לספירת ASCs מתאי מונונוקלאריים של דם פריפריאלי (PBMCs) ומתאי מחול השומג (BM) של קופי רזוס; קופי רזוס הם מודל פרה-קליני חשוב למחקר חיסוני HIV. בדיקת enzyme-linked immunospot (ELISpot) זו מאפשרת כימות של ASCs ספציפיים לאנטיגן ושל סך כל ה-IgG, IgM ו-IgA, על ידי מדידת התדירות המוחלטת והיחסית שלהם. בדם פריפריאלי, הבדיקה לוכדת את שיא תגובת הפלסמבלאסטים לאחר החסנה, בעוד שבמחול השומג היא מזהה את הצטברותם של תאי פלזמה ספציפיים לאנטיגן מאיזוטייפים שונים, ובכך מעריכה את העמידות של ASCs ארוכי חיים. פרוטוקול זה מציע גישה חסונה וניתנת לשחזור להערכת שילובים של אימונוגנים ומעצברים במחקרי חיסונים פרה-קליניים, ומספק נתונים בעלי ערך לתמיכה במעבר של מועמדים מבטיחים לחיסונים לפיתוח קליני.

מבוא

תאים מפרישי נוגדנים (ASCs) הם מרכיבים מרכזיים של החסינות הנרכשת והם כוללים הן פלסמבלסטים (plasmablasts) קצרי חיים, הנוצרים במהירות לאחר חיסון, והן תאי פלסמה (plasma cells) ארוכי חיים, האחראים לייצור נוגדנים מתמשך. פלסמבלסטים ניתנים לזיהוי באופן זמני בדם הפריפרי ובאיברים לימפואידיים משניים, ומגיעים לשיא שכיחותם בנקודות זמן מוגדרות לאחר החיסון, המשתנות בהתאם להרכב החיסון ולמין המארח (בדרך כלל בימים 4–5 בקוף מקאק רזוס ובערך ביום 7 בבני אדם). לעומת זאת, תאי פלסמה בוגרים הם ארוכי חיים ושוהים בעיקר ברקמות לימפואידיות משניות ובמחול השרימה (BM). חיסון יעיל צריך לעורר תגובות חיסוניות חזקות, הן הומורליות והן תאיות. מדידה של תגובות זיכרון (recall responses), הבאות לידי ביטוי בהתרחבות מהירה של פלסמבלסטים בתאים מונונוקליאריים של דם פריפרי (PBMCs) לאחר חיסון דחף, מספקת תובנה בעלת ערך לגבי עוצמת התגובה החיסונית שהשכיח החיסון. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה אמינה לכימות תגובות מוקדמות של פלסמבלסטים ותאי פלסמה ארוכי חיים לאחר חיסון ספציפי ל-Env בקוף מקאק רזוס.

בבדיקת immunospot מקושרת לאנזים (ELISpot), מתרבים תאי ASC בלוחיות של 96 בארות בעלות תחתית ממbranה של פוליבינילידן פלואוריד (PVDF) או תרכובת אסטרי תאית (MCE), המצופות באנטיגן (Ag), דבר המאפשר לתאים חיוניים להפריש חלבונים שנקלטים ישירות על פני הממברנה. החלבונים הנקלטים מזוהים לאחר מכן באמצעות נוגדנים בפורמט של בדיקת sandwich immunoassay קונבנציונלית. בבדיקות ELISpot כרומוגניות, נוצרות נקודות (spots) באמצעות המרת הסובסטרט 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) על ידי פרוקסידאז חזרתי (HRP) למשב שאינו מסיס ובעל צבע, מה שמאפשר ויזואליזציה וספירה של תאי ASC בודדים. שיטת ה-ELISpot מציעה מספר יתרונות חשובים, כולל היכולת לזהות תגובות ספציפיות לאנטיגן ex vivo, הערכה תפקודית רגישה מאוד של תאי חיסון בודדים, וניטור כמותי של תגובות חיסוניות של תאי T ותאי B הן במחקרים פרה-קליניים והן במחקרים קליניים1,2,3.

כאן מתואר פרוטוקול B-cell ELISpot לכימות של ASCs מסוג IgG, IgM ו-IgA, כולל סך הכל ואלו הספציפיים לאנטיגן, ב-PBMCs ובתאי BM  מקופים מסוג rhesus macaques. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הקריטיים, כולל ציפוי פלטות, חסימה, זריעת תאים, פיתוח הבדיקה, ספירת נקודות וניתוח נתונים, כדי לאפיין את הקינטיקה של תגובות פלסמבלסטים ותאי פלסמה כוללים ואלו הספציפיים ל-Env. שיטה זו מספקת גישה הניתנת לשחזור להערכה והשוואה של האימונוגניות של פורמולציות שונות של אנטיגנים ואדג'ובנטים במחקרי חיסון פרה-קליניים, ותומכת באופטימיזציה של אסטרטגיות חיסון לצורך טרנסלציה קלינית עתידית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הקפודים מסוג rhesus macaques ששימשו בפרוטוקול זה הגיעו ממושבות נקיות מפתוגנים ספציפיים (SPF) של מרכז המחקר New Iberia ושוכנו במרכז Michale E. Keeling לרפואה ומחקר השוואתי, במרכז הסרטניות MD Anderson של אוניברסיטת טקסס. הטיפול בבעלי החיים וכל ההליכים הניסויים תאמו את ההנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז הסרטנים MD Anderson של אוניברסיטת טקסס (פרוטוקול מספר 2616RN00).

פרוטוקול זה מהווה אופטימיזציה של הטכניקה שתוארה במחקרי קדם-קליניקה קודמים של חיסון4,5,6,7, אשר פותחה לצורך זיהוי תגובות ASC. הפרוטוקול להלן מתאר את הליך ה-ELISpot באמצעות תכשירי תאים של PBMCs ו-BM טריים מקבלים מקק רסוס (rhesus macaques) שהשתתפו בפרוטוקול של חיסון ניסיוני ל-HIV.

הערה: יש לבצע את כל הפרוצדורות מסעיפים 1–4 במCabs בטיחות ביולוגית מאושרת בדרגה II (Class II) תוך שימוש בטכניקה אספטית. השתמשו בפיפטות רב-ערוציות ב whenever possible.

1. הכנת פלטות ELISpot

  1. ציפוי פלטות ה-ELISpot
    1. צפו את פלטות האימונוגלובולין (Ig) הכולל 1 ו-3 ב-100 µL/well של 5 µg/mL נוגדן עיזים לא מזוגג נגד קוף IgG + IgM + IgA מדולל ב-DPBS סטרילי. הדגרימו את הפלטות ב-4 °C למשך 8 שעות לפחות, רצוי למשך הלילה (איור 1A,C).
    2. צפו את הפלטות הספציפיות לאנטיגן 2 ו-4 ב-100 µL/well של 20 µg/mL לקטין Galanthus nivalis (GNL) מדולל ב-DPBS. הדגרימו את הפלטות ב-4 °C למשך 8 שעות לפחות, רצוי למשך הלילה (איור 1B,D).
    3. שמרו את הפלטות המצופות ב-4 °C עד לשימוש.
  2. שטיפה וחסימה של פלטות האימונוגלובולין הכולל
    1. הסירו את תמיסת הציפוי מפלטות 1 ו-3 על ידי היפוך מהיר של כל פלטה מעל מיכל פסולת. הקישו את הפלטה ההפוכה בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל.
    2. שטפו כל פלטה פעמיים עם 200 µL/well של PBS המכיל 0.05% Tween 20. לאחר מכן שטפו את הפלטות פעמיים עם 200 µL/well של DPBS כדי להסיר שאריות דטרגנט.
      הערה: Tween 20 הוא ציטוטוקסי. הסירו אותו לחלוטין לפני זריעת התאים.
    3. הוסיפו 200 µL/well של RPMI-10 לכל באר. הדגרימו את הפלטות למשך 2 שעות ב-37 °C באינקובטור לח.
  3. שטיפה וחסימה של הפלטות הספציפיות לאנטיגן
    1. הסירו את תמיסת הציפוי GNL מפלטות 2 ו-4 על ידי היפוך מהיר של כל פלטה מעל מיכל פסולת. הקישו את הפלטות ההפוכות בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל.
    2. שטפו כל פלטה ארבע פעמים עם 200 µL/well של DPBS.
      הערה: אין להשתמש ב-PBS המכיל Tween 20 עבור פלטות מצופות GNL.
    3. הוסיפו 200 µL/well של RPMI-10 לכל באר. הדגרימו את הפלטות למשך 2 שעות ב-37 °C באינקובטור לח.
    4. שפכו את תמיסת החסימה. שטפו כל פלטה ארבע פעמים עם 200 µL/well של DPBS.
    5. הוסיפו 100 µL/well של אנטיגן CH505 SOSIP בריכוז סופי של 5 µg/mL. הדגרימו את הפלטות למשך 2 שעות ב-37 °C.
    6. שפכו את תמיסת האנטיגן ושטפו כל פלטה ארבע פעמים עם DPBS סטרילי.
      הערה: השאירו DPBS בבארים לאחר השטיפה האחרונה כדי למנוע את התייבשות ממבראת ה-MCE לפני זריעת התאים.

2. הכנת דגימות: בידוד PBMCs ותאי מונונוקלאריים של מחית העצם

  1. בידוד PBMCs מדם מלא
    1. סובב במרכזפוגה מבחנות דם עם 10 mL EDTA במהירות של 450 x g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ללא שימוש בבלמים.
    2. הסר את הפלסמה והוסף 4 mL DPBS ללא Ca2+ ו-Mg2+. ערבב בעדינות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 mL.
    3. שכּב בזהירות את הדם המדולל מעל 4 mL Ficoll במבחנה לצנטריפוגה של 15 mL. סובב במרכזפוגה במהירות של 800 x g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בהאצה ובבלימה איטיות.
    4. העבר את שכבת ה-buffy coat המכילה תאים מונונוקלאים של דם פריפריאלי למבחנה נקייה של 15 mL. הוסף 8–10 mL DPBS וסובב במרכזפוגה במהירות של 450 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את העילאי (supernatant) והשעה בעדינות את משקע התאים.
    6. הוסף 2 mL באפר ליזיס של own Ammonium Chloride Potassium (ACK) לתליה של התאים. דגור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: אין לעבור את זמן הדגירה של 5 דקות, שכן חשיפה ממושכת לבאפר ליזיס ACK מפחיתה את חיוניות התאים.
    7. עצור את ליזיס האריתרוציטים על ידי הוספת 10 mL DPBS המכיל 2% fetal bovine serum (FBS). סובב את התאים במרכזפוגה במהירות של 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את העילאי והשעה את התאים ב-RPMI-10.
    9. ספור את ה-PBMCs באמצעות שיטת ספירת תאים מתאימה וודא שהחיוניות היא >90%, למשל, באמצעות צביעת trypan blue.
    10. כוון אליקוט אחד לריכוז של 5 × 106 תאים/mL עבור בדיקות ELISpot ספציפיות לאנטיגן. כוון אליקוט שני לריכוז של 1 × 106 תאים/mL עבור בדיקות ELISpot לאימונוגלובולינים כוללים.
  2. בידוד תאים מונונוקלאים ממח עצם
    1. מקם מסנן תאים של 70 µm בתוך מבחנה לצנטריפוגה של 50 mL. הרטב מראש את המסנן עם 1 mL DPBS.
    2. הוסף 4 mL DPBS ל-1 mL של שאיבת מח עצם. ערבב היטב באמצעות פיפטה סרולוגית.
    3. העבר את תליית מח העצם דרך מסנן התאים של 70 µm. שטוף את המסנן עם 2 mL DPBS לפני השלכתו.
    4. שכּב את התליה המסוננת מעל 4 mL Ficoll במבחנה לצנטריפוגה של 15 mL. סובב במרכזפוגה במהירות של 800 x g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בהאצה ובבלימה איטיות.
    5. העבר את שכבת התאים המונונוקלאים למבחנה נקייה של 15 mL. הוסף 8–10 mL DPBS וסובב במרכזפוגה במהירות של 450 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את העילאי והשעה בעדינות את משקע התאים.
    7. הוסף 2 mL באפר ליזיס ACK לתליית התאים. דגור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: אין לעבור את זמן הליזיס המומלץ כדי לשמר את חיוניות התאים.
    8. עצור את ליזיס האריתרוציטים על ידי הוספת 10 mL DPBS המכיל 2% FBS. סובב את התאים במרכזפוגה במהירות של 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את העילאי והשעה את התאים ב-RPMI-10.
    10. ספור את התאים המונונוקלאים של מח העצם באמצעות שיטת ספירת תאים מתאימה וודא שהחיוניות היא >90%, למשל, באמצעות צביעת trypan blue.
    11. כוון אליקוט אחד לריכוז של 5 × 106 תאים/mL עבור בדיקות ELISpot ספציפיות לאנטיגן. כוון אליקוט שני לריכוז של 1 × 106 תאים/mL עבור בדיקות ELISpot לאימונוגלובולינים כוללים.

3. זריעה ודגירה של תאים

  1. זריעה של פלטות האימונוגלובולין הכולל
    1. הסר את מדיום החסימה מפלטות 1 ו-3 על ידי הפיכה מהירה של כל פלטה מעל מיכל פסולת. הקיש את הפלטות ההפוכות בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות מדיום.
    2. הוסף 100 µL RPMI-10 לכל באר בשורה הראשונה ו-133 µL RPMI-10 לכל באר בשורה השנייה והשלישית. שלבים אלו מבוצעים בכפילויות טכניות.
    3. הוסף 100 µL מתליה של PBMC (ריכוז של 1 × 106 cells/mL) לבאר הראשונה של כל עמודה בפלטה 1. סדר את הדגימות בהתאם למערך הפלטה [למשל, באערים A1–A6 עבור קוף רזוס 1 (RM1) ובאערים A7–A12 עבור קוף רזוס 2 (RM2)].
    4. הוסף 100 µL מתליה של תאי מחול השומן (ריכוז של 1 × 106 cells/mL) לבאר הראשונה של כל עמודה בפלטה 3. סדר את הדגימות בהתאם למערך הפלטה.
    5. הכן דילול סדרתי פי שלושה על ידי העברה של 67 µL מבאר אחת לבאה אחריה, וערבב היטב לאחר כל העברה. המשך את הדילול הסדרתי לבאערים הייעודיים, ולאחר מכן השליך את 67 µL האחרונים כדי לשמור על נפח סופי של 133 µL לכל באר.
    6. דגור את הפלטות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO2.
      ​הערה: הימנע מהזזת או הפרת הפלטות במהלך הדגירה כדי למנוע היווצרות של נקודות כפולות.
  2. זריעה של פלטות הספציפיות לאנטיגן
    1. הסר את ה-DPBS מפלטות 2 ו-4 על ידי הפיכה מהירה של כל פלטה מעל מיכל פסולת. הקיש את הפלטות ההפוכות בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות באפר.
    2. הוסף 100 µL RPMI-10 לכל באר בשורה הראשונה ו-133 µL RPMI-10 לכל באר בשורה השנייה והשלישית.
    3. הוסף 100 µL מתליה של PBMC (ריכוז של 5 × 106 cells/mL) לבאר הראשונה של כל עמודה בפלטה 2. הוסף את הדגימות בהתאם למערך הפלטה.
    4. הוסף 100 µL מתליה של תאי מחול השומן (ריכוז של 5 × 106 cells/mL) לבאר הראשונה של כל עמודה בפלטה 4. הוסף את הדגימות בהתאם למערך הפלטה.
    5. הכן דילול סדרתי פי שלושה על ידי העברה של 67 µL מבאר אחת לבאה אחריה, וערבב היטב לאחר כל העברה. המשך את הדילול הסדרתי לבאערים הייעודיים, ולאחר מכן השליך את 67 µL האחרונים כדי לשמור על נפח סופי של 133 µL לכל באר.
    6. דגור את הפלטות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO2.
      הערה: הימנע מהפרעת האינקובטור במהלך הדגירה, שכן רעידות עלולות לגרום להיווצרות נקודות כפולות או ארטיפקטים של "זנב שביט".

4. עיבוד פלטות ה-ELISpot

  1. עיבוד פלטות האימונוגלובולין הכולל
    1. הוצא את הפלטות מהאינקובטור לאחר כ-18 h של דגירה.
    2. הסר את התאים ואת מצע התרבית על ידי הפיכה מהירה של כל פלטה מעל מיכל פסולת המכיל 10% bleach. ה叩ק את הפלטות ההפוכות בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל.
      הערה: בצע את שלבי העיבוד הנותרים בתנאים שאינם סטריליים.
    3. שטוף כל פלטה ארבע פעמים עם 200 µL/well DPBS המכיל 0.05% Tween 20.
      הערה: השאר את בופר השטיפה האחרון בבארות כדי למנוע מהממברנות להתייבש.
    4. לחלופין, שטוף את הפלטות באמצעות שוטף מיקרופלטות אוטומטי כאשר מעבדים מספר רב של פלטות.
    5. הכן את תמיסת הנוגדן לזיהוי על ידי דילול נוגדי IgG ו-IgM anti-monkey biotinylated ביחס של 1:1,000 ונוגדן IgA anti-monkey biotinylated ביחס של 1:500 ב-DPBS המכיל 0.05% Tween 20 ו-1% FBS.
    6. הסר את בופר השטיפה האחרון על ידי הקשה של הפלטות על נייר סופג. הוסף 100 µL/well של נוגדן anti-IgG מדולל לעמודות 1 ו-2, 7 ו-8, נוגדן anti-IgM לעמודות 3 ו-4, 9 ו-10, ונוגדן anti-IgA לעמודות 5 ו-6, 11 ו-12.
      הערה: עבד פלטה אחת בכל פעם כדי למנוע מהממברנות להתייבש.
    7. דגור את הפלטות למשך 2 h בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את תמיסת הנוגדן לזיהוי ושטוף את הפלטות ארבע פעמים עם DPBS המכיל 0.05% Tween 20.
    9. הכן את התצמיד האנזימטי על ידי דילול HRP-avidin ביחס של 1:1,000 ב-DPBS המכיל 0.05% Tween 20 ו-1% FBS.
    10. הוסף 100 µL/well של HRP-avidin מדולל לכל בארה. דגור את הפלטות למשך 2 h בטמפרטורת החדר, מוגנות מאור.
    11. הסר את תמיסת ה-HRP-avidin ושטוף את הפלטות ארבע פעמים עם DPBS המכיל 0.05% Tween-20.
      ​הערה: השאר את בופר השטיפה האחרון בבארות עד לסיום פיתוח הסובסטרט.
  2. עיבוד פלטות ספציפיות לאנטיגן
    הערה: הפרוצדורה דומה לזו שנעשתה עבור פלטות האימונוגלובולין הכולל. עם זאת, בצע את כל שלבי השטיפה באמצעות DPBS ללא Tween 20 כדי לשמר את ציפוי ה-GNL.
    1. הוצא את הפלטות מהאינקובטור לאחר כ-18 h של דגירה.
    2. הסר את התאים ואת מצע התרבית על ידי הפיכה מהירה של כל פלטה מעל מיכל פסולת המכיל 10% bleach. ה叩ק את הפלטות ההפוכות בחוזקה על נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל.
      הערה: בצע את שלבי העיבוד הנותרים בתנאים שאינם סטריליים.
    3. שטוף כל פלטה ארבע פעמים עם 200 µL/well DPBS.
      הערה: השאר את בופר השטיפה האחרון בבארות כדי למנוע מהממברנות להתייבש.
    4. הכן את תמיסת הנוגדן לזיהוי על ידי דילול נוגדי IgG ו-IgM anti-monkey biotinylated ביחס של 1:1,000 ונוגדן IgA anti-monkey biotinylated ביחס של 1:500 ב-DPBS המכיל 1% FBS.
    5. הסר את בופר השטיפה האחרון על ידי הקשה של הפלטות על נייר סופג. הוסף 100 µL/well של נוגדן anti-IgG מדולל לעמודות 1 ו-2, 7 ו-8, נוגדן anti-IgM לעמודות 3 ו-4, 9 ו-10, ונוגדן anti-IgA לעמודות 5 ו-6, 11 ו-12.
      הערה: עבד פלטה אחת בכל פעם כדי למנוע מהממברנות להתייבש.
    6. דגור את הפלטות למשך 2 h בטמפרטורת החדר.
    7. הסר את תמיסת הנוגדן לזיהוי ושטוף את הפלטות ארבע פעמים עם 200 µL/well DPBS.
    8. הכן את התצמיד האנזימטי על ידי דילול HRP-avidin ביחס של 1:1,000 ב-DPBS המכיל 1% FBS.
    9. הוסף 100 µL/well של HRP-avidin מדולל לכל בארה. דגור את הפלטות למשך 2 h בטמפרטורת החדר, מוגנות מאור.
    10. הסר את תמיסת ה-HRP-avidin ושטוף את הפלטות ארבע פעמים עם 200 µL/well DPBS.
      הערה: השאר את בופר השטיפה האחרון בבארות עד לסיום פיתוח הסובסטרט.
  3. ביצוע שטיפה אוטומטית (אופציונלי)
    1. הכן את שוטף המיקרופלטות האוטומטי עם DPBS לפי הוראות היצרן.
    2. בחר את תוכנית השטיפה המוגדרת מראש עבור ELISpot ובצע את כל שלבי השטיפה באמצעות DPBS.
      הערה: השתמש ב-DPBS לכל השטיפות האוטומטיות כדי למנוע הכנה חוזרת של המכשיר עם בופרי שטיפה שונים.
    3. השתמש בהגדרות השוטף המפורטות ב- טבלה 1 עבור שוטף המיקרופלטות.

5. גילוי

  1. הכנת תמיסת הסובסטרט
    1. הכינו את תמיסת העבודה של ה-AEC מיד לפני השימוש על ידי הוספת טיפה אחת של תמיסת כרומוגן לכל 1 mL של תמיסת סובסטרט. ערבבו היטב באמצעות וורטקס.
      הערה: הכינו כ-40 mL של תמיסת עבודה עבור ארבעה פלטות בעלות 96 בארות.
  2. פיתוח פלטות ה-ELISpot בטמפרטורת החדר
    1. עבדו פלטה אחת בכל פעם. השליכו את באפר השטיפה האחרון והוסיפו מיד 100 µL לבערה של תמיסת עבודה AEC.
    2. עקבו אחר התפתחות הנקודות באופן חזותי עד להופעת נקודות אדומות ברורות, בדרך כלל תוך 2–4 min.
      זהירות: אין לפתח את הפלטות יתר על המידה, שכן פיתוח מוגבר מגביר את צביעת הרקע ופוגע ברזולוציית הנקודות.
    3. עצרו את התגובה האנזימטית על ידי שטיפה יסודית של הפלטה תחת ברז פתוח.
    4. שטפו את הפלטה ארבע עד חמש פעמים במי ברז. הסירו עודפי מים באמצעות נייר סופג.
    5. הסירו את תומך הניקוז של הפלטה והניחו לפלטות להתייבש באוויר למשך כ-24 h לפני ספירת הנקודות.
      הערה: עצרו את התגובה ברגע שנקודות הופכות גלויות בבארים המכילות את ריכוזי התאים הגבוהים ביותר, כדי למנוע פיתוח יתר.
    6. חזרו על שלבים 5.2.1–5.2.5 עבור כל פלטה שנותרה.

6. כימות הנקודות

  1. רכישת תמונות ELISpot
    1. סרוק כל פלטה באמצעות קורא ELISpot המצויד בתוכנה לרכישת תמונות.
    2. בחר את תבנית הפלטה המתאימה, הגדר את הבארים למניתוח ורכוש תמונות בהתאם להוראות התוכנה.
    3. שמור את הנתונים הגולמיים וייצא את תמונות הפלטה בפורמט TIFF למטרות ארכיונאיות.
  2. ספירת תאים מפרישים נוגדנים
    1. סקור את ספירות הנקודות האוטומטיות עבור כל באר.
    2. אמת ידנית כל באר כדי לזהות נקודות שהמוזגו או פוצלו באופן שגוי. סמן נקודות בודדות ידנית במידת הצורך כדי להשיג ספירות מדויקות.
      הערה: אימות ידני מומלץ מכיוון שנקודות גדולות עשויות להיספר מספר פעמים על ידי תוכנת ניתוח אוטומטית.
    3. רשום את ספירות הנקודות יחד עם מקדמי הדילול המתאימים בגיליון נתונים כפי שמתואר ב-Table 2.
    4. נתח בארים כפולים בנפרד עבור IgG, IgM ו-IgA לפני חישוב ספירת הנקודות הממוצעת לכל דילול.
    5. חשב את מספר התאים המפרישים נוגדנים למיליון תאי קלט על ידי הכפלת ספירת הנקודות הממוצעת במקדל הדילול המתאים.
      הערה: השתמש במקדמי דילול של 15×, 45× ו-135× עבור בדיקות אימונוגלובולין כוללי, ו-3×, 9× ו-27× עבור בדיקות ספציפיות לאנטיגן.
    6. בצע את כל החישובים בתוכנת גיליון נתונים והפק גרפים באמצעות תוכנה לגרפים סטטיסטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדיקת ELISpot של תאי B זו, נבדקו תאים מפרישי נוגדנים (ASCs) באמצעות CH505 SOSIP, טרימר מסיס של גליקופרוטאין המעטפת (Env) של HIV-1, ששימש כאנטיגן לציפוי במחקר חיסונים שמטרתו לעורר נוגדנים ניטרליים רחבי טווח (bnAbs) נגד HIV-1. איור 1 מדגים את תכנון פלטת ה-ELISpot ששימשה לכימות ASCs כוללים ו-ASCs ספציפיים לאנטיגן על פלטות נפרדות. התכנון מזהה את בעלי החיים האינדיבידואליים ואת מיקומי הבארים שהוקצו לניתוחי IgG, IgM ו-IgA. תוויות הפלטה כוללות גם את מספר המחקר, נקודת הזמן של הדגימה ואת התאריך. בנוסף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת B-cell ELISpot היא שיטה רגישה לזיהוי תגובות כוללות של אימונוגלובולין ותאים מפרישי נוגדנים (ASC) ספציפיים לאנטיגן בתאי דם, פלסמה ותאי מוח עצם8,9,10,11. מספר שלבים הם קריטיים להבטחת השחזור של הפרוטוקול. ראשית, יש לצפות את הממברנות באופן מדויק בריכוז אופטימלי של הנוגדן הלכד. חסימת הממברנה חיונית למניעת קישור לא ספציפי, ומומלץ לבצע אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C, כפי שמתואר בפרוטוקול זה. לח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים פיננסי להצהיר עליו.

תודות

המחברים מבקשים להודות לבעלי החיים ולצוות הטיפול והמחקר במרכז קילינג (Keeling Center) לרפואה ומחקר השוואתיים על הטיפול שנתנו, ולחברי צוות ועמיתים רבים בעבר על שיפורים עקביים בפרוצדורה. מימון לפרויקט חיסון ה-HIV ב-NHP סופק על ידי מענקי NIH שמספרם 5R01AI183472 עבור MBZ ו-R24OD010947 עבור FJV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ACK LysisQuality Biological118-156-101500 ml
מסנן µm 70Fisher22363548מסנן תאים סטרילי, מתאים למבחנות קוניות של 50 mL
תסבס (Substrate) עבודה AECBD Biosciences551951ריאגנטים ל-10 פלטות
ניתוח: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel עבור Microsoft 365
ניתוח: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinNHPRRAB-3086851ליופיליזציה
Anti-monkey IgG biotinRocklandP/N 617-106-012ליופיליזציה
Anti-monkey IgM biotinRocklandP/N 617-106-007ליופיליזציה
מדיום חסימה (Blocking media)ריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימיתRPMI-10
בופר לדילול הנוגדן המשני ו-HRPריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימית1X DPBS עם 1%FBS
צנטריפוגה Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, שנת ייצור: 2013, רוטור TX-750 ו-75003608 (דלי עגול)
בופר ציפוי (Coating buffer)ריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימית1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
פלטות ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50מארז של 50 פלטות
סרום עגל עוברי (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL לא מצומדVector LaboratoriesL-1240-5ליופיליזציה
Horseradish Peroxidase (HRP) - AvidinVector LaboratoriesA-20045mg/ml מוכן לשימוש
קורא Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000דימוי וניתוח אוטומטיים לבדיקות ELISpot ו-Flurospot
פניצילין/סטרפטומייציןGibco15140-122100X
שוטף פלטותBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSשוטף מיקרו-פלטות 405 TS
RPMI-10ריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימיתRPMI-1640 + 10% סרום עגל עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
נוגדן פוליקלונלי מעז לא מצומד נגד monkey IgG+IgA+IgM Antibody IgG/IgM/IgALS-BioC347340ליופיליזציה
בופר שטיפה (פלטות ספציפיות לאנטיגן)ריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימית(DPBS 1X בלבד)
בופר שטיפה (פלטות Total Ig)ריאגנטים שהוכנו במעבדהפורמולציה פנימית(DPBS 1X + 0.05% Tween 20)

מקורות

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דם היקפיאימונוגניות של חיסוןתגובת פלסמבלאסטיםתאי פלזמהאסטרטגיית חיסוןמחקרי חיסונים פרה-קליניים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.