מאמר שיטה

הכנה והערכת איכות של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין למטרות טיפול בשחפת

8 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71858

⸱

1 באוקטובר 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד לייעל את הכנתם של ליפוזומים טעונים בתרופות נגד שחפת ולהקים מערכת סטנדרטית להערכת איכות עבור הפורמולציות הליפוזומליות.

תקציר

שחפת (TB), הנגרמת על ידי Mycobacterium tuberculosis (MTB), נותרה אחד הגורמים המובילים לתמותה מזיהומים ברחבי העולם עם נטל מחלה כבד בסין, המוחמר עקב התפשטותה של שחפת עמידה לריפמפיצין/למספר תרופות ומגבלות קריטיות של כימותרפיה קונבנציונלית — כולל חדירות תרופתית נמוכה, רעילות מערכתית חמורה והיענות נמוכה לטיפול. מערכות הובלה ליפוזומליות מציעות יתרונות ייחודיים לטיפול נגד שחפת, אך פיתוחן מעוכב בשל תהליכי הכנה שאינם עקביים, יעילות טעינה נמוכה של התרופה ומחסור במסגרת סטנדרטית להערכת איכות. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת הידרציה של שכבה דקה, בשילוב עם טיפול אולטרסאונד וסינון, להכנת ננוליפוזומים טעונים בריפמפיצין עם יחסי פוספוליפיד-כולסטרול שונים. בוצעה תיקוף של שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) לקביעת יעילות הכליאה וטעינת התרופה. פיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) שימשו לאפיון גודל החלקיקים, פוטנציאל זטא ומורפולוגיה מיקרוסקופית, ופרופילי שחרור תרופה in vitro נותחו באמצעות בדיקות התמוססות. הליפוזומים שעברו אופטימיזציה הראו יעילות כליאה גבוהה, טעינת תרופה אידיאלית, גודל חלקיקים אחיד בננו-סקלה, יציבות אחסון טובה ושחרור תרופה ממושך in vitro. עבודה זו מספקת שיטות ניסוייות סטנדרטיות ומערכת מקיפה להערכת איכות עבור פיתוח ליפוזומים נגד שחפת, ובכך תומכת בתרגום קליני של מערכות הובלה ליפוזומליות לטיפול בשחפת.

מבוא

שחפת (TB), מחלה זיהומית כרונית הנגרמת על ידי Mycobacterium tuberculosis (MTB), נותרת סיבת התמותה המובילה בקרב מחלות זיהומיות המיוחסות לפתוגן בודד, ומהווה איום מתמיד וחמור הן לבריאות האדם והן לביטחון בריאות הציבור העולמי. על פי דוח השחפת העולמי לשנת 2025 של ארגון הבריאות העולמי (WHO), נאמדו כ-10.7 מיליון מקרי שחפת חדשים וכ-1.23 מיליון מקרי מוות הקשורים לשחפת ברחבי העולם בשנת 20241. מתוכם, דווחו כ-390,000 מקרים חדשים של שחפת עמידה לריבוי תרופות/עמידה לריפמפיצין (MDR/RR-TB), כאשר רק 42% מהאנשים שנפגעו נרשמו לטיפול. ההדבקה המתמשכת של שחפת עמידה לתרופות הפכה למכשול מרכזי ביישום אסטרטגיית "סיום השחפת" (End TB Strategy) הגלובלית של ארגון הבריאות העולמי.

נכון להיום, כימותרפיה נותרת עמוד השדרה של הטיפול הקליני ב-TB. המשטר הסטנדרטי של קו ראשון כולל שילוב של isoniazid, rifampicin, pyrazinamide ו-ethambutol, עם משך טיפול ממושך של 6 עד 9 חודשים2. עבור MDR/RR-TB, המשטר מחייב הכללה של תרופות אנטי-TB של קו שני, דבר המאריך את מהלך הטיפול ל-18–24 חודשים3, בליווי עלויות מוגברות משמעותית ועלייה ניכרת בתופעות לוואי של התרופות4. למרות שסוכנים אנטי-TB חדשים — כגון bedaquiline, delamanid ו-pretomanid — אושרו בשנים האחרונות והציעו אפשרויות טיפוליות חדשות עבור TB עמיד לתרופות5, הם עדיין לא הצליחו להתגבר על צווארי הבקבוק הבסיסיים הטבועים בטיפול האנטי-TB הקיים6,7.

ראשית, M. tuberculosis הוא פתוגן תוך-תאי טיפוסי השוהה בעיקר בתוך מקרופאגים אלבולאריים של המארח. לתרופות חופשיות יש חדירות נמוכה דרך ממברנת המקרופאג, מה שמוביל לריכוזי תרופה תוך-תאיים הנמוכים בהרבה מהריכוז המעכב המינימלי (MIC)8. הכישלון הנובע מכך במיגור תאים שורדים (persisters) תוך-תאיים משמש כגורם מפתח להישנות של השחפת ולהופעת עמידות לתרופות9. שנית, נגעי שחפת מציגים מחסומים ביולוגיים מרובים, כולל רקמה נמקית גבינית וקפסולות פיברוטיות, המעכבים את חדירותן של תרופות חופשיות לליבת הנגע, דבר המוביל לריכוזי תרופה מקומיים תת-אופטימליים ולירידה ביעילות הבקטריצידית10,11. שלישית, מתן מערכתי לטווח ארוך במינונים גבוהים נוטה לגרום לתגובות לוואי חמורות — כגון הפטו-טוקסיות מושרית ריפמפיצין, אוטו-טוקסיות ונפרו-טוקסיות הקשורות לאמינוגליקוזידים, וטנדנופתיה וקרדיו-טוקסיות הקשורות לפלואורוקינולונות — המהוות סיבות עיקריות להפסקת הטיפול ולהיענות חולה נמוכה12,13. רביעית, מונותרפיה או מתן רצפי בוחרים בקלות מוטציות עמידות לתרופות ב-M. tuberculosis, בעוד שמשטרי שילוב של תרופות מרובות מגבירים עוד יותר את הסיכון לרעילות מצטברת, מה שיוצר דילמה קלינית מתמשכת14.

פיתוח מערכות הובלה של ננו-רפואה מציע אסטרטגיה מבטיחה להתמודדות עם צווארי הבקבוק שהוזכרו לעיל בטיפול נגד שחפת (anti-TB). מבין אלה, ליפוזומים — נשאי שלפוחיות סגורים בננו-סקלה המרכיבים את עצמם משכבות בילייר של פוספוליפידים — התגלו כאחת מפלטפורמות הננו-נשאים בעלות הפוטנציאל הגבוה ביותר לתרגום קליני עבור טיפול אנטי-זיהומי, זאת בשל התאימות הביולוגית המצוינת שלהם, יכולת הפירוק הביולוגי, היכולת להובלה ממוקדת ותכונות של שחרור מבוקר וממושך15,16. בהשוואה לתרופות חופשיות נגד שחפת, למערכות הובלה ליפוזומליות יש מספר יתרונות שאינם ניתנים להחלפה עבור טיפול ב-TB.

ראשית, הם מאפשרים העשרה ממוקדת במקרופאגים. ליפוזומים נספגים באופן מועדף על ידי פגוציטים של מערכת הרטיקולו-אנדותלספלינית (RES), מה שמוביל להצטברות ספציפית באיברים מרכזיים שבהם שוכנים MTB, כגון הריאות, הכבד והטחול. יתרה מכך, הם חודרים ביעילות דרך ממברנת המקרופאג17, מה שמעלה משמעותית את ריכוזי התרופה התוך-תאיים, מחסל חיידקים תוך-תאיים עמידים, ובכך מפחית באופן מהותי את הישנות מחלת ה-TB ואת העמידות לתרופות. שנית, הם מפגינים חדירות מוגברת לתוך נגעי TB. באמצעות ויסות גודל החלקיקים, המטען הפני ושינויים במשטח, ליפוזומים יכולים לחצות ביעילות את הקפסולה הפיברוטית ואת מחסום הנמק הגביני של נגעי TB, ובכך להעלות משמעותית את ריכוזי התרופה המקומית ולשפר את היעילות הבקטריצידית18. שלישית, הם מפחיתים באופן ניכר את רעילות התרופות. ליפוזומים משנים את הפיזור הביולוגי (biodistribution) של תרופות in vivo, ובכך מגבילים את החשיפה של רקמות ואיברים בריאים ומפחיתים משמעותית את הרעילות הסיסטמית של סוכני אנטי-TB. לדוגמה, ליפוזומים טעונים באמינוגליקוזידים מפחיתים מאוד את הצטברות התרופה בקוכלא ובכליות, ובכך כמעט ומבטלים את הסיכונים לאוטוטוקסיות ונפרוטוקסיות19. רביעית, הם מספקים שחרור ממושך וארוך טווח. מבנה השכבה הכפולה של הפוספוליפידים מאפשר שחרור מבוקר ואיטי של התרופה, מה שמאריך את זמן מחצית החיים במחזור הדם ואת משך הפעילות in vivo, מפחית את תדירות המינונים ומשפר משמעותית את היענות המטופלים20. חמישית, הם מאפשרים הובלה משולבת של מספר תרופות. ליפוזומים יכולים להכיל בו-זמנית מספר תרופות אנטי-TB בעלות תכונות פיזיקו-כימיות שונות, להשיג הובלה מסונכרנת ואפקטים בקטריצידיים סינרגטיים, ובכך לדכא ביעילות את הופעתם של מוטנטים של MTB העמידים לתרופות21.

הושגה התקדמות משמעותית בתרגום הקליני של מערכות הולכת תרופות ליפוזומליות לטיפול נגד שחפת (anti-TB). תמיסת השאיפה של ליפוזומי amikacin (ALIS) קיבלה אישור מהמנהל למזון ותרופות של ארה"ב (FDA) לטיפול במחלת ריאות הנגרמת על ידי Mycobacterium avium complex (MAC)22, ומאז שולבה במשטרי טיפול בשחפת עמידה לריבוי תרופות (MDR-TB) במדינות רבות, מה שמדגיש את הערך הקליני ואת סיכויי היישום הרחבים של פלטפורמות ליפוזומליות בניהול השחפת23. עם זאת, הפיתוח והתיעוש של ליפוזומים נגד שחפת ממשיכים להתמודד עם מספר צווארי בקבוק טכניים קריטיים, הכוללים שחזור דל של תהליכי ההכנה, קיבולת טעינת תרופות נמוכה ויעילות הכנסה נמוכה, התפלגות גודל חלקיקים לא הומוגנית, אגרגציה ודליפת תרופה במהלך האחסון, ומתאם שאינו מובן דיו בין התנהגות ההמסה/שחרור in vitro לבין היעילות in vivo. אתגרים אלו מעכבים באופן משמעותי את תהליך המחקר והפיתוח ואת התרגום הקליני של פורמולציות ליפוזומליות חדשניות נגד שחפת24,25.

מחקר זה מבסס שיטת הידרציה של סרט דק–אולטרסוניקציה–סינון המתאימה לכליאה של תרופות קטנות הידרופוביות או ליפופיליות חלשות (למשל, rifampicin) בתוך השכבה הכפולה של הפוספוליפידים. עבור תרופות הידרופיליות מאוד, שיטת הסרט הדק הקונבנציונלית נותנת נצילות כליאה נמוכה, אלא אם כן מיושמת אופטימיזציה נוספת (למשל, טעינה במדרג של ammonium sulfate). הפרוצדורה משתמשת בציוד סטנדרטי (מאדה סיבובי, מכשיר ניקוי אולטרסוני, HPLC, DLS, TEM), מה שמבטיח שחזור קל ללא צורך במכשירים ייעודיים. ההתקנה הנוכחית בקנה מידה מעבדתי של 10 mL מניבה איכות יציבה ועקביות טובה בין סדרות. הגדלה לקנה מידה תעשייתי תדרוש אופטימיזציה של ואקום האידוי, מהירות הסיבוב, עוצמת האולטרסוניקציה ומפרטי הממברנה. ראוי לציין כי הליפוזומים נותרים יציבים במשך 30 days בטמפרטורה של 4 °C, אך מראים חמצון, אגרגציה והשכבה לאחר 60 days, מה שמחייב lyophilization או שינוי בפורמולציה לצורך שימור לטווח ארוך. ביצענו אופטימיזציה שיטתית של יחס הפוספוליפיד-לכולסטרול, תיקננו את תהליך ההכנה והקמנו מערכת הערכה מקיפה לאיכות הכוללת נצילות כליאה, טעינת תרופה, גודל חלקיקים, פוטנציאל זטא, מורפולוגיה, שחרור in vitro ויציבות אחסון. פרוטוקול זה מספק הנחיה ברורה לחוקרים להערכת התאמת השיטה להובלת תרופות הידרופוביות ומשמש כסימוכין להתאמת פורמולציה, תכנון ניסויי ובחינה ראשונית של הגדלת קנה המידה.

פרוטוקול

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או בעלי חיים, ולא נדרש אישור אתי.

1. הכנת ננו-ליפוזומים טעונים בריפמפיצין

הערה: יש להכין את כל הפורמולציות בשלוש חזרות.

  1. שקלו את רכיבי הליפוזום באמצעות מאזניים אנליטיים ברמת דיוק של אחת למאה אלף. יחסי המסה של פוספוליפיד לכולסטרול נקבעו כ-95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 ו-70:30, בהתאמה (Table 1).
  2. הניחו את שלושת הרכיבים בבีก'ר בצורת פקעת בנפח 100 mL המתאים לאידוי סיבובי. המיסו את כל רכיבי הליפידים ב-6 mL של כלורופורם. בצעו סוניקציה לתערובת באמבט מים (40 kHz, 100 W) למשך 1 min עד לקבלת תמיסה צלולה.
    ​אזהרה: כלורופורם הוא ממס אורגני נדיף, המזיק במקרה של שאיפה או ספיגה דרך העור. בצעו את כל השלבים הכוללים כלורופורם (1.3–1.5) בתוך מapay של כימיקלים מאושר. עבדו עם כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקפי מגן כימיים.
  3. הסירו את הכלורופורם באמצעות מאייד סיבובי (rotary evaporator) לפי הפרמטרים הבאים:
    1. קבעו את טמפרטורת המעבה לערך שאינו גבוה מ-5- °C.
    2. קבעו את טמפרטורת אמבט המים ל-37 °C
    3. קבעו את מהירות הסיבוב ל-60 rpm
    4. כוון את הוואקום ל-330 mbar כדי להוריד את נקודת הרתיחה של הכלורופורם
      אזהרה: יש להפעיל את המאיד הסיבובי בתוך מapay. ודאו שמלכודת הקור מחוברת כראוי כדי למנוע חדירה של אדי ממס למשאבת הוואקום.
  4. הפעילו ב-330 mbar למשך 20 min, לאחר מכן הגבירו את הוואקום ל-80 mbar והמשיכו למשך 10 min נוספים כדי להסיר לחלוטין את שאריות הממס וליצור שכבת ליפידים דקה26.
    הערה: אספו את הממס המאודה שהתעבה במעבה כפסולת אורגנית המכילה הלוגנים. השליכו את כל פסולת הכלורופורם למכל ייעודי לממסים אורגניים הלוגנתיים המסומן כראוי. אין לשפוך למסוק.
  5. ייבשו את שכבת הליפידים תחת ואקום (≤ 80 mbar) בטמפרטורה של 25 °C למשך 12 h.
    הערה: שלב הייבוש מבוצע בדסיקטור ואקום בתוך מapay כדי למנוע שחרור של שאריות ממס.
  6. הידרו את השכבה המיובשת עם 10 mL של בופר פוספט סאליין (PBS). הניחו את הבקרא על המאיד הסיבובי (ללא ואקום) במהירות של 100 rpm ובטמפרטורה של 37 °C למשך 1 h עד שהשכבה הליפידית תתנתק לחלוטין. הריכוז הסופי של rifampicin הוא 1 mg/mL.
  7. בצעו סוניקציה באמבט מים (40 kHz, 100 W) בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 min. ודאו שטמפרטורת אמבט המים נשארת ב-37 °C. הנפח הכולל של הדגימה המטופלת הוא 10 mL.
  8. סננו את ת сусפנזיה שעברה סוניקציה באופן רצופי. הרטיבו מראש מסנן מזרק PES של 0.45 µm (קוטר 13 mm) עם 1 mL של PBS. באמצעות מזרק של 10 mL, העבירו את כל דגימת ה-10 mL דרך מסנן ה-0.45 µm פעם אחת. לאחר מכן, הרטיבו מראש מסנן מזרק PES של 0.22 µm (קוטר 13 mm) והעבירו את התסנין דרכו פעם אחת. אין להשתמש באקסטרודר ליפוזומים (Figure 1).

2. יעילות הכליאה

הערה: יעילות הכליאה (EE) נקבעה באמצעות סנטריפוגציה של אולטרה-פילטרציה, המפרידה במהירות תרופה חופשית מתרופה כלואה בליפוזומים על בסיס מעקב פיזי. לאחר מכן, יש למדוד את תכולת התרופה בשתי השברים ולחשב את יעילות הכליאה27.

  1. הוסיפו בדיוק 200 µL של תרחיף ליפוזומים למאגר הדגימות של מבחנת אולטרה-פילטרציה בנפח 0.5 mL (MWCO של 3 kDa), ולאחר מכן ביצעו סרכוז להפרדת התרופה החופשית מהליפוזומים.
  2. סרכזו במהירות של 7,000 x g (רוטור בעל זווית קבועה) בטמפרטורה של 25 °C למשך 15 min. אספו את התסנין למבחנת האיסוף, וחזרו על הפעולה במשך 4–5 מחזורים.
  3. אחדו את כל התסנינים ודללו ל-10 mL באמצעות Methanol בבקבוק מדידה. סננו דרך מסנן מזרק Nylon66 בנקבים של 0.22 µm לפני ההזרקה ל-HPLC.
  4. הגדירו את תנאי ה-HPLC באופן הבא: עמודה: עמודת C18 (4.6 mm x 250 mm, 5 µm); פאזה ניידת: acetonitrile: חומצה פוספורית מימית = 45: 55 (V/V); אורך גל לגילוי: 475 nm; קצב זרימה: 1.0 mL/min; טמפרטורת עמודה: 40 °C; נפח הזרקה: 20 µL; זמן ריצה: 20 min
    זהירות: Acetonitrile היא חומר דליק ורעיל. יש להכין ולטפל בפאזה הניידת בתוך מ इथे שאיבה. יש להשתמש בציוד מיגון אישי (PPE) מתאים.
  5. חשבו את יעילות הכליאה (EE) באמצעות המשוואה הבאה: Encapsulation Efficiency (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. חשבו את טעינת התרופה (DL) באמצעות המשוואה הבאה: Drug Loading (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    הערה: Wtotal—התוכן הכולל של פוספוליפידים, כולסטרול ו-rifampicin שהוספו; Wrfb—התוכן של rifampicin שהוסף; Wfree—התוכן של תרופות חופשיות בליפוזומים.

3. תיקוף שיטת HPLC

הערה: בצעו תיקוף של שיטת ה-HPLC עבור ליניאריות, דיוק, הדירות, יציבות, התאוששות וספציפיות באופן הבא.

  1. הכינו תמיסות סטנדרט של rifampicin בריכוזים הבאים בתוך הפאזה הניידת: 1.15, 2.3, 4.6, 9.2, 13.8, 18.4, ו-23.0 µg/mL. נתחו כל תמיסה באמצעות HPLC, רשמו את שטחי הפיקים, וחשבו את משוואת הרגרסיה ואת R2.
  2. מדדו את שטחי הפיקים של תמיסות rifampicin בריכוזים של 9.2, 13.8, ו-18.4 µg/mL. בצעו חמישה בדיקות מקבילות ביום אחד וחשבו את ה-RSD.
  3. הכינו ארבע תמיסות מקבילות של rifampicin בריכוז 9.2 µg/mL. מדדו את שטחי הפיקים באמצעות HPLC וחשבו את ה-RSD של הדיוק (repeatability) של השיטה.
  4. שמרו את תמיסת הסטנדרט בריכוז 9.2 µg/mL בטמפרטורת החדר. נתחו את התמיסה בנקודות זמן של 0, 2, 4, 6, 12, ו-24 שעות, רשמו את שטחי הפיקים, וחשבו את ה-RSD לבדיקת היציבות.
  5. הוסיפו סטנדרט ידוע של rifampicin למטריצות ליפוזומליות ריקות. עבדו את הדגימות באמצעות אולטרה-פילטרציה, נתחו באמצעות HPLC, ולאחר מכן חשבו את אחוזי הניצול (recovery) ואת ה-RSD.
  6. בחנו את הכרומטוגרמות לאיתור פיקים של הפרעה בזמן השהייה (retention time) של rifampicin.

4. גודל חלקיקים ופוטנציאל זטא

  1. העבירו בפיפט 20 µL של תרחיף ליפוזומים לתוך 980 µL של מים אולטרה-טהורים (שסוננו מראש דרך מסנן 0.22 µm). ערבבו ב-Vortex למשך 10 s, ולאחר מכן בצעו סוניקציה באמבט מים למשך 30 s.
  2. העבירו את הדגימה המדוללת לקובטה אוניברסלית למדידת גודל, ולתא קפילרי מקופל למדידת פוטנציאל זטא.
  3. הגדירו את הפרמטרים באופן הבא: חומר מפיץ (dispersant) = מים, טמפרטורה = 25 °C.
  4. בצעו לפחות 3 חזרות טכניות, שכל אחת מהן כוללת 10–15 הרצות. רשמו את ה-Z‑average (קוטר הידרודינמי ממוצע המשוקלל לפי עוצמה) ואת מדד הפולידיספרסיות (PDI).
  5. הכניסו אלקטרודת פלדיום לקובטה כדי למדוד את פוטנציאל הזטא תחת אותם פרמטרים28.
  6. הוציאו את הקובטה וכבו את המכשיר.

5. אפיון מורפולוגי (TEM)

  1. דללו את תגליל הליפוזומים הטעונים בריפמפיצין (rifampicin) פי 50–100 במים אולטרה-טהורים כדי להגיע לריכוז מתאים לתצפית ב-TEM.
  2. בצע סוניקציה לדגימה המדוללת באמבט מים באמצעות מכשיר סוניקטור למסבך (40 100 kHz ו) למשך 30 ש.
    זהירות: יש להימנע מסוניקציה מרובה כדי למנוע פיצוץ של הליפוזומים.
  3. הניחו רשת נחושת מצופה פחמן של 300-mesh על נייר הסינון, כאשר הצד המצופה פחמן פונה כלפי מעלה.
  4. פיפטה 10 µL של תרחיף ליפוזומים מהול למרכז הרשת. המתן להסנפה במשך 1 דק׳
  5. ספגו את שארית התמיה מהדפנות של הרשת באמצעות נייר סינון נקי; אין לגעת באזור התצפית המרכזי.
  6. צביעה שלילית: הוסף מיד 10 µL של חומצה פוספוטנגסטית בריכוז 2% (משקל/נפח) (pH 7.0) על גבי הרשת. לאחר 1 דקות, ספגו את שאריות הצבע מהקצה.
  7. ייבשו את הרשת באוויר בטמפרטורת החדר למשך 3 ה. העבירו את הרשת המייובשת למחזיק הדגימות של ה-TEM.
  8. בצע תצפית במתח האצה של 80–120 kV. השתמש במצב דימוי במינון נמוך (low-dose imaging mode).29 ורשום תמונות באמצעות מצלמת CCD (למשל, Gatan OneView) בהגדלות נומינליות של 10,000x, 25,000x ו-40,000x.
  9. בחרו שדות מייצגים והימנעו מאזורים עם הצטברויות (aggregation) או ארטיפקטים של צביעה.

6. שחרור תרופה in vitro

  1. גזרו קרומי דיאליזה (MWCO 7 kDa) לאורכים המתאימים. הכינו תמיסה בנפח גדול של 2% (w/v) סודיום ביקרבונט ו-1 mmol/L EDTA, כשה-pH כוונן ל-8.0.
  2. הרתיחו את קרומי הדיאליזה בתמיסה זו למשך 10 min. שטפו את הקרומים היטב במים מזוקקים.
  3. הגיעו לשיווי משקל עם הקרומים השטופים בתווך שחרור (0.01 M PBS) למשך 30 min. העבירו 1 mL של תרחיף ליפוזומים לתוך שקית הדיאליזה שעברה טיפול מקדמי; אטמו את שני הקצוות באמצעות תפסני דיאליזה.
  4. הניחו את שקית הדיאליזה בכלי כימי (beaker) של 100 mL המכיל 80 mL של תווך שחרור שחומם מראש ל-37 °C, בתוספת 0.1% חומצה אסקורבית (w/v) ו-0.1 mL Tween 80. כסו את הכלי בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מאור.
  5. ערבבו בחושך בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 rpm באמצעות בוחש מגנטי. שלפו 1 mL של תווך שחרור בנקודות זמן קבועות מראש: 0.5, 1.5, 3, 5, 7, 9, 12, 24, ו-48 h.
  6. הוסיפו 1 mL של תווך שחרור טרי שחומם מראש (37 °C) לכלי הכימי באמצעות פיפטה, תוך הזרמה עדינה של הנוזל אל דופן הכלי30 (המערכת סגורה; אין צורך בתיקון עבור אידוי).
  7. סננו את הדגימות דרך מסנן של 0.22 µm ובצעו אנליזה באמצעות HPLC. נתחו את הדגימות תחת אותם תנאי HPLC המתוארים בסעיף 2.4.
  8. חשבו את השחרור המצטבר (Cumulative Release %) = (סך התרופה שזוהתה בכל נקודת זמן / טעינת התרופה הראשונית) × 100%

7. הערכת יציבות האחסון

  1. יש לאחסן את תרחיף הליפוזומים הטעונים בריפמפיצין (rifampicin) שהוכן בבקבוק זכוכית אטום בטמפרטורה של 4 °C, תוך הגנה מאור.
  2. יש לאסוף דגימות ביום 1, 4 ו-30 לאחר האחסון. את הדגימה שנשלפה יש להשליח (אין להחזירה לבקבוק המקורי).
  3. יש לקבוע את גודל החלקיקים, מדד הפולידיספרסיות (polydispersity index) ופוטנציאל זטא של הליפוזומים בכל נקודת זמן31.
  4. יש לתעד את המראה החזותי ולבחון אם קיימת שקיעה או התשכבות של תרחיף הליפוזומים.
  5. יש לאסוף דגימות נוספות ביום 60 כדי לבחון חזותית חמצון, שקיעה והתשכבות של התרחיף.
    הערה: כל המדידות בוצעו בשלושה ניסויים מקבילים. נתונים ניסיוניים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן.

תוצאות

בוצע תיקוף של שיטת HPLC לצורך כימות של rifampicin. כרומטוגרמות מייצגות של תמיסות סטנדרט של rifampicin מוצגות ב-איור 2A. השיא העיקרי של rifampicin הופיע בזמן שהייה של 14.13 min, עם צורת שיא טובה וללא הפרעה משמעותית משיאים אחרים. עקומת הכיול הפגינה ליניאריות טובה בטווח ריכוזים של 1.15–23 µg/mL, עם משוואת רגרסיה Y = 12729.5X-4778.6 ומקדם דטרמינציה R2=0.9995. ערך של R2 ≥ 0.999 נחשב בדרך כלל למקובל עבור אנליזה כמותית במעבדות תרופות; לכן, הערך שהתקבל, 0.9995, מוכיח כי השיטה היא ליניארית מאוד לאורך הטווח שנבדק. ריבועים שחורים מייצגים נקודות נתונים שנמדדו, והקו הרצוף מייצג את הרגרסיה הליניארית המותאמת (איור 2B).

בדיקות דיוק בוצעו בשלושה ריכוזים של rifampicin ( ‏9.2, 13.8 ו-18.4 µg/mL). ערכי סטיית התקן היחסית (RSD) של שטחי הפסגות היו כולם מתחת ל-1%, מה שמאשר דיוק מכשיר גבוה (טבלה 2). בדיקת החזרתיות (n = 4) הניבה RSD של 0.32%, דבר המצביע על הדירות מהימנה (טבלה 3). בדיקת היציבות, שנערכה במשך 24 h בטמפרטורת החדר, הראתה RSD של 0.59%, מה שמוכיח שתמיסת ה-rifampicin נותרה יציבה בתנאים אלו (טבלה 4). שיעור השחזור הממוצע היה 98.12%, מה שמאשר את דיוק השיטה לניתוח rifampicin בדגימות ליפוזומים. תוצאות אלו אישרו במצטבר כי שיטת ה-HPLC מתאימה לקביעה כמותית של rifampicin במחקר זה. תיקוף קפדני זה מבטיח שמסירות עוקבות של יעילות הכליאה, טעינת התרופה ופרופילי השחרור הן מהימנות וניתנות לשחזור בין סדרות ניסויים שונות.

תרופה חופשית ותרופה כלואה בליפוזומים הופרדו באמצעות סנטריפוגת אולטרה-פילטרציה. ניתוח כמותי בשיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) הראה שכאשר תכולת הכולסטרול הייתה 20%, יעילות הכליאה של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין הגיעה למקסימום של 68.54 ± 2.19, ושיעור טעינת התרופה היה 11.42 ± 0.37 (איור 3). כאשר ישנו עודף של כולסטרול, יעילות הכליאה ושיעור טעינת התרופה של הליפוזומים יורדים משמעותית (טבלה 5). תוצאות אלו מדגימות כי יחס של 20% כולסטרול לפוספוליפיד הוא האופטימלי לאיזון בין קשיחות הממברנה לנזילותה ושמירה על הריפמפיצין בתוך השכבה הכפולה. סטיות התקן הקטנות (כולן <2.2% עבור EE ו-<0.4% עבור DL לאורך שלוש הכנות חוזרות) מאשרות כי פרוטוקול ההכנה מניב איכות פורמולציה עקבית עם שחזור טוב בין סדרות ייצור.

הליפוזומים שהוכנו באמצעות השיטה המותאמת הראו התפלגות גדלים צרה (איור 4), עם גודל ממוצע של 185 nm. ערך PDI <0.3 מקובל באופן נרחב כמעיד על אוכלוסייה מונו-דיספרסית; לפיכך, ה-PDI שהתקבל, 0.153, מאשר כי הליפוזומים אחידים מאוד בגודלם. פוטנציאל זטא מוחלט >30 mV מספק בדרך כלל דחייה אלקטרוסטטית מספיקה כדי למנוע צבירה (aggregation). הערך שנמדד של 38- ערך ה-mV חוזה, אם כן, יציבות קולואידית טובה32סטיות התקן הנמוכות בין דגימות בשלוש חזרות (למשל, גודל 185.41 ± 0.72 (ננומטר בריכוז של 20% כולסטרול) מדגימים עוד יותר את רמת השחזור הגבוהה של הליך ההכנה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול ההידרטציה של סרט דק-אולטרסוניקציה-סינון מייצר באופן מהימן ליפוזומים בננו-קנה מידה עם התפלגות גודל צרה ומטען פני שטח נאות, ובכך מבטיח יציבות לטווח ארוך.

הליפוזומים שהוכנו הראו אפקט טינדל (Tyndall effect) ברור. איור 5A מדגים את אפקט הטינדל של הליפוזום33. מאפיינים מורפולוגיים של ננוליפוזומים טעוני rifampicin הוערכו באמצעות TEM ופיזור אור דינמי (DLS). כפי שמוצג באיור 4, עקומות התפלגות הגדל המשוקללות לפי עוצמה ב-DLS של הליפוזומים הראו שיא בודד וצר, ללא חלקיקים גדולים או אגרגטים נראים לעין, מה שמעיד על הומוגניות ומונו-דיספרסיות (monodispersity) טובה של הפורמולציה שהוכנה (איור 5B). בהגדלה נמוכה נצפו שלפוחיות ליפוזומליות כדוריות; עם זאת, נצפתה אגרגציה מקומית מסוימת (איור 5C), שניתן לייחסה לפיזור לא מלא במהלך הכנת הדגימה, וכן לאפשרות של היתוך שלפוחיות במהלך הייבוש. בהגדלה גבוהה (50,000×, איור 5D), נראו הבדלי ניגודיות ברורים: האזור המרכזי הכהה תואם לליבה המימית המכילה את התרופה, בעוד שהטבעת החיצונית הבהירה מייצגת את השכבה הליפידית הכפולה, מאפיין טיפוסי של ליפוזומים בצביעה שלילית34.

גודל החלקיקים שנצפה ב-TEM היה קטן יותר מהקוטר ההידרודינמי שנקבע ב-DLS. פער זה נובע מהעקרונות השונים של שתי הטכניקות: TEM מודד את קוטר הליבה המיובשת תחת ואקום, בעוד ש-DLS מזהה את הקוטר המהוהה, כולל שכבת ההידרטציה של הפני השטח, המהווה מאפיין ידוע של ננו-חלקיקים ליפוזומליים35.

לא נצפתה שחרור התפרצות (burst release) ניכר בשלוש קבוצות הליפוזומים הראשונות (שיעור השחרור המצטבר ב-0.5 h היה <40% בכל הקבוצות). שחרור התפרצות של <40% במהלך השעה הראשונה נחשב בדרך כלל לבטוח עבור תכשירי אנטי-טוברקולוזיס ארוכי טווח, שכן הוא ממזער את הסיכון לרעילות סיסטמית חריפה. ניתן לחלק את שלבי השחרור הספציפיים באופן הבא:

תקופת שחרור מהיר (0.5–12 h): התרופה דיפוזה באיטיות משכבת הפנים או מהאזור הסמוך לממברנה של הליפוזומים, וקצב השחרור היה מהיר יחסית. קצב השחרור המצטבר של שלוש הקבוצות הראשונות היה קרוב ל-90% ב-12 h (איור 6).

לאחר 24 שעות, הועלתה השערה כי rifampicin עבר פירוק חמצוני ופירוק הידרוליטי, מה שהביא לירידה חריגה בקצב השחרור המצטבר36. כאשר תכולת הכולסטרול הייתה 30%, קצב השחרור המצטבר ב-0.5 שעות היה >40%, נתון שלא עמד בתקן לשחרור מושהה.

לפיכך, פורמולציות המכילות 5–15% כולסטרול הן מקובלות, וגם ריכוז של 20% עומד בקריטריון של שחרור מהיר (burst-release). השונות הנמוכה בין סדרות הייצור (איור 6) מאשרת את השחזוריות של שיטת בדיקת השחרור.

נתוני השחרור עבור שלוש הקבוצות הראשונות הותאמו למודלים קינטיים נפוצים (סדר אפס, סדר ראשון, Higuchi ו-Ritger-Peppas) (איור 7). התוצאות הראו כי מודל קינטי מסדר ראשון השיג את איכות ההתאמה הגבוהה ביותר (R2= 0.987), שהייתה עליונה באופן משמעותי ממודלי סדר אפס (R2= 0.246), Higuchi (R2= 0.544) ו-Ritger-Peppas (R2 = 0.926). דבר זה מעיד כי התנהגות שחרור התרופה מהליפוזומים עוקבת אחר קינטיקה מסדר ראשון. קצב השחרור נמצא במתאם חיובי עם ריכוז התרופה הנותר בליפוזומים, ומראה מאפיין טיפוסי של "שחרור התפרצות ראשוני - שחרור מתמשך לאחר מכן", מה שמאשש עוד יותר את המנגנון שבו כולסטרול משפיע על קצב הדיפוזיה על ידי ויסות מבנה הממברנה37.

ליפוזומים הטעונים בריפמפיצין הראו יציבות טווח-קצרה טובה במהלך 30 ימי אחסון ב- 4 °Cבמהלך תקופת ההערכה של 1, 4 ו-30 ימים, גודל החלקיקים עלה קלות, בעוד שנשמרה הומוגניות גודל מצוינת (PDI < 0.15) ויציבות קולואידית חיובית (פוטנציאל זטא מוחלט > (24 mV) נשמרו (טבלה 6). ביום ה-60 נצפו חמצון בולט ושבבים (floccules), דבר המעיד על יציבות לטווח ארוך דלה של הפורמולציה. תוצאה זו מדגישה את הצורך בליופילזציה (freeze-drying) או בשינוי של הפורמולציה (למשל, הוספת נוגדי חמצון או חומרי הגנה לקפאה/lyoprotectants) לצורך שימור לטווח ארוך – מסקנה מעשית חשובה עבור חוקרים המשתמשים בפרוטוקול זה.

figure-results-1
איור 1הכנת ליפוזומים טעונים בריפמפיצין בשיטת הידרציה של שכבה דקה. תרשים זרימה הממחיש את תהליך ההכנה של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין. רכיבי הליפידים הומסו בממס אורגני, ולאחר מכן בוצע עיבוי לשכבה דקה באמצעות אידוי סיבובי, ייבוש בוואקום, הידרציה וסוניקציה להפקת הפורמולציה הליפוזומלית הסופית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2זיהוי וכיול של ריפמפיצין באמצעות HPLC. (A(כרומטוגרמת HPLC מייצגת של rifampicin, המראה את שיא זמן השהייה (retention peak) האופייני המשמש לניתוח כמותי.)B) עקומת כיול שנוצרה על ידי שרטוט שטח הפסגה מול ריכוז הריפמפיצין (1.15-23.0 µg/mL). משוואת הרגרסיה ומקדם המתאם (R2 (= 0.9995) מעידים על ליניאריות מצוינת בטווח הריכוזים שנבדק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. נצילות הכליאה והעמסת התרופה של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין (rifampicin). נצילות הכליאה (EE) והעמסת התרופה (DL) של ליפוזומים שהוכנו עם תכנים שונים של כולסטרול. ה-EE הגבוה ביותר (68.5%) וה-DL הגבוה ביותר (11.4%) נצפו בריכוז של 20% כולסטרול, מה שמעיד על כך שתוכן הכולסטרול משפיע באופן משמעותי על כליאת התרופה והעמסתה. פסי השגיאה מייצגים ממוצע × SD (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4התפלגות גודל החלקיקים של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין. פרופילי התפלגות גודל חלקיקים של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין (rifampicin), שהוכנו ביחסים שונים של פוספוליפיד כולסטרול. הפורמולציה האופטימלית הראתה קוטר ממוצע (Z-average diameter) של 185 ננומטר ומדד פולידיספרסיות (PDI) של 0.153, המעידים על התפלגות גודל צרה והומוגניות טובה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5. אפיון פיזיקו-כימי של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין. (A) אפקט טינדל שנצפה בתרחיף הליפוזומים הטעונים בריפמפין מעיד על נוכחות של חלקיקים בננו-קנה מידה. (B) עקומות התפלגות גודל חלקיקים משלוש חזרות מקבילות של פורמולציית הליפוזומים האופטימלית. (C) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) המראה מספר של לפוזומים כדוריים. (D) תמונת TEM מייצגת בהגדלה גבוהה של וסיקולה ליפוזומלית בודדת. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6פרופילי שחרור in vitro של ריפמפיצין מליפוזומים. פרופילי שחרור מצטבר של rifampicin מליפוזומים שהוכנו ביחסי פוספוליפיד-לכולסטרול שונים במהלך תקופת המחקר. התנהגות השחרור השתנתה בהתאם לתכולת הכולסטרול, דבר המדגים את השפעתו על מאפייני שחרור התרופה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7. מידול קינטי של שחרור rifampicin מליפוזומים. נתוני שחרור עבור הפורמולציה האופטימלית (20% cholesterol) המותאמים למודלים קינטיים של (A) סדר אפס, (B) סדר ראשון, (C) Higuchi, ו-(D) Ritger-Peppas. למודל הסדר הראשון היה מדד ההתאמה הגבוה ביותר (R2 = 0.987), מה שמעיד על ההתאמה הטובה ביותר לנתוני השחרור הניסיוניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מרכיבי הליפוזוםלציטיןכולסטרולריפמפיצין
5%47.5 mg2.5 mg10 mg
10%45 mg5 mg10 mg
15%42.5 mg7.5 mg10 mg
20%40 mg10 mg10 mg
25%37.5 mg12.5 mg10 mg
30%35 mg15 mg10 mg
נפח סופי10 mL

טבלה 1: הרכב של פורמולציות ליפוזומים טעוניים בריפמפיצין. לציטין, כולסטרול וריפמפיצין שימשו להכנת ליפוזומים עם יחסי פוספוליפיד-לכולסטרול שונים, תוך שמירה על נפח סופי של 10 mL.

ריכוז (µg/mL)`X±SRSD(%)
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

טבלה 2: דיוק כימות HPLC בריכוזים שונים של rifampicin. מדידות שטח שיא התקבלו עבור תמיסות סטנדרט של rifampicin בריכוזים של 9.2, 13.8, ו-18.4 µg/mL. התוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן (SD), כאשר ערכי סטיית התקן היחסית (RSD) מעידים על דיוק אנליטי גבוה.

מס'1234RSD (%)
שטח שיא1145031141251139691145390.32

טבלה 3: דיוק המכשיר של שיטת ה-HPLC. הערכת דיוק (Precision) המבוססת על ארבעה הזרקות רצופות של אותו תמיסת סטנדרט של ריפמפיצין (rifampicin). ערכי שטח השיא וסטיית תקן יחסית (RSD) מדווחים כדי להעריך את חזרתיות המכשיר.

זמן (h)024681224RSD (%)
שטח שיא1145031143251145161139781138941136381125760.59%

טבלה 4: יציבות של תמיסת סטנדרט של rifampicin. הערכת יציבות של תמיסת סטנדרט של rifampicin בריכוז 9.2 µg/mL שנשמרה בטמפרטורת החדר ונבדקה בנקודות זמן של 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו-24 שעות. ערכי שטח הפסגות וסטיית התקן היחסית (RSD) מדווחים כדי להעריך את יציבות התמיסה לאורך תקופת הבדיקה.

כולסטרולגודל (ננומטר)PDIפוטנציאל זטא (mV)יעילות התמססות (%)גבול גילוי (%)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

טבלה 5: מאפיינים פיזיקו-כימיים של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין (rifampicin). גודל חלקיקים, מדד פולידיספרסיות (PDI), פוטנציאל זטא, יעילות הכנסה (EE) וטעינת תרופה (DL) של ליפוזומים שהוכנו עם תכנים שונים של כולסטרול. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3).

יום אחד4 ימים30 ימים 
גודל (ננומטר)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
PDI0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
פוטנציאל זטא (mV)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

טבלה 6: יציבות אחסון של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין ב-4 °C. שינויים בגודל החלקיקים, במדד הפולידיספרסיות (PDI) ובפוטנציאל זטא של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין לאחר אחסון למשך 1, 4 ו-30 ימים ב-4 °C. התוצאות שימשו להערכת היציבות הפיזיקלית של הפורמולציה הליפוזומלית במהלך האחסון.

דיון

ריפמפיצין (Rifampicin) נותר אבן יסוד בכימותרפיה של קו ראשון נגד שחפת, אך התועלת הקלינית שלו נפגעת קשות עקב רעילות כבדית תלוית-מינון, חדירות תוך-תאית נמוכה למקרופאגים המכילים Mycobacterium tuberculosis (MTB), והופעה מהירה של עמידות לתרופה תחת חשיפה בתת-מינון טיפולי. כדי לתת מענה לצרכים קליניים לא מסופקים אלו, מחקר זה ביסס ועמד על פרוטוקול הידרציה של קרום דק (thin-film hydration) חסון, בשילוב עם אולטרסוניקציה וסינון, לצורך ייצור של ליפוזומים טעונים בריפמפיצין. הפורמולציה האופטימלית הפגינה גודל חלקיקים ננומטרי אחיד, מורפולוגיה וסיקולרית תקינה, יעילות כליאה גבוהה של התרופה ופרופיל שחרור ממושך של התרופה in vitro, כאשר אפיון פיזיקו-כימי מקיף בוצע באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (TEM), כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) ובדיקות התמוססות in vitro.

מספר שלבי פרוטוקול משפיעים באופן קריטי על איכות הליפוזומים ועל השחזוריות. ראשית, היחס בין הפוספוליפיד לכולסטרול הוא מכריע. יחס אופטימלי של 80:20 מניב EE = 68.5% ו-DL = 11.4%; סטיות ליחסים של 75:25 או 70:30 גורמות לאובדן של >30% ב-EE. שקילה מדויקת עם מאזניים בעלי רגישות של אחת למאה אלף היא חובה. שנית, ההידרציה (סעיף 1.6) דורשת סיבוב במהירות של 100 rpm, בטמפרטורה של 37 °C למשך 1 h במאיד סיבובי (rotary evaporator) ללא ואקום. דגירה סטטית או ניעור ידני מובילים לשחזוריות נמוכה. שלישית, אולטרסוניקציה (סעיף 1.7): 40 kHz, 100 W, למשך 10 min ב-37 °C מניבים Z‑average של 185 nm ו-PDI < 0.2. סוניקציה קצרה יותר (5 min) מניבה >300 nm ו-PDI > 0.3; סוניקציה ארוכה יותר (20 min) עלולה לגרום לפירוק התרופה. יש לשמור על טמפרטורה של 37 °C כיוון שריפמפיצין (rifampicin) רגישה לחום. רביעית, עבור סינון רצופי (0.45 µm ולאחר מכן 0.22 µm), יש להרטיב מראש את המסננים ב-PBS ולהעביר אותם בבתור אחד עדין. דחיפה דרך מסננים יבשים או שימוש במזרק קטן עלולים לגרום לפיצוץ של הוסיקולות. חמישית, אולטרה-פילטרציה לחישוב EE (סעיפים 2.1–2.3): בדיוק 200 µL, 4 מחזורים ב-7,000 × g, ב-25 °C, תוך איסוף ואיחוד של כל התסננים לאחר כל מחזור. מחזורים לא שלמים מובילים להערכת חסר של ה-EE. שישית, צביעה שלילית ב-TEM (סעיף 5.6): 2% חומצה פוספוטנגסטית, pH 7.0, תוך ספיגה מיידית. השהיה או pH שגוי גורמים לקריסת הוסיקולות. עקביות בביצוע שישה שלבים אלה מניבה ליפוזומים העומדים בקריטריוני הקבלה, כפי שמעידות סטיות תקן נמוכות בבדיקות של שלשות.

כולסטרול הוא מרכיב מבני קריטי של דו-שכבות ליפוזומליות, בעל השפעות כפולות מתועדות היטב על נזילות הממברנה, יציבות מכנית ושימור של תרופות ליפופיליות. במחקר זה, הערכנו באופן שיטתי את ההשפעה של יחס המול של כולסטרול על ביצועי הפורמולציה ומצאנו כי יעילות הכליאה המקסימלית של 68.5% הושגה בתכולת כולסטרול של 20% (יחס מסה). ההנחה היא שיחס אופטימלי זה יוצר איזון בין שימור המבנה הלמלארי המסודר של דו-שכבת הפוספוליפידים כדי למזער דליפה של התרופה, לבין שמירה על נזילות ממברנה מספקת כדי להכיל מולקולות ליפופיליות של rifampicin בתוך הליבה ההידרופובית של דו-השכבה. לעומת זאת, תכולת כולסטרול העולה על 20% הובילה להקשחה מוגברת של דו-שכבת הליפידים, לשיבוש של הסידור הלמלארי הרגיל, ולצמי לצמיה לכך ירידות משמעותיות הן ביעילות הכליאה והן בקיבולת טעינת התרופה. ממצאים אלו תואמים את ההבנה המכניסטית המקובלת לגבי תפקידו של הכולסטרול בהנדסת ממברנות ליפוזומליות. לפיכך, שקילה מדויקת של ליפידים (באמצעות מאזניים ברמת דיוק של אחת למאה אלף) והיצמדות קפדנית ליחס מסה של 20% כולסטרול הן חיוניות להשגת טעינת תרופה גבוהה.

הליפוזומים האופטימליים המעומסים בריפמפיצין הראו קוטר הידרודינמי ממוצע של 185 nm עם מדד פולידיספרסיות (PDI) של 0.164 ± 0.044, מה שמעיד על התפלגות גודל חלקיקים אחידה מאוד. ממד ננומטרי זה (< 200 nm) אינו רק תואם לאפקט החדירות והשימור המוגברים (EPR) עבור טרגט פסיבי לנגעים דלקתיים של שחפת ריאתית, אלא הוא גם אופטימלי לבליעה יעילה (פגוציטוזה) על ידי מקפגים אלבאולריים – הנישה התוך-תאית העיקרית של MTB. תכנון גודל חלקיקים זה עשוי לפתור את המגבלה המרכזית של ריפמפיצין חופשי, שאינו מצליח להגיע לריכוזים טיפוליים בתוך מקפגים נגועים ב-MTB. פוטנציאל זטא של −38 mV עבור הפורמולציה האופטימלית מספק דחייה אלקטרוסטטית חזקה בין החלקיקים, המונעת ביעילות אגרגציה, היתוך ושקיעה של הוסיקולות במהלך אחסון קצר טווח, ובכך מבטיחה יציבות קולואידית מצוינת. ראוי לציין כי גודל הליבה של החלקיקים שנמדד ב-TEM היה קטן יותר מהקוטר ההידרודינמי שהתקבל ב-DLS, תופעה מתועדת היטב באפיון ליפוזומים: DLS מכמת את קוטר הוסיקולה המהודרת, כולל שכבת ההידרציה המימית שמסבבה, בעוד שדימוי TEM לוכד את ליבת הליפידים המהודרת בתנאי ואקום גבוה. פער זה הוא, לפיכך, ממצא צפוי ורציונלי מבחינה פיזיקו-כימית, ולא אי-עקביות באפיון.

דימות TEM תיקף באופן נוסף את המאפיינים המורפולוגיים של הליפוזומים האופטימליים, אשר הופיעו בעיקר כשלפוחיות חד-שכבתיות (unilamellar) תקינות, כדוריים ואחידות, עם התגבבות מקומית מינורית בלבד וללא היתוך או קרע ממברנתי ניכרים. ממצאים אלה מאשרים כי תהליך משולב של אולטרסוניקציה וסינון מאפשר בקרה מדויקת על המורפולוגיה והשכבתיות של השלפוחיות, תוך שמירה על השלמות המבנית של השכבה הליפידית הכפולה. שלמות מבנית היא מאפיין איכות קריטי עבור פורמולציות ליפוזומליות, שכן היא נמצאת במתאם ישיר עם שימור התרופה במהלך האחסון, יציבות הסירקולציה in vivo וביצועי המסירה המכוונת. בנוסף, אפקט טינדל הבולט שנצפה בסספנסיית הליפוזומים אישש עוד יותר את הטבע הקולואידי של פיזור השלפוחיות בננו-קנה מידה.

בדיקות שחרור תרופה in vitro הראו כי ליפוזומים אופטימליים המעמיסים rifampicin לא הראו שחרור ראשוני מואץ (burst release) משמעותי ב-0.5 h הראשונות, מאפיין קריטי המפחית את הסיכון לרעילות מערכתית חריפה הקשורה לריכוזי שיא מהירים של rifampicin חופשי בפלזמה. מידול קינטיקה של שחרור התרופה גילה כי פרופיל השחרור התאים בצורה מיטבית למודל קינטיקה מסדר ראשון, מה שמעיד על כך ששחרור ה-rifampicin מהשכבה הליפוזומית נשלט בעיקר על ידי דיפוזיה פסיבית ולא על ידי שחיקה של המטריצה הליפידית. דפוס שחרור ממושך זה, הנשלט על ידי דיפוזיה, רצוי מאוד לטיפול בשח Tuberculosis, שכן הוא מאפשר שמירה ממושכת על ריכוזי תרופה תרפויטיים יעילים, ובכך מפחית את הסיכון לחשיפה תת-תרפויטית המניעה הופעת עמידות לתרופות. נצפתה ירידה קלה בשחרור המצטבר של התרופה לאחר 24 h, שניתן לייחסה ככל הנראה לפירוק חמצוני והידרוליטי של rifampicin שאינו מוכנס לליפוזומים בתמיסת השחרור המימית, ממצא העולה בקנה אחד עם נתוני יציבות שפורסמו בעבר עבור rifampicin בסביבות מימיות38. באופן חשוב, השכבה הליפוזומית מספקת מיקרו-סביבה מגינה לתרופה המוכנסה, ובכך מפחיתה את חשיפתה לתנאי פירוק בהשוואה ל-rifampicin חופשי.

הפורמולציה הליפוזומלית המיוטבת הטעונה בריפמפיצין שפותחה במחקר זה מציעה מספר יתרונות מובחנים לטיפול אנטי-שחפת, ובכך נותנת מענה ישיר למגבלות המרכזיות של כימותרפיה קונבנציונלית בריפמפיצין. ראשית, השכבה הליפוזומלית הכפולה מספקת מחסום מגן מפני פירוק מוקדם של התרופה בסביבות מימיות וביולוגיות, ובכך משמרת את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של הריפמפיצין. שנית, פרופיל השחרור הממושך הנשלט על ידי דיפוזיה מאריך את זמן מחצית החיים של התרופה במחזור הדם המערכתי, מה שמאפשר הפחתה בתדירות המינונים ושיפור בהיענות המטופלים לטיפול — אתגר מרכזי בכימותרפיה ארוכת טווח לשחפת. שלישית, גודל החלקיקים הננומטרי המיוטב מקל הן על טרגוט פסיבי לנגעים שחפתיים דלקתיים באמצעות אפקט ה-EPR והן על ספיגה יעילה על ידי מקרופאגים אלבולריים נגועים ב-MTB, ובכך מושג ריכוזי תרופה תוך-תאיים גבוהים שאינם ניתנים להשגה עם ריפמפיצין חופשי39,40. לבסוף, הפורמולציה מורכבת מפוספוליפידים וכולסטרול תואמי ביולוגית ממקור טבעי, מה שממזער את הסיכון לאימונוגניות או לרעילות מערכתית הקשורה לנשא התרופה עצמו.

ראוי לציין כי למחקר זה מספר מגבלות שיש להתייחס אליהן במחקרים עתידיים. בעוד שהאפיון הפיזיקו-כימי במערכת in vitro ואפיקי השחרור מעידים על ביצועי פורמולציה מבטיחים, נדרשים מחקרים נוספים in vivo כדי להעריך את ההתנהגות הפרמקוקינטית, את ההתפלגות ברקמות, את היעילות נגד שחפת ואת הרעילות הסיסטמית של הליפוזומים הטעונים ב-rifampicin במודלים רלוונטיים של בעלי חיים. בנוסף, יכולת ההרחבה (scalability) של פרוטוקול ההכנה המיטבי לייצור בקנה מידה תעשייתי מחייבת תיקוף נוסף.

לסיכום, מחקר זה ביסס פרוטוקול פשוט, בעל שחזוריות גבוהה ורובסטי של הידרציה של קרום דק, אולטרסוניקציה וסינון להכנת ליפוזומים טעונים בריפמפיצין. אופטימיזציה סיסטמטית של הפורמולציה זיהתה את תפקידו הקריטי של תכולת הכולסטרול בוויסות יעילות הכליאה ויציבות הממברנה, כאשר הפורמולציה האופטימלית הפגינה תכונות פיזיקו-כימיות אידיאליות, יעילות כליאת תרופה גבוהה, יציבות קולואידית מצוינת ושחרור תרופה מבוקר ומתמשך in vitro. פרוטוקול סטנדרטי זה מספק מסגרת מתודולוגית מהימנה לפיתוח ואפיון של מערכות להולכת תרופות אנטי-טוברקולוזיים ליפוזומליות, ומניח בסיס מוצק להערכה פרה-קלינית עתידית של ריפמפיצין ליפוזומלי לטיפול בשחפת הרגישה לתרופות ובשחפת העמידה לתרופות.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (מס' 21977019).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
L-α-Phosphatidylcholine (Soybean)RHAWNR024502≥90% purity , 25 g/bottle, CAS: 97281-47-5
בופר PBS בריכוז 1×SolarbioP1038500 mL, 0.01 mol/L, pH 6.5
בופר PBS בריכוז 1×, pH 7.4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1500 mL, pH 7.4
כלורופורםGuangzhou BrandGD10-AR-2.5Lדרגת AR, 500 mL/bottle, CAS: 67-66-3
כולסטרולAladdinC104028-5g דרגת AR, ≥95% (HPLC), 5 g/bottle, CAS 57-88-5
ממברנות דיאליזה (MD25, 7000 Da)SolarbioYA1081-5m7000 Da MWCO, אורך 5 m, חומר לא מתכתי
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), דגם LC-20AShimadzu Corporation, JapanLC-20Aהמערכת מצוידת בגלאי UV מסוג SPD-20A, משאבה רבעונית CBM-20A, מסיר גזים מקוון LC-20AT, דוגם אוטומטי SIL-20A, תנור עמודה CTO-20A ותוכנת תחנת עבודה LC-solution. היא שימשה לקביעה כמותית של ריפמפיצין.
צנטריפוגת שולחנית מהירהShanghai Anting Scientific Instrument FactoryTGL-16Bשימשה לסנטריפוגציה של דגימות
L-Ascorbic acidMacklinA80029699.99% purity , 100 g/bottle, CAS: 50-81-7
מנתח גודל חלקיקים ופוטנציאל זטא OmniBrookhaven Instruments Corporation, USA173PIשימש לקביעת גודל חלקיקים, מדד פולידיספרסיות (PDI) ופוטנציאל זטא של ליפוזומים
ריפמפיציןMacklinR81723797% purity, 250 mg/bottle, CAS: 13292-46-1
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM)Hitachi, Ltd., JapanHT7700שימש לתצפית מורפולוגית של ליפוזומים
Tween 80Energy ChemicalE0807391000-A01דרגת AR, 100 mL/bottle, CAS: 9005-65-6
יחידות סינון צנטריפוגלי לאולטרה-פילטרציה (0.5 mL, 3 kDa)Merck MilliporeUFC5003963 kDa MWCO, נפח 0.5 mL, חומר פלסטי

מקורות

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ליפוזומים של ריפמפיציןטיפול נגד שחפתהולכת תרופות ליפוזומליתהידרציה של קרום דקיעילות כליאהכרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוההפיזור אור דינמימיקרוסקופיה אלקטרונית חודרתשחרור תרופה במבחנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.