מאמר שיטה

מבחן השלמה מפוצל-לוסיפראז למדידה זמנית של ניקוי טאו במיקרוגליה

DOI:

10.3791/71870

⸱

24 ביולי 2026

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Behavior Graduate Program, University of Massachusetts Amherst, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts Amherst, 3Molecular and Cellular Biology Graduate Program, University of Massachusetts Amherst

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פלטפורמה כמותית רגישה, עם פתרון זמן, למדידת ניקוי טאו חוץ-תאי במיקרוגליה שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) שנגרמו על ידי בני אדם, באמצעות מערכת לומינסנציה מבוססת מיקרופלט. גישה זו מאפשרת זיהוי רגיש של קינטיקה של פירוק טאו בפורמט מיקרובאר, ומאפשרת חקירת טיפול בטאו בתפוקה גבוהה בתנאי ניסוי שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתאי החיסון התושבים במערכת העצבים המרכזית, המיקרוגליה הם רגולטורים מרכזיים של הומאוסטזיס מוחי ומתווכים מרכזיים למחלות ניווניות עצבית. תאים אלו סוקרים באופן רציף את הסביבה העצבית ומשחקים תפקיד קריטי בזיהוי, הפנמה ופירוק של תת-קרקעים חוץ-תאיים, כולל חלבונים מקופלים בצורה שגויה ומצטברים כמו טאו פתולוגי. למרות עדויות הולכות וגדלות המצביעות על מיקרוגליה בניקוי טאו, הגישות הקיימות למדידת קליטה ופירוק הטאו חסרות את הרזולוציה הזמנית והרגישות הנדרשות ללכוד מלא את התהליכים הדינמיים הללו. כאן פיתחנו מבחן מבוסס זוהר כדי לעקוב כמותי אחר ניקוי טאו במיקרוגליה שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) שנגרמו על ידי בני אדם. פלטפורמה זו משתמשת במערכת השלמה מבוססת לוסיפראז מפוצל כדי לאפשר זיהוי רגיש מאוד בזמן אמת של טאו בתאים חיים, ומאפשר מעקב מדויק אחר העיבוד התוך-תאי. בדיקה זו ניתנת להרחבה וגמישה בין סוגי תאים שונים, ומספקת כלי רב-שימושי לחקירת מסלולים אנדוליזוזומליים ומנגנונים תאיים השולטים בטיפול בטאו במחלות ניווניות עצביות, כולל מחלת אלצהיימר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טאואופתיות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מאופיינות בהצטברות והתפשטות של טאו חלבוני הקשור למיקרוטובול במעגלים עצביים 1,2. הגליה זוכה להערכה הולכת וגדלה כמווסתים של דינמיקת מחלת הטאו, כולל קליטה, התדרדרות והתפשטות 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. הבנת האופן שבו הגליה תורמת לטאואופתיה היא דאגה דחופה לפתרון דינמיקות מחלות מרכזיות, כולל דלקת עצבית והתפשטות טאו. מבין אוכלוסיות הגליאלים, המיקרוגליה - הפגוציטים התושבים במוח - ממוקמים באופן ייחודי לתיווך פינוי טאו.

למרות הצורך הדחוף להבהיר את מנגנוני הטיפול בטאו במיקרוגליה, התחום נותר מוגבל ברזולוציה ובקצב התפוקה של הבדיקות הזמינות. שאלות מרכזיות בנוגע להפנמת טאו, סחר תוך-תאי ופינוי סלולרי נותרו בלתי פתורות. כל אחד מהשלבים הללו מייצג תהליך מכניסטי מובחן: קליטה מתייחסת לאינטרנליזציה של טאו חוץ-תאית בממברנת הפלזמה; התנועה כוללת מיון והעברה של טאו פנימי דרך תאים אנדוזומליים, ליזוזומליים ואחרים; ודרדציה מציינת את הפירוק הפרוטאוליטי של טאו, בעיקר דרך מסלולים ליזוזומליים ופרוטיאזומליים. למרות ששלבים אלה עוקבים אחרי עיבוד טאו חוץ-תאי, מאחר שטאו פנימי חייב לעבור תאים תוך-תאיים לפני שמגיע למנגנון התדרדרות, הם מווסתים באופן עצמאי והפרעה ניסיונית מסוימת עשויה להשפיע על שלב אחד מבלי לשנות את האחרים. לדוגמה, ירידה באות הטאו התוך-תאי עלולה לשקף פגיעה בקליטה, ניתוב שגוי מאזורים מתדרדרים או התדרדרות מוגברת. פתרון תהליכים אלו דורש פלטפורמות בדיקה חדשות שיכולות לזהות נוכחות חלבון ולהיות משולבות עם מדדים קיימים לקביעת גורל החלבון לאורך זמן.

שיטות עכשוויות לפתרון הפנמה ופירוק טאו מתבססות על אימונוציטוכימיה, ציטומטריית זרימה, ווסטרן בלוטינג וגישות סימון פלואורסצנטי לכימות קליטה, מיקום תת-תאי ועיבוד תוך-תאי של מיני טאו 13,14,15,16,17,18. עם זאת, כל אחת מהגישות הללו סובלת ממגבלות יסודיות כאשר היא מיושמת על חקר דינמיקת ניקוי חלבונים. אימונוציטוכימיה ומערב בלוטינג חסרות את הרגישות לזיהוי מיני טאו בעלי שפע נמוך, ודורשות עבודה רבה. ציטומטריית זרימה ובדיקות מבוססות פלואורסצנציה אינן מדווחות באופן נאמן על ניקוי חלבונים, משום שהפלואורופורים יכולים להישאר גם לאחר שהחלבון המצומד התפרק19, ובכך מנתקים את אות הפלואורסצנציה מהגורל האמיתי של החלבון המעוניין. יחד, מגבלות אלו משאירות פער קריטי, כאשר אין שיטה קיימת שמספקת בו זמנית את הרגישות, הרזולוציה הזמנית והיכולת להרחבה הנדרשים למעקב כמותי אחר דינמיקת פינוי הטאו. לכן, מכשול מרכזי בהבנת דינמיקת טיפול בטאו במיקרוגליה הוא היעדר בדיקות כמותיות, מבוקרות זמן ומהירות תפוקה גבוהה למדידת פינוי טאו בתאים חיים.

כדי להתמודד עם המחסור בפלטפורמה כמותית למעקב אחר דינמיקת הטאו החיה, פיתחנו מבחן רגיש מבוסס זוהר שיכול לשמש לזיהוי דינמיקת חלבוני טאו תוך-תאית. גישה זו עושה שימוש במערכת השלמה מבוססת פיצול-לוסיפראז, שבה תג פפטיד קטן (High Affinity Binary Technology או HiBiT) מתמזג לטאו, ומאפשר מדידות קינטיות בתאים חיים. באינטראקציה עם בן זוגו המשלים (Large Binary Technology או LgBiT), החלבון המתויג יוצר מחדש אנזים לוסיפראז פעיל, ומייצר אות ביולומינסנטי כמותי 20,21,22. אות זוהר זה מספק קריאה ישירה ורגישה של שפע חלבונים, ומאפשר מעקב דינמי אחר שינויים ברמות התוך-תאיות לאורך זמן. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בלומינסנציה כמדווח חזק על נוכחות או אובדן חלבונים, כמו במקרה של התדרדרות תוך-תאית. ביחד, פלטפורמה זו מאפשרת מדידה מדויקת וזמנית של טיפול בטאו ומציעה אסטרטגיה רחבה ליישום לחקר תחלופת חלבונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים התאים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 מתאימה, שאושרה על ידי שירותי הסביבה והבריאות של אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט.

1. ביטוי, טיהור והסרת אנדוטוקסין של חלבון Tau-SLP

  1. הוסף את תג פפטיד לוסיפראז מפוצל או תג SLP (VSGWRLFKKIS) למבנה טאו ליצירת מבנה מתויג (Tau-SLP) באמצעות שיטות שיבוט סטנדרטיות, כמו גיבסוןאסמבלי 23.
    הערה: השלמת תג הפפטיד מפוצל-לוסיפראז יוצרת אות עמיד כאשר הוא ממוקם בקצה C, בקצה N, או בדומיינים הפנימיים של 2N4R Tau24.
  2. הביטוי וטוהר Tau-SLP באמצעות שיטות שתוארוקודם 25,26 והבטחת טוהר באמצעות SDS-PAGE ואימונובלוטינג.
  3. לשימוש בתאי מיקרוגליאל, יש לעקוב אחר פרוטוקולים שפורסמו להסרת אנדוטוקסין חיידקי לאחר טיהור Tau-SLP במטרה להגביל תגובתיות מבלבלת27.
  4. כמת את ריכוז החלבון Tau-SLP באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית סטנדרטית (BCA) או מבחן ברדפורד28,29.
  5. אם רוצים, יש לאסוף את Tau-SLP בהתאם לפרוטוקוליםשתוארו קודם 24.
  6. אימות הלומינסנציה הפונקציונלית של Tau-SLP על ידי יצירת עקומה סטנדרטית באמצעות מצע לוסיפראז מסחרי ותגובת השלמה, בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).

2. תרבית מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC (iTF-Microglia)

  1. תרבית תאי מיקרוגליה ב-5%CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיום התרבית המתאים.
  2. התמיינת קו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המכיל שישה פקטורי שעתוק המושרים על ידי דוקסיציקלין ליצירת תא דמוי מיקרוגליה (מיקרוגליה-דמוי מיקרוגליה (iTF-Microglia) באמצעות פרוטוקול מאומת30 (ראו טבלת חומרים).
    הערה: בדיקה זו אינה מוגבלת ל-iTF-Microglia וניתן להשתמש בה עם כל קו תאים דבק. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה לזמני ניקוי כאשר עובדים עם קווי תאים אחרים.

3. בדיקת ניקוי טאו

  1. לתוך לוח עם 24 בארות, תאי הלוחות בצפיפות של 1 x 105 תאים לבאר, בשלוש כפילים לכל תנאי, עם מדיום תרבית (250 מיקרוליטר) ודוגרים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 (איור 1A).
  2. הסר מדיום תרבית, שטוף תאים פעם אחת עם PBS (250 מיקרוליטר), והחלף במדיום תרבית של 250 מיקרוליטר.
  3. כדי למדוד את פינוי טאו-SLP בזמן, חשפו תאים ל-Tau-SLP באופן מדורג כך שכל הבארות ייקצרו בו-זמנית תוך הבדלים רק בזמן הניקוי. לדוגמה, עבור קבוצות ניקוי של 0, 2 שעות ו-4 שעות פנוי, הוסף תחילה את המדיום המכיל 100 ננומטר של Tau-SLP לקבוצת 4 היות, ואז שעה מאוחר יותר לקבוצת 2 היות, ולבסוף שעה מאוחר יותר לקבוצת 0 שעות (ראו איור 1B להמלצות תזמון). לאחר סיום תקופת ההפנמה הסופית, כל הבארות עברו את אותה תקופת חשיפה ל-Tau-SLP אך יהיו שונות רק בזמן הפינוי (איור 1B).
  4. כלול בארות שאינן מקבלות טיפול טאו-SLP עבור חיסור רקע (איור 1C).
  5. בסוף תקופת ההפנמה, יש להסיר את המדיום המכיל טאו-SLP. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את Tau-SLP חוץ-תאי והחליפו במדיום תרבית ללא Tau-SLP.
  6. דגרו את התאים לתקופת הניקוי המיועדת (איור 1A). קבוצת הפינוי של 0 שעות, שנאספה מיד לאחר תקופת ההפנמה, מייצגת את הכמות הכוללת של Tau-SLP הפנימית בתחילת שלב הניקוי.
  7. בהתאם לכל נקודות זמן הניקוי, הסר את המדיה מהבארות ושטוף עם 250 מיקרול PBS.
  8. טפלו בכל אחד היטב עם 250 מיקרוליטר טריפסין-EDTA 0.25% למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שלב זה מסיר את הטאו הקשור לפני השטח כדי להבטיח שהזוהר משקף את ה-Tau-SLP הפנימי. נטרלו כל באר עם מעכב טריפסין של 250 מיקרוליטר (5 מ"ג/מ"ל).
  9. אסוף כל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מתויג כראוי בנפח 1.5 מ"ל וכדור באמצעות צנטריפוגה (500 x גרם, 5 דקות).
  10. הכינו כמות מתאימה של בופר ליזיס המכיל מצע לוסיפראז ורכיבי השלמה (ראו טבלת חומרים; 50 מיקרוליטר x # של בארות + 10%).
  11. הסר כל סופרנטנט עם פיפטה שואפת והחזיר את פלט התא ל-50 מיקרוליטר של בופר ליזיס המכיל תת-לוסיפראז ורכיבי השלמה. זה ייצור קומפלקס השלמה מפוצל-לוסיפראז וייצור זוהר (איור 1D).
  12. העבר תאים מפורקים ללוח לבן עם חצי נפח 96 בארות.
  13. קרא את הזוהר בקורא מיקרופלט עם רעד אורביטלי למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס) לפני הקריאה כדי להבטיח פירוק מלא של כדורי התאים.
  14. קבעו את שפע Tau-SLP המנורמל על ידי חיסור ערך האור הממוצע שהתקבל מבארות שלא נחשפו ל-Tau-SLP. נרמול כל ערך לאות הממוצע המוחסר ברקע של קבוצת הניקוי של 0 שעות.
  15. גרף נרמל את שפע טאו-SLP כפונקציה של זמן הניקוי. ירידה הדרגתית בלומינסנציה מצביעה על ירידה בשפע טאו-SLP תוך-תאי ומפורשת כניקוי טאו-SLP, בעוד ערכי זוהר יציבים מצביעים על פגיעה או פינוי מאוחר. חשב אחוז פינוי כ: % פינוי = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות בדיקה רגישה מבוססת זוהר, ניתן היה לעקוב אחרי שפע Tau-SLP תוך-תאי לאורך זמן לאחר תקופת קליטה מסונכרנת במיקרוגליה שמקורה ב-iPSC אנושי. לאחר ניקוי טאו-SLP, הלומינסנציה ירדה בהתמדה, בהתאם לניקוי תוך-תאי של טאו-SLP. פלטפורמה זו הייתה רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בטיפול במיני טאו-SLP מונומרי וסיבי על ידי מיקרוגליה. טאו-SLP מונומרי נוקה לחלוטין ב-iTF-Microglia בתוך 60 דקות, בעוד ש-Tau-SLP פיברילרי נמשך מעל 240 דקות (איור 2A). בנוסף, ביצענו את הבדיקה עם טאו מוטנטי (למשל, N279K) להערכת קינטיקת פינוי ומצאנו כי TauN279K-SLP מראה קינטיקה מופחתת משמעותית בנקודות זמן ניקוי קצרות בלבד (15 דקות) (איור 2B). תוצאות אלו מצביעות על כך שההתדרדרות שנצפתה עשויה להיות ניכרת רק בשל הרגישות הגבוהה של מבחן זה. ביצענו ניסוי פירוק Tau-SLP באמצעות המולקולה הקטנה L-Leucyl-L-Leucine מתיל אסטר (LLOMe) כדי לאשר מעורבות ליזוזומה. LLOMe הוא סובסטרט קתפסין C החודר לממברנות הליזוזומליות, ומפריע לפעילות הליזוזומלית31. בטיפול ב-LLOMe, ראינו עלייה משמעותית ברמות מצב יציב של Tau-SLP ב-t=0 (איור 3A) ובקצב ירידה משמעותית בהתדרדרות (איור 3B) עם עלייה פי 4 ב-Tau-SLP שנותרה לאחר זמן ניקוי של 60 דקות. לבסוף, ביצענו את מבחן ניקוי Tau-SLP בנוירונים שמקורם ב-iPSC כדי לאשר תאימות מבחנים בין סוגי תאים. כאן מצאנו כי נוירונים שמקורם ב-iPSC בעלי קינטיקה מופחתת של פינוי הן לצורות מונומריות (איור 4A) והן לצורות סיביות (איור 4B) של Tau-SLP. הבולט ביותר הוא שרמות הסיבים של Tau-SLP נשארות יציבות ב~100% במהלך ניקוי של 240 דקות, בעוד שבאותו פרק זמן רמות הסיבים של Tau-SLP ירדו מתחת ל-50% ב-iTF-Microglia. תוצאות אלו מראות כי פלטפורמת ההשלמה המבוססת ספליט-לוסיפראז שלנו מציעה גילוי חזק ואמין של ניקוי אנדוליזוזומי תוך-תאי של Tau-SLP, ומדגימה עיצוב בדיקה גמיש מאוד שניתן ליישם על חלבונים או סוגי תאים רבים נוספים.

figure-results-1
איור 1: עיצוב ניסויי מייצג של מבחן ניקוי טאו-SLP. (א) תמונת שדה בהיר מייצגת של iTF-Microglia ששימשה לבדיקה זו (פס קנה מידה = 100מיקרום) (B) מיקרוגליה אנושית (iTF-Microglia) נחשפת ל-2N4R-SLP רקומביננטי בצורה מדורגת, מה שמאפשר גילוי עמיד מבוסס לומינסנציה. לאחר דגירה של שעה, הטאו החוץ-תאי מוסר באמצעות החלפת מדיה והתאים נשטפים באמצעות PBS. התאים נשמרים במדיה בסיסית במהלך תקופת הניקוי המתאימה שלהם (0 ש', '2 שעות, 4 שעות') לפני הקציר. בנקודת הקצה, התאים עוברים ליזה, ונמדדת זוהר. (ג) עיצוב לוח מוצע למדידת מרווח Tau-SLP השוואה בין התדרדרות מונומרי לפיברילרית. (D) חלבון Tau-SLP מופנם לתאים ומנותב לפירוק ליזוזומלי. הוספת LgBiT מספקת קריאה כמותית של כמות ה-Tau-SLP שנותרה בתא דרך השלמה וייצור של זוהר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: iTF-Microglia טאו-SLP חוץ-תאי שקוף. (A) iTF-Microglia נחשפו ל-Tau-SLP מונומרי (100nM) או ל-Tau-SLP פיברילרי (50nM), דגימות ננורמו לקליטה התחלתית (t = 0; 100%) ולתאים שלא נחשפו ל-Tau-SLP (0%) (ממוצע ± SD; n = 9 משלוש התמיינויות עצמאיות). (B) iTF-Microglia דוגרו עם Tau-SLP מונומרי או TauN279K-SLP (100nM), והדגימות ננורמו לקליטה התחלתית (t = 0; 100%) ותאים שלא נחשפו ל-Tau-SLP (0%) (ממוצע ± SD; n ≥ 7 משלוש הבדלים בלתי תלויים; ∗ עמוד < 0.05 באמצעות מבחן ה-t של וולש הלא מזווג). הנתונים הודפסו מחדש מ-Shultz ואחרים, 2025,24, ושימשו תחת רישיון Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: עיכוב ליזוזומי פוגע בניקוי טאו-SLP. (א) טיפול במעכב ליזוזומי של 1 מילימטר L-Leucyl-L-Leucine מתיל אסטר (LLOMe) במשך 24 שעות הגביר את קליטת ה-Tau-SLP הראשונית (t = 0) בתאי H4 נוירוגליומה (ממוצע ± SD; n = 9 תרביות עצמאיות; ∗ p < 0.05 באמצעות מבחן t לא מזווג של וולש). (ב) טיפול ב-LLOMe (1mM) במשך 24 שעות עלה באחוז הנורמל של Tau-SLP RLU לאחר זמן ניקוי של 60 דקות (t = 60 דקות) בהשוואה לרכב (DMSO). אות זוהר מנורמל לרמות קליטה ראשוניות מתאימות (100%) ותאים שלא נחשפו ל-Tau-SLP (0%) (ממוצע ± SD; n = 9 תרביות עצמאיות; ∗∗∗∗ p < 0.0001, ∗ p < 0.05 באמצעות מבחן t לא מזווג של וולש). הנתונים הודפסו מחדש מ-Shultz ואחרים, 2025,24, ושימשו תחת רישיון Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: iTF-Microglia ו-iNeurons מראים הבדלים בניקוי Tau-SLP. (A) iTF-Microglia או iNeurons נדגרו עם Tau-SLP מונומרי (100nM), הדגימות ננורמו לקליטה התחלתית (t=0; 100%) ותאים שלא נחשפו ל-Tau-SLP (0%) (ממוצע±SD; n ≥ 6 משתיים-שלוש התמיינויות עצמאיות; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 באמצעות ANOVA דו-כיווני; זמן: F(1, 28) = 7.489, p = 0.0107; סוג תא: F(1, 28) = 46.61, עמוד < 0.0001; אינטראקציה: F(1, 28) = 3.229, p = 0.0831; מבחן ההשוואות המרובות של סידאק, ערכי p המצוינים באיור, ערכי t=0 מוצגים כהפניה אך הוצאו מהניתוח הסטטיסטי). (B) iTF-Microglia או iNeurons הוטמעו עם Tau-SLP סיבי (50nM), הדגימות ננורמו לקליטה ראשונית (t=0; 100%) ותאים שלא נחשפו ל-Tau-SLP (0%) (ממוצע±SD; n ≥ 6 משתי עד שלוש התמיינויות בלתי תליות; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 באמצעות ANOVA דו-כיווני; זמן: F(1, 26) = 0.3888, p = 0.5384; סוג תא: F(1, 26) = 43.09, עמוד < 0.0001; אינטראקציה: F(1, 26) = 1.209, p = 0.2816; מבחן ההשוואות המרובות של סידאק, ערכי p המצוינים באיור, ערכי t=0 מוצגים כהפניה אך הוצאו מהניתוח הסטטיסטי). הנתונים הודפסו מחדש מ-Shultz ואחרים, 2025,24, ושימשו תחת רישיון Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה וכמותית למדידת ניקוי טאו-SLP חוץ-תאי על ידי מיקרוגליה עם רגישות גבוהה ורזולוציה זמנית. בניגוד לגישות המסורתיות המבוססות על הדמיה, שלרוב דורשות עיבוד דגימות מייגע ומוגבלות בתפוקה ובדגימה זמנית, מערכת מבוססת זוהר זו מאפשרת כימות ישיר ברמת האוכלוסייה של טיפול בטאו בפורמט מיקרופלטה. הקריאה המתקבלת מספקת מדידה כמותית של ניקוי טאו-SLP לאחר חשיפה לטאו חוץ-תאי. מכיוון שניתן לבצע מדידות שוב ושוב במספר נקודות זמן ועם תקופות דגירה ארוכות יותר, הבדיקה מאפשרת ניתוח מהיר וקינטית של דינמיקת קליטת הטאו והניקוי. בנוסף, שינויים בזוהר לאורך זמן תואמים לשינויים בשפע Tau-SLP תוך-תאי, אך אינם מבחינים בין תנועה, התדרדרות או הפרשה ללא גישות משלימות. למרות שתיווג Tau-SLP לא שינה משמעותית את קליטת הטאו או את ההצטברות במחקר הנלווהשלנו 24, תגיות חיצוניות עשויות להשפיע על התנהגות חלבונים אחרים. לכן, יש להשלים את ממצאי הבדיקה בגישות אורתוגונליות ולהשוות להכנות טאו לא מתויגות ככל האפשר. מגבלה נוספת היא שבדיקה זו עושה שימוש במינים רקומביננטיים של טאו-SLP במקום טאו אנדוגני או אגרגטים פתולוגיים שמקורם במטופל. בעוד שטאו רקומביננטי 2N4R מספק תת-קרקע ניסיוני ששכפול, הוא אינו משקף במלואו את ההטרוגניות האנדוגנית (כלומר, שינויים פוסט-תרגומיים) של מיני טאו מבודדים ממוחות מטופלים אנושיים. קיימים פרוטוקולים רבים לזרחון חוץ גופי של חלבון טאו רקומביננטי וניתן לשלבם בקלות בזרימת עבודה זו. פלטפורמה זו יכלה להיות מותאמת גם לחקר טאו אנדוגני; דבר זה ידרוש שימוש בהנדסה גנטית לשילוב רצף תגית SLP בלוקוס הטאו (MAPT).

חשוב לציין שפרשנות הפחתת האות כהתדרדרות תלויה בהסרה אפקטיבית של טאו חוץ-תאי וקשור למשטח, לדוגמה, באמצעות טריפסיניזציה או שלבי הסרה מקבילים. תוצאות שליליות שגויות עלולות להתרחש אם לא תושג הסרה יעילה. אובדן אות נראה לעין, שיכול להתפרש כחיובי שגוי של התדרדרות טאו. זה יכול להיגרם מהיפרדות תא או מוות, הפרשת טאו-SLP, או חיתוך פרוטאוליטי שמפריד בין SLP לטאו מבלי לפגוע בחלבון. בהתאם לכך, יש לפרש ירידה בזוהר כהפחתות בשפע טאו-SLP תוך-תאי ולא כמדידות ישירות של פירוק הליזוזומי. כדי לייחס באופן חד-משמעי יותר שינויים באותות להידרדרות הליזוזומית, מומלץ להשתמש באסטרטגיות אימות אורתוגונליות. אלה עשויים לכלול הפרעה פרמקולוגית בתפקוד הליזוזומלי, כגון טיפול בבאפילומיצין A1 או LLOMe (איור 3), וכן עיצובים ניסיוניים של פולס-צ'ייס לזיהוי קינטיקה של קליטה מול פירוק.

הגמישות של מבחן זה הופכת אותה למתאימה מאוד לחקירת מנגנונים המפקחים על קליטת טאו, סחר תוך-תאי ופירוק, וכן לסינון מודולטורים פרמקולוגיים או גנטיים של ניקוי טאו במערכות התא האנושיות. למרות שהודגם כאן במיקרוגליה שמקורה ב-iPSC, הפלטפורמה ניתנת להתאמה בקלות לסוגי תאים אחרים (איור 4), ומאפשרת יישום רחב במודלים של ביולוגיה של טאו ומחלות ניווניות עצביות, כולל מחלת אלצהיימר וטאופתיות ראשוניות ומשניות נוספות. מכיוון שבדיקה זו מתבססת על חשיפה חוץ-תאית של Tau-SLP וגילוי מבוסס לומינסנציה, היא אמורה להיות גמישה בקלות לאסטרוציטים, אוליגונדרוציטים או קווי תאים נפוצים, אם כי ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של תנאי הקליטה. ביחד, גישה זו מספקת כלי עוצמתי לניתוח מסלולים תאיים המעורבים בפרוטאוסטזיס ולקידום הבנה מכנית של תהליכי מחלות ניווניות נוירודגנרטיביות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AG064116, AG077672)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AccutaseThermo ScientificA1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231
DMEM/F-12, HEPESThermo Scientific11330057
DoxycyclineClontech631311
DPBSThermo Scientific14-190-250
GlutaMAXThermo Scientific35050061
Graphing SoftwareGraphPad Prism (או דומה)n/a
Human GM-CSFThermo Scientific300-03
KnockOut DMEMThermo Scientific10829018
Luminescent Plate ReaderSpectraMax i3x (או דומה) - Molecular Devicesn/a
Microcentrifuge TubesFisher Scientific02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, WhiteGreiner675075
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection SystemPromegaN3030
Poly-L-Lysine hydrobromide Fisher ScientificICN15017750
Recombinant Human IL-34Thermo Scientific200-34
Recombinant Human M-CSFThermo Scientific300-25
Recombinant Human TGF-β1Thermo Scientific100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlatesFisher ScientificFB012927
Tau-HiBiT proteinIn housen/aחלבון טאו עם תגית VSGWRLFKKIS
Trypsin InhibitorSigma AldrichT9128
Trypsin-EDTAThermo Scientific5-200-072
Y-27632 dihydrochlorideBio-techne1254

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233Nano GloHiBiT
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים