פרוטוקול גידול ומיקרוהזרקה יעיל לשינוי גנטי של הזבוב היציב, Stomoxys calcitrans

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוהזרקה אמינה לעובר לשילוב חומר גנטי זר בגנום היציב של הזבובים, מערכת סקר פלואורסצנטי למעקב אחר התפתחות עוברית לאחר ההזרקה, וסובסטרט גידול זחלים המורכב מאגר חלמון ביצה עם תוספת פחמן פעיל, המחונת באשרכיה קולי התומך בהתפתחות הביצה לבוגרת.

Abstract

זבובי היציבות הם מזיקים ניזונים דם של בעלי חיים, בעלי חיים לבני אדם ובני אדם, ונמצאים בכל היבשות למעט אנטארקטיקה. הנשיכות הכואבות של זכרים ונקבות בוגרות גורמות להתנהגויות הקשורות ללחץ בבעלי חיים, מה שמוביל לירידה במשקל ולהפסדים כלכליים משמעותיים ליצרנים. גם זבובי האורווה הזכרים וגם הנקבות הם מאכילים דם חובה, מה שמקשה על טכניקת חרקים סטרילית ואסטרטגיות ניהול מזיקים אחרות שדורשות שחרור המוני של זכרים. אסטרטגיות ניהול מזיקים יציבות כיום לעיתים קרובות אינן מצליחות לשלוט כראוי באוכלוסיות הזבובים. למרות שפותחו שיטות רבות של מניפולציה גנטית להכנסת חומר גנטי חיצוני או ליצירת הדחפות גנטיות עבור יתושים, דרוזופילה וקבוצות חרקים מודליים אחרות, שיטות לשינוי גנטי של זבובים יציבים נותרו מוגבלות. פרוטוקול זה מתאר גישה אמינה ומשופרת להכנסת חומר גנטי זר לזבובים יציבים באמצעות וריאנט היפראקטיבי של טרנספוזאז פיגיבק ומדיום גידול זחלים מוצק חדשני התומך בהתאוששות, בקיעה, האכלה וסינון פלואורסצנטי לאחר הזרקה עוברית.

Introduction

זבובי היציבות (Stomoxys calcitrans L., 1758) הם מזיקים חשובים כלכלית ומחלות של בעלי חיים ^1,2,3 ויש להם תפוצה קוסמופוליטית ברחבי העולם. אסטרטגיות ניהול מזיקים משולב (IPM) לעיתים קרובות אינן מצליחות לשלוט כראוי באוכלוסיות זבובים יציבות ^2,3, מה שמוביל להפסדים שנתיים המוערכים במעבר ל-2 מיליארד דולר בארצות^{הברית בלבד.} בנוסף, עמידות לחומרי הדברה תועדה באוכלוסיות זבובים יציבות באירופה ^4,5 ודווחה גם^{בארצות הברית}. כתוצאה מכך, גישות לשליטה גנטית כמו טכניקת החרק הסטרילי (SIT) ומערכות הנעת גנים מהוות תוספות רצויות לתוכניות IPM מסורתיות.

מאמצים קודמים לפתח שיטות בקרה גנטית בזבובים יציבים, כולל יצירת זנים גנטיים לזיהוי מין עבור SIT, התבססו על רבייה סלקטיבית והעברה מושרה קרינה ^7,8. גישות אלו דורשות עבודה רבה ומוגבלות לשינויים שאינם טרנסגניים. בהמשך, או'ברוכטה ואחרים.⁹ הוכיחו כי השימוש במערכת הרמס טרנספוזאז הצליח לשלב טרנסגנים ב-S. calcitrans; עם זאת, הפרוטוקול הניב יעילות טרנספורמציה נמוכה, כאשר כ-0.11% מהעוברים שהוזרקו הפיקו צאצאים טרנסגניים, ויצר ביטוי חלש של סמן החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP) תחת שליטת פרומוטר חיצוני⁹.

שיטות מניפולציה גנטיות אחרות, כולל מערכות CRISPR-Cas, עדיין לא יושמו באופן נרחב בזבובים יציבים, בין היתר בגלל הקושי לחדור לכוריון העמיד של עוברי זבובים יציבים. הכוריון החיצוני הקשה דומה לזה של זבובים שריריים אחרים ^10,11. ניסיונות להזריק דרך הכוריון באמצעות מחטי קוורץ או להסיר את הכוריון באמצעות סרט דבק דו-צדדי נכשלו, מה שדרש טיפול בתמיסה מחמצנת (3% נתרן היפוכלוריט, NaOCl), שמפחיתה את קצב הבקיעה.

זבובים יציבים יכולים להישמר לטווח ארוך בתנאי מעבדה, ושלבים לא בוגרים מגודלים בדרך כלל במצעי תאית מותססים כמו שבבי עץ, סובינת חיטה או קש המושלמים במקורות חנקן, כולל תוספי חלבון עגלים או פתיתי דגים¹². עם זאת, מצעים אלו מציגים מספר חסרונות כאשר הם משמשים לגידול עוברים מוזרקים במיקרו. האטימות והאוטופלואורסצנציה הגבוהה שלהם מקשים על זיהוי זחלים חיוביים ל-GFP לאחר הבקיעה והחפירה במצע. בנוסף, למרות שנדרש נוכחות חיידקית מסוימת להישרדות הזחלים¹³, מדיום מותסס יוצר קהילות חיידקיות ופטרייתיות בלתי צפויות שעלולות להזיק או לצרוך עוברים לפני הבקיעה. מגבלות אלו מנעו התאוששות של זחלים שעברו שינוי^{באמצעות שיטות} הזרקה וגידול שתוארו קודם, מה שהדגיש את הצורך בפרוטוקול הזרקה אמין יותר שמאפשר גם סקר פלואורסצנטי לאורך כל ההתפתחות.

כאן מוצג פרוטוקול מיקרו-הזרקה שניתן לשחזור הכולל שיפורים בבחירת טרנספואזות, שיטת ההזרקה, ומדיות סינון וגידול. שינויים אלו מסייעים בפיתוח זבובים יציבים מהונדסים גנטית ליישומים הכוללים זני מין גנטיים ל-SIT, הנעות גנים וניקוי גנים בתיווך CRISPR-Cas. שיפורים מרכזיים כוללים שימוש ב-piggyBac transposase¹⁴ היפראקטיבי תחת שליטת פרומוטר חלבון הלם חום זבוב יציב (hsp)83, ייבוש עוברים למזעור אובדן אופלזמה לאחר ההזרקה, והסרת סרט דבק ושמן הלוקרבון במהלך הזרקת עוברים.

ההתאוששות של עוברים שהוזרקו השתפרה עוד יותר על ידי החלפת מדיום גידול בתפזורת בלוחות אגר מזינים שטוחים ופיגמנטיים שחוסנו בדשא של אשריכיה קולי. נוסח אגר זה מעניק שני יתרונות עיקריים. ראשית, הוא מספק מקור מזון חיידקי מונוגני צפוי להתפתחות הזחלים. שנית, הוא מספק רקע בעל ניגודיות גבוהה ואוטופלואורסצנציה נמוכה שמקל על תצפית על מורפולוגיה, התפתחות וביטוי GFP בזחלים מהדור הראשון (G0). זבובי בית וזבובי היציבות מתפתחים ומתגלמים באופן טבעי על לוחות אגר מבוססי חלמון ביצה ^13,15. הנוסחה המתוארת כאן משלבת אבקת פחם פעיל כתוסף לא תגובתי, בטוח למזון, כדי להפחית עוד יותר את הפלואורסצנציה ברקע.

Protocol

כל הניסויים והפעולות בוצעו באישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של טקסס A&M (פרוטוקול IBC2019-081). המגבים, הכימיקלים והכלים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. גידול זבובים לייצור ביצים

1. הכנת כלובים למבוגרים
   1. כוון את התרמוסטט של תא האינקובטור ל-28°C וערבב 3 ק"ג נתרן כלוריד עם ~5 ליטר מי ברז במחבת של 10 ליטר, תוך המסה ~50% מהמלח.
   2. הניחו את תבנית המלח החשוף בתחתית תא האינקובטור כדי לשמור על לחות של כ-80% RH. שמור על מחזור יום-לילה של 16:8 בחדר או בחדר.
   3. ריפדו את תחתית כלובי החרקים (30 על 30 על 30 ס"מ כלובים אלומיניום/אלומיניום עם רשת רשת) בשתי שכבות של מגבות נייר והניחו תבלינים חד-פעמית בנפח 45 מ"ל מלאה בסוכר גרגירי מעל שכבת המגבת (איור 1A).
      הערה: מגבות הנייר מסייעות לספוג גרגר זבוב, והסוכר מספק מקור מזון לפני האכלה בדם.
   4. מלאו בקבוק גריפין בנפח 250 מ"ל בכ-100 מ"ל של מי ברז בטמפרטורת החדר וארזו בד כותנה שחור בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ (שנחתך מציפית או סדינים שחורים פשוטים) למים עד שהבד נרטב. כוון את הבד השחור כך שהקצוות שלו יגיעו 1-2 ס"מ מעבר לשפת הבקבוק (איור 1B).
      הערה: הבד הלח הזה מספק מים נוזליים ומשטח ביצים לזבובים הבוגרים. מוות יכול להתרחש במהירות אם למבוגרים אין גישה למקור לחות.
   5. העבר 500-1,500 גולמי זבובים יציבים לצלחת קטנה או בקבוק ומניח אותם בכלוב החרקים. הניחו את הכלוב הבוגר בתא הטיפוח הלח (שלב 1.1.1) ועוקבים מדי יום אחר אקלוזיה. כאשר הבוגרים יוצאים, התחילו להאכיל מדי יום בדם בקר ציטרטורי (סעיף 1.2).
2. הזנת זבובים בוגרים
   1. הכינו דם בקר ציטרטי על ידי הוספת ריכוז סופי של 10.9 מ"מ מ"מ טריסודיום ציטראט די-הידראט לדם בקר שנאסף זה עתה.
   2. לזמן קצר, השאירו ~12.8 גרם מלח ציטראט בנפח מינימלי של מים דה-יוניים והוסיפו ל-4 ליטר דם שנאספו בבית המטבחיים המקומי.
      הערה: מיכלי דם צריכים להיות עם מכסים עם מכסה ברגי (למשל, בקבוקי ידית מרובעים, רחבי פה, 4 ליטר) ולנקות היטב עם סבון ומים חמים לפני השימוש. בבית המטבחיים, הימנעו מאיסוף ~1 ליטר דם בקר הראשון מחיה שנשחטה כדי למזער זיהום בשיער, זיעה, לכלוך וחומרים קרישיים אחרים.
   3. הקפיאו דם בקר ציטרטורי ב-200 מ"ל אליקווטים והפשרו לפי הצורך, תוך שמירה על האליקווטים המופשרים במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
   4. לספק ~40 מ"ל דם בטמפרטורת החדר לכל 600 זבובים לכל כלוב בוגר.
   5. ניתן להציע דם במיכל תבלינים או בקבוק, ויש להכניס ספוג גזה כותנה לא סטרילי מקופל לכלי כדי לספוג את הדם. ערבבו את הפתיל עד שהכותנה רוויה לחלוטין והכניסו אותו לכלוב.
      הערה: יש להחליף דם מדי יום החל מ-24 שעות לאחר ההוצאה.
3. איסוף ביצים
   1. לאחר שהביצים נצפו על בד כותנה שחור, יש להוציא את הבד מהבקבוק ולשטוף ביצים למיכל פלסטיק רדוד נפרד בנפח ~700 מ"ל באמצעות בקבוק כביסה (איור 2A). הטלת ההטלה מתרחשת בדרך כלל כאשר הזבובים בני 7-10 ימים.
      הערה: בדקו גם ביציות בכוסות דם ואספו ביצים משוטטות שעשויות להיות מונחות שם.
   2. אספו ביצים על נייר פילטר באמצעות סינון ואקום. זה נעשה על ידי הנחת נייר פילטר שחור במשפך של בוכנר, מריחת ואקום, ואז שפיכת הביצים מהשלב 1.3.1 על ההגדרה.
   3. לאחר מכן, מעבירים ביציות לצילינדר מדורג או לצינור מיקרוצנטריפוגה מדורג בנפח 1.7 מ"ל באמצעות בקבוק שטיפה ולתעד את נפח הביציות שנאספו (איור 2B).
      הערה: הימנעו מטבילה ממושכת של ביצים במים, שכן שיעור התמותה מתחיל לעלות ~10 דקות לאחר ההטבילה.
4. הכנת מדיום זחלים בתפזורת
   1. אסוף חומרים למדיות זחל בתפזורת (איור 3A), כפי שמפורט בטבלה 1.
   2. בכוס של 1000 מ"ל, מוסיפים את תוסף חלבון העגל ואת כל מי הברז. תן לה להידרדר מחדש כל הלילה בטמפרטורת החדר.
   3. הוסיפו את סובין החיטה והוורמיקוליט למיכל ערבוב נפרד וגדול יותר.
   4. לאחר החזרת לחות ללילה, ערבבו היטב את תוסף העגל המיובש כדי לשבור גושים, ואז שפכו את התערובת למיכל עם סובין חיטה וורמיקוליט. מערבבים היטב עד שהסובין ההומוגני וכל סובין החיטה מצופה בתערובת תוסף העגלים.
   5. העבר את המדיה הנפזת למיכל אחסון מזון מפוליפרופילן בשכבה בעומק ~8 ס"מ המכסה את כל תחתית המיכל (איור 3B).
   6. הוסף ~1,000 עוברים (כ-0.2 מ"ל ביציות לכל 2.2 ליטר מדיום בתפזורי) על ידי איסוף עוברים דרך .סינון ואקום על נייר סינון עגול בקוטר 90 מ"מ ואז הנחת נייר הסינון עם הביצים הפוכות במרכז מיכל המדיה (איור 3B, C).
   7. כסו את נייר הסינון ב-~1 ס"מ של מדיום לשמירת לחות (איור 3C) וכסים את המיכל במלבן גדול של בד כותנה שחור, עם 5 ס"מ של בד כותנה בולט החוצה מעבר לשפת המיכל.
   8. חתוך חור גדול (~12 ס"מ בקוטר) במכסה מיכל המזון כדי לאפשר חילופי גזים ולהצמיד את המכסה לתיבת המדיה תוך כדי לכידת בד כותנה שחור בין המיכל למכסה (איור 3D).
      הערה: זה משמש כאטם, שמונע מהמרווח בין המכסה למיכל ללכוד זחלים^{מהשלב הראשון} בטיפות עיבוי.
   9. הניחו את תיבת המדיה המוגמרת בתא הגידול של הבוגר עד להתגלמות ולעקוב אחר התפתחות הזחלים (איור 4) (הגולם מתרחש תוך ~10 ימים בהתאם לטמפרטורת המדיה ולצפיפות הזחל).
      הערה: כיסוי הבד צריך להיות דק מספיק כדי למנוע מעבר זחלים מהדרגה הראשונה, אך גם חדיר מספיק כדי למנוע היווצרות עיבוי על דפנות פנימיות של מיכלי המדיה, שיכולים ללכוד ולהטביע זחלים.
5. הפרדת גולמים
   1. הסר את כיסוי הבד מפח הגולם ואסף את הגולם עם כף או כף.
      הערה: גולמי זבובים יציבים מופיעים כגלילים אדומים-חומים לא ניידים, באורך 4-7 מ"מ, בניגוד לזחלים הצהוב-לבנים הניידים. הגולמים בדרך כלל מצטברים על ההיקף החיצוני של דפנות המיכל או במיקומים לחים ומוגבהים בתוך תיבת המדיה שלהם כאשר הזבובים מתחילים את המטמורפוזה מזחלים לגולמים ולבוגרים.
   2. שכבת 500-1,500 גולמים בעומק ~1 ס״מ על צלחת והניחו בכלוב נקי חדש כפי שמתואר בסעיף 1.1 כדי להתרבות את הדור הבא.

איור 1: חומרי גידול זבובים בוגרים. (A) כלוב גידול זבובים בוגר המציג את הסוכרוז (S) וגביע הביוץ (O). (ב) ההטלה מוכנה מבד כותנה שחור רווי מים המתפרש מעט מעבר לשפת הכוס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: איסוף ביצים. (א) איסוף ביצים מבד ההטלה באמצעות בקבוק שטיפה. (ב) שיחזור ביצים באמצעות סינון ואקום על נייר סינון בעל ניגודיות גבוהה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

חומרים למדיית זחלים בכמויות גדולות
ריאגנט	מסה (g)
מים	900
סובין חיטה	230
תוסף עגל	100
ורמיקוליט (A4 גס)	70
חומרים לפתרונות דה-כוריוניון
פתרון	הרכב
אמבט מחמצן	3% נתרן היפוכלוריט במים דה-יוניים
אמבטיה לשטוף	תמיסת טריטון X-100 0.02% במים דה-יוניים
שטוף	מים דה-יוניים
חומרים ללוחות סינון והגדלה של אגר שחור
ריאגנט	מסה (g)
מים	500
חלמון ביצים טחון	18
פחם פעיל	4
כלוריד נתרן	1

טבלה 1: תגובות למדיה זחלית בתפזורת גדולה, תמיסות דכוריון ולוחות אגר שחורים. חומרים המשמשים להכנת מדיום זחלים בתפזורת לתחזוקת המושבה, וכן הרכב התמיסות המשמשים להחלשת והסרת הכוריון מעוברי זבובים יציבים, וחומרים הנדרשים להכנת 500 מ"ל של מדיום סינון וגידול אגר שחור.

איור 3: הכנת מדיום זחלים בתפזורת ( A). (A) חומרים המשמשים להכנת מדיום זחלים בתפזורת: תוסף חלבון עגל (CM), סובין חיטה (WB), ורמיקוליט (VM), מיכל אחסון (SC), מכסה (L) ואטם בד (FG). (ב) ערבוב יסודי של רכיבי המדיה. (ג) הנחת נייר סינון מצופה ביצה (EP) הפוך כלפי מטה על פני המדיה וכיסוי עם מדיה נוספת למניעת ייבוש. (ד) התקנת אטם הכותנה בין המיכל למכסה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: התפתחות זחלים במדיה בתפזורת. מיכלים שקופים מאפשרים ניטור התפתחות הזחלים ומצב המדיה. הזחלים (L) נראים על דפנות המיכל, המכסה ובתוך המדיה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. הכנה להזרקה: דה-כוריוניון ויובוש

1. הנח בד כותנה שחור רטוב בכוס כפי שמתואר בשלב 1.1.4. והעבר אותו לכלוב בוגר למשך 25 דקות לאיסוף ביצים. שטוף את הביצים על מסננת נירוסטה בנפח 106 מיקרון באמצעות בקבוק כביסה.
   הערה: תקופת איסוף של 25 דקות בדרך כלל מניבה כ-400 ביצים.
2. אפשר לעוברים לנוח ללא הפרעה על המסננת למשך 30 דקות נוספות.
3. בזמן שהעוברים מזדקנים, הכן 150 מ"ל כל אחד מתמיסות החמצון, השטיפה והשטיפה המתוארות בסעיף "חומרים לפתרונות דה-כוריונינציה" בטבלה 1 (איור 5). השתמש בנפח מספק כדי לכסות את העוברים בכ-1 ס"מ של תמיסה.
4. טבלו את המסננת המכילה עוברים באמבט המחמצן למשך 2 דקות וערבבו בעדינות את העוברים באמצעות פיפטת פסטר (איור 6A).
   הערה: שאיפה חוזרת והפצה של תמיסה ליצירת מערבולת מעגלית מסייעת לרכז עוברים במרכז המסננת ומונעת מעוברים טריים להידבק לדפנות המסננת.
5. הסר את המסננת מהאמבטיה המחמצנת והקיש את התמיסה העודפת. העבר את המסננת לתמיסת הכביסה וערבב על ידי שאיבה והזרקה למשך 2 דקות.
6. העבר את המסננת המכילה את העוברים לתמיסת השטיפה וערבב כפי שמתואר בשלב 2.4. למשך 2 דקות. הוציאו את המסננת מתמיסת השטיפה וטפחו מים עודפים.
7. מניחים כיסוי זכוכית סטרילי על המסננת, ומתחת למיקרוסקופ חיתוך משתמשים במכחול ניילון דק להעברת עוברים (איור 6B) מהמסננת לקצה הכיסוי. מקמו עוברים קרובים זה לזה מבלי לאפשר להם לגעת, כאשר הקוטב האחורי הרחב פונה לקצה הכיסוי. הימנעו מכיפום, עיוות או קריעת עוברים במהלך ההעברה.
8. הכינו תא ייבוש על ידי כיסוי תחתית בקבוקון בנפח 1 ליטר ב-100 מ"ל חומר ייבוש סולפט סידן ואטום הבקבוק עם פקק גומי.
   הערה: לאחר 24 שעות של שיווי משקל, תא הייבוש בדרך כלל מגיע ללחות יחסית של <5% בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס.
9. הסר מים עודפים מהכיסוי והניח את הכיסוי המכיל עוברים מפורקים על הנוזל היבש. סגור מחדש את הבקבוק עם פקק גומי וייבש את העוברים למשך 8 דקות.
10. הסר את הכיסוי מתא הייבוש והנח אותו על שלב המיקרוסקופ תחת מטרה של 20× להזרקה מיקרוסקופית.

איור 5: פתרונות דקוריון. משמאל לימין: מסננת נירוסטה, תמיסת מחמצן, תמיסת שטיפה ותמיסת שטיפה המשמשת לדכוריון עוברים. נתרן היפוכלוריט נשמר כתמיסת מלאי של 6% המוגנת מאור, וטריטון X-100 נשמר כתמיסת מלאי של 10× ומדולל לריכוז סופי של 0.02% לפני השימוש. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: דקוריון עוברים. (א) שאיפה עדינה והזרקת תמיסה יוצרות מערבולת שמרכזת עוברים במרכז המסננת ומפחיתה את ההידבקות לדפנות המסננת. (ב) עובר מפורק היוצא מהכוריון השקוף לאחר השטיפה. הקוטב הקדמי (הקצה הצר יותר) בדרך כלל יוצא לפני הקוטב האחורי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. מיקרוהזרקה

1. למשוך מחטי מיקרו-הזרקת קוורץ מנימי זכוכית חוטיים בקוטר 100 מ"מ (זיהוי 0.7 מ"מ, O.D. 1.0 מ"מ) באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 2. אחסן את המחטים במקום נטול אבק עד השימוש.
   הערה: ניתן גם להשתמש במחטי בורוסיליקט עם גיאומטריה דומה.
2. הכינו בופר הזרקה (0.1% w/v פנול אדום במי מלח מפופר פוספט (PBS), pH 7.4) ועקר באמצעות פילטר מזרק של 0.22 מיקרון.
3. הכינו 20 מיקרוליטר תערובת הזרקה על ידי שילוב של 10 מיקרוגרם של פלסמיד עזר פיגי-בק ופלסמיד תורם, המכיל את המטען הגנטי בין חזרות הטרמינל ההפוכות של פיגיבק השמאלי לימין, עם 4 מיקרוליטר של בופר הזרקה. מדלללים לריכוז סופי של 500 ng/μL באמצעות מים נטולי נוקלאז.
   הערה: הפלסמיד העוזר מורכב מרצף פרומוטר hsp83 בנפח 3.1 קילוברק במעלה הזרם של קודון ה-hsp83. ורצף הקידוד ההיפראקטיבי של פיגיבק טרנספוזאז.
4. העבר את תערובת ההזרקה למסנן PTFE בנפח נמוך של 0.20 מיקרון ומניח את המסנן בפתח של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל (איור 7A). צנטריפוגה ב-≥11,000 x גרם למשך 10 דקות או עד שכל תערובת ההזרקה עברה דרך המסנן. יש לאחסן תערובת הזרקה שלא נעשה בה שימוש בטמפרטורה של -20°C.
5. מילאו מחדש מחט מיקרו-הזרקת קוורץ עם כ-2 מיקרוליטר תערובת הזרקה באמצעות קצה פיפטה עם טעינת ג'ל מיקרו (איור 7B). הימנעו מהחדרת בועות אוויר במהלך הטעינה.
   הערה: כוון את מחט המיקרו-הזרקה במקביל לציר הארוך של העובר ושמור על אפס הזזה זוויתית אופקית ואנכית כדי למזער קריעה וגזירה.
6. הקישו בעדינות את קצה המחט על קצה מחליק זכוכית עד שתערובת ההזרקה זורמת דרך קצה המחט (איור 7C).
   הערה: שברו בהדרגה את קצה המחט כדי ליצור את הצמצם הקטן והחד ביותר שעדיין מאפשר זרימה של הזרקה-תערובת.
7. הזרקו את העובר דרך הקוטב האחורי מיד לאחר הייבוש, תוך שימוש בלחץ הזרקה של כ-700 ה-Pa ולחץ אחורי של כ-300 hPa.
8. נקב בעדינות את העובר והזריק בערך עשירית מנפח העובר בתערובת ההזרקה (איור 7D–F).
   הערה: למזער חדירת מחט כדי להפחית הפרעה לממברנת הוויטלין ולמנוע אובדן אופלזמה בזמן משיכת המחט.
9. העבר את הכיסוי לצלחת פטרי המצופה בנייר סינון שחור סטרילי ורטוב בעובי 90 מ"מ מיד לאחר ההזרקה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
   הערה: להשלים את כל ההזרקות בתוך שעתיים מההטלה כדי לכוון לעוברים לפני השלב הסינציציאלי.
10. בדקו עוברים לבקיעה כל 12–16 שעות. העבר את הזחלים שבקעו זה עתה ואת כיסוי הזכוכית לפלטת אגר מחוסנת ומותאמת שהוכנה כמתואר בסעיף 4.

פרמטר	חום	פיל	וול	דל	משוך
ערך	825	5	60	150	175

טבלה 2: פרמטרים של משיכת מחט. פרמטרים המשמשים ליצירת מחטי מיקרוהזרקה לקוורץ.

איור 7: מיקרוהזרקה לעובר. (א) סינון תערובת הזרקה באמצעות פילטר מזרק המקונן בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל. (ב) טעינת תערובת הזרקה מסוננת לתוך מחט מיקרו-הזרקה באמצעות קצה פיפטה עם טעינת ג'ל. (C) גאומטריה סופית של מחט מיקרו-הזרקת קוורץ. (ד) יישור המחט עם הקוטב האחורי של העובר. (ה) חדירה למשטח העובר תוך מזעור הפרעה לממברנת הוויטלין. (ו) הזרקה של כעשירית מנפח העובר ואחריה משיכת מחט. שקיפות מוגברת מצביעה על הזזת אופלזמה על ידי תערובת ההזרקה. פס קנה מידה = 400 מיקרון (D–F) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הכנת צלחת מטופלת

1. ניסוח מדיום אגר
   1. הכינו את המדיום המתואר בסעיף "חומרים לסינון וגידול אגר שחור" בטבלה 1 ואוטוקלאב למשך 15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. שפוך את האגר בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס או אחסן אותו בטמפרטורת החדר לפני חימום מחדש והזנתו לצלחות פטרי בקוטר 90 מ"מ.
      הערה: סובבו בעוצמה לפני ששופכים להחזיר חלקיקים מוצקים.
2. חיסון לוחות
   1. מדלל תרבית של 24 שעות של K12 Escherichia coli. ל-OD600 = 0.200 במרק לוריה-ברטאני ולזרוק 200 מיקרו-ליטר על פלטת אגר מקוררת ומוצקה. פזרו את התרבית באופן שווה באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר זכוכית ואפשרו לפלוחת לספוג לחות עודפת (איור 8A, B).
      הערה: השתמש בצלחות אגר בתוך חודש מהשפכה או להשליך אותן כדי להבטיח צמיחה אמינה של חיידקים וזחלים.
3. הכנת לוחות
   1. קפלו 6 × 6 ס"מ של נייר פילטר שחור ליצירת 6-10 רכסים גליים ועיקור על ידי אפייה או אוטוקלב. מניחים נייר סינון גלי סטרילי אספטי על צלחת פטרי המחוסנת והרטיבו אותה בכמה טיפות מים סטריליים (איור 8C).
   2. חטא על פני השטח את זחלי השלב הראשון מסוג טבע (WT) שלא טופלו ולא מוזרקו והעבירו 10 זחלים לנייר הסינון הלח.
      הערה: סטריליזציה של עוברי WT על ידי הטבילה ב-10% אקונומיקה (0.6% NaOCl) למשך דקה, ואז שטיפה במים סטריליים ללא יוניים למשך 2 דקות.
   3. הנח נייר סינון בקוטר 90 מ"מ בין המכסה לגוף צלחת פטרי כדי לשמש כאטם.
   4. אפשרו לזחלים של WT להכין את הלוחות ל-24 שעות לפני הוספת עוברים שהוזרקו על כיסויי זכוכית (איור 8C). הסר את זחלי ה-WT לאחר בקעת העוברים הראשונים.

איור 8: הכנת לוחות אגר והתאוששות לאחר ההזרקה. (א) חיסון לוחות אגר עם תרבית OD600 = 0.2 של Escherichia coli באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים. (ב) ספיגת לחות שטח עודפת לפני העברת העובר. (ג) הצבת אטם נייר פילטר בקוטר 90 מ"מ בין המכסה לגוף צלחת הפטרי. (ד) סקר זחלים לסמנים פלואורסצנטיים על לוחות אגר מותאמים. עוברים שהוזרקו נאספים על נייר סינון רווי מים בעובי 90 מ"מ, המונח במכסה של צלחת פטרי הפוכה ומוחזקים במשך 48 שעות לפני העברתם ללוחות סינון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Results

באמצעות פרוטוקול זה, 431 עוברים יציבים של זבובים עברו דה-קוריון והוזרק לפלסמיד תורם פיגיבק-Hsp83 ופלסמיד עזר Hsp83 בריכוז סופי של 500 ng/μL. מתוך 431 העוברים שהוזרקו, 18 זחלים חיוביים ל-ZsGreen (4.2%) ו-8 זחלים שליליים ל-ZsGreen (1.9%) בקעו 48-76 שעות לאחר ההזרקה כאשר נבדקו על פלטות אגר פחמן שחור (טבלה 3). בסך הכל, 26 מתוך 431 עוברים שהוזרקו בקעו (6.0%), ו-16 מתוך 26 זחלים שבקעו שרדו לבגרות (61.5%).

מינים	סוג ההזרקה	מבנה	# מוזרק	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	גולם ZsGreen(+)	גולם ZsGreen(-)	ZsGreen(+) מבוגרים	מבוגרים של ZsGreen(-)	# בוגרים שמייצרים צאצאי ZsGreen(+)
סטומוקסיס קלציטרנס	הכנסת טרנספוזאז	Hsp83:hy-pBac (עוזר, 500 ng/uL) hsp83: zsGreen (תורם, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
סטומוקסיס קלציטרנס	הכנסת טרנספוזאז	Hsp83:hy-pBac (עוזר, 500 ng/uL) hsp83: zsGreen (תורם, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

טבלה 3: סטטיסטיקות הזרקה. שיעורי הישרדות, טרנספורמציה והחלמה לאחר מיקרוהזרקה לעובר.

מתוך 18 הזחלים החיוביים ל-ZsGreen G0, 12 שרדו עד הגולם (66.7%) ו-10 סגורים כבוגרים. שישה מבוגרים חיוביים ל-ZsGreen (1.4% מהעוברים שהוזרקו, 60% מהשורדים הפוריים של G0) הפיקו צאצאים חיוביים ל-ZsGreen. צאצאים אלו (איור 9A–E) עברו הכלאה עצמית ושמרו על פלואורסצנציה במשך שישה דורות בזמן כתיבת שורות אלו.

מתוך שמונת הזחלים השליליים של ZsGreen, שישה שרדו עד הבגרות (75%). אף אחד מהבוגרים הלא-פלואורסצנטיים לא הפיק צאצאים פלואורסצנטיים.

איור 9: סקר פלואורסצנטי של זבובים טרנסגניים. (א) השוואה בין זחלי F1 המבטאים את ZsGreen לזחלי WT. (ב) פלואורסצנציה נראית דרך הקוטיקולה של הגולם, המאפשרת סקר טרנסגני בשלב הגולם. (C,D) השוואה בין שלושה זחלים וגולמים המבטאים את ZsGreen (משמאל) לבין שלושה זחלים וגולמים של WT (מימין) תחת אור לבן (C) ותאורת פלואורסצנציה (D). (ה) זבוב F1 בוגר טרנסגני המבטא את ZsGreen (משמאל) לעומת זבוב בוגר WT (מימין). פסי סולם = 1 מ"מ (A), 2 מ"מ (B,E) ו-3 מ"מ (C,D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

הטרנספורמציה הגנטית של מיני חרקים שאינם מודלים נותרה צוואר בקבוק מרכזי בפיתוח והערכת אסטרטגיות שליטה גנטית למזיקים ווקטורים של פרוקי רגליים.

לזבובים יציבים, הפרוטוקול המתואר כאן מפחית את הזמן, המשאבים, העבודה והשונות הקשורים להזרקה וגידול זבובי G0 לאחר הזרקת העוברים. בנוסף, השימוש בלוחות סקרינג לאגר שחור מאפשר תצפית ישירה על ההתפתחות לאורך כל מחזור החיים, ומקל על זיהוי ותיקון בעיות המתעוררות במהלך ההזרקה, ההתאוששות וגידול הזחלים. באמצעות מבני הפלסמיד שנבדקו במחקר זה, הפרוטוקול יצר קווי זבובים יציבים טרנסגניים עם פחות עוברים שהוזרקו מאשר בשיטות שדווחו קודם^{לכן 9}. למרות שזה מעבר להיקף מאמר השיטה, ניתן לבצע אישור ומיקום של אתרי הכנסת גנים טרנסגניים באמצעות גישות מבוססות כמו PCR הפוך ו-SPLINKERETTE PCR.

פרוטוקול הזרקה יעיל גם מאפשר מחקרים עתידיים בגנומיקה פונקציונלית, כולל אפיון פרומוטרים באמצעות מדווחי פלואורסצנט; מיומנות וקטורית, באמצעות ניתוחי גנטיקה הפוכה של גנים הקשורים להעברת פתוגנים; אפיון נוקלאז, כולל הערכת CRISPR-Cas9 וגרעינים מתוכנתים אחרים בזבובים יציבים; מחקר עמידות לקוטלי חרקים באמצעות שינוי אללים עמידות מועמדים; וחקירות ביולוגיה בסיסית, כולל גנים המעורבים בהזלה בדם, הזדווגות והתפתחות. הפרוטוקול שלנו גם מבטל את הצורך בהזרקות עוברים טבולות בשמן ובחדרי לחות מחומצנים להחלמה לאחר ההזרקה, כפי שתועד בספרות הטרנספורמציה הקודמת של Musca domestic ו-Lucilia cuprina piggyBac ^16,17.

מספר פרמטרים הם קריטיים להצלחת הטרנסגנזה. ייבוש עוברים ותזמון ההזרקה חשובים במיוחד כי יש להכניס DNA פלסמיד לפני התאית כדי להבטיח שילובו בתאי קדם-נבט. עם זאת, התזמון המדויק של היווצרות הסינציטיום בעוברים יציבים של זבובים נותר לא ידוע. בנוסף, קצב ההתפתחות העוברי מושפע מהטמפרטורה, וציר הזמן ההתפתחותי של עוברים יציבים של זבובים בתנאי סביבה שונים לא אופיין במלואו. מחקר עתידי על קצבי ההתפתחות והעוברים של זני מעבדה יציבים עשוי לספק תובנות לאופטימיזציה של פרוטוקולי מיקרוהזרקה וטרנספורמציה, ובכך להגדיל עוד יותר את היעילות ואת שחזור הפרוטוקול. עם זאת, עד אז, קביעת חלון ההזרקה האופטימלי נותרת מגבלה מתודולוגית שעלולה להשפיע על יעילות הטרנספורמציה. כאשר שיעורי ההישרדות נמוכים, ניתן לבצע פתרון תקלות על ידי השוואת שיעורי ההישרדות של הבקיעה והבוגר בקרב עוברים לא מטופלים, עוברים עם דקוריוניות, עוברים שהוזרקו ב-PBS מעוקר בפילטר, ועוברי WT שגודלו על לוחות אגר. ספרות קודמת שתיארה את הטרנספורמציה של מוסקה הביתית הניבה 14 אירועי אינטגרציה מתוך 1,668 הזרקות (0.84% מההזרקות)¹⁶, והטרנספורמציה של מזיק הכבשים Lucilia cuprina יצרה 3 קווים טרנסגניים מתוך כ-900 הזרקות עובר (0.33% מהזריקות)¹⁷, מה שמרמז כי פרוטוקול הטרנספורמציה היציב לזבוב המתואר בפרוטוקול זה (6 אירועי אינטגרציה ב-431 הזרקות, 1.4% מההזרקות) משפר את יעילות ההזרקה בהשוואה למינים אחרים של מזיקים בספרות.

הפרומוטר המרכיב היציב hsp83 זבוב סיפק ביטוי חזק של ZsGreen לאורך כל ההתפתחות ותמך בביטוי הטרנספוזאז ההיפראקטיבי של פיגיבק במהלך העובר המוקדם, ובכך שיפר את נראות הסמנים הפלואורסצנטיים ואת יעילות הטרנספורמציה בהשוואה לפרוטוקול טרנספורמציה יציב^{שדווח קודם לכן}. הפלסמיד העזר ששימש במחקר זה נוצר על ידי תת-שיבוט של 3.1 קילובייט DNA גנומי מיד במעלה הזרם של קודון ההתחלה hsp83 לווקטור פלסמיד מינימלי במעלה רצף הקידוד ההיפראקטיבי של פיגיבק טרנספוזאז. יחס הפלסמיד בין עוזר למטען נקבע אמפירית ביחס של 1:1 לפי מסה ושימש לאורך כל המחקר. למרות שלא הוערכו יחסי פלסמידים נוספים, ייתכן שגם יחסים חלופיים יהיו יעילים.

השיפורים המתוארים כאן עשויים להיות רלוונטיים לפרוטוקולי טרנסגנזה עבור פרוקי רגליים אחרים. בנוסף, מערכת הסינון וההגדלה המבוססת על אגר מיושמת כיום על הזרקת עוברים ובדיקות סינון לעובר זבוב חייל שחור (Hermetia illucens). הפרוטוקול עשוי להיות שימושי במיוחד למאמצי טרנסגנזה בזבובי שרירים אחרים, כולל Musca domestica ו-Haematobia irritans, בשל האקולוגיה הדומה של הזחלים וההתפתחות שלהם בתת-קרקעים סיביים מתפרקים. השימוש בלוחות אגר מחונים ב-Escherichia coli עשוי לספק גישה מעשית למעקב לאחר ההזרקה תוך מתן אפשרות לחוקרים להעריך התפתחות עוברית, מורפולוגיית הזחלים, ביטוי הסמן, קצב הבקיעה וההחלמה הכוללת. התאמת הרכיב החיידקי בתווך לביולוגיה של המין המטרה עשויה להעצים עוד יותר את התועלת של גישה זו לפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי טרנסגנזה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	תא ייבוש
Bacto Agar	Difco	281230	אגר לצלחות אגר שחורות
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	בד כותנה שחור לאספני ביצים ואטם בד למיכלי גידול זחלים
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	חומר מייבש לתא ייבוש
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	מדיום זחלים בכמויות גדולות
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	מיקרוסקופ הזרקה
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	מקור תזונתי לצלחות אגר שחורות
E. coli	New England Biolabs	C2987H	חיידקים המשמשים בצלחות אגר שחורות
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	מקור לחץ להזרקה מיקרוסקופית
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	העברת עוברים
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	נימים לשליפת מחטים
Forceps	Fine Science tools	11251-20	טיפול בדגימות
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	מחזיק עוברים במהלך הסרת הקליפה
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	תמיסת הלבנה להסרת הקליפה
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	מיכל מדיום זחלים בכמויות גדולות
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	איסוף עוברים
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	תרביות LB עבור חיידקי E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	מיקרוסקופ להזזה ויישור עוברים
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	משמש לטעינת תערובת ההזרקה לתוך המחטים
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	מניפולטור מיקרוסקופי להזרקה
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	משמש לסינון תערובת ההזרקה
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	מאגר הזרקה
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	פיגמנט לצלחות אגר שחורות
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	מכשיר לשליפת מחטים מנימים
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	מאגר הזרקה
Petri plates	VWR	391-0609	צלחות פטרי לאגר צלחות ביצים שחורות
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	צבע להזרקה
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	פקק תא ייבוש
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	מדיום זחלים בכמויות גדולות
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	זכוכית כיסוי למיקרו-הזרקה
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	מנורה פלורסנטית ומסננים להקרנת זחלים
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	פיזור חיידקים על צלחות
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	שטיפת עוברים במהלך הסרת הקליפה
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	הסרת קליפה מעוברים
Wash bottle	Safetyware	Z423335	שטיפת עוברים ממשטחים