מחקר זה משלב טכניקות התנהגותיות וטכניקות דימות לצורך הערכה רב-מודאלית ואורכית של עכברים עם אוסטאוארתריטיס לאחר טיפול באלקטרו-אקופונקטורה, כולל צביעת סחוס ודירוג לפי מדדי ה-Osteoarthritis Research Society International (OARSI).
מאמר שיטה
הערכה רב-מודאלית של טיפול באלקטרו-אקופונקטורה לדלקת מפרקים בברך בעכברים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
דלקת מפרקים ניוונית (Osteoarthritis) היא מחלה דגנרטיבית כרונית של המפרקים הפוגעת בדרך כלל בברך וגורמת לכאב, נפיחות, נוקשות ומגבלה תפקודית. דלקת סינוביאלית ושינויים בשרירים הפרי-ארטיקולריים תורמים להתחלה ולהתקדמות של המחלה. ראיות קליניות מצביעות על כך שאלקטרו-אקופונקטורה עשויה להקל על דלקת מקומית ולולת מטבוליזם של הסחוס. במחקר זה, הושרה מצב של דלקת מפרקים ניוונית בברך של עכברים באמצעות דסטביליזציה כירורגית של המניסקוס המדיאלי. התוצאות הוערכו באמצעות פרוטוקול רב-מודאלי הכולל את מבחן ה-rotarod, אולטרסאונד, תרמוגרפיה באינפרא-אדום, דימות תהודה מגנטית (MRI) וצביעה היסטולוגית. נפח חלל המפרק וטמפרטורת העור נוטרו לאורך זמן, ודימות תהודה מגנטית בנקודת הסיום וצביעת Safranin O-Fast Green שימשו להערכת שינויים באות השרירים הפרי-ארטיקולריים ופתולוגיה של הסחוס. אלקטרו-אקופונקטורה הייתה קשורה לשיפור בביצועים מוטוריים, הפחתה בנפיחות המפרק, טמפרטורת עור מקומית גבוהה יותר, שינויים פחות בולטים באות השרירים הפרי-ארטיקולריים בדימויי תהודה מגנטית וציונים נמוכים יותר של דגנרציה של הסחוס. ממצאים אלה תומכים בשימוש בפרוטוקול רב-מודאלי זה להערכת תוצאות הקשורות לאלקטרו-אקופונקטורה במודל פרה-קליני של עכברים.
מבוא
דלקת מפרקים של הברך (KOA) היא המחלה האוסטאו-ארטיקולרית השכיחה ביותר בעולם, והיא משפיעה על כ-250 מיליון בני אדם1. סימניה הפתולוגיים כוללים דגנרציה הדרגתית של הסחוס ופרוליפרציה סינוביאלית, ובמישור הקליני היא מתבטאת בכאב, נפיחות ופגיעה תפקודית2,3.
דלקת מפרקים ניוונית (Osteoarthritis - OA) נחשבה במשך זמן רב להפרעה מפרקית שאינה דלקתית, אך כיום מוכר כי יש לה מרכיב דלקתי, כאשר סינוביטיס (דלקת קרומי המפרק) ניתנת לזיהוי ברוב המטופלים. ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון interleukin (IL)-1β ו-IL-18, יחד עם מיני חמצן רבטיביים ומאמץ ביומכני, נחשבים כגורמים התורמים לתהליך הפתולוגי4. דלקת מלווה לעיתים קרובות בزيادة בזרימה הדמית המקומית, המתבטאת קלינית כאדמומיות, חום ונפיחות5. מעבר להאצת פירוק הסחוס והירידה התפקודית, הדלקת עשויה להיות פעילה במיוחד בשלבים המוקדמים של המחלה. לפיכך, ניטור המצב הדלקתי לאורך זמן עשוי להכዊב אסטרטגיות טיפול המכוונות למכניזם הבסיסי ולאפשר ניהול מותאם לשלב המחלה6,7. מחקרים קודמים שהשתמשו בסריקת אולטרסאונד (US) בברכי עכברים זיהו אזור משולש בין הקונדילים של השוק והירך. ניתוח היסטולוגי אישר כי אזור זה מכיל רקמות רכות, כולל הסינוביום, המניסקוס וכרית השומן, וכן חללים מלאים בנוזל סינוביאלי. אזור זה, המזוהה באולטרסאונד, מוגדר כנפח הבין-מפרקי (interarticular volume), המקיף את אזורי הרקמות הרכות שהוזכרו לעיל8.
יתר על כן, טמפרטורה היא פרמטר פיזי מרכזי המשקף באופן ישיר את התקדמות הדלקת במפרקים. טמפרטורה מקומית מוגברת היא אחד מארבעת הסימנים הקלאסיים של דלקת, והדמיה תרמוגרפית מאפשרת זיהוי וכמתור מדויקים של שינויים תרמיים אלו9. סקירה שיטתית שנערכה לאחרונה הדגישה את המתאם בין טמפרטורת פני השטח של העור לבין מחלות מפרקים דלקתיות וניווניות כאחד10, ובכך ביססה עוד יותר את התועלת של תרמוגרפיה באינפרה-אדום (IRT) במחקר על דלקות מפרקים ובניהול קליני11. יתרה מכך, IRT מספקת מדד עקיף הקשור לפרפוזיה של רקמות ולפעילות מטבולית, ועשויה להיות שימושית לניטור תגובות טיפוליות.
במחקר זה, שילבנו את מבחן ה-rotarod, US, IRT והדמיית תהודה מגנטית (MRI) כדי להעריך את ההשפעות של דיקור חשמלי (EA) במודל עכברים של OA. גישה רב-מודאלית זו אפשרה הערכה סימולטנית של ביצועים מוטוריים, מורפולוגיה של המפרק, שינויים תרמיים ודלקת ברקמות רכות, מדדים שאינם זמינים באמצעות היסטולוגיה בלבד. חשוב לציין, כי הפאנל מספק מידע משלים על פני רמות ביולוגיות מרובות בעלות עלות או עבודה מינימלית. לפיכך, הוא מתאים במיוחד למחקרי קדם-קליניים הדורשים ניטור חוזר ולא פולשני לאורך זמן, במיוחד כאשר ההתערבות הנבדקת צפויה להניב השפעות מתונות בלבד או כאשר הפרופיל הזמני של התגובה אינו ודאי. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון המשתמש בשילוב ספציפי זה של טכניקות, המקיף את נפח חלל המפרק, דלקת שרירים וטמפרטורה מקומית, כדי לעקוב אחר התגובה הטיפולית לדיקור חשמלי ב-OA. הפרוטוקול שתיארנו הוא מעשי וניתן לשחזור, ואנו מאמינים שהוא עשוי לשמש כנקודת ייחוס מועילה להערכות יעילות אורכיות ובזמן אמת במסגרות ניסיוניות דומות.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסויים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים במעבדה של חברת .Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd (מספר אישור אתי: WTPZ20260209001). כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו עכברים מסוג C57BL/6 בני 8 שבועות, שמשקלם היה כ-20 גרם, אשר נרכשו מספק מסחרי (ראו את ה- טבלת חומריםהניסוי כלל 24 עכברים. לאחר תקופת אקלמיזציה של שבוע אחד, הוקצו בעלי החיים באופן אקראי, כאשר שישה עכברים שובצו לכל אחד מארבעת התנאים הניסויים. תנאים אלו כללו ניתוח דמה (sham surgery), דסטביליזציה של המניסקוס המדיאלי (DMM), דיקור דמה (SA) ואלקטרו-אקופונקטורה (EA). מספר בעלי החיים שנעשה בהם שימוש נקבע ללא חישוב מוקדם של גודל המדגם; תחת זאת, גודל הקבוצה נבחר בהתבסס על מחקרי אלקטרו-אקופונקטורה קודמים שהשתמשו במודלים של אוסטאוארתריטיס ובנקודות סיום דומות, ובהתאם לעיקרון ה-3Rs.
1. טיפול טרום-ניתוחי ומודלינג
הערה: טכנאי ניתוח מנוסה ביצע את כל הליכי המידול. החזירו את בעלי החיים לכלובים רק לאחר שהם מחזירים לעצמם את ההכרה על גבי פד מחומם.
- הסגילו את העכברים לסביבת הניסוי למשך 7 ימים לפחות לפני תחילת הניסוי.
- סטריליזו את כל כלי הניתוח לפני הניתוח. חטאו ביסודיות את אזור הניתוח.
- הפעילו את ציוד הרדמת הגז. הניחו את העכבר בתא ההשראההשריעו הרדמה כללית עם 2–3% isoflurane למשך 5 min.
- לאחר השלמת השראת ההרדמה, העבירו את העכבר לשולחן הניתוחים. שמרו על ההרדמה על ידי מתן רציפה של 1–1.5% isoflurane באמצעות מסכת הרדמה עד לסיום הפרוצדורה הכירורגית.
- מקמו את העכבר בתנוחה גבנית (supine) כאשר מפרק הברך פונה כלפי מעלה. ודאו שהתנוחה יציבה ושהאתר הכירורגי חשוף לחלוטין. השתמשו ב-DMM כדי ליצור מודל בגפה האחורית הימנית12. עבור קבוצת ה-Sham, בצעו חתך באותו מיקום ולאחר מכן תפרו אותו.
- תהליך הניתוח של DMM
- בצעו חתך אורכי מדיאלי פארא-פטלארי (parapatellar) באורך 1 cm כדי לחשוף את מפרק הברך.
- דרך החתך המדיאלי הפארא-פטלארי שבוצע בשלב 1.5.1.1, בצעו פתיחה אורכית של קפסולת המפרק. השתמשו בפינצטה כדי להפריד את הקפסולה מספיק מהרקמה שמסביב. לאחר מכן, תמכו את כף הרגל האחורית הדיסטלית ביד שמאל ללא הפעלת לחץ מוגבר והשתמשו בפינצטה כדי להזיז את הפיקה (patella) ואת הרצועה הפטלארית לצד (לטרלית), ובכך לחשוף את מפרק הברך. טיפלו בכף הרגל בזהירות לאורך פרוצדורה זו כדי למנוע פגיעה.
הערה: שחרור הולם של קפסולת המפרק מאפשר להזיז את הפיקה בכוח מינימלי. - טפטפו סליין סטרילי על פני הסחוס המפרקי במהלך הניתוח כדי למנוע התייבשות.
- אתרו את המניסקוס המדיאלי בחלל שבין הקונדיל הפמורלי המדיאלי לבין הפלטו הטיביאלי המדיאלי. מההיבט הלטרלי שלו, עקבו אחר הרצועה המניסקו-טיביאלית המדיאלית עד לנקודת חיבורה בבליטה האינטרקונדילרית של הטיביה. ייצבו את כף הרגל האחורית בעדינות ביד וכרתו את הרצועה באמצעות להב כירורגי מס' 10, תוך זהירות לא לבוא במגע עם הסחוס שמתחת למניסקוס המדיאלי. הערה: ודאו שהסחוס המפרקי ורצועות אחרות אינם נפגעים. במקרים רבים, יש להזיז את כרית השומן העליונה אך לא להסירה כדי לזהות את הרצועה.
- קרבו את קצוות קפסולת מפרק הברך ואבטחו אותם באמצעות חומר תפירה נספג 6-0.
- סגרו את העור בתפירת משי 6-012.
- תהליך הניתוח של DMM
- לטיפול לאחר הניתוח, טפטפו טיפה אחת של 0.25% bupivacaine לאתר הכירורגי לאנסטזיה מקומית, ושמרו על העכברים עם גישה חופשית (ad libitum) למזון ומים.
הערה: במהלך ההרדמה, שמרו על קצב זרימת החמצן בטווח של 0.5–1 NL/min. הרדמה מוצלחת אושרה על ידי אובדן רפלקס הזקיפה, היעדר תגובות נסיגה ללחיצה על הבהונות ונשימה יציבה וסדירה. לאורך הניתוח, השתמשו בבסליין סטרילי עם בופר פוספט (PBS) כתמיסת שטיפה לשמירה על הידרטציה של הסחוס. הגדלים והמפרטים הספציפיים של התפירה הנספגת לסגירת קפסולת המפרק ותפירת המשי לסגירת העור מפורטים בטבלת החומרים.
2. טיפול באלקטרו-אקופונקטורה
הערה: ההתערבויות בקבוצות ה-SA וה-EA החלו שבוע לאחר ביסוס המודל (איור 1A). שתי הקבוצות קיבלו טיפול מדי יום שני, שלוש פעמים בשבוע, למשך 15 דקות למפגש לאורך 4 שבועות. קבוצות ה-Sham וה-DMM עברו את אותם הליכי הרדמה וקיבוע באותו לוח זמנים, ללא החדרת מחטים או גרייה חשמלית. כל המפעילים עברו הכשרה לפני הניסוי כדי להבטיח עקביות בבחירת נקודות הדיקור, בזווית ההחדרה ובבעומק.
- הניחו את העכברים בתא ההשראה והוציאו אותם לאחר השראת הרדמה באמצעות isoflurane.
- שמרו את העכברים במנח גב (supine) תחת הרדמה שאיפתית רציפה עם isoflurane (1.5–2.0% ב-100% O₂) לאורך כל סשן האלקטרו-אקופונקטורה כדי להבטיח מצב שקט ויציב.
- אתרו במדויק את נקודות הדיקור בעכברים. הכניסו שתי מחטים סטריליות חד-פעמיות (0.16 mm × 25 mm) לתוך נקודות הדיקור ST36 (Zusanli) ו-SP10 (Xuehai) בגפיים התחתונות לעומק עור של 5 mm13 (איור 1B).
הערה: ST36 ממוקמת 1 mm לטרלית (צדית) מהבליטה הקדמית של הטיביה (tibia), 3 mm מתחת לראש הפיבולה (fibula), ובאופן ישיר מתחת למפרק הברך. SP10 ממוקמת בירך המדיאלית, 3 mm מעל השוליים העליונים-מדיאליים של הפיקה (patella) בבליטה המדיאלית של שריר הקוואדריספס (quadriceps) כאשר הברך כפופה.- בקבוצת ה-SA, הכניסו את המחטים באופן שטחי, לעומק של כ-1 mm, לאזורים סמוכים שאינם נקודות דיקור במקום ST36 או SP10, וחברו אותן למכשיר ה-EA ללא העברת זרם14.
הערה: לפיכך, קבוצת ה-SA שונה מקבוצת ה-EA במיקום המחטים, בעומק ההחדרה ובהיעדר גירוי חשמלי, אך היא תואמת בכל שאר הפרמטרים הפרוצדורליים. בהשוואה לקבוצת ה-DMM, קבוצת ה-SA מקבלת דיקור שטחי בנקודות שאינן נקודות דיקור וחיבור למכשיר ללא זרם, בעוד שקבוצת ה-DMM מקבלת הרדמה וקיבוע בלבד.
- בקבוצת ה-SA, הכניסו את המחטים באופן שטחי, לעומק של כ-1 mm, לאזורים סמוכים שאינם נקודות דיקור במקום ST36 או SP10, וחברו אותן למכשיר ה-EA ללא העברת זרם14.
- חברו את המחטים למכשיר האקופונקטורה האלקטרוני והפעילו גירוי ב-2/100 Hz ו-2 mA כדי ליצור רעידות שרירים עדינות. התחילו את גירוי ה-EA למשך 15 min, 3 פעמים בשבוע, החל מ-7 ימים לאחר יצירת המודל, והמשיכו למשך 4 שבועות.
- לאחר הטיפול, הניחו את העכבר על משטח חימום והחזירו אותו לכלובו לאחר שהתעורר.
3. הערכה דינמית של יעילות ה-EA
הערה: כל ההערכות (מבחן rotarod, US, IRT, MRI ומדידת OARSI) בוצעו על ידי חוקרים שהיו עיוורים להקצאת הקבוצות, כאשר זהות הקבוצות נשמרה בסוד עד להשלמת כל ניתוחי הנתונים. רכישת הדימות וניתוח הנתונים בוצעו על ידי אנשים נפרדים, וההערכה ההיסטולוגית בוצעה באופן עצמאי על ידי שני פתולוגים שהיו עיוורים לקבוצות הטיפול. אף אחד מהמעריכים לא השתתף בשיבוץ בעלי החיים או בהתערבות האלקטרו-אקופונקטורה.
- בדיקת עייפות ברוטארוד (Rotarod)
- יש להעביר את העכברים אימון מקדים כדי להכיר להם את המערך הניסויי לפני הבדיקה הרשמית.
- במהלך הבדיקה הפורמלית, הניחו כל עכבר באופן פרטני על ה-rotarod, אשר מאיץ בקצב של 4 סיבובים לדקה עד לנפילת העכבר.
- יש להקליט באופן מיידי את משך הזמן שכל עכבר נשאר על המוט. יש להמתין לרווח של 30 דקות בין ניסויים עבור כל עכבר, ולחשב את הערך הממוצע משלושה ניסויים חוזרים.
הערה: השתמשו במבחן ה-rotarod כדי להעריך קואורדינציה מוטורית לפני ביסוס מודל ה-OA ולאחר השלמת הטיפול ב-EA. כדי למזער כאבים לאחר ניתוח, הפחיתו את איסוף הנתונים במבחן ה-rotarod במהלך השבוע הראשון לאחר הניתוח.
- בדיקת US בבעלי חיים קטנים
הערה: הפרוטוקול המפורט לביצוע דימות באולטרסאונד ותחימה של חלל המפרק מוצג ב- איור 2.- לפני רכישת נתונים פורמלית, הנח את העכבר בתא הרדמה עד לאובדן תפקוד מוטורי, ולאחר מכן השתמש בקרם להסרת שיער כדי להסיר את הפרווה ממפרק הברך הימנית. בעת הסרת פרווה מהעכבר, פעל בעדינות רבה ככל האפשר; נגב בעדינות בעזרת מים חמימים כדי למזער את הגירוי עבור העכבר.
הערה: שמרו על סמיות במהלך האנליזה על ידי הצגת קודי בעלי החיים ונקודות הזמן בלבד, עד להשלמת כל מדידות הנפח וחשיפת המידע על הקבוצות לצורך אנליזה סטטיסטית. - הפעילו את מערכת האולטרסאונד, התקינו את המתמר לאולטרסאונד לבעלי חיים קטנים, והגדירו את פרוטוקול הבדיקה המתאים לעכבר. במקביל, הניחו את העכבר בכלוב להרדמה רציפה.
- לאחר השלמת ההרדמה, העבירו את העכבר לפלטפורמת הבקרה והנחילו הרדמה בשאיפה באמצעות איזופלוראן (isoflurane) דרך מסכת אף. מקמו את העכבר כך שראשו יפנה הרחק מהמבצע וזנארו יפנה לעברו.
- כופפו את מפרק הברך, קבעו את העכבר ומריחו חומר צימוד אולטרסאונד (US coupling agent) על העור מעל הרצועה הפטלארית.
- כוון את המ probes ומיקם אותו כך שיהיה מקביל למפרק הברך.
- הגדר את ה- מרחק סריקה אל 4 מ"מ ו-ה גודל צעד אל 0.04 מ"מאתר את חלל המפרק בתמונה על סמך מיקומו האנטומי. אין להזיז את בעל החיים במהלך סריקת המתמצץ (probe).
- רכשו תמונות. זהו את חלל המפרק: אזור משולש עם גבולות ברורים בין הפמור, הטיביה, והעור והשרירים העל-בנאיים.
- שמרו ותנו שם לתוצאות הסריקה, ולאחר מכן ייצאו אותן למחשב הניתוח תוך שמירה על מבנה התיקיות המקורי.
- נתחו את נפח חלל מפרק הברך באמצעות תוכנה. הזינו את ה- מחקר מודול, ולחץ על ה- ייבוא תפקוד
- דפדפו ובחרו את תיקיית הנתונים, בדקו את קבצי הנתונים המיועדים לייבוא, ולחצו לחיצה כפולה כדי לפתוח אותם.
- ב- תצוגה מצב, בחירה עיבוד תמונה | טעינה לתלת-ממד | מבט בחתך רוחבי | מדידת נפח | התחלה בסדר עוקב.
- השתמשו בגלגלת העכבר או במכוון הפרוסות (slice slider) כדי לדפדף בין הפרוסות מהחלק הפרוקסימלי לדיסטלי, ואתרו את הפרוסה שבה חלל המפרק מופיע לראשונה (בדרך כלל הוא נראה כאזור משולש עם גבולות ברורים בין הפמור, הטיביה ורקמת העור והשריר העוטפת).
- התחילו בשרטוט בחתך שבו חלל המפרק מופיע לראשונה. לחצו לחיצה שמאלית כדי להתחיל בשרטוט המתאר.
- עקבו לאורך קצה חלל המפרק נקודה אחר נקודה כדי לצייר קו סביב (contour) סגור, עד שחלל המפרק ייעלם לחלוטין.
- לחץ סיום; המערכת תייצר נפח מסוגמנט (segmented volume) בתלת-ממד ותפיק את תוצאות מדידת הנפח.
- בחר את סוג הקובץ הרצוי כדי לייצא את התמונה כקובץ אזור תמונה בפורמט TIFF (.tif).
- לפני רכישת נתונים פורמלית, הנח את העכבר בתא הרדמה עד לאובדן תפקוד מוטורי, ולאחר מכן השתמש בקרם להסרת שיער כדי להסיר את הפרווה ממפרק הברך הימנית. בעת הסרת פרווה מהעכבר, פעל בעדינות רבה ככל האפשר; נגב בעדינות בעזרת מים חמימים כדי למזער את הגירוי עבור העכבר.
- תרמוגרפיה באינפרא-אדום לבעלי חיים קטנים
הערה: המדידות נלקחו יום אחד לפני הניתוח, 7 ימים לאחר הניתוח ובסיום הטיפול בעכברים עם OA. בצע IRT 6 שעות לאחר הטיפול בחדר בטמפרטורה מבוקרת (22–24 °C), כאשר העכברים עברו אקלימיזציה למשך 30 דקות לפני הדימות.- הנח את החיה במצב שכיב על הגב (supine) כאשר הגפיים האחוריות פשוטות, והדבק את כל הגפיים לספסל העבודה באמצעות סרט דבק כדי להבטיח חשיפה עקבית של הברך. הנח את העכבר בתא השראה ומתן isoflurane באופן רציף עד להשגת הרדמה מלאה.
- קבע את העכבר המורדם במנח גב (supine) על שולחן הניתוח ושמור על טמפרטורת סביבה קבועה.
- אחזו בעדינות בגפה האחורית של העכבר כדי ליישר את מפרק הברך הימני, ולאחר מכן השתמשו במדחום תרמי אינפרא-אדום כדי לצלם תמונות ולמדוד טמפרטורות באזור.
- השתמשו במקדמי פליטה (emissivity) ברירת המחדל של העור (0.98). רכשו תמונות 3 דקות לאחר הרדמה עמוקה. הגדירו את אזור העניין (ROI) של הברך כקו המפרק המדיאלי במפגש בין הפמור לטיביה (femoral‑tibial articulation), ואת אזור העניין של הקרסול כהצד הדורסלי של המפרק הטיביאלי-טאלרי (tibiotalar joint). תגדירו ידנית את כל אזורי העניין על ידי מפעיל מיומן אחד, בהסתמך על נקודות ייחוס אלה.
- נתחו את התמונות באמצעות התוכנה הנלווית למכשיר כדי לקרוא נתוני טמפרטורה ממפרק הברך ומהעור שסביבו, וקבעו נקודות בקרה למדידה במפרקי הקרסול והברך, במקומות שבהם מדרגי הטמפרטורה פוחתים.
- MRI של בעלי חיים קטנים
הערה: לאחר טיפול ב-EA, נעשה שימוש ב-MRI לבעלי חיים קטנים כדי להעריך דלקת מקומית במפרקי הברך של עכברים בכל קבוצה.- הנח את העכבר בתיבת הרדמה לצורך הרדמה. לאחר אובדן התפקוד המוטורי, מרח קרם להסרת שיער על שני מפרקי הברכיים.
- לאחר דקה אחת, נגבו את קרם הסרת השיער בעזרת גזה טבולה במים חמימים כדי להשלים את הסרת השיער משני מפרקי הברכיים.
הערה: יש לוודא כי הוסר מרב פרוותו של העכבר, ולבצע את האיסוף תחת הרדמה. - הגדירו את הפרוטוקול המתאים באמצעות גאנטרי (gantry) המותאם לעכבר.
- ודאו כי מכשיר המיקום משתמש ברצף הד הדליק (fast gradient echo sequence) בשלושה מישורים (TR/TE = 50/3 מילי-שניות, שדה ראייה (FOV) = 30 × 30 מ"מ, עובי פרוסה 1 מ"מ) כדי למרכז את מפרק הברך בתמונה; השתמשו ברצף fast spin echo המשוקלל ל-T2 (T2WI) לסריקת מפרק הברך של העכבר.
- השתמש בפרמטרי הסריקה הבאים: זמן חזרה (TR) של 2,500 מילי-שניות, זמן הד (TE) של 8 מילי-שניות, שדה ראייה (FOV) של 20 × 20 מ"מ, מטריצה של 256 × 256, עובי חתך של 0.5 מ"מ, ללא מרווח בין החתכים, ו-10 חתכים רצופים המכסים את האזור מהקונדילה הפמורלית (femoral condyle) עד לרמה הטיביאלית (tibial plateau); משך סריקה בודדת צפוי להיות כ-8 דקות ו-20 שניות.
- בדוק את תמונות ה-T2-weighted שהתקבלו כדי לבחון שינויים מורפולוגיים בסחוס הברך, בסינוביום, בחלל המפרק וברקמות הרכות שסביבו, ו- הערכה נזילת מפרק, עיבוי סינוביאלי ודלקת מקומית.
- הניחו את העכבר על המסגרת (gantry), השריו אותו באמצעות הרדמה בשאיפה של isoflurane דרך מסכה, וקבעו את הגפיים באמצעות סרט דביק רפואי כדי להבטיח מיקום עקבי של הברכיים כלפי מעלה.
- החליקו את הגנטרי לתוך סורק ה-MRI לצורך הדמיה.
- במיקום המקדים בשלושת המישורים (three-plane localizer), ודאו כי המרווח של מפרק הברך מקביל למישור הקורונלי, שמרכז השכבה (slab) מיושר עם המרווח של המפרך, וכי לולאות מעי או חללי אוויר אינם נמצאים בתוך שדה הראייה (FOV) כדי למנוע ארטיפקטים של רגישות (susceptibility artifacts); אם המיקום אינו מדויק, בצעו מיקום מחדש וסריקה חוזרת.
- ייצאו את תמונות ה-T2-weighted הרב-הד (multi-echo) שהושגו בפורמט DICOM או NIfTI לצורך הערכה איכותית.
- העריכו את תמונות ה-MR באמצעות בחינה חזותית של עוצמת האות והפיזור של אזורים היפראינטנסיביים בתוך מפרק הברך והרקמות הרכות הפרי-מפרקיות, והשוו את אותות הדלקת בין הקבוצות על בסיס תמונות מיוצאות אלו.
4. תצפיות פתולוגיות ומורפולוגיות
- קיבוע וחיתוך של ברכי עכברים
- קבע את שתי דגימות הברך מעכברים ב-10% פראפורמאלדהיד למשך 48 שעות. לאחר מכן, טבול את הדגימות בתמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS) למשך 30 דקות ושטוף.
- לאחר ספיגת העודפי הלחות, העבירו מיד את הדגימות לתמיסת דקאלציפיקציה (pH 7.2–7.4) שהוכנה מראש, והחליפו את התמיסה בכל 3 ימים;
- המשך את תהליך הדקלקציה למשך שבועיים, שטוף את הדגימות תחת זרימת מים, ולאחר מכן טבול אותן באתנול 75% למשך שעתיים.
- בצעו ייבוש במדרגות ריכוז אוטומטיות במכשיר לעיבוד רקמות למשך 18 שעות.
- לאחר דהידרציה, טבול את הדגימה בשעוות פרהפין שחוממה מראש למשך שעתיים במכשיר להטמעה בפרהפין, ולאחר מכן המשך בתהליך ההטמעה;
- במהלך הטמיעה הסגיטלית של מפרק הברך, מקמו את פני השטח המדיאליים של המפרק כלפי מטה, כך שפני שטח אלו ייחתכו ראשונים.
- הצמד את בלוק הרקמה למיקרוטום ובצע חיתוך רציף ב- 4 µmלאחר הגעה להפרדה במרכז המניסקוס, אספו 21 חתכים רצופים.
- פרסו את החתכים על פני משטח לפיזור חתכים. השתמשו בפינצטה כדי להפריד בין הדגימות על פני המים ואספו אותן באמצעות זכוכיות כיסוי, כך שייאספו שתי דגימות לכל זכוכית כיסוי;
- הניחו את השקופיות באופן שטוח במייבש שקופיות למשך יותר משעה אחת כדי להבטיח אידוי מלא של הלחות. הניחו את השקופיות בתיבת דגימות ובצעו הסרת שעווה (dewaxing) בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 8 שעות. שמרו בצד לשימוש מאוחר יותר.
הערה: יש לאסוף את כל מקבע הפאראפורמאלדהיד, תמיסות דה-קלציפיקציה ושטיפות האתנול כפסולת מסוכנת ולהשליכן בהתאם להנחיות המוסדיות.
- צביעת Safranin O-Fast Green
- הניחו חתכים לא צבועים על מתקן צביעה וחממו אותם בתנור למשך 5 דקות. במהלך זמן זה, הכינו את תמיסת הצביעה במCסת מנדף (fume hood).
- המתינו עד שהחתכים יגיעו לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו הסרת שעווה שגרתית עד למעבר למים.
- העבירו את החתכים לקופסה רטובה וצבעו בתמיסת Weigert טרייה (חלק א' + חלק ב') למשך 5 דקות.
- שטוף במים 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם.
- בצעו דיפרנציאציה באמצעות חומצה כלורידית 1% באתנול למשך 15 שניות, ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים למשך 10 דקות.
- צבע באמצעות תמיסת Fast Green למשך 4 דקות ו-55 שניות.
- שטפו במהירות את החתכים בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 10-15 שניות כדי להסיר שאריות של Fast Green, ולאחר מכן ייבשו באוויר.
- טבילה בספראנין צבע ב-O למשך 4 דקות ו-35 שניות.
- בצעו דהידרציה מהירה של החתכים באמצעות אתנול 95% למשך 3–5 שניות, ולאחר מכן שטפו באתנול מוחלט פעמיים למשך דקה אחת בכל פעם.
- בצעו שקיפות באמצעות קסילן (xylene), השתמשו בשרף ניטרלי להרכבה, והניחו במנדף במשך 4 שעות לאידוי הקסילן.
- בצע תצפית מקדימה וסריקה של הסשן באמצעות סורק שקופיות שלמות (whole-slide scanner).
הערה: קסילן, אלכוהול-חומצה, חומצה אצטית, פראפורמאלדהיד והתמיסות לצביעה שנעשה בהן שימוש במחקר זה, כולל תמיסת Weigert, Fast Green ו-Safranin O, הם חומרים מסוכנים. יש לבצע את כל הפעולות במנדף תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, הכולל כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. יש להפריד פסולת מסוכנת, כולל ריאגנטים ושטיפות משומשים, כאשר יש להפריד את פסולת הקסילן מהפסולת המימית, לאסוף אותה במכלים ייעודיים ולהשליכה בהתאם לתקנות המוסדיות.
5. ניתוח סטטיסטי
- דווח על נתונים רציפים כממוצע ± סטיית תקן (SD) אלא אם צוין אחרת; ציוני OARSI מדווחים כחציון (P25, P75).
- עבור תוצאים שדווחו כממוצע ± SD, בצעו השוואות בין קבוצות מרובות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחני Tukey post hoc. ציוני OARSI נותחו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ולאחריו פוסט הוק (post hoc) בדיקות באמצעות מבחן Mann-Whitney חד-צדדי להשוואות זוגיות בין שתי הקבוצות15.
- שקול P ערכים < 0.05 מובהקות סטטיסטית ("ננו-שנייה" מעיד על היעדר הבדל מובהק).
תוצאות
בדיקת ה-rotarod הראתה זמן נפילה ממושך יותר בקבוצת ה-EA מאשר בקבוצת ה-DMM (P < 0.05), בעוד שקבוצת ה-SA לא נבדלה באופן משמעותי מקבוצת ה-DMM (איור 1C ו-טבלה 1). לפני יצירת המודל, סריקות אולטרסאונד אורך של מפרק הברך (מרחק סריקה, 4 mm; גודל צעד, 0.04 mm) לא הראו הבדלים משמעותיים בנפח חלל המפרק בין הקבוצות (איור 3A,B ו-טבלה 2). שבוע לאחר יצירת המודל, שחזור תלת-ממדי הראה נפח חלל מפרק גדול משמעותית בקבוצות DMM, SA ו-EA מאשר בקבוצת ה-Sham (P < 0.05), ללא הבדלים משמעותיים בין קבוצות ה-DMM, ה-SA וה-EA (P > 0.05) (איור 3A,C). לאחר 4 שבועות של טיפול ב-EA, נפח חלל המפרק היה נמוך משמעותית בקבוצת ה-EA מאשר בקבוצת ה-DMM (P < 0.05) (איור 3A,D), ממצא העולה בקנה אחד עם הפחתה בנפיחות חלל המפרק.
IRT היא טכניקה המשמשת לאיסוף מידע על הטמפרטורה במישור המוקד בתוך שדה ראייה ולהצגת התפלגויות טמפרטורה של פני השטח בפורמט של פסאודו-צבע16. לא נצפו הבדלים משמעותיים בטמפרטורת פני השטח של העור בין הקבוצות לפני המודלינג או שבוע לאחר המודלינג (איור 4A-C ו-טבלה 3). עם זאת, בעקבות טיפול ב-EA, טמפרטורת פני השטח של העור בקבוצת ה-DMM הייתה נמוכה משמעותית מזו של קבוצת ה-Sham. לעומת זאת, טמפרטורת פני השטח של העור בקבוצת ה-EA הייתה גבוהה משמעותית מזו של קבוצת ה-DMM (איור 4A,D), מה שמעיד על כך ש-EA היה קשור לטמפרטורת פני שטח מקומית גבוהה יותר מאשר DMM, בעוד ש-SA לא היה קשור לכך.
תמונות MRI לא הראו חריגה נראית לעין באות השרירים הפרי-מפרקיים בקבוצת ה-Sham, שינויים בולטים יותר באות בקבוצת ה-DMM, שינויים פחות בולטים בקבוצת ה-EA, ושינויים דומים בקבוצות ה-SA וה-DMM (איור 5A). לאחר טיפול EA, נאספו מפרקי הברך הימניים, הוטמעו בפאראפין ונחתכו בסגִיטלית בעובי של 4 µm. החתכים נצבעו ב-Safranin O-Fast Green ודורגו באמצעות המערכת ההיסטופתולוגית של OARSI. בהשוואה לקבוצת ה-Sham, קבוצת ה-DMM הראתה שחיקה גדולה יותר של הסחוס המפרקי וציון OARSI גבוה יותר. קבוצת ה-EA הראתה דגנרציה פחותה של הסחוס וציון OARSI נמוך יותר מאשר קבוצת ה-DMM (P < 0.05), בעוד שקבוצת ה-SA לא נבדלה באופן מובהק מקבוצת ה-DMM (איור 5B,C ו-טבלה 4).
איור 1: לוח זמנים ניסויי, תרשים נקודות דיקור ובדיקת rotarod בעכברים עם OA. (A) לוח זמנים ניסויי. (B) תרשים של נקודות דיקור. (C) בדיקת rotarod. n = 6 לכל קבוצה. כל עכבר השלים שלושה ניסיונות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ns, SA לעומת DMM, P > 0.05; ** EA לעומת DMM, P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלבי בדיקת אולטרסאונד. (A) הנח את העכבר בתא השראה להרדמה. (B) מרח קרם להסרת שיער על הגפה האחורית. (C) לאחר מריחה אחידה של הקרם, המתן 1 min. (D) נגב את שאריות קרם הסרת השיער ואת השיער בעזרת גזה. (E) בדוק את הגפה האחורית לאחר הסרת השיער. (F) לפני רכישת התמונה, החזר את העכבר לתא ההשראה להרדמה. (G) מרח ג'ל הולכה לאולטרסאונד על הגפה האחורית וסובב את המתמר עד שיהיה מקביל לציר האורכי של הגפה האחורית. (H) רכוש תמונות אולטרסאונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות ותוצאות כמותיות מבדיקות אולטרסאונד בבעלי חיים קטנים בעכברים עם OA. (A) שחזורי אולטרסאונד תלת-ממדיים של מפרק הברך לפני הניתוח, שבוע לאחר הניתוח, ולאחר טיפול EA (מרחק סריקה, 4 mm; גודל צעד, 0.04 mm). פסי קנה מידה = 2 mm. (B) נפח חלל המפרק לפני הניתוח (n = 6 לקבוצה). (C) נפח חלל המפרק שבוע לאחר הניתוח (n = 6 לקבוצה). (D) נפח חלל המפרק לאחר התערבות EA (n = 6 לקבוצה). ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ns, SA לעומת DMM, P > 0.05; *** EA לעומת DMM, P < 0.001. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תרמוגרמות אינפרא-אדום מייצגות ותוצאות כמותיות של טמפרטורת העור בעכברים עם OA. (A) תרמוגרמות של הגפיים התחתונות לפני הניתוח, שבוע לאחר הניתוח ואחרי טיפול EA. כל תרמוגרמה הוצגה באמצעות טווח הטמפרטורה האוטומטי של תוכנת מצלמת האינפרא-אדום; לכן, הצבעים אינם ניתנים להשוואה ישירה בין הפאנלים. השוואות כמותיות צריכות להתבסס על תרשימי הפיזור בפאנלים B–D.(B–D) ניתוח כמותי של טמפרטורת העור באזור העניין (ROI) במפרק הברך, שהוגדר כקו המפרק המדיאלי במפרק הפמורו-טיביאלי.(B) טמפרטורת עור של הגפיים התחתונות לפני הניתוח (n = 6 לכל קבוצה). (C) טמפרטורת עור של הגפיים התחתונות שבוע לאחר הניתוח (n = 6 לכל קבוצה). (D) טמפרטורת עור של הגפיים התחתונות לאחר התערבות EA (n = 6 לכל קבוצה). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ns, SA לעומת DMM, P > 0.05; ** EA לעומת DMM, P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות MRI מייצגות של שינויים באות השרירים סביב המפרק, חתכים היסטולוגיים של מפרק הברך ותוצאות כמותיות בעכברים עם OA. (A) תמונות MRI מייצגות מכל קבוצה. (B) חתכי ברך מייצגים שצבעו ב-Safranin O-Fast Green. סרגלי קנה מידה = 1 mm. (C) מדדי פתולוגיה של סחוס לפי OARSI (n = 6 לכל קבוצה). מדדי OARSI מוצגים כחציונה (P25, P75). ### Sham מול DMM, P < 0.001; ns, SA מול DMM, P > 0.05; ** EA מול DMM, P < 0.01. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| קבוצה | N | שבוע 5 |
| דמה | 6 | 101.300 ± 5.416 |
| DMM | 6 | 70.280 ± 3.363### |
| ניתוח שטח פנים (Surface Area) | 6 | 70.060 ± 7.796 |
| EA | 6 | 84.390 ± 9.504** |
| הערה: ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01. | ||
טבלה 1: בדיקת Rotarod (ממוצע ± SD; n = 6 לקבוצה). ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01.
| קבוצה | N | שבוע 0 | שבוע 1 | שבוע 5 |
| דמה (Sham) | 6 | 2.029 ± 0.055 | 2.056 ± 0.071 | 2.061 ± 0.079 |
| DMM | 6 | 2.058 ± 0.068 | 2.591 ± 0.056### | 2.926 ± 0.088### |
| SA | 6 | 2.056 ± 0.045 | 2.592 ± 0.076 | 2.915 ± 0.112 |
| EA | 6 | 2.032 ± 0.059 | 2.548 ± 0.074 | 2.177 ± 0.110*** |
| הערה: ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; *** EA לעומת DMM, P < 0.001. | ||||
טבלה 2: נפח חלל המפרק (ממוצע ± SD; n = 6 לכל קבוצה). ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; *** EA לעומת DMM, P < 0.001.
| קבוצה | N | שבוע 0 | שבוע 1 | שבוע 5 |
| דמה (Sham) | 6 | 35.517 ± 1.366 | 35.717 ± 0.546 | 35.650 ± 0.701 |
| מד רב-מודד (DMM) | 6 | 35.783 ± 1.292 | 35.033 ± 0.781 | 32.967 ± 1.223### |
| סרטון הדרכה (SA) | 6 | 35.583 ± 1.780 | 35.283 ± 0.861 | 33.267 ± 0.501 |
| EA | 6 | 35.500 ± 1.510 | 35.417 ± 0.882 | 34.533 ± 0.929** |
| הערה: ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01. | ||||
טבלה 3: טמפרטורת העור (ממוצע ± SD; n = 6 לכל קבוצה). ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01.
| קבוצה | N | שבוע 5 | חציון |
| ביקורת (Sham) | 6 | 0.000 (0.000, 0.250) | 0 |
| מולטימטר דיגיטלי (DMM) | 6 | 4.000 (3.000, 4.250)### | 4 |
| ניתוח רצף (Sequence Analysis) | 6 | 4.000 (3.000, 4.250) | 4 |
| EA | 6 | 2.500 (1.750, 3.000)** | 2.5 |
| הערה: ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01. | |||
טבלה 4: מדד OARSI [חציון (P25, P75); n = 6 לקבוצה]. ### Sham לעומת DMM, P < 0.001; ** EA לעומת DMM, P < 0.01.
דיון
דלקת מפרקים של הברך (Knee osteoarthritis - KOA) היא מחלה ניוונית פרוגרסיבית, וההתערבויות הטיפוליות הנוכחיות מציעות יעילות מוגבלת בעצירת התהליך הבסיסי של התקדמותה17. תפקוד שרירים לקוי וירידה בביצועים פיזיים הם מנבאים בעלי משמעות קלינית לחומרת התסמינים. כתוצאה מכך, ניהול פעיל של גורמי סיכון הניתנים לשינוי הוא חיוני לעיכוב התקדמות ה-KOA18. באמצעות מערכת הערכה רב-מודאלית, מחקר זה הדגים כי EA היה קשור לשיפור בביצועים מוטוריים, להפחתה בנפח חלל המפרק, לטמפרטורת פני עור מקומית גבוהה יותר, לשינויים פחות בולטים באות ה-MRI של השרירים הפרי-מפרקיים, ולציוני OARSI נמוכים יותר בעכברים עם OA.
הממצאים של ה-IRT תומכים עוד יותר בתפיסה משולבת זו. שבוע לאחר הניתוח, טמפרטורות העור לא נבדלו בין הקבוצות, כולל קבוצת ה-Sham, דבר שסביר להניח שמשקף תגובה אחידה לטראומה כירורגית, המאופיינת בכיווץ כלי דם (vasoconstriction) חולף ובבצקת שטחית שהפחיתו זמנית את פליטת החום מפני העור. לעומת זאת, השונות התרמית המשמעותית שנצפתה לאחר הטיפול מרמזת כי הפעולות האנטי-דלקתיות והמיקרו-סירקולטוריות של ה-EA הן מצטברות ולא מיידיות, והופכות ניכרות רק לאחר מספר מפגשים חוזרים. מדדי תוצאה אלו עשויים להיות קשורי זה בזה. נפיחות חלל המפרק משקפת בדרך כלל את היקף הדלקת הסינוביאלית והנזילה, בעוד שמצב המיקרו-סירקולציה המקומי קשור הדוקות לשינויים בחדירות כלי הדם במהלך דלקת19. בניסויים שלנו, ההפחתה בנפח המפרק בעקבות מתן EA לוותה בעלייה בטמפרטורה המקומית. למרות ש-IRT אינו מודד זרימת דם באופן ישיר, השינויים הסימולטניים מרמזים כי הגברה של זרימת הדם המקומית עשויה להקל על פינוי מתווכי דלקת, ובכך להפחית חדירה דלקתית בתוך הסינוביום ובשרירים הסובבים. השיפור העוקב בתפקוד המוטורי עשוי לנבוע מהשילוב של ירידה בנפיחות והפחתה בדלקת. באופן כללי, השינויים שנצפו בפרמטרים אלו נראים כתגובות השזוריות זו בזו ולא כאירועים מבודדים. דפוס זה מרמז כי EA עשוי לווסת מספר תהליכים פתולוגיים באופן משולב, במקום לפעול באמצעות מנגנון יחיד20.
בהשוואה להערכות היסטולוגיות קונבנציונליות בנקודת סיום, מערכת הניטור הדינמית הרב-מודאלית ששימשה במחקר זה מציעה יתרונות מעשיים ברורים. אולטרסאונד לבעלי חיים קטנים מאפשר מעקב אורכי ולא פולשני של נזילה במפרק ללא חשיפה לקרינה, ובכך עוקף את השונות הבין-חייתית הגלומה בדגימת רקמות בנקודת סיום21. MRI לבעלי חיים קטנים משלים את ה-US על ידי מתן ויזואליזציה מפורטת של שינויים באות בשרירים הפרי-ארטיקולריים. דבר זה מאפשר הערכה איכותית של דלקת בשרירים שייתכן ו-US לבדו לא יתעד במלואו. בשילוב עם IRT למדידה בזמן אמת של טמפרטורת העור המקומית, גישה זו מספקת אינדיקטור עקיף לנסיגת הדלקת. הזמינות של מודליות דימות אלו הופכת מדידות חוזרות לאורך מהלך הטיפול לאפשריות. מעבר לעמידה בעקרונות ה-3R, תכנון אורכי זה מאפשר תצפיות חוזרות בכל בעל חיים, מה שממזער את השפעת השונות הבין-אינדיבידואלית. למיטב ידיעתנו, שום מחקר קודם בבעלי חיים שהעריך דיקור עבור OA לא שילב US, MRI, תרמוגרפיה, בדיקות התנהגותיות והיסטופתולוגיה במסגרת ניסוית אחת. גישה רב-שכבתית זו מניבה נתונים משלימים בתחומים פונקציונליים, מורפולוגיים והיסטולוגיים, ומספקת הערכה מקיפה יותר מכל נקודת סיום בודדת שיכולה להציע.
יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, עבודה זו נשענת על נתונים תצפיתיים מניסויי בעלי חיים וחסרה ראיות מכניסטיות ממחקרי in vitro. לא ידוע האם EA מפעיל את נתיב ה-NOD-like receptor family pyrin domain 3 (NLRP3)/caspase-1/IL-1β. IL-1β ו-IL-18 הם מתווכים מרכזיים של דלקת סינוביאלית ובשרירים, והבשלתם דורשת הפעלה של inflammasome NLRP322. כמו כן, איננו יכולים לקבוע האם השיפורים המהלקיים שנצפו קשורים לשינויים בביטוי של vascular endothelial growth factor (VEGF) או endothelial nitric oxide synthase (eNOS)23. שנית, יישמנו פרמטר EA יחיד (2/100 Hz) שהוגדר לשתי נקודות דיקור (ST36 ו-SP10). השאלה האם הגדרות שונות או שילובי נקודות דיקור חלופיים עשויים להניב תוצאות טובות יותר דורשת חקירה נוספת24. שלישית, מפעיל יחיד רכש את כל נתוני ההדמיה. בעוד שגישה זו הבטיחה עקביות טכנית, מהימנות בין צופים לא הוערכה, מה שעלול להגביל את היכולת להכליל את ממצאי ההדמיה. רביעית, השמטנו קבוצת ביקורת שהוצבה תחת ריסון בלבד, מה שהופך את ההפרדה המלאה בין השפעות ההרדמה, הקיבוע והטיפול לבין ההשפעות הטיפוליות של EA למאתגרת. חמישית, פרוצדורת ה-SA תוכננה כביקורת מינימלית להפחתת השפעות ספציפיות לנקודות הדיקור, לרקמות עמוקות ולגירוי חשמלי. עם זאת, ההבדל בעומק הדיקור בין ההתערבות האמיתית לזו של ה-sham מונע מאיתנו לבודד את התרומה של העומק לבדו. כתוצאה מכך, יש לפרש את ממצאינו כהשוואה בין פרוטוקול EA מלא לבין פרוצדורת sham מינימלית, ולא כהערכה קפדנית של גירוי חשמלי בלבד. שישית, מרחק המצלמה, זווית ההדמיה ושטח ה-ROI המוחלט לא תועדו באופן פורמלי, דבר המהווה מגבלה טכנית. מגבלה סופית היא השימוש ב-ANOVAs נפרדים לכל נקודת זמן, מה שמתעלם ממתאמי המדידות החוזרות ומאינטראקציה בין הזמן לקבוצה, ובכך מפחית את הרגישות לשינויים דינמיים.
לסיכום, EA נמצאה קשורה לתוצאות פונקציונליות ואנטי-דלקתיות במודל עכברים של KOA ש誘חשה על ידי DMM. למרות מגבלות כגון רזולוציה משתנה בין המודליות השונות, תלות של US ו-IRT במפעיל, עלויות גבוהות של MRI ומתח פוטנציאלי כתוצאה ממדידות חוזרות, הפרוטוקול נותר פלטפורמה ישימה להערכה רב-מודלית אורכית. המערכת המשולבת מספקת מסגרת להערכה פרה-קלינית. עבודות עתידיות צריכות למטב את הפרמטרים החשמליים ולנצל פלטפורמות של אורגנואידים, איבר-על-שבב (organ-on-chip) ו-AI כדי להסביר מנגנונים ולהנחות טיפול מותאם אישית25,26. כמו כן, נדרשים בישורי פקד (sham controls) משופרים, פרוטוקולים סטנדרטיים ומעקב ממושך יותר כדי לשפר את התרגום הקליני.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית הפעולה לחדשנות במדע וטכנולוגיה בשנגחאי (23YF1447900 עבור JMC) והקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (U23A20508 עבור LQY, 82575196 עבור HSC, ו-U24A6013 עבור HX).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת חומצה אצטית 1% | Solarbio | מספר קטלוגי G1371 | תמיסת בידול/שטיפה לצביעה |
| 1% חומצה הידרוכלורית באתנול | Solarbio | מספר קטלוגי G1371# | תמיסת בידוד בחומצה ואלכוהול |
| MRI לבעלי חיים קטנים ב-7T | שנגחאי צ'נגואנג (Shanghai Chenguang) | MRI 7T NOVAL | מערכת דימות תהודה מגנטית לבעלי חיים קטנים |
| מחטי דיקור סיני (0.16 מ"מ × 25 מ"מ) | Wuxi Jiajian Medical Instrument, וווקסי, סין | מספר אצווה 491226 | מחטי דיקור סטריליות |
| זכוכיות מיקרוסקופ דביקות | Jiangsu Shitai | MH0662 | זכוכית מיקרוסקופ עבור חתכי רקמה |
| אתנול אנहाइडרי | Shanghai Titan Technology Co., Ltd. | 64-17-5 | אתנול להסרה של מים (דהידרציה) |
| עכברי C57BL/6 | Shanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd. | https://www.slaccas.com/ | בעלי חיים ניסייניים |
| זכוכיות כיסוי | Jiangsu Shitai | לא סופק טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט המבוקש. | איסוף והרכבה של חתכי רקמה |
| תמיסת דקלציפיקציה | Serivebio | G1105-500ml | ריאגנט להסרת סידן מעצמות וממפרקים, pH 7.2-7.4 |
| מכשיר לטיפול חשמלי | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | SD-Z | מכשיר לגירוי אלקטרו-אקופונקטורה |
| חומצה אתילנדיאמיןטטרהאצטית | Shanghai Titan Technology Co., Ltd. | 60-00-4 | ריאגנט כלטורי |
| Fiji (ImageJ) | המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) | ImageJ המצורפת עם Java 8 ב-64 סיביות. | תוכנה לניתוח תמונות |
| גזה | Weizhe Medical | סוג A1: רפידות גזה סטנדרטיות (סטריליות) | חומרי הסרת שיער וניקוי |
| קרם להסרת שיער | VEET | לא סופק | קרם להסרת שיער |
| תוכנה לניתוח תמונות באינפרא-אדום | FLIR | לא סופקה גרסה | התוכנה המסופקת עם המצלמה התרמית באינפרא-אדום |
| מדד תרמי באינפרא-אדום | FLIR | 435-0007-03 (סדרה מוקדמת) | מערכת תרמוגרפיה באינפרא-אדום |
| מערכת הרדמה בשאיפה לבעלי חיים קטנים | Matrx | 07149 | מערכת הרדמה בגז לבעלי חיים קטנים |
| איזופלורן (חומר הרדמה בשאיפה) | נתונים מהעולם האמיתי (RWD) | 217140901 | חומר הרדמה בשאיפה |
| סרט אלסטי עמיד במים Naisikang Medical (3.81 ס"מ × 4.57 מ') | נאיסיקאנג™ | 732 | חומרי קיבוע גפיים עבור MRI |
| ערכת צביעה משופרת של Safranin O ו-Fast Green (לעצם) | Solarbio | מס' קטלוג G1371 | ערכה לצביעת סחוס ועצם |
| מחזיק מחטים | נתוני העולם האמיתי (RWD) | F21001-12 | סגירה בתפירה ות clamp תוך-ניתוחי |
| תוסף קיבוע משרף ניטרלי | biosharp | 23338664 | תוכנית סגירה היסטולוגית |
| חמצן | לא סופק טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט המקור באנגלית כדי שאוכל לתרגמו לעברית בהתאם להנחיות המקצועיות. | נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. | גז נשא להרדמה בשאיפה |
| מכשיר להטמעה בפרפין | LEICA | EG1150C | מערכת להטמעה בפרפין |
| מיקרוטום לפאראפין | LEICA | RM2235 | מיקרוטום סיבובי |
| שעוות פראפין | epredia | 151534 | תווך שיכון |
| פראפורמאלדהיד | Sinopharm Reagents Co., Ltd. | 80096618 | מקבע רקמות |
| PBS | Servicebio | G0002 | סלויין פוספט (Phosphate-buffered saline) |
| מכשיר Rotarod | Panlab | LE8205 | מערכת לבדיקת עייפות באמצעות Rotarod |
| פלטפורמה לדימות אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים | פוג'י | Vevo 3100 | מערכת אולטרסאונד לבעלי חיים קטנים |
| נתרן הידרוקסיד | Shanghai Titan Technology Co., Ltd. | G19852H | ריאגנט למעבדה |
| מיקרוסקופ סטריאו | Olympus | SZ61 | מיקרוסקופ סטריאו (מיקרוסקופ לדיסקציה) |
| מחטי תפירה עם חוט (חוט תפירה נספג 6-0 וחוט משי 6-0) | Ningbo Medical Suture Co., Ltd. | מחטים קוסמטיות 1/2 4X12 40 | תפירה לאחר ניתוח |
| להבי ניתוח (מס' 10) | Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd. | 20090120 | חתירה של רצועת המניסקוס המדיאלי |
| מייבש רקמות | LEICA | TP1020 | מעבד רקמות אוטומטי |
| מייבש רקמות | LEICA | HI1220 | מייבש סליידים |
| בלוקים להטמעת רקמה | Jiangsu Shitai | REF31050102W | חומרים מתכלים לשיחון |
| מרחיב רקמות | LEICA | HI1210 | מערכת לפריסת חתכים |
| תוכנה לניתוח אולטרסאונד (Vevo Lab 3.1.0) | אופטי | גרסה 3.1.0 | תוכנה לניתוח אולטרסאונד תלת-ממדי |
| חומר צימוד לאולטרסאונד | הו צ'ינג-יו טאנג | YY0299-2008 | ג'ל צימוד לאולטרסאונד |
| סורק סרקים שלם (Whole-slide scanner) | Olympus | VS200 | מערכת לסריקה דיגיטלית של סליידים |
| קסילן | Sinopharm Reagents Co., Ltd. | 10023418 | ריאגנט להבהרה |
מקורות
- Lee BJ et al. Association between metabolic syndrome and knee osteoarthritis: a cross-sectional nationwide survey study. J Rehabil Med. 2019;51(6):464-70.
- Glyn-Jones S et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386(9991):376-87.
- Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393(10182):1745-59.
- Rahmati M, Mobasheri A, Mozafari M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: a critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 2016;85:81-90.
- Fokam D, Lehmann C. Clinical assessment of arthritic knee pain by infrared thermography. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2019;30(3):20170218.
- Ren G et al. Serum and synovial fluid cytokine profiling in hip osteoarthritis: distinct from knee osteoarthritis and correlated with pain. BMC Musculoskelet Disord. 2018;19(1):39.
- Siqueira MB et al. Comparison of synovial fluid cytokine levels between traumatic knee injury and end-stage osteoarthritis. J Knee Surg. 2017;30(2):128-33.
- Xu H et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 2017;5:17012.
- Tattersall GJ. Infrared thermography: a non-invasive window into thermal physiology. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2016;202:78-98.
- Schiavon G et al. Infrared thermography for the evaluation of inflammatory and degenerative joint diseases: a systematic review. Cartilage. 2021;13(2_suppl):1790S-801S.
- De Marziani L et al. Infrared thermography in symptomatic knee osteoarthritis: joint temperature differs based on patient and pain characteristics. J Clin Med. 2023;12(6):2319.
- Zhao Y, Liu B, Liu CJ. Establishment of a surgically-induced model in mice to investigate the protective role of progranulin in osteoarthritis. J Vis Exp. 2014;(84):e50924.
- Jiang Y et al. Electroacupuncture ameliorates cerebrovascular impairment in Alzheimer’s disease mice via melatonin signaling. CNS Neurosci Ther. 2023;29(3):917-31.
- Wang Z et al. Effect of electroacupuncture on the kisspeptin system in a pubertal rat model of polycystic ovary syndrome. Acupunct Med. 2021;39(5):491-500.
- Brochard S, et al. A single intraarticular injection of a tranexamic acid-modified hyaluronic acid (HA/TXA) alleviates pain and reduces OA development in a murine model of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Front Pharmacol. 2024;15:1456495.
- Mi B et al. A preliminary study on the diagnostic value of infrared thermography in children with idiopathic thrombocytopenic purpura. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2020;37(4):652-60.
- Bannuru RR et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2019;27(11):1578-89.
- Oliveira MC, Vullings J, van de Loo FAJ. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 2020;70:110486.
- Ramezanpour S et al. Impact of sustained synovitis on knee joint structural degeneration: 4-year MRI data from the Osteoarthritis Initiative. J Magn Reson Imaging. 2023;57(1):153-64.
- Zhao M et al. Electroacupuncture alleviates osteoarthritis and is associated with activation of the Nrf2/HO-1 pathway and reduced ferroptosis-related changes. Front Mol Biosci. 2026;13:1764620.
- Blackshear CP et al. Three-dimensional ultrasound versus computerized tomography in fat graft volumetric analysis. Ann Plast Surg. 2018;80(3):293-6.
- Karmakar V et al. Targeting the NLRP3 inflammasome as a novel therapeutic target for osteoarthritis. Inflammopharmacology. 2025;33(2):461-84.
- Wilson TG et al. Circulating miR-126-3p is a mechanistic biomarker for knee osteoarthritis. Nat Commun. 2025;16(1):2021.
- Wang J et al. Effects of electroacupuncture on knee osteoarthritis in rats through suppressing p38 MAPK/ERK/CREB pathway. J Inflamm Res. 2026;19:581985.
- Cao JC, et al. Electrostrategies in orthopaedic research. Biomater Transl. 2025;6(3):294-313.
- Wei Y, et al. Organoids in aging research: Bridging cutting-edge biotechnology with the wisdom of traditional Chinese medicine.Organoid Res. 2026;2(1):025460035.