מחקר זה משלב מאגרי נתונים ציבוריים, תיקוף של רקמות זוגיות, בדיקות נדידת תאים, חיזוי רשת מטרות וניתוח חתימה חיסונית כדי להעריך את miR-192-5p בסרטן המעי הגס והחלחולת. הממצאים מדגישים אי-התאמה בין נתוני הביטוי של TCGA/GDC לבין תוצאות qRT-PCR מקומיות, ומזהירים מפני פרשנות יתר של המשמעות האבחנתית, הפרוגנוסטית, התפקודית והחיסונית שלו.
מאמר מחקר
משמעות קלינית, נוף חדירה חיסונית וניתוח רשת תפקודית של miR-192-5p בסרטן המעי הגס והחלחול (Colorectal Cancer)
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) הוא גידול ממאיר הטרוגני שבו miR-192-5p עשוי לתרום להתקדמות הגידול ולגילוי סמנים ביולוגיים. מחקר זה בחן את המשמעות הקלינית, הקשרים החיסוניים והרשת התפקודית של miR-192-5p ב-CRC באמצעות שילוב של ניתוחים ביו-אינפורמטיים ממסדי הנתונים TCGA/GDC ו-GEO, תיקוף באמצעות qRT-PCR של רקמות זוגיות, חיזוי מטרות, ניתוח חתימה חיסונית וניסויי ריפוי פצעים בתאי HT29. ניתוח חוזר של נתוני miRNA-seq מ-TCGA/GDC כלל 616 דגימות גידול ו-11 דגימות נורמליות של COADREAD, והראה אות hsa-mir-192 גבוה יותר ברמת מסד הנתונים בדגימות גידול מאשר בדגימות נורמליות (Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). כיוון דומה נצפה ב-11 מקרים זוגיים מ-TCGA (הפרש חציוני בין גידול לנורמה = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029), בעוד ש-qRT-PCR מקומי ברקמות קליניות זוגיות תמך בביטוי נמוך יותר של miR-192-5p בוגר ברקמות CRC. ניתוח ROC מבוסס TCGA הראה הפרדה חזקה בין גידול לנורמה, אך ניתוחי דגימה חוזרת מאוזנת (balanced resampling) וניתוחי leave-one-normal-out אישרו כי יש לפרש תוצאה זו בזהירות בשל המספר המוגבל של דגימות נורמליות. ניתוח קליני-פתולוגי הצביע על קשרים עם שלב N וגיל בקוהורט ה-TCGA, בעוד ששלב T ושלב M לא היו מובהקים בטבלה המסכמת, וניתוח הישרדות כוללת לא הראה קשר פרוגנוסטי מובהק. ניתוחים של גנים מרכזיים (hub-genes) מועמדים באמצעות RNA-seq של TCGA סיפקו ראיות גילוי של ביטוי, מתאם והישרדות, אך לא ביססו מיקוד ישיר של miR-192-5p. ניתוח חתימה חיסונית הראה מתאמים הטרוגניים וחלשים ברובם. מבחינה תפקודית, טרנספקציה של mimic של miR-192-5p הפחיתה את סגירת הפצע בתאי HT29. ממצאים אלה מעידים על כך ש-miR-192-5p רלוונטי ביולוגית ל-CRC, אך כיוון הביטוי שלו והפרשנות הקלינית תלויים בפלטפורמה ודורשים תיקוף ניסויי נוסף.
מבוא
סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) הוא אחד הממאירות השכיחות ביותר ברחבי העולם ונשאר סיבה מובילה לתמותה הקשורה לסרטן1,2. למרות שקולונוסקופיה, בדיקות אימונוכימיות לצואה, בדיקות מתילציה של SEPT9, סממנים גידוליים במחזור הדם ופרופיל מולקולרי שיפרו את הגילוי והניהול הקליני של CRC3,4, נותרת הטרוגניות משמעותית בביולוגיה של הגידול, בתגובה לטיפול ובתוצאות עבור המטופלים5,6,7. לפיכך, סממנים ביולוגיים המסייעים לאפיון הביולוגיה של CRC עשויים לתרום לסיווג סיכונים ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מותאמות אישית יותר8.
מיקרו-RNAs (miRNAs) הם RNAs קצרים שאינם מקודדים, באורך של כ-19–24 נוקלאוטידים, המווסתים את ביטוי הגנים בעיקר באמצעות מנגנונים פוסט-טרנסקריפציונליים9. ביטוי לא מאוזן של miRNA עשוי להשפיע על שגשוג תאי סרטן, נדידה, פלישה, אפופטוזיס, אינטראקציות חיסוניות ותגובה לטיפול10. דווח כי miR-192-5p פועל באופן תלוי-הקשר במחלות ובסוגי סרטן שונים, עם קשרים אונקוגניים או מדכאי-גידול, בהתאם לסוג הרקמה, הרקע המולקולרי והמערכת הניסויית11,12,13,14,15,16. ב-CRC, מחקרים קודמים דיווחו על פרופילי miRNA משתנים בדגימות קליניות ועל ויסות תפקודי של פנוטיפים ממאירים בתאי סרטן המעי הגס12,14,15. עם זאת, ניתוחים של מאגרי נתונים ציבוריים עשויים שלא להראות תמיד את אותו כיוון ביטוי, והמשמעות הקלינית, רשת המטרות והקשרים החיסוניים של miR-192-5p ב-CRC דורשים הערכה זהירה.
המחקר הנוכחי בחן את miR-192-5p ב-CRC על ידי שילוב של ניתוחים ביו-אינפורמטיים ממאגרי TCGA/GDC ו-GEO, תיקוף באמצעות qRT-PCR ברקמות קליניות זוגיות, בדיקות נדידה in vitro, חיזוי גנים מטרה פוטנציאליים, העשרת מסלולים וניתוח קורלציה של חתימה חיסונית. המחקר התבסס על ההיפותזה כי miR-192-5p בוגר עשוי להיות מופחת (downregulated) ברקמות CRC וייתכן כי הוא מפעיל השפעה מדכאת גידולים. מכיוון שסיגנל ה-miRNA-seq שנותח מחדש מ-TCGA/GDC הראה כיוון ביטוי הפוך, התוצאות מפורשות כגילויים ראשוניים (exploratory) התלויים בפלטפורמה, ולא כדפוס ביטוי חד-משמעי אחד.
פרוטוקול
מחקר זה בוצע בהתאם להצהרת הלסינקי. אישור ניתן על ידי ועדת האתיקה של Inner Mongolia Medical University ב-21 באוקטובר 2021. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים שנכללו במחקר.
איסוף דגימות קליניות
רקמות של CRC ורקמות לא סרטניות סמוכות שנלקחו כזוגות נאספו מ-45 מטופלים שעברו כריתה רדיקלית בין דצמבר 2017 לפברואר 2020. אף אחד מהמטופלים לא קיבל רדיותרפיה או כימותרפיה טרום-ניתוחית, ומטופלים עם גידולים ממאירים אחרים הוחרגו. רקמה לא סרטנית סמוכה נאספה במרחק של לפחות 5 cm משולי הגידול. הדגימות הוקפאו מיד לאחר ההסרה הכירורגית ואוחסנו בחנקן נוזלי עד למיצוי ה-RNA. העוקבה כללה 27 מטופלים גברים ו-18 מטופלות נשים; 13 מטופלים היו צעירים מ-60 שנים, ו-32 היו בני 60 שנים ומעלה. המשתנים הקליניקופתולוגיים כללו קוטר גידול, שלב TNM, דיפרנציאציה, תסביב גידול כלי דם, גרורות בקשרי לימפה ורמת CEA טרום-ניתוחית.
איסוף נתונים ציבוריים ועיבוד מקדים
נתוני miRNA-seq, RNA-seq ונתונים קליניים בגישה פתוחה עבור TCGA-COAD ו-TCGA-READ התקבלו מפורטל Genomic Data Commons. גידולי ראשוניים ודגימות רקמה מוצקה נורמלית זוהו בהתאם לסוג הדגימה של GDC. דגימות של גידולים גרורתיים וחוזרים הוצאו מניתוח הביטוי הדיפרנציאלי בין גידול לנורמה. עבור קבצי miRNA-seq של TCGA, הרשומה ברמת בסיס הנתונים שזוהתה עבור ניתוח זה הייתה hsa-mir-192; ערכי הביטוי נותחו כ-log2(RPM + 1), כאשר RPM מציין reads per million של קריאות miRNA ממופות. ניתוחים של גידול-נורמה, הן לא מזווגים והן מזווגים, בוצעו כאשר היו דגימות תואמות זמינות. מערכי נתונים GEO GSE89076 ו-GSE156355 שימשו לסריקת גנים מועמדים למטרה. גנים עם ביטוי דיפרנציאלי מ-GEO נסרקו באמצעות p adjusted < 0.05 וערך מוחלט של log2 fold-change ≥ 2. שמות מערכי הנתונים נבדקו לעקביות לאורך כתב היד.
ניתוחים אבחנתיים, קליניקו-פתולוגיים ושל הישרדות
ניתוח עקומת מאפייני המקלט (ROC) שימש להערכת ההפרדה הראשונית בין גידול לרקמה נורמלית ב-TCGA-COAD, TCGA-READ, ובקוהורט המשולב COADREAD. מכיוון שמספר הדגימות הנורמליות היה קטן, בוצעו ניתוחי רגישות נוספים, כולל דגימה חוזרת מאוזנת של גידול-נורמלית ב-5,000 חזרות וניתוח leave-one-normal-out. לצורך ניתוחי קשר קליני-פתולוגיים, דגימות גידול ראשוני חולקו לקבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך על פי רמת הביטוי החציונית של miR-192 ב-TCGA. הניתוחים חזרו על עצמם עבור קוהורט COADREAD המשולב ועבור COAD ו-READ בנפרד כאשר גודל המדגם התיר זאת. הישרדות כוללת הוערכה באמצעות ניתוח Kaplan-Meier עם מבחן log-rank ורגרסיית Cox חד-משתנית. ניתוחים אבחנתיים, קליני-פתולוגיים וניתוחי הישרדות דווחו בנפרד כדי למנוע הגזמה במסקנות הפרוגנוסטיות.
ניתוחים של גנים מועמדים למטרה וגני צומת (hub-genes)
גנים מטרת-מועמדים זוהו על ידי שילוב של תחזיות miRWalk עם גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מ-GSE89076 ו-GSE156355. החפיפה בין שלושת המקורות הללו נשמרה לצורך ניתוח גישוש המשכי. רשת אינטראקציות חלבון-חלבון נבנתה באמצעות STRING, וגני מפתח (hub genes) נבחרו על פי דרגת הצומת (node degree) וקישוריות המודול באמצעות ניתוחי cytoHubba ו-MCODE מבוססי Cytoscape. גני המפתח שנשמרו (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3, ו-KIF5C) הוערכו בהמשך באמצעות נתוני RNA-seq של TCGA. הבדלי ביטוי בין גידול לרקמה נורמלית, מתאמי Spearman עם ביטוי miR-192 ב-TCGA, וקשרים עם הישרדות כוללת סוכמו כניתוחי גישוש משלימים. גנים אלו נחשבו כגנים מטרת-מועמדים בלבד; לא הוסק מהנתונים הביואינפורמטיים קשירה ישירה, אפקט הצלה (rescue effect) או רגולציה ברמת החלבון במורד המסלול.
ניתוח העשרה של GO ו-KEGG
ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) בוצעו עבור קבוצת הגנים המועמדת ומודולי רשת משמעותיים. מונחי GO קובצו לקטגוריות של תהליך ביולוגי, רכיב תאי ותפקוד מולקולרי. תוצאות העשרה עם p < 0.05 נחשבו למשמעותיות סטטיסטית ופורשו כאותות של מסלולים המעוררים השערות, ולא כמנגנונים המהווים אישוש ניסויי.
מיצוי RNA ואנליזת qRT-PCR
RNA כולל הופק מ-45 דגימות זוגיות של CRC ורקמה לא סרטנית סמוכה באמצעות ריאגנט TRIzol בהתאם לפרוטוקול היצרן. טוהר ה-RNA והריכוז שלו נבדקו באופן ספקטרופוטומטרי, ודגימות עם ערכי A260/A280 שבין 1.8 ל-2.1 שימשו לתעתוק הפוך. qRT-PCR בוצע באמצעות מערכת לתעתוק הפוך של miRNA וריאגנטים ל-miRNA qPCR מבוססי SYBR Green מחברת TransGen Biotech. התעתוק ההפוך וההגברה ב-qPCR בוצעו בהתאם להוראות יצרן הריאגנטים. כל תגובת qRT-PCR הורצה בשלישייה טכנית. RNU6B שימש כרפרנס פנימי. הפריימרים של miR-192-5p היו 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) ו-5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse). הפריימרים של RNU6B היו 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) ו-5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse). ניתוח עקומת המסת (Melt-curve) שימש להערכת ספציפיות ההגברה כאשר פלטפורמת ה-qPCR תמכה בכך. ביטוי יחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt. תוצאות של גידול ורקמה סמוכה בזוגות נותחו כמדידות קליניות זוגיות.
תרבית תאים והסמכה (טרנספקציה)
קו התאים האנושי CRC HT29 הושג ממלאי התאים של מעבדת המחברים, ואומת ונמצא נקי מזיהום mycoplasma. תאי HT29 תורגלו בתווך McCoy's 5A מועשר ב-10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, ו-100 µg/mL streptomycin בטמפרטורה של 37 oC באטמוספירה של 5% CO2. התאים הועברו למצע חדש כאשר הגיעו לכ-80% confluence. miR-192-5p mimics והאוליגוניוקלאוטיד לשלילה con238 נרכשו מ-Sangon Biotech (שנגחאי, סין) ושימשו לטרנספקציה זמנית. תאי HT29 נזרעו בלוחות של 6 באריים וטרנספקטו כאשר צפיפות התאים הגיעה לכ-20–30%, תוך שימוש בריכוז סופי של אוליגוניוקלאוטיד של 50 nM ובפרוטוקול טרנספקציה מבוסס ליפידים שבוצע בהתאם להוראות יצרן הריאגנט. היחס המדויק בין הריאגנט לאוליגוניוקלאוטיד וכמות הריאגנט התאימו לפרוטוקול המומלץ של היצרן כפי שמופיע ברישומי המעבדה של המחברים. התאים הוצאו לדגירה עם קומפלקסי הטרנספקציה בתנאי תרבית סטנדרטיים, ובדיקות דימוי לאחר טרנספקציה ובדיקות ריפוי פצעים (wound-healing assays) בוצעו לאחר הטרנספקציה בהתאם ללוח הזמנים הניסויי. רק נתונים של תאי HT29 נכללו במחקר הנוכחי.
בדיקת ריפוי פצעים
תאי HT29 שעברו טרנספקציה נזרעו בלוחות של 6 בארות וגודלו עד להיווצרות שכבה חד-שכבתית רציפה (confluent monolayer). שריטה ליניארית נוצרה באמצעות טיפ של פ pipette סטרילי בנפח 200 µL, ותאים שהסתלקו הוסרו על ידי שטיפה ב-PBS. לאחר מכן, המצע הוחלף במצע נטול סרום כדי להפחית השפעות הקשורות לשגשוג במהלך הערכת הנדידה. תמונות של הפצע צולמו בנקודות הזמן 0 h, 24 h ו-48 h. בדיקת ריפוי הפצע בוצעה בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, ושדות מיקרוסקופיים מרובים נמדדו עבור כל קבוצה ונקודת זמן. רוחב הפצע כומת מתמונות המיקרוסקופיה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות; גרסת התוכנה המדויקת ששימשה למדידות המקוריות לא הייתה זמינה ברשומות המקור. קצב ריפוי הפצע חושב לפי הנוסחה: [(רוחב הפצע ב-0 h - רוחב הפצע בנקודת הזמן המצוינת) / רוחב הפצע ב-0 h] x 100%. מכיוון שנתוני כתב היד הזמינים אינם כוללים ניסוי נפרד לבקרת שגשוג, תוצאות ריפוי הפצע פורשו כקשורות לנדידה, אך לא כהדרה מוחלטת של השפעות שגשוג.
ניתוח קורלציה של חתימה חיסונית
הקשר בין ביטוי miR-192 ב-TCGA לבין חתימות הקשורות למערכת החיסון נבחן מחדש באמצעות נתוני RNA-seq של גידולים ראשוניים. סה"כ 425 דגימות גידול עם נתוני miRNA ו-RNA-seq תואמים נכללו בניתוח המתאם של ציון החתימה. ביטוי miR-192 הראה מתאמים שליליים חלשים אך מובהקים סטטיסטית עם מספר חתימות חיסוניות לאחר תיקון שיעור גילוי שגוי (FDR), כולל תאי Tfh (rho = -0.205, FDR = 0.00049), תאי דנדריטיים מופעלים (rho = -0.186, FDR = 0.00098), תאי Treg (rho = -0.185, FDR = 0.00098), תאי דנדריטיים פלסמציטואידיים (rho = -0.169, FDR = 0.0027) ומקרופאגים (rho = -0.149, FDR = 0.0092). מתאמים חיוביים נצפו בעיקר עבור חתימות של אאוזינופילים (rho = 0.139, FDR = 0.0155) ותאי Th17 (rho = 0.121, FDR = 0.0296). ממצאים אלו מעידים על קשרים חיסוניים הטרוגניים ובדרך כלל חלשים, ולא על דפוס אחיד של חדירה חיסונית חיובית.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0, ותוכנת R 3.6.3. משתנים רציפים סוכמו כממוצע ± סטיית תקן או כחציון עם טווח בין-רבעוני, לפי העניין. השוואות של רקמות זוגיות נותחו באמצעות מבחנים מזווגים כאשר דגימות הגידול והרקמה הסמוכה לו היו תואמות. מבחנים לא פרמטריים שימשו כאשר הנחות הנורמליות לא התקיימו. עקומות ROC, דגימה חוזרת מאוזנת (balanced resampling) וניתוח leave-one-normal-out שימשו לאפיוני הבחנה אבחנתית ראשונית; מבחני Chi-square שימשו לקשרי קליניקה-פתולוגיה קטגוריים; מודלי Cox ומבחן log-rank שימשו לניתוחי הישרדות; ומתאם Spearman שימש לניתוחי מערכת החיסון וגני מפתח (hub-genes). ערך p < 0.05 דו-צדדי נחשב למשמעותי סטטיסטית, כאשר עבור מתאמי חתימת חיסונית דווח תיקון של שיעור התגליות השגויות (false-discovery rate).
תוצאות
ניתוח ביטוי במאגרי נתונים ציבוריים וברקמות קליניות תואמות
דפוס הביטוי של miR-192 נבחן מחדש באמצעות נתוני miRNA-seq של TCGA-COAD ו-TCGA-READ שהופקו מה-GDC (איור 1). בקבצים אלו, הערך ברמת מסד הנתונים סומן כ-hsa-mir-192 ולא ישירות כסוג ה-hsa-miR-192-5p הבוגר; לפיכך, תוצאה זו ממסד הנתונים הציבורי פורשה כאות של TCGA miR-192. בעקבה המשולבת של COADREAD, נותחו 616 גידולים ראשוניים ו-11 דגימות רקמה נורמליות מוצקות. דגימות גידולים הראו ביטוי גבוה יותר של miR-192 מאשר דגימות נורמליות (חציון 16.05 לעומת 13.46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). אותה מגמה של ביטוי גבוה יותר בגידולים נצפתה ב-COAD לבדו (455 גידולים ו-8 דגימות נורמליות, p = 9.89 x 10-8) וב-READ לבדו (161 גידולים ו-3 דגימות נורמליות, p = 1.94 x 10-5). ניתוח TCGA בזוגות הראה גם הוא ביטוי גבוה יותר בגידולים ב-11 מקרים תואמים (חציון ההפרש בין גידול לנורמה = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029). תוצאות אלו נותרו סותרות לתוצאת ה-qRT-PCR המקומית בזוגות, אשר תמכה בביטוי מופחת של miR-192-5p בוגר ברקמות CRC (איור 2).
ביצועים אבחנאיים וקשרים קליני פתולוגיים
ניתוח ROC המבוסס על TCGA חזר על עצמו באמצעות הגדרת ההבחנה בין דגימות גידול לדגימות נורמליות שתוארה לעיל (איור 3). ה-AUC היה 0.968 עבור קהילת COADREAD המשולבת, 0.947 עבור COAD לבדו, ו-0.994 עבור READ לבדו. דגימה חוזרת מאוזנת נוספת הניבה ערכי AUC חציוניים של 0.983 עבור COADREAD, 0.984 עבור COAD, ו-1.000 עבור READ; עם זאת, רווחי הסמך של 95% היו רחבים עבור COADREAD (0.868–1.000) ועבור COAD (0.781–1.000), ו-READ כלל רק שלוש דגימות נורמליות. ניתוח נורמלי מסוג leave-one-out הראה גם כי הערכת ה-ROC הייתה רגישה לקבוצה הנורמלית הקטנה. לכן, תוצאת ה-ROC נשמרה רק כראיה גישושית להפרדה בין גידול לנורמה, ולא כראיה מספקת לסמן ביולוגי לאבחון קליני. ניתוח קשר קלינו-פתולוגי המבוסס על ביטוי חציוני של miR-192 ב-TCGA הראה קשרים מובהקים עם N stage (p = 0.019) וגיל (p = 0.004), בעוד ש-T stage (p = 0.110) ו-M stage (p = 0.932) לא היו מובהקים (טבלה 1).
ניתוח הישרדות
ניתוח הישרדות כוללת לא תמך בקשר פרוגנוסטי מובהק עבור ביטוי של TCGA miR-192 ב-CRC (איור 3). בקוהורט המשולבת של COADREAD, השוואת Kaplan-Meier לפי חציונה לא הייתה מובהקת (log-rank p = 0.857), וגם רגרסיית Cox חד-משתנית לא הראתה קשר מובהק (HR = 0.934 ליחידת ביטוי log2, p = 0.374). אותה מסקנה נצפתה ב-COAD (log-rank p = 0.889; Cox p = 0.493) וב-READ (log-rank p = 0.807; Cox p = 0.716). לפיכך, הנתונים אינם תומכים בטענה ש-miR-192 מהווה ביומרקר פרוגנוסטי חזק ב-CRC.
גנים מועמדים למטרה והעשרה תפקודית
ניתוח של גנים מטרת-מועמדים בוצע על ידי שילוב חיזוי של miRWalk עם גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי ממאגרי הנתונים של GEO המסומנים כ-GSE89076 ו-GSE156355. סריקה זו זיהתה 93 גנים מועמדים לניתוחי העשרה ורשתות בהמשך (איור 4). ניתוח אינטראקציית חלבונים השאיר את KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3, ו-KIF5C כגני מפתח (hub genes) למחקר גישוש (איור 5). ניתוח רגישות של RNA-seq מ-TCGA הראה כי KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, ו-CDK1 היו גבוהים יותר ברקמת גידול מאשר ברקמה נורמלית, בעוד ש-PLP1, NRXN1, GRIK3, ו-KIF5C היו נמוכים יותר ברקמת גידול. ניתוח קורלציה עם ביטוי miR-192 מ-TCGA היה מעורב: CDCA5, CCNB1, ו-CDK1 הראו קורלציות חיוביות, בעוד ש-PLP1, NRXN1, ו-KIF5C הראו קורלציות שליליות. ניתוח העשרה הדגיש מונחים מייצגים הקשורים למטבוליזם של תרופות על ידי cytochrome P450, מטבוליזם של קסנוביוטיקה על ידי cytochrome P450, מטבוליזם של רטינול, מונחים הקשורים לסינפסה גלוטמטרגית, וארגון פרה-סינפטי (איור 6). ממצאים אלו תומכים ברלוונטיות הביולוגית של רשת גני המפתח, אך אינם מבססים ת targeting ישיר של miR-192-5p.
בדיקת נדידת תאים
תאי HT29 עברו טרנספקציה עם miR-192 mimics כדי להעריך את ההשפעות התפקודיות של ביטוי יתר (upregulation) של miR-192. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה טרנספקציה מוצלחת בקבוצות הטרנספקציה של miR-192-5p mimic ובביקורת השלילית (איור 7). בבדיקת ריפוי פצע (wound-healing assay), קצב הנדידה של תאי HT29 שעברו טרנספקציה עם miR-192 היה נמוך יותר מזה של תאי HT29 שלא עברו טרנספקציה ומזה של תאים שעברו טרנספקציה בביקורת שלילית, הן ב-24 h והן ב-48 h (איור 8). ב-24 h, קצב הנדידה היה 9.75 +/- 2.43% בקבוצה שעברה טרנספקציה עם miR-192, בהשוואה ל-15.69 +/- 3.47% בקבוצה שלא עברה טרנספקציה ו-15.45 +/- 3.92% בקבוצת הביקורת השלילית (P = 0.010). ב-48 h, קצב הנדידה היה 20.04 +/- 2.54% בקבוצה שעברה טרנספקציה עם miR-192, בהשוואה ל-26.84 +/- 7.65% ו-27.98 +/- 6.78% בשתי קבוצות הביקורת, בהתאמה (P = 0.021). תוצאות אלה מצביעות על כך שביטוי יתר של miR-192 מדכא את נדידת תאי HT29 in vitro.
ניתוח קורלציה של חתימה חיסונית
הקשר בין ביטוי miR-192 ב-TCGA לבין חתימות הקשורות למערכת החיסון נבחן מחדש באמצעות נתוני RNA-seq של גידולים ראשוניים (איור 9). סך של 425 דגימות גידול עם נתוני miRNA ו-RNA-seq תואמים נכללו בניתוח המתאם של ציון החתימה. ביטוי miR-192 הראה מתאמים שליליים חלשים עם מספר חתימות של תאי חיסון, כולל תאי Tfh (rho = -0.205, p = 2.15e-05), תאים דנדריטיים מופעלים (rho = -0.186, p = 0.00011), תאי Treg (rho = -0.185, p = 0.00013), תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים (rho = -0.169, p = 0.00046), מקרופגים (rho = -0.149, p = 0.0020), תאי Tcm (rho = -0.136, p = 0.0050), תאי NK CD56bright (rho = -0.132, p = 0.0065), ותאי Tem (rho = -0.129, p = 0.0078). מתאמים חיוביים חלשים נצפו עבור חתימות של אאוזינופילים (rho = 0.139, p = 0.0040) ותאי Th17 (rho = 0.121, p = 0.0129). לפיכך, נראה כי הקשר החיסוני של miR-192 ב-CRC הוא הטרוגני ואין לתארו כחיובי באופן אחיד על פני תסננוני מערכת החיסון.
זמינות נתונים
מאגרי הנתונים הציבוריים שנותחו במחקר זה זמינים בפורטל GDC/TCGA ובמאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) תחת מספרי גישה GSE89076 ו-GSE156355. ניתוחי ה-dry-lab והניתוחים החוזרים שבוצעו במהלך מחקר זה מופיעים ב-Supplementary Table 1. הנתונים הניסויים הבסיסיים התומכים בניתוחי ה-qRT-PCR ובניתוחי ריפוי הפצעים, כולל ערכי Ct גולמיים של qRT-PCR, מדידות של רוחב הפצע, תמונות מיקרוסקופיות מקוריות ונתונים ניסויים קשורים, מופיעים ב-Supplementary Folder 1.
איור 1: סקירה כללית של ביטוי miR-192 במגוון סוגי סרטן (Pan-cancer) ב-TCGA. ציר ה-x מציג קיצורי גידולים, וציר ה-y מציג ביטוי יחסי של miR-192. כחול מציין רקמה נורמלית, ואדום מציין רקמת גידול. מובהקות סטטיסטית מסומנת באופן הבא: * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001; NS = לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי miR-192/miR-192-5p במאגרי נתונים של CRC וברקמות זוגיות. (A) ניתוח miRNA-seq מ-TCGA/GDC המראה אות hsa-mir-192 גבוה יותר ברמת מסד הנתונים בדגימות גידול של CRC מאשר בדגימות נורמליות. (B) ניתוח qRT-PCR של דגימות רקמה מקומיות זוגיות המראה ביטוי נמוך יותר של miR-192-5p בוגר ברקמות CRC מאשר ברקמות סמוכות שאינן סרטניות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוחים אבחנתיים חוקרים וניתוחי הישרדות המבוססים על ביטוי hsa-mir-192 ב-TCGA. (A–C) עקומות הישרדות קפלן-מייר. ניתוח ההישרדות לא תמך בקשר פרוגנוסטי מובהק. (D) עקומת ROC לאפליה בין גידול לרקמה נורמלית בקוהורט ה-TCGA. יש לפרש את ה-AUC בזהירות בשל המספר הקטן של דגימות נורמליות. נא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סריקת גנים מטרים מועמדים ואנליזת אינטראקציות חלבונים. (A) דיאגרמת ונ המראה את החפיפה בין חיזוי מטרות של miRNA לבין גנים עם ביטוי דיפרנציאלי מ-GSE89076 ו-GSE156355. (B) רשת אינטראקציות חלבון-חלבון של 93 הגנים המועמדים. הצמתים מייצגים גנים, והקשתות מייצגות קשרי גנים שחזו או אותם ביצעו קיורציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סריקת גני-מפתח (Hub-genes) מרשת מטרות המועמדות. (A,B) מודולי רשת שזוהו באמצעות סריקת מודולים. (C) דירוג גני-מפתח המבוסס על קישוריות הרשת. (D) מטרות גני-מפתח מועמדות שנשמרו לאחר שילוב הסריקה המבוססת על המודול ועל דרגת הקישוריות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מונחי העשרה נבחרים של GO ו-KEGG עבור גנים מועמדים ומודולים משמעותיים של הרשת. תרשים הבועות מסכם תפקודי ביולוגיה ומסלולים מועשרים מייצגים. תוצאות ההעשרה הן גששיות ודורשות תיקוף ניסויי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות טרנספקציה של תאי HT29. (A) תאי HT29 מייצגים. (B) תמונת פלואורסצנציה של תאי HT29 שעברו טרנספקציה עם miR-192-5p mimic. (C) תמונת פלואורסצנציה של תאי HT29 שעברו טרנספקציה עם בקרת שלילה con238. Scale bar = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: בדיקת ריפוי פצעים בתאי HT29. (A) תמונות שריטה מייצגות ב-0 שעות, 24 שעות ו-48 שעות בתאי HT29 שלא עברו טרנספקציה, תאי HT29 שעברו טרנספקציה של miR-192-5p mimic, ותאי HT29 שעברו טרנספקציה של con238. (B) כימות של קצבי ריפוי הפצעים ב-24 שעות ו-48 שעות, המוצגים כאחוזים. סרגל קנה מידה = 100 µm. נא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: מתאם בין ביטוי TCGA miR-192 לבין ציוני חתימות הקשורות למערכת החיסון בדגימות גידולי CRC. הניתוח הראה קשרים חיסוניים הטרוגניים, עם מספר מתאמים שליליים חלשים, ובעיקר עבור חתימות של תאי eosinophil ותאי Th17, מתאמים חיוביים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| מאפיינים | ביטוי נמוך של TCGA miR-192 | ביטוי גבוה של TCGA miR-192 | ערך p | שיטה |
| n | 308 | 308 | ||
| שלב T, מספר (%) | 0.11 | Chisq.test | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| שלב N, מספר (%) | 0.019 | Chisq.test | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| שלב M, מספר (%) | 0.932 | Chisq.test | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| גיל, חציון (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | Wilcoxon |
טבלה 1: הקשר בין קבוצות ביטוי של TCGA miR-192 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים ב-CRC. קבוצות ביטוי גבוה ונמוך הוגדרו על פי הרמה החציונית של ביטוי TCGA miR-192. בטבלה המסוכמת, שלב N וגיל היו משמעותיים, בעוד ששלב T ושלב M לא היו משמעותיים.
טבלה נלווית 1: תוצאות ניתוח חוזר של מעבדת יבש (Dry-lab) שהופקו עבור מחקר זה. חוברת העבודה כוללת השוואות ביטוי של TCGA/GDC, ניתוחי רגישות של ROC מאוזנים, ניתוחי leave-one-normal-out, ניתוחי קשר קליני-פתולוגי, ניתוחי הישרדות, סיכומי ביטוי ומתאם של hub-genes, ותוצאות מתאם של חתימה חיסונית.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
תיקיית השלמה 1: נתונים ניסיוניים גולמיים התומכים בניסויי ה-qRT-PCR, הטרנספקציה של התאים וריפוי הפצעים. קבצים אלו כוללים ערכי Ct מקוריים של qRT-PCR, נתוני ציטומטריה זרימה/טרנספקציה, מדידות של רוחב הפצע ותמונות מיקרוסקופיה מייצגות ששימשו לניתוחים המוצגים במאמר.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
מחקר זה העריך את הרלוונטיות הקלינית והביולוגית של miR-192-5p ב-CRC באמצעות שילוב של ניתוח מאגרי נתונים ציבוריים, תיקוף רקמות מקומי, חיזוי רשת מטרות, ניתוח חתימה חיסונית וניסויי נדידה in vitro. בניתוחים נעשה שימוש בהגדרות דגימות מאושרות של TCGA, הפרדה בין COAD ל-READ במידת האפשר, ערכי miRNA של log2(RPM + 1), הבחנה בין השוואות מזווגות לבלתי מזווגות, בדיקת חוסן של ROC, והוספת ניתוחי רגישות של RNA-seq לגנים מרכזיים (hub-genes). הממצא המרכזי הוא שאות ה-miR-192 במאגר הציבורי TCGA/GDC ותוצאות ה-qRT-PCR המקומיות של miR-192-5p בוגר מצביעות על כיווני ביטוי מנוגדים, מה שמדגיש את הצורך להבחין בין הערות של מקדימים (precursors) ברמת מסד הנתונים לבין מדידות של miRNA בוגר9,11.
אין להסביר אי-התאמה זו אך ורק על ידי גדלי מדגם לא שווים. קבוצת הנורמה ב-TCGA הייתה קטנה, אך ניתוחים לא מזווגים, מזווגים, ניתוחים של COAD בלבד ו-READ בלבד הראו כולם את אותה מגמה של ביטוי גבוה יותר בגידול ב-TCGA/GDC. מספר גורמים עשויים לתרום לכך, כולל הבדלים במקור המדגמים, פלטפורמות של ריצוף לעומת qRT-PCR, אנוטציה של hsa-mir-192 ברמת בסיס הנתונים לעומת מדידה של hsa-miR-192-5p בוגר, עיבוד RNA, טוהר הגידול, הגדרת רקמה סמוכה ומאפייני אוכלוסייה. חששות דומים בנוגע לפרשנות של סמנים ביולוגיים והטרוגניות של גידולים הודגשו במחקרי CRC5,6,7,8. לפיכך, הממצאים תומכים בפרשנות של miR-192-5p ב-CRC התלויה בהקשר ובפלטפורמה, ולא בכיוון ביטוי אוניברסלי יחיד.
יש לפרש את הניתוח האבחנתי בזהירות. למרות שניתוח ה-ROC המבוסס על TCGA הניב AUC גבוה, ההשוואה כללה דגימות גידול רבות יותר מדגימות נורמליות, עם 11 דגימות נורמליות בלבד בקוהורט המאוחד של COADREAD. דגימה מחדש מאוזנת הראתה עדיין ערכי חציון גבוהים של AUC, אך הרווחים היו רחבים מכיוון שכל השוואה מאוזנת הוגבלה על ידי הקבוצה הנורמלית הקטנה. לכן, תוצאת ה-ROC תומכת בהפרדה חוקרת בין גידול לנורמה בתוך TCGA/GDC, אך אינה מספיקה כדי לבסס את miR-192-5p כסמן ביולוגי אבחנתי קליני. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם ההבחנה הכללית בין אותות של סמנים ביולוגים חוקרים לבין סמנים ביולוגים אבחנתיים או פרוגנוסטיים המהווים תקיפים קלינית4,8.
ניתוח הישרדות לא הראה קשר מובהק בין ביטוי miR-192 לבין הישרדות כללית ב-COADREAD, COAD או READ. בניתוח הנוכחי, miR-192 עשוי להיות קשור למשתנים קליניקו-פתולוגיים נבחרים, אך הנתונים הזמינים אינם תומכים במסקנה חזקה לגבי תפקידו כסמן ביולוגי פרוגנוסטי. הבחנה זו היא חשובה כיוון שסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים דורשים ראיות לכך שסטטוס הסמן קשור לתוצאה באופן עצמאי וניתן לשחזור בהקשרים רלוונטיים מבחינה קלינית8.
בדיקת ריפוי פצעים in vitro מספקת ראיה תפקודית לכך שביטוי יתר של miR-192 יכול להפחית את נדידת תאי HT29. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם תפקוד פוטנציאלי כמדכא גידול בתאי CRC ועם כיוון התוצאות ב-qRT-PCR המקומי. עבודות קודמות תמכו אף הן בתפקידם של miRNAs, כולל מסלולים הקשורים ל-miR-192, בבקרת מעבר אפיתלי-מזנכימלי (epithelial-to-mesenchymal transition), גורל התא ופנוטיפים הקשורים לנדידה15,16,17. עם זאת, הנתונים התפקודיים נותרו חסרים. תיקוף נוסף במעבדה (wet-lab) יהיה נחוץ כדי לתמוך במודל מכניסטי של דיכוי גידולים, כולל חזרות על טרנספקציות בלפחות קו תאי CRC נוסף אחד, בקרות פרוליפרציה לבדיקות ריפוי פצעים, בדיקות נדידה/פלישה ב-Transwell, תיקוף של מטרות נבחרות באמצעות dual-luciferase, מדידות של mRNA וחלבונים של המטרות, וניסויי הצלה (rescue experiments).
יש להתייחס לניתוח גני הצומת (hub-gene analysis) כמייצר השערות. השלמה באמצעות נתוני RNA-seq מ-TCGA הראתה הבדלי ביטוי חזקים בין גידול לרקמה נורמלית עבור גני הצומת שנשמרו, אך המתאמים שלהם עם miR-192 היו מעורבים. מספר גנים של מחזור התא, כולל CDCA5, CCNB1 ו-CDK1, נמצאו במתאם חיובי ולא שלילי עם miR-192, דבר שאינו תואם מודל פשוט של דיכוי ישיר של מטרה על ידי miRNA. לעומת זאת, PLP1, NRXN1 ו-KIF5C הראו מתאמים שליליים. תוצאות אלו תומכות ברלוונטיות הביולוגית של הרשת, אך מעידות כי לא ניתן להסיק על קיום של מיקוד ישיר ללא תיקוף באמצעות לוקיפראז, רמת חלבון וניסויי הצלה (rescue). פרשנות זהירה זו עולה בקנה אחד עם אופיה המחקרי של ניתוחי רשת-מטרות in silico10,11.
הניתוח החיסוני תומך עוד יותר בפרשנות זהירה. ציוני חתימה חיסונית ב-RNA-seq של הגידול הראו כי ביטוי של miR-192 נמצא במתאם שלילי עם מספר חתימות חיסוניות ובמתאם חיובי בעיקר עם חתימות של eosinophil ותאי Th17. מרבית המתאמים היו חלשים, גם לאחר תיקון של שיעור התגליות השגויות (false-discovery rate). מכיוון ששיטות של חתימה חיסונית מסיקות העשרה של מסלולים או מצבי תאים מנתוני ביטוי כוללים (bulk expression), יש להתייחס לממצאים אלו כגששייים והם דורשים תיקוף באמצעות גישות אורתוגונליות של פרופיל חיסוני13.
למחקר זה מספר מגבלות. ראשית, קבוצת התיקוף המקומית הייתה קטנה יחסית והגיעה ממרכז רפואי יחיד. שנית, ניתוח מאגרי הנתונים הציבוריים ותיקוף ה-qRT-PCR המקומי השתמשו בפלטפורמות וברמות מדידה שונות. שלישית, מספר דגימות ה-miRNA-seq הנורמליות מ-TCGA היה נמוך, דבר המגביל את ההסקה האבחנתית. רביעית, ניתוחי הגנים המרכזיים (hub-genes) והניתוחים האימונולוגיים היו חישוביים ודורשים תיקוף ניסויי. חמישית, הניסויים התפקודיים הזמינים היו מוגבלים לנתוני ריפוי פצעים בתאי HT29. מגבלות אלו מצדיקות את הצגת המחקר כניתוח גישושי משולב ולא כראיה חלוטה לכך ש-miR-192-5p הוא ביומרקר אבחנתי, פרוגנוסטי או מכניסטי מתוקף ב-CRC6,8.
לסיכום, נראה כי miR-192-5p רלוונטי ביולוגית ל-CRC, אך תבנית הביטוי שלו והפרשנות הקלינית שלו הן מורכבות. ניתוח של TCGA/GDC הראה אות miR-192 גבוה יותר בדגימות גידול של CRC, בעוד ש-qRT-PCR בקוהורט מקומי של רקמות זוגיות הראה ביטוי נמוך יותר של miR-192-5p בוגר. ניתוח ROC הצביע על הפרדה ראשונית בין גידול לרקמה נורמלית, אך הוגבל בשל הקבוצה הנורמלית הקטנה ב-TCGA. לא נצפה קשר משמעותי להישרדות כוללת. ניתוחי Hub-gene ומערכות חיסוניות מספקים ראיות המגבשות היפותזות, ונתוני ריפוי פצעים בתאי HT29 מרמזים כי העלאה (upregulation) של miR-192-5p עשויה להפחית נדידת תאים. נדרשות קוהורטים עצמאיים נוספים וניסויי מעבדה ממוקדים לפני שניתן יהיה להחשיב את miR-192-5p כסמן ביולוגי מאושר לאבחון, לפרוגנוזה או למנגנון תאי ב-CRC.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר עליו.
תודות
המחברים מודים למעבדת האבחון המולקולרי של גידולי אוניברסיטת הרפואה של מונגוליה הפנימית על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי של ועדת הבריאות העירונית של יאנצ'נג (מענק מס' YK2023101), אשר מימן גם את דמי עיבוד המאמר.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25%+2:60 trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-054-1 | עיכול/מעבר תאים |
| 10% ammonium persulfate | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | ריאגנט SDS-PAGE |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | ריאגנט SDS-PAGE |
| 4x protein loading buffer | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | הכנת דגימת חלבון |
| מקפיא בטמפרטורה נמוכה מאוד -80 C | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | אחסון דגימות |
| Anti-Myc mycoplasma removal reagent | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | דקונטמינציה של מיקופלסמה |
| ערכות פריימרים ל-ARL2, BATF2, MEN1, ו-beta-actin | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | פריימרים ל-mRNA qPCR |
| קורא מיקרופלט אוטומטי | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | מדידת absorbance |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | כימות חלבון |
| מטודת בטיחות ביולוגית / שולחן נקי | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | תרבית תאים אספטית |
| תא ספירה של תאים / המוציטומטר | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | ספירת תאים |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | בדיקת פרוליפרציה של תאים/ציטוטוקסיות |
| בקבוקי תרבית תאים, פלטות תרבית, מבחנות צנטריפוגה וטיפים לפיפט | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | מתכלים כלליים לתרבית תאים |
| Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | ניתוח מחזור תא/אפופטוזיס בציטומטריה זרימתית |
| אינקובטור CO2 לתאים | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | תרבית תאים |
| con238 negative-control oligonucleotide | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | בקרת טרנספקציה |
| תוכנת Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | ויזואליזציה של מודול רשת וגנים מרכזיים (hub-genes) |
| מערבל מגנטי תרמוסטטי דיגיטלי | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | הכנת תמיסות |
| תנור ייבוש תרמוסטטי חשמלי | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | תמיכה בייבוש/סטריליזציה |
| מערכת אלקטרופורזה | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | אלקטרופורזה של ג'ל |
| מערכת להעברה חשמלית | Hoefer | TE77XP | העברת חלבון |
| סרום עוברי בקר | Biological Industries | 04-001-1ACS | תוסף לתרבית תאים |
| ציטומטר זרימתי | ACEA Biosciences | NovoCyte | ציטומטריה זרימתית |
| מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | דימוי תאים ופצעים |
| פורטל GDC/TCGA | National Cancer Institute | Open-access database | נתונים ציבוריים של miRNA-seq, RNA-seq ונתונים קליניים |
| מאגר נתוני GEO | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 and GSE156355 | מאגרי נתונים ציבוריים של ביטוי גנים |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9 | ניתוח סטטיסטי וגרפיקה |
| צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | הכנת דגימות |
| תאי HT29 | Authors' laboratory cell stock | Not applicable | שורת תאי סרטן מעי-רחם אנושית |
| תוכנה לניתוח תמונות | ImageJ | Not applicable | כימות רוחב פצע |
| מערכת דימוי | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | דימוי ג'ל/בלוט |
| מערכת IncuCyte S3 לתצפית דינמית על תאים וניתוח תפקודי | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | דימוי תאים חיים/ניתוח תפקודי |
| אמבט מים תרמוסטטי חכם | Leica | HI1210 | דגירה בבקרת טמפרטורה |
| לנטי-וירוס וריאגנט הדבקה | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | טרנסדוקציה יציבה של תאים |
| פיפטות ידניות | Gilson | PIPETMAN P | טיפול בנוזלים |
| McCoy's 5A basal medium | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | תווך תרבית לתאי HT29 |
| צנטריפוגה רפואית | Zhuhai manufacturer not specified | 3200 | הכנת דגימות |
| מקרר-מקפיא רפואי | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | אחסון ריאגנטים/דגימות |
| Meilunbio Fixer Supersensitive ECL Chemiluminescence Substrate | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | MA0186 | זיהוי אימונובלוט |
| מיני-צנטריפוגה | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | הכנת דגימות |
| ערכות פריימרים ל-miR-192-5p ו-U6 | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | Custom synthesized | פריימרים ל-miRNA qPCR |
| miR-192-5p mimic | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | אוליגוניוקלאוטיד לטרנספקציה זמנית |
| miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | KR211 | שעתוק הפוך של miRNA |
| miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation Kit (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | FP411 | miRNA qPCR |
| miRWalk | Public database | Web database | מאגר לחיזוי מטרות miRNA |
| ממברנת ניטרוסלולוז | Millipore | HATF00010 | ממברנת העברה לחלבונים |
| חלב רזה מיובש | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | ריאגנט חסימה לאימונובלוט |
| רקמות סרטן מעי-רחם צמודות לרקמות לא סרטניות | Authors' institution | Not applicable | דגימות קליניות |
| מבחנות PCR | Corning | PCR-02-C | הכנת PCR/qRT-PCR |
| תמיסת פניצילין-סטRepartition | Biological Industries | 03-031-1B | אנטיביוטיקה לתרבית תאים |
| PerfectStart Uni RT&qPCR Kit | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | AUQ-01 | שעתוק הפוך של mRNA ו-qPCR |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | בופר לשטיפת תאים |
| סמן חלבון צבוע מראש | Fermentas | 26619 | סמן משקל מולקולרי לחלבון |
| מערכת להכנת מים טהורים | China Moer | Not available | הכנת מים טהורים |
| Puromycin | Phygene | PH1143 | סלקציה של תאים שעברו טרנסדוקציה |
| תוכנת R | R Foundation for Statistical Computing | Version 3.6.3 | ניתוח סטטיסטי וביואינפורמטיקה |
| בופר העברה מהירה | Crisbio | Not applicable | העברה חשמלית של חלבון |
| מערכת PCR כמותית עם פלואורסצנציה בזמן אמת | Applied Biosystems (ABI), USA | Not available | זיהוי qRT-PCR |
| בופר ליזיס RIPA | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | מיצוי חלבון |
| מבחנות מיקרוצנטריפוגה נקיות מ-RNase | Corning | 3208 | טיפול ב-RNA |
| תווך קריו-שימור תאים ללא סרום | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | קריו-שימור של תאים |
| SPSS Statistics | IBM | Version 25 | ניתוח סטטיסטי |
| מדלל נוגדנים מיוצב | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Not applicable | דילול נוגדנים ראשוניים/שניוניים |
| טיפים סטריליים לפיפט | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | כלי לשריטה עבור בדיקת ריפוי פצעים |
| מאגר נתוני STRING | STRING Consortium | Web database | ניתוח רשת אינטראקציות חלבונים |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | ריאגנט SDS-PAGE |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | ET111-01 | מיצוי RNA |
| בופר Tris-HCl, pH 6.8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | בופר ג'ל ריכוז (stacking-gel) ל-SDS-PAGE |
| בופר Tris-HCl, pH 8.8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | בופר ג'ל הפרדה (resolving-gel) ל-SDS-PAGE |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | ריאגנט שטיפה לאימונובלוט |
| סטריליזטור קיטור אנכי | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | סטריליזציה |
מקורות
- Sung, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 69 (1), 7-34 (2019).
- Issa, I. A., Noureddine, M. Colorectal cancer screening: an updated review of the available options. World J Gastroenterol. 23 (28), 5086-5096 (2017).
- Song, L., Jia, J., Peng, X., Xiao, W., Li, Y. The performance of the SEPT9 gene methylation assay and a comparison with other CRC screening tests: a meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 3032 (2017).
- Linnekamp, J. F., Wang, X., Medema, J. P., Vermeulen, L. Colorectal cancer heterogeneity and targeted therapy: a case for molecular disease subtypes. Cancer Res. 75 (2), 245-249 (2015).
- Sveen, A., Kopetz, S., Lothe, R. A. Biomarker-guided therapy for colorectal cancer: strength in complexity. Nat Rev Clin Oncol. 17 (1), 11-32 (2020).
- Whiffin, N. et al. Identification of susceptibility loci for colorectal cancer in a genome-wide meta-analysis. Hum Mol Genet. 23 (17), 4729-4737 (2014).
- Ballman, K. V. Biomarker: predictive or prognostic? J Clin Oncol. 33 (33), 3968-3971 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Forterre, A., Komuro, H., Aminova, S., Harada, M. A comprehensive review of cancer microRNA therapeutic delivery strategies. Cancers (Basel). 12 (7), 1852 (2020).
- Ren, F. J., Yao, Y., Cai, X. Y., Fang, G. Y. Emerging role of miR-192-5p in human diseases. Front Pharmacol. 12, 614068 (2021).
- Nagy, Z. B. et al. Colorectal adenoma and carcinoma specific miRNA profiles in biopsy and their expression in plasma specimens. Clin Epigenetics. 9, 22 (2017).
- Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14 (1), 7 (2013).
- Staiteieh, S. A. et al. Study of microRNA expression profiling as biomarkers for colorectal cancer patients in Lebanon. Mol Clin Oncol. 16 (2), 39 (2022).
- Przygodzka, P. et al. Regulation of miRNAs by Snail during epithelial-to-mesenchymal transition in HT29 colon cancer cells. Sci Rep. 9 (1), 2165 (2019).
- Sun, C. Y., Zhang, X. P., Wang, W. Coordination of miR-192 and miR-22 in p53-mediated cell fate decision. Int J Mol Sci. 20 (19), 4768 (2019).
- Zhao, L., Wang, B., Sun, L., Sun, B., Li, Y. Association of miR-192-5p with atherosclerosis and its effect on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Mol Biotechnol. 63 (12), 1244-1251 (2021).