כאן אנו מציגים פרוטוקול נתיחה המשמר את בלוטת האצטרובל, שלעיתים קרובות אובדת בעת הוצאת המוח מהגולגולת. פרוטוקול זה מבטיח את שימורה של בלוטת האצטרובל בהכנות של מוח עכבר עוברי ובשלבים מוקדמים לאחר הלידה עבור יישומים המשכיים, הכוללים אימונוהיסטוכימיה, in situ hybridization וטרנסקריפטומיקה מרחבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימור בלוטת האצטרובל בהכנות של מוח עכבר בתקופה הפרינטלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבלוטה האצטרובלית, מבנה נוירואנדוקריני המפריש מלטונין, נוצרת מרקמה ראשונית (anlage) בקו האמצע הגבי של המוח הקדמי העוברי. ביום עוברי (E) 14.5 בעכבר, נראה דיברטיקולום אצטרובלים הבולט החוצה מגג הדיאנצפאלון בין השקיקים הטלנצפאלים הזוגיים. דיברטיקולום זה נמצא במגע הדוק עם רקמת סחוס, קרומי מוח ורקמה וסקולרית העלונות לו. קל לאבדו אותו כאשר פותחים את קמחרת הגולגולת כדי להוציא את המוח בשלבים עובריים מאוחרים או בשלבים פוסט-נטאלים מוקדמים. למרות תפקידה הנוירואנדוקריני החשוב, ההתפתחות המוקדמת של הבלוטה האצטרובלית ומנגנוני האיתות המווסתים תהליך זה נותרו לא מובנים דיו, בין השאר בשל הקושי לשמר מבנה זה שלם במהלך השלבים העובריים של התפתחות מוח העכבר.
מאמר זה מציג פרוצדורת ניתוח חדשנית המשמרת את בלוטת האצטרובל (pineal gland) תוך שמירה על שלמותה המבנית ועל חיבורה לתקרת הדיאנצפאלון (diencephalon) במהלך בידוד המוח משלבים עובריים ועד ליום postnatal (P) 7. הפרוצדורה מודגמת באמצעות מוח עכבר E18.5 ולכן היא מתאימה ליישומים המשכיים הדורשים שימור של ארכיטקטורת הרקמה, כולל היברידיזציה in situ, אימונוהיסטוכימיה וטרנסקריפטומיקה מרחבית. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם לבידוד בלוטת האצטרובל המתפתחת, ובכך לשפר את הייצוג הספציפי של הבלוטה בניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, דבר המהווה אתגר בשל גודלה הקטן.
מבוא
הבלוטה האפיתלית (pineal gland) היא מבנה נוירואנדוקריני קטן הממוקם בקו האמצע הגבי של מוח חולייתנים, והיא ממלאת תפקיד מרכזי בויסות הפיזיולוגיה הצירקדית באמצעות הפרשה מחזורית של מלטונין1,2. במהלך האמבריוגנזה של יונקים, הבלוטה האפיתלית נוצרת מקו האמצע הגבי של המוח הקדמי המתפתח. בעכברים, התפתחות הבלוטה האפיתלית מתחילה כאשר אזור מיוחד של הנוירואפיתל הדיאנצפלי הגבי יוצר את ה-pineal anlage/pineal recess, אשר בעקבות זאת מבצע מבליטה (evagination) ליצירת ה-pineal diverticulum ביום עוברי (E) 14.53,4,5. דיברטיקולום זה מחובר לתקרת הדיאנצפאלון ונראה בין השקיקים הטלנצפליים הזוגיים. ככל שההתפתחות נמשכת, דיברטיקולום זה הופך לקשור באופן הדוק למבנים העלונים בקו האמצע הגבי של המוח, ובמיוחד לסינוס הסגיטלי העליון (SSS) ולסינוס הרוחבי (TS), שהם תעלים ורידיים העוברים לאורך פניו הגביים של המוח הקדמי6. הבלוטה האפיתלית המתפתחת שוכנת מיד מתחת למפגש שבין ה-SSS ל-TS, והחיבור העדין שלה לדיאנצפאלון הגבי פגיע במיוחד כאשר המבנים הווסקולו-מנינגיאליים העלונים מוסרים כדי להוציא את המוח מתוך קמני הגולגולת7. עובדה זו הופכת את הבלוטה האפיתלית לרגישה במיוחד לנזקים, שכן היא עלולה להיקרע בעת פתיחת קמני הגולגולת לצורך הוצאת המוח. כתוצאה מכך, הבלוטה האפיתלית אובדת לעיתים קרובות במהלך נתיחות שגרה, דבר המגביל את ניתוח המבנה וההרכב המולקולרי שלה בדגימות שלמות.
כאן אנו מתארים פרוטוקול שלב-אחר-שלב לדיסקציה של מוח עכבר תוך שימור בלוטת האצטרובל (pineal gland) והחיבור שלה לגג הדיאנספאלון (diencephalon). השיטה ישימה לשלבים עובריים החל מ-E16.5 ועד לשלבים פוסט-נטאלים מוקדמים (P7), והיא מתאימה למחקרים של התפתחות בלוטת האצטרובל באמצעות היברידיזציה in situ, אימונוהיסטוכימיה וטרנסקריפטומיקה מרחבית. כהדגמה של יישומים המשכיים, מוצגות היברידיזציה in situ ואימונוהיסטוכימיה עבור הסמן CRX המועשר בבלוטת האצטרובל.
החידוש המרכזי בשיטה זו הוא צמצום העומס על מבני קו האמצע על ידי הסרה זהירה של חיבורים פיזיים שאלמלא כן היו גורמים לקריעת בלוטת האצטרובל בעת הוצאת המוח מהגולגולת. זהו שיפור לעומת הפרוצדורה הסטנדרטית.
שיטת הניתוח זו מוגבלת לשלבים עד P7 מכיוון שההסמכה (ossification) הדרגתית של קמרה הגולגולת במהלך ההתפתחות הפוסטנטלית המוקדמת מגבירה את קשיחות הגולגולת ומחזקת את הקשרה למבנים וסקולריים וקרומיים. בעוד שמספר מחקרים תיארו הליכי ניתוח של בלוטת האצטרובל במכרסמים בוגרים8, מעטים מאוד התמקדו בשימור בלוטת האצטרובל במהלך השלבים העובריים והפוסטנטליים המוקדמים, כאשר הבלוטה שברירית במיוחד ופגיעה לנזק במהלך בידוד המוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים המוסדית של Tata Institute of Fundamental Research.
1. הכנת החומרים
- יש לוודא שכל המכשירים הדרושים למיקרו-דיסקציה (ראו את טבלת החומרים) מוכנים לפני הפרוצדורה. יש לעקר את כל המכשירים באמצעות 70% ethanol. עבור איסוף דגימות ליישומים המשכיים כגון טרנסקריפטומיקה מרחבית/היברידיזציה in situ, יש לנגב את המכשירים בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase.
- יש לנקות את בסיס מיקרוסקופ הדיסקציה בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase ולהחזיק בקבוק של 1× PBS קר במקרר בהישג יד ליד שולחן הדיסקציה.
- יש להכין את המכשירים והכלי הפלסטיים הבאים לפני פרוצדורה זו:
- להכנת בעל החיים, יש להכין את הדברים הבאים: 2 זוגות פינצטות קהות, זוג מספריים כירורגיים, 2 צלחות פטרי (10 cm), ומספר צלחות פטרי (6 cm; לפי הצורך, אחת לכל ראש).
- לבידוד המוח, יש להכין את הדברים הבאים: זוג פינצטות #5, זוג פינצטות #5, זוג מספרי מיקרו-דיסקציה, ומבחנות/צלחות איסוף המתאימות ליישום ההמשכי.
- הערה: אם היישום ההמשכי כולל היברידיזציה in situ או טרנסקריפטומיקה מרחבית, יש לנקות את מכשיר הדיסקציה בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase לפני השימוש.
2. הכנת בעלי החיים
- בצעו את השלבים (2.1.1– 2.1.6) עבור חיות בשלבים E14.5–P0
- בצעו המתנזיה לנקבה ההרה בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים מוסדית. בדוגמה המוצגת, ההמתנזיה בוצעה על ידי פריקה של חוליות הצוואר.
- בצעו חתך בקו האמצע של חל הבטן של הנקבה ההרה כדי לחשוף את הרחם. באמצעות פינצטה קהה, שלפו בעדינות את קרני הרחם והניחו אותן בצלחת סטרילית של 10 cm המכילה 1× PBS קר מאוד.
- בודדו בזהירות כל עובר בנפרד על ידי הפרדתו משקית השית ומהשלייה שסביבו.
- העבירו את העוברים לצלוחית פטרי נקייה של 10 cm המכילה 1× PBS קר מאוד ושמרו אותם על קרח עד שכל אחד מהם יילקח לבידוד המוח. העבירו עובר בודד לצלוחית פטרי של 6 cm המכילה PBS קר מאוד.
- עבור שלבים פוסט-נטאלים עד P7, בצעו המתנזיה לגור בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים מוסדית. לאחר מכן המשיכו משלב 2.1.6 ואילך.
- באמצעות מספריים כירורגיים, הפרידו את הראש מהגוף באופן שבו המוח האחורי נשאר בחלק של הראש כדי להגן על המוח הקדמי מפני נזק מקרי.
- שטפו את הראש ב-PBS קר להסרת הדם. העבירו לצלוחית פטרי נקייה של 6 cm המכילה 1× PBS קר מאוד. השאירו את הראש טבול ב-PBS כדי לאפשר שטיפה של דם ושאריות במהלך שלבי הניתוח הבאים.
3. פרוצדורת נתיחה לבידוד המוח עם בלוטת האצטרובל שלמה
הערה: יש לבצע את כל השלבים להלן באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. כווננו את ההגדלה ל-2× לפחות (או לפי הצורך) כדי להבחין בבירור במוח ובמבנים הסובבים אותו לאורך כל הדיסקציה. יש לבצע את כל תהליך הדיסקציה ב-PBS קר מאוד (בטמפרטורת קרח) כדי למזער את הפירוק של RNA וחלבונים. בשלבים 3.1–3.10, השתמשו ביד הלא-דומיננטית כדי להחזיק את הראש בצורה איתנה ולייצב אותו לאורך הפרוצדורה בהתאם להוראות בשלב 3.1. את שלבים 3.2–3.9 יש לבצע כאשר היד הלא-דומיננטית מייצבת את הראש, והיד הדומיננטית משמשת לביצוע פעולות עדינות, תחילה באמצעות פינצטה מסוג #5, ולאחר מכן במעבר לפינצטה מסוג #55 או למספרי מיקרו-דיסקציה כפי שצוין עבור כל שלב.
- השתמש בפינצטה מס' 5 ביד הלא-דומיננטית. הכנס את שתי השיניים אל שקעי העיניים בתנועה נחרצת כלפי מטה. שמור על לחץ כלפי מטה כדי לקבע את המוח לתחתית צלחת הפטרי עד לסיום שלב 3.9.
הערה: המוח מונח מעל שקעי העיניים ואינו מושפע מהכנסת הפינצטה לשקעי העיניים. שמירה על לחץ קבוע כלפי מטה מייצבת את המוח לאורך כל תהליך הנתיחה. - באמצעות היד הדומיננטית, תלוש והסר את העור המכסה את הראש בעזרת פינצטה מס' 5.
הערה: בשלב זה, ניתן לראות את ה-chondrocranium החלק המכסה את המוח. - הסר את חלק ה-chondrocranium המכסה את המוח האמצעי והמוח האחורי באופן הבא:
- השתמש בפינצטה מס' 5 כדי לבצע שתי חתכים חודרים ב-chondrocranium משני צידי המוח האמצעי, בדיוק בנקודת המפגש שלו עם ה-telencephalon.
- החלק שן אחת של פינצטה מס' 5 באופן משיקי תחת ה-chondrocranium לאורך הקו המשיקי הדמיוני המפריד בין ה-telencephalon למוח האמצעי. אחז חזק וקרע את ה-chondrocranium.
- המשיך בהסרת ה-chondrocranium כך שהמוח האמצעי והמוח האחורי ייחשפו.
- עבור לשימוש בפינצטה מס' 5. הכנס שן אחת בדיוק מתחת לשפה של השוליים הזנביים (caudal) של ה-chondrocranium המכסה את ה-telencephalon. הפרד בעדינות את ה-chondrocranium על ידי ניתוק所有 קשרים עם רקמות כלי דם וקרומי מוח (meningeal).
- בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה, חתוך לאורך קו האמצע הגבי של ה-telencephalon לכיוון הבצלול (olfactory bulb). בעזרת פינצטה מס' 55 סגורה, נקה בעדינות את כל ההיצמדויות של ה-chondrocranium למוח. הפרד בין שני חלקי ה-chondrocranium המכסים את המיספרות של ה-telencephalon בעזרת פינצטה מס' 5.
הערה: בשלב זה, ניתן לראות את ה-SSS כוריד אדום כה לאורך השוליים העליונים של ה-chondrocranium במוח, ואת ה-TS נראה בניצב ל-SSS. - בלוטת האצטרובל (pineal gland) נמצאת ממש מתחת ל-SSS. בצע חתך בקצה הרוסטרלי (rostral) של ה-SSS בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה.
- בעזרת פינצטה מס' 5, הסר לחלוטין את החלק הגבי של ה-chondrocranium מכל צד כדי לחשוף טוב יותר את בלוטת האצטרובל, את ה-SSS ואת ה-TS.
- בצע שני חתכים ב-TS משני צידי בלוטת האצטרובל, בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה. בעזרת פינצטה מס' 5, נתק את ההיצמדויות הלטרליות של ה-TS.
- בעזרת פינצטה מס' 5 סגורה, שחרר בעדינות את החלק הרוסטרלי של המוח מהקמרה הגולגולתית הוונטרלית. החלק את הפינצטה הסגורה תחת הצד הוונטרלי של המוח ושחררו לחלוטין.
- שמור את המוח כשהבלוטה האצטרובלית שלמה, בהתאם לדרישות יישומי המשך.
4. שלבים קריטיים בפרוטוקול
הערה: הצלחתו של פרוטוקול נתיחה זה תלויה בטיפול זהיר בחיבורים כלי הדם המקיפים את בלוטת האצטרובל. הנקודות הבאות הן קריטיות לשמירה על שלמות בלוטת האצטרובל לאורך הליך הנתיחה:
- ייצבו את הראש על ידי החדרת שיני פינצטה מסוג #5 לשני שקעי העיניים ושמרו על לחץ כלפי מטה חזק לאורך שלבים 3.1–3.9. פעולה זו מספקת תמיכה יציבה תוך הימנעות מלחץ ישיר על המוח.
- במהלך הסרת הכונדרוקרניום (שלב 3.3), הימנעו מפעולות משיכה או קילוף מרובות, שכן אלו עלולות להוביל לניתוק בלוטת האצטרובל מהדיאנצפאלון הגבי.
- במהלך ניקוי ההצמדות המנינגיאליות והכליים (שלב 3.4), ובזמן פתיחת הכונדרוקרניום התלנצפלי הגבי (שלב 3.5), השתמשו אך ורק בקצוות של פינצטה מסוג #5. חדירה עמוקה של הפינצטה עלולה לפגוע בבלוטת האצטרובל, השוכנת מיד מתחת לגג התלנצפאלון הזנבי.
- השלימו את חיתוך הסינוס הסגיטלי העליון (שלב 3.6) ואת החיתוך הדו-צדדי של הסינוס הרוחבי (שלב 3.8) לפני הוצאת המוח. חיתוכים אלו מקלים על המתח בתוך הרשת הוורידית הגבית ומונעים קריעה של בלוטת האצטרובל במהלך הוצאת המוח.
- בשלב 3.9, שחררו בעדינות את המוח באמצעות פינצטה סגורה מבלי להביא להפרעה של קו האמצע הגבי. המוח אמור להיפרד בחופשיות מקשת הגולגולת ברגע שכל ההצמדות המנינגיאליות והכליים שוחררו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול נתיחה זה מאפשר בידוד עקבי של מוחות עכברים עובריים ומראשית השלב הפוסט-נטאלי מ-E16.5–P7, כאשר בלוטת האצטרובל נשמרת במיקומה האנטומי הטבעי (איור 1).
הסרה שלבית של ה-chondrocranium, בשילוב עם ניקוי זהיר של היצמדויות קרומיות וכלי דם, מונעת מאמצי גזירה שגויים על בלוטת האצטרובל. יתרה מכך, חיתוך מבוקר של ה-superior sagittal sinus (SSS) בקצתו הרוסטרלית, יחד עם חיתוכים דו-צדדיים ב-transverse sinus (TS), משחררים ביעילות את המתח ברשת כלי הדם הדורסלית. פעולה זו מגנה על...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטות סטנדרטיות לדיסקציה של בלוטת האצטרובל (pineal gland) פותחו עבור מוח של עובר או תינוק אנושי, ובכך הן מסייעות לפתולוגים פורנזיים בהבנת הגורם לתסמונת מוות פתאומי של תינוקות1. פרוטוקולים קודמים הדגימו הסרה של בלוטת האצטרובל יחד עם כלי דם שטחיים, קרומי המוח והפלקס כורואידס (choroid plexus)12; עם זאת, לא תוארו שיטות להשגת שימור אמין של בלוטת אצטרובל שלמה המחוברת לגג הדיאנצפאלון (diencephalic roof) במהלך שלבים מוקדמים של התפתחותה בעכברים או במכרסמים אחרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים לד"ר Shital Suryavanshi ולצוות בית החיות של ה-Tata Institute of Fundamental Research על תמיכתם המצוינת. אנו מודים לד"ר Sundar Naganathan על שאיפשר בנדיבות את השימוש במיקרוסקופ הסטריאו-מאקרו-זום Olympus MVX10 במעבדתו לצורך הקלטת הווידאו של הפרוצדורה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מה-Department of Atomic Energy (DAE), ממשלת הודו, מספרי זיהוי פרויקטים RTI403 ו-RTI4015 (ST); מענק ICMR-DHR SUG, GAP0303, ומענק ANRF PMECRG, GAP0313 (AP).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ שדה בהיר (Brightfield) | Olympus | IX73 | כל מיקרוסקופ שדה בהיר עם מצלמה צבעונית הוא מתאים. |
| מיקרוסקופ קונפוקאלי | Olympus | FV300 | כל מיקרוסקופ קונפוקאלי או מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה הוא מתאים, בהתאם לרזולוציה הנדרשת |
| נוגדן CRX | Invitrogen | PA5-32182 | פרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית המתואר ב-Parichha et al.9. |
| גשמי ת CRX | Custom made | Custom made | פרוטוקול היברידיזציה במקום (in situ hybridization) לפי Parichha et al.10. |
| פינצטה עדינה # 5 | F.S.T | 1251-23 | ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה. |
| פינצטה עדינה # 55 | F.S.T | 125-20 | ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה. |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 1010023 | ניתן להחליף בפריטים דומים מכל חברה. |
| צלחת פטרי | Corning | CLS351029 | ניתן להחליף בפריטים דומים מכל חברה. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | RNaseZap RNase Decontamination Solution הוא תמיסה לדיסאינפקציה של משטחים המשמידה RNases במגע |
| מספריים עם קפיץ (מספריים למיקרו-דיסקציה) | F.S.T | 15020-15 | ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה. |
| מיקרוסקופ סטריאו-זום | Nikon | SMZ745 | כל מיקרוסקופ דיסקציה הוא מתאים |
מקורות
- Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.
- Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.
- Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.
- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
- Estivill-Torrús G, Vitalis T, Fernández-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.
- Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.
- Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice's pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.
- Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.
- Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.
- Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by β-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.
- Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.
- Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.
- Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
