תפקידו של סאנקי בייג'י סאן בהפחתת פגיעה בתאי אפיתל קיבתיים הנגרמת מאתנול באמצעות איתות הקשור ל-PI3K/AKT

סיכום

מחקר זה מתאר מודל במבחנה להערכת ההשפעות המגנות של סאנקי בייג'י סאן מפני פגיעה בתאי אפיתל קיבתיים הנגרמת מאתנול ומעורבותה באיתות הקשורים ל-PI3K/AKT.

תקציר

עבודה זו נועדה להבהיר את מנגנון ההגנה של סאנקי בייג'י סאן (SQBJ) מפני פגיעה בתאי אפיתל קיבתיים הנגרמות על ידי אתנול ולבחון את הרלוונטיות הפוטנציאלית שלו לכיב קיבה (GU). פרמקולוגיית רשת שימשה לסינון הרכיבים הפעילים של SQBJ (מאגר נתונים וניתוח מערכות רפואה סינית מסורתית [TCMSP], זמינות ביולוגית אורלית [OB] ≥ 20%, דמיון תרופות [DL] ≥ 0.1), מיפוי היעדים שלהם (משאב חלבון אוניברסלי [UniProt]), איסוף יעדים הקשורים ל-GU (GeneCards/OMIM/DrugBank), וניתוח יעדים חופפים באמצעות העשרת אונטולוגיית גנים (GO)/אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) ועגינה מולקולרית. תאי קו תאים אפיתל קיבה-1 (GES-1) שנפגעו באתנול טופלו ב-SQBJ או במעכב PI3K LY294002. CCK-8 שימש לקביעת הריכוז האופטימלי של SQBJ. ניתוחי פרמקולוגיה רשתית זיהו 126 מטרות משותפות המועשרות בתוך מפלסים הקשורים ל-PI3K/AKT/MAPK והציעו אינטראקציות פוטנציאליות בין רכיבי SQBJ עיקריים לחלבונים הקשורים ל-PI3K/AKT. בתאים עם אתנול, SQBJ הקל על פגיעות תאי על ידי הפחתת שחרור מתווך דלקתי ולחץ חמצוני, כפי שניתן לראות בירידה במיני חמצן תגובתיים תוך-תאיים וברמות המלונדיאלדהיד. SQBJ החזיר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת תכולת ה-ATP והפחית שינויים הקשורים לאפופטוזיס ברמות חלבוני X-לימפומה של תאי B-2, קספאז-3 שחתך ו-X הקשורים ל-Bcl-2. SQBJ גם מודולציה של סימני איתות PI3K/AKT ו-MAPK. השפעות הגנה אלו נחלשו במידה רבה על ידי LY294002, מה שמרמז כי איתות הקשור ל-PI3K/AKT מעורב בהגנה על ציטו-פרוטקציה בתיווך SQBJ. ממצאים אלו מספקים בסיס מכני במבחנה ליישום פוטנציאלי של SQBJ ב-GU, אם כי נדרש אימות נוסף במודלים בעלי חיים של כיב קיבה מושרה על ידי אתנול.

מבוא

כיב קיבה (GU) הוא הפרעה במערכת העיכול נפוצה מאוד ברחבי העולם, המאופיינת בדלקת מקומית, שחיקה וכיב של רירית הקיבה. על פי הערכות שהתקבלו בניתוח Global Load of Disease (GBD 2021) לשנת 2021, מחלת כיב קיבה (PUD) ממשיכה להטיל נטל קליני וכלכלי משמעותי על מיליוני מטופלים ברחבי העולם. למרות שהשכיחות הכללית של PUD ירדה בעקבות ההסתמכות הקלינית הנרחבת והנרחבת על משטרים אנטי-זיהומיים ומעכבי משאבות פרוטון מדכאות חומצה (PPIs), מגמת הירידה הזו התייצבה, ואף נצפה התאוששות באזורים^{מסוימים 1}. ראוי לציין כי צריכת אלכוהול (אתנול) היא גורם פתוגני קריטי, שאינו תלוי בזיהום הליקובקטר פילורי (H. pylori.) ובשימוש בתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAID). צריכת אלכוהול מופרזת לטווח ארוך פוגעת במחסום הרירית בקיבה, מאיצה את התפתחות הכיב ואף מעלה את הרגישות לממאירות קיבה—ובכך הופכת מצב זה למשבר רפואי בינלאומי קריטי². במדינות מתפתחות, שכיחות פגיעות ריריות קיבה הקשורה לאלכוהול נמצאת בעלייה בשל מספר גורמים, כולל עלייה בצריכת אלכוהול ושינויים באורח החיים, מה שיוצר צורך דחוף באסטרטגיות מניעה וטיפול יעילות ובטוחות.

המנגנון הפתולוגי שמאחורי פגיעת רירית הקיבה הנגרמת מאתנול הוא רב-פקטורי ורב-שכבתי. במגע ישיר עם רירית הקיבה, האתנול מפריע במהירות למחסום הריר-ביקרבונט וגורם לגל בלתי מבוקר של מיני חמצן תגובתי תוך-תאיים (ROS). ההתפרצות החמצונית הזו מפעילה לאחר מכן פרוקסידציה של שומנים (מסומנת על ידי עלייה במלונדיאלדהיד MDA), מדללת נוגדי חמצון אנדוגניים בתוך רירית הקיבה, כולל סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), יחד עם גלוטתיון (GSH), ולבסוף גורמת^לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. ראיות מצטברות מצביעות על כך ש-ROS תוך-תאי המושר על ידי אתנול נגזר בעיקר ממיטוכונדריה והוא קשור קשר הדוק לקריסת פוטנציאל הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה (Δψm) ולעיכוב סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP)⁴. בינתיים, הלחץ החמצוני מפעיל עוד יותר את המפלים הפרו-דלקתיים תחת פיקודו של גורם גרעיני-קאפה B (NF-κB). הפעלה זו מקדמת לאחר מכן שחרור מסיבי של מתווכים דלקתיים, בעיקר פקטור נמק גידול-α (TNF-α), אינטרלוקין-6 (IL-6) וחלבון C-ריאקטיבי (CRP), וכך יוצרת מעגל קסמים של "תגובה דלקתית של לחץ חמצוני"⁵. על בסיס זה, מפל האפופטוטי הפנימי המונע על ידי מיטוכונדריה מופעל, כפי שמעיד הפרעה ביחס Bcl-2 ל-Bax לצד הפיצול הפרוטאוליטי הסדרתי של פרוטאאז ציסטאיניל אספרטט ספציפי 3 (Caspase-3), מה שמוביל בסופו של דבר למוות המוני של תאי האפיתל הרירית בקיבה ולהיווצרות כיבים⁶. בהתאם לכך, מיקוד סימולטני בשלושת הקשרים הפתולוגיים המרכזיים של לחץ חמצוני, תגובה דלקתית ואפופטוזיס מהווה אסטרטגיה מרכזית להתערבות יעילה בפגיעה רירית קיבה אלכוהולית.

מסלול האיתות של פוספונואינוזיטיד 3-קינאז/חלבון קינאז B (PI3K/AKT) מהווה ציר רגולטורי מרכזי השולט באריכות ימים תאית, התרבות ומוות מתוכנת, וממלא תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס רירית קיבה. לאחר ההפעלה, איתות PI3K/AKT מזרחן מספר סובסטרטים במורד הזרם, מעכב את פעילות הגורם הפרו-אפופטוטי Bad, ובכך מונע את בריחת הציטוכרום c ההרסני לתא, שומר על הומאוסטזיס ΔΨm ומקדם את הישרדות התא⁷. יתרה מזאת, קיימת מערכת יחסים אנטגוניסטית מורכבת בין מפל PI3K/AKT לרשתות קינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן (MAPK): ההפעלה המושלמת של PI3K/AKT יכולה להחליש העברת אותות דלקתיים ותגובות מפל אפופטוטי על ידי עיכוב הפעלת קינאזות לחץ, כולל p38, קינאז N-טרמינל c-Jun (JNK) וקינאזות חלבון מוסדרות חוץ-תאית (ERK)⁸. מחקרים רבים הראו כי פעילות מופחתת של מסלול PI3K/AKT קשורה קשר הדוק להחמרה בדלקת ולעלייה באפופטוזיס במודלים של פגיעות ריריות קיבה, בעוד ששיקום פעילות מסלול זה יכול לשפר משמעותית את פגיעת הריר⁹. עם זאת, כיום קיים חוסר באימות ניסויים סיבתיים שיטתיים לגבי מנגנון הרגולציה המדויק של PI3K/AKT בפגיעה רירית קיבה הנגרמת מאתנול, במיוחד הקשר הסינרגטי שלו עם מסלול MAPK.

במונחים של תרופות מודרניות, מעכבי PPI הם האפשרות הראשונה לניהול קליני של GU, אך מתן ארוך טווח העלה חששות בטיחותיים גוברים. מחקרים מצטברים קישרו שימוש כרוני ב-PPI למגוון תוצאות שליליות, כולל מחלות כליות, אירועים קרדיווסקולריים, שברים אוסטאופורטיים, חסרים בחומרים מזינים (ברזל, מגנזיום וויטמין B12), Clostridioides difficile. זיהום, ואפילו סיכון מוגבר לסרטן הקיבה¹⁰. יתרה מזאת, תופעת הפרשה מוחזרת של חומצות קיבה לאחר הפסקת PPI אושרה על ידי נתוני פרמקוביג'ילנס רחבי היקף¹¹. סיכוני בטיחות אלו דחפו את קהילות המחקר הקליני והבסיסי לחקור באופן פעיל טיפולים חלופיים עם מנגנוני הגנה מרובי מטרות, מינימום תופעות לוואי והתאמה לשימוש ארוך טווח. במיוחד, תכשירים טבעיים מהרפואה הסינית המסורתית (TCM) זכו לתשומת לב רבה בשל הקונספט הטיפולי ההוליסטי שלהם של פעולה "רב-רכיבים, רב-מטרות ורב-מסלולים"¹².

אבקת סאנקי בייג'י (SQBJ) היא נוסחת תרכובת מסורתית קלאסית המורכבת מ-Panax notoginseng ו-Bletilla striata ביחס מסה של 1:1. פאנקס נוטוגינסנג ידוע בהשפעותיו בקידום זרימת הדם ועצירת דימום, וכן בהקלה על נפיחות כואבת. המרכיבים הביואקטיביים העיקריים שלו, כולל נוטוגינסנוסיד R1 יחד עם ג'ינסנוסידים (Rg1, Rb1), מפעילים השפעות אנטי-דלקתיות, נוגדי חמצון ותיקון ריריות משמעותיות. Bletilla striata מאופיינת בהשפעותיה החריפות, העוצרות דימום, מפחיתות נפיחות ומקדמות התחדשות רקמות פגועות. במקביל, Bletilla striata polysaccharide (BSP), המשמש כתמצית הפעילה העיקרית שלו, תיעדה יעילות בדיכוי מפל JNK/p38 MAPK, ובכך הפחיתה את הביטוי של אינטרלוקין-1β (IL-1β), TNF-α ו-IL-6, והגברת יכולת ההגנה של נוגדי החמצון של רירית הקיבה¹³. ראיות ספרותיות מצטברות אישרו כי מתן משותף של פאנקס נוטוגינסנג סאפונינים (PNS) ו-BSP משפיע על השפעה סינרגטית במודלים של כיב קיבה אלכוהולי¹⁴, ותרופות הקשורות ל-SQBJ הראו השפעות הגנה משמעותיות על הריר במחקרים פרה-קליניים של דלקת ושט וכיב קיבה¹⁵. עם זאת, נכון לעכשיו אין אימות שיטתי ניסויי חוץ-גופי למנגנון מסלול האיתות הבסיס לאפקט ההגנה הרירית בקיבה של SQBJ, במיוחד התפקיד המרכזי של מסלול PI3K/AKT והקשר הרגולטורי שלו עם MAPK. בינתיים, הקשר הסיבתי בין הכימיקלים המרכיבים המרכזיים לקולטנים התפקודיים של SQBJ טרם הובהר במלואו.

כדי להתמודד עם פערים אלו, המחקר הנוכחי אימץ אסטרטגיית מחקר משולבת המשלבת פרמקולוגיה רשתית ואימות ניסויי במבחנה , תוך שימוש בקו התאים GES-1 המאתגר באתנול כפלטפורמה ניסיונית לחקר המנגנון המולקולרי הפוטנציאלי שמאחורי השפעות ההגנה האפיתל של SQBJ, עם דגש על לחץ חמצוני, תגובות דלקתיות, תהליכים אפופטוטיים, איתות PI3K/AKT. ושינויים הקשורים ל-MAPK. ראשית, השתמשנו במעכב PI3K LY294002 להערכת המעורבות של איתות PI3K/AKT ומצאנו כי עיכוב מסלול זה מפחית את אפקט ההגנה של SQBJ, מה שמרמז כי איתות PI3K/AKT תורם להגנה על ציטו-הגנה בתיווך SQBJ. שנית, בדקנו את הקשר בין שינויים הקשורים ל-PI3K/AKT לבין ויסות מסלולי MAPK, וסיפקנו ראיות ראשוניות לכך ששינויים באיתות MAPK עשויים להיות קשורים למודולציה של SQBJ בתגובה הפונקציונלית של ציר PI3K/AKT. ביחד, עבודה זו יוצרת מסגרת מולקולריתi-n vitro להערכת האופן שבו SQBJ מקל על פגיעה אפיתלית קיבתית הנגרמת מאתנול ומספקת ראיות ראשוניות לחקירה נוסחית נוסחאות תרכובות TCM בפגיעות ריריות קיבה אלכוהוליות. עם זאת, עדיין נדרשים ניסויים בבעלי חיים כדי לאשר האם ניתן לתרגם את השפעות ההגנה התאית הללו ליעילות טיפולית בחיים בתוך מודלים ניסיוניים של כיב קיבה מונע מאלכוהול (איור משלים S1).

פרוטוקול

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, דגימות רקמה אנושיות, דגימות קליניות או ניסויים בבעלי חיים. משאבי מסדי נתונים זמינים לציבור ובעלי אנונימיות שימשו לניתוח פרמקולוגיה רשתית, ותאי GES-1 מסחריים זמינים שימשו לניסויים במבחנה. לכן, לא נדרשו אישור אתי פורמלי והסכמה מדעת. מידע מפורט על התגובות העיקריות, נוגדנים, ערכות בדיקה, מכשירים, יצרנים, מספרי קטלוג ומזהי משאבי מחקר (RRIDs), כאשר רלוונטי, מסוכם בטבלת החומרים.

הכנה ובקרת איכות של תמצית מימית SQBJ

חומרים צמחיים
חומרי הגלם של Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (שורש וקנה) ו-Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (פקעות) הושגו מספק מסחרי לרפואה סינית מסורתית ואומתו לאחר מכן על ידי רוקח בכיר של רפואה סינית מסורתית לאחר ה-Pharmacopoeia הסיני (מהדורת 2025). דגימות שובר (No. SQBJ-20240301, מס' PN-20240301, מס' BS-20240301) הופקדו בהרבריום של המוסד שלנו. שני העשבים נמעכו ומעורבבים ביחס מסה של 1:1 להכנת אבקת SQBJ.

הכנת תמצית מימית SQBJ
אבקת SQBJ עברה שתי הפקות רפלוקס רצופות עם מים דה-יוניים ביחס מוצק לנוזל של 1:10 (g/mL) למשך שעה לכל מפגש. לאחר מכן, התמציות שנאספו שולבו ועברו דרך ארבע שכבות של גזה רפואית להסרת חומר שאריתי. הסינון שהתקבל רוכז תחת לחץ מופחת בטמפרטורה של 60°C עד שהגיע לצפיפות יחסית של 1.05–1.10, ולאחר מכן בוצע ייבוש בהקפאה בוואקום לקבלת אבקת תמצית מימית SQBJ, עם תפוקת הפקה סופית של 18.2% ± 0.6%. אבקת התמצית נאטמה ואוחרה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס, נמסה במדיום DMEM ללא סרום, ולאחר מכן עברה דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרון לעיקור לפני ניסויי התא.

בקרת איכות של תמצית מימית SQBJ
כדי להעריך את העקביות בין אצווה וסטנדרטיזציה של תמצית המים SQBJ, ביצענו קביעה כמותית לצד פרופיל טביעות אצבע בכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC). טבלת החומרים מפרטת את הפרמטרים הטכניים המקיפים הנוגעים למערכת HPLC. בהתבסס על פרופילים כימיים של שני הצמחים, כיוונו לארבעה סמנים מייצגים: נוטוגינסנוסיד R1, ג'ינסנוזיד Rg1, ג'ינסנוזיד Rb1 ומיליטרין. עם זאת, אסטרטגיית בקרת האיכות המבוססת על HPLC שיקפה בעיקר מספר מרכיבים מייצגים ולא סיפקה פרופיל כימי מקיף של כל התרכובות הפעילות ב-SQBJ.

הפרדה כרומטוגרפית הושגה באמצעות עמוד C18 בפאזה הפוכה (4.6 מ"מ × 250 מ"מ, 5 מיקרון). הפעולה נשמרה בטמפרטורת עמודה של 30 מעלות צלזיוס, עם קצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה, נפח הזרקה של 10 מיקרוליטר, ואורך גל גילוי של 203 ננומטר. הרכב הפאזה הניידת כלל אצטוניטריל (A) ותמיסת חומצה זרחנית מימית (B) של 0.1%, תוך שימוש ברצף שחרור הגרדיאנט הבא: 0–15 דקות, 19% A; 15–35 דקות, 19%–35% A; 35–55 דקות, 35%–55% A; ו-55–60 דקות, 55%–19% A. מידע מפורט על מכשירים ועמודות מסופק בטבלת החומרים.

הכנת חומר רפרנס
כדי לבצע ניתוח כמותי, רכשנו תקנים מסחריים לנוטוגינסנוסיד R1, ג'ינסנוזיד Rg1, ג'ינסנוסיד Rb1 ומיליטרין, כולם עם טוהר ≥ 98%. הכימיקלים הייחוס הבודדים נמדדו במדויק והוססו למאגר מתנול יחיד להשגת תמיסת ייחוס מעורבבת אחידה בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל לכל רכיב.

הכנת דוגמה:
אבקת תמצית מימית SQBJ יבשה (50 מ"ג) נמדדה במדויק, ואחריה המסה באמצעות 25 מ"ל מתנול בדרגה אנליטית. תערובת זו עברה טיפול באמבט אולטרסוני למשך 30 דקות תחת פרמטרים מבוקרים של מכשור (הספק: 250 וואט; תדר: 40 קילוהרץ). לאחר שיווי משקל חזרה לטמפרטורת החדר הסביבתית, הנוזל עבר דרך ממברנת סינון אורגנית של 0.22 מיקרון כדי לקבל את תמיסת הבדיקה האנליטית הסופית.

תוצאות קביעת תוכן:
התכולה הממוצעת של רכיבי הליבה בשלוש אצוות רצופות של תמצית מימית SQBJ הייתה כדלקמן: נוטוגינסנוסיד R1 3.12 ± 0.11 מ"ג/גרם, ג'ינסנוזיד Rg1 8.45 ± 0.23 מ"ג/גרם, ג'ינסנוזיד Rb1 5.26 ± 0.18 מ"ג/גרם, ומיליטרין 2.78 ± 0.09 מ"ג/גרם, כאשר רמת ה-RSD של כל רכיב < 5% בין האצוות, מה שמאשר עקביות טובה בין אצווה.

הצהרת אתיקה וציות
לא היו מעורבים במהלך המחקר הזה לא ניסויים בבעלי חיים ולא הכללת דגימות קליניות אנושיות, ביופסיות רקמה ונבדקים חיים. ניתוח הפרמקולוגיה ברשת בוצע באמצעות מסדי נתונים ציבוריים, כולל TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem ו-RCSB PDB. כל הנתונים שנאספו ממאגרים אלו היו נגישים לציבור והיו אנונימיים; לכן, הפרופילינג בביואינפורמטיקה היה פטור לחלוטין מדרישת הסכמה מדעת רשמית או פיקוח אתי נוסף.

הניסויים הנוכחיים במבחנה נערכו באמצעות קו התאים האפיתל של רירית הקיבה האנושית, GES-1, הזמין מסחרית. לא נעשה שימוש בתאים אנושיים ראשוניים או בחומרים ביולוגיים שמקורם במטופלים. קו התאים הושג ממאגר תאים מאומת וטופל בהתאם לבטיחות ביולוגית מוסדית והנחיות תרבית תאים. מכיוון שמחקר זה כלל רק קווי תאים מבוססים ומאגרי מידע זמינים לציבור, הוא היה פטור מאישור פורמלי של ועדת אתיקה מוסדית. כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לדרישות בטיחות ומעבדות מחקריות מוסדיות רלוונטיות.

מחקרי פרמקולוגיה רשתית

זיהוי וסינון של מטרות מרכיבים פעילים
הרכיבים הפעילים של Panax notoginseng ו-Bletilla striata., שני הצמחים המרכיבים את SQBJ, נאספו ממאגרי מידע ציבוריים. כל המידע שמקורו במאגר הנתונים ששימש במחקר זה היה נגיש לציבור ולא הכיל מידע אישי מזוהה. באמצעות שמות בוטניים כשאילתות, זיהינו כימיקלים פיטוכימיים מועמדים מתוך פלטפורמת מסד הנתונים והניתוח של מערכות פרמקולוגיה מסורתית ברפואה סינית (TCMSP). כדי לזהות מולקולות ביואקטיביות זכאיות, פרוטוקול הסקר יישם ספים של זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 20% ודמיון תרופתי (DL) ≥ 0.1. לאחר מכן, זיהינו את היעדים הגנטיים הפוטנציאליים במורד הזרם הקשורים לרכיבים המועמדים הללו, תוך השמטת רכיבים ללא מטרות גנים תקפות תואמות. כל הגנים המטרה עברו הערות ותוקנון באמצעות משאב החלבון האוניברסלי (UniProt), שהגביל את חיפוש מסד הנתונים הייחוס בלעדית להומו ספיינס, ובכך נוצרה רשימת הגנים היעד הסופית לרכיבים הפעילים של SQBJ הפונקציונליים.

שליפת מטרות הקשורות לפתולוגיה
כדי לאסוף גנים הקשורים למצב, שאלתנו שלושה מאגרי מידע ציבוריים: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), ו-DrugBank, עם מונח החיפוש "כיב קיבה". מאגר הנתונים החוצה פלטפורמות אוחד לאחר מכן, ואחריו בוטל רשומות מיותרות ליצירת רשימה סטנדרטית של גנים מטרה הקשורים לכיב קיבה.

בניית רשת למרכיבים, מטרות ומחלות
קבענו את חפיפי גני היעד בין רכיבי SQBJ הפעילים לבין כיב קיבה. בהמשך, נבנתה רשת אינטראקציה רב-שכבתית באמצעות תוכנת ויזואליזציה לרשת. כדי להעריך את חשיבות הצומת, אלגוריתם ההערכה הטופולוגית המשולבת חישב את הפרמטרים הטופולוגיים של כל צומת, כולל מרכזיות דרגה ובין לבין הצומת. בהתבסס על ערכים מחושבים אלו, זיהינו את הרכיבים הפעילים והיעדים התפקודיים המרכזיים של SQBJ בטיפול בכיב קיבה.

מיפוי רשתות אינטראקציה בין חלבונים לחלבון (PPI)
מטרות הקונצנזוס שזוהו בין SQBJ לכיב קיבה הושוו מול מאגר הנתונים STRING. השאילתה שלנו ציינה את תבנית הניתוח הרב-חלבוני תוך הגבלת הרקע האנליטי להומו ספיינס. PPIs סוננו עם סף ביטחון אינטראקציה מינימלי של ביטחון בינוני (> 0.4).

רשומות הקישוריות הפונקציונליות שנוצרו יוצאו כקובץ TSV, אשר שולב לאחר מכן בתוכנת ויזואליזציה ייעודית לרשת לניתוח PPI. בהתבסס על טופוגרפיית החיבור המחושבת, הערכנו את הצמתים הפונקציונליים המרכזיים ברשת על ידי דירוג ערך הדרגה הספציפי של כל צומת.

הערות פונקציונליות במורד הזרם ומיפוי מסלולים
כדי להבהיר את התפקידים הביולוגיים של הצמתים המשותפים, ביצענו ניתוח העשרה פונקציונלית של אונטולוגיית גנים (GO) וניתוח העשרת מסלולים של אנציקלופדיית קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) באמצעות כלי ביואינפורמטי נגיש ברשת. הסיווג הפונקציונלי מסווג גנים לשלוש קטגוריות קלאסיות: תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). גרפים בועות ותרשימי עמודות לתוצאות העשרה נוצרו באמצעות פלטפורמת תרשים ביואינפורמטית מקוונת למיפוי התהליכים הביולוגיים הראשוניים ומסלולי האיתות הקשורים להשפעה הטיפולית של SQBJ על כיב קיבה.

סימולציית עגינה מולקולרית חישובית
קבצי הגיאומטריה המרחבית של הרכיבים הפעילים המרכזיים של SQBJ הורדו ממאגרי מידע מורכבים ציבוריים ונשמרו לאחר מכן כקבצי MOL2 באמצעות תוכנת עיבוד קבצים. קיבלנו גם את מבני הגביש התלת-ממדיים של חלבוני היעד המרכזיים על ידי שאילתה למאגר נתוני החלבונים. מבנים מקרומולקולריים אלו עובדו מראש על ידי הסרת הליגנדים המוקדמים ומולקולות המים, והמודלים הנקיים שהתקבלו נשמרו בפורמט PDB. כדי לדמות אנרגטיקה של קישור קולטנים-ליגנדים, בוצע אימות העגינה הכולל רכיבים פעילים מרכזיים וחלבוני מטרה באמצעות תוכנת עגינה מולקולרית חישובית סטנדרטית. תוצאות העגינה אופטימיזציה והוצגו באמצעות תוכנת ויזואליזציה מולקולרית.

תרבית תאים
תאי אפיתל קיבה שמקורם באדם ב-GES-1 גודלו באמצעות מדיום RPMI-1640 משולב עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. זיהינו את תרבית המקור כקו תאים מבוסס, וקיבלנו את המלאי הראשוני ממאגר תאים מאומת. במפגש שנצפה של 80–90%, השכבות המונולריות נשטפו פעמיים עם PBS ואחריה ניתוק באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לסיים את תגובת החיתוך האנזימטי, הכנסנו נפח שווה של מדיום שלם. ההשעיה התאית שנוצרה עברה צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הכדור הושתה מחדש במדיום טרי ומלא, והוחזר לזריעה בצפיפות המתאימה. התרביות הוחזרו לתנאי דגירה זהים. במהלך תקופת ההתפשטות, נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך להערכת קיום התאים, המורפולוגיה ומצב הצמיחה, ותאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי נאספו באופן שגרתי לניתוחים במורד הזרם.

הקמה וטיפול במודל פגיעות תאי GES-1 המושרת באתנול
תאי GES-1 בשלב לוגריתמי נזרעו ב-5 × 10⁵ תאים/באר בלוחות 6 בארות או 1 × 10⁴ תאים/באר בלוחות 96 בארות ודגרו במהלך הלילה כדי להידבק. פגיעה שנגרמה מאתנול הוכחה על ידי חשיפת תאים לאתנול של 500 מ"מול/ליטר ב-RPMI-1640 ללא תוספת למשך 4 שעות. תנאי זה נבחר בהתבסס על ניסויים ראשוניים בריכוז ובתגובה בזמן. במבחן הראשוני, 250 mmol/L אתנול למשך 4 שעות גרם לנזק קל בלבד, כאשר עמידות התאים נותרה בכ-78.6 ± 5.4%, בעוד ש-750 mmol/L אתנול הפחיתו את החיוניות ל-32.8 ±-4.7%, המצביעים על ציטוטוקסיות מופרזת. חשיפה לאתנול של 500 מ"מ/ליטר במשך 4 שעות הפחיתה את חיוניות התאים ל-54.7 ± 4.9%, מה שגרם לפציעה בינונית-חמורה שניתנת לשחזור, תוך שמירה על תאים חיוניים מספיקים להתערבויות מאוחרות ולבדיקות מכניות. לכן, נבחר 500 mmol/L אתנול ל-4 שעות להקמת הדגם. מצב זה שימש לסימולציה של פגיעה אפיתלית חריפה שנגרמה מאתנול במבחנה ואינו משחזר במלואו את דפוס החשיפה הפיזיולוגי של רירית הקיבה ב-vivo.

להתערבות פרמקולוגית, נבחרו שלושה ריכוזים של תמצית מימית SQBJ (5, 10 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל) וניתנו מיד לאחר אתנול. בזרוע העיכוב של PI3K, התאים עברו דגירה מוקדמת עם 20 מיקרומול/ליטר LY294002 למשך 30 דקות לפני טיפול משותף באתנול ובריכוז האופטימלי של SQBJ. קבוצת ביקורת חיובית קיבלה 20 מיקרומול/ליטר אומפרזול מיד לאחר החשיפה לאתנול. אומפרזול שימש כסוכן גסטרופרוטקטי ייחוס ולא כמשוואה שווה למינון. הריכוז נבחר בהתבסס על הערכת ציטוטוקסיות ראשונית ועל טווחי התערבות חוץ-גופית נפוצים, ונועד לספק ייחוס פרמקולוגי להגנה תאית. תאי הבקרה נשמרו במדיה שלמה ללא אתנול או חומרים נוספים. כל הדגירה התבצעה באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כל קבוצת ניסויים כללה לפחות שלושה בארות שכפול, וכל הפרוטוקול בוצע באופן עצמאי 3 פעמים.

קביעת ריכוז SQBJ אופטימלי באמצעות שיטת CCK-8
יסודות HGE/GES-1 בשלב לוגריתמי צופים לוקטור של 96 בארות בצפיפות של 1 ×^{10 4} תאים לבאר ודגרו במהלך הלילה במדיום RPMI-1640 מלא בתנאים סטנדרטיים (37 °C, 5% CO₂) כדי להבטיח היצמדות. התרביות חולקו באקראי לארבע קבוצות: ביקורת כלי רכב (בינוניים מלאים בלבד), התערבות SQBJ במינון נמוך (5 מיקרוגרם/מ"ל), התערבות SQBJ במינון בינוני (10 מיקרוגרם/מ"ל), והתערבות SQBJ במינון גבוה (50 מיקרוגרם/מ"ל); שלושת הריכוזים הללו שימשו לסינון טיפולי והוכנו על ידי המסה של SQBJ ב-PBS. כל התנאים נבדקו לפחות בשלושה בארות מקבילים, והפרוטוקול הכולל חזר על עצמו בשלוש קבוצות ניסוי נפרדות. לאחר תקופת הטיפול שנקבעה, כל באר קיבלה 10 מיקרוליטר של תגובת CCK-8, ואחריה תקופת דגירה של שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צפיפות האופט (OD) ב-450 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרופלט. אחוז החיות של התאים חושב כ-(absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, מה שאפשר זיהוי ריכוז ה-SQBJ היעיל ביותר לניסויים הבאים.

qPCR
יסודות GES-1 בשלב לוגריתם גודלו בלוחות 6 בארות (5 × 10,⁵ תאים לבאר) ונשמרו ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ כדי לאפשר היצמדות. לאחר מכן, התאים נחשפו לריכוז האופטימלי שנקבע מראש של SQBJ ונקטפו בבסיס (0 שעות) וב-6, 12, 24 ו-48 שעות לאחר הטיפול כדי לקבוע את התגובה הדינמית של מולקולות האיתות. בהתבסס על תוצאות מסלול הזמן, נבחר מרווח ה-24 שעות לבדיקות מכניות מאוחרות יותר משום שהראה את תגובת האיתות החזקה ביותר תוך שמירה על יציבות החיות של התא. כל נקודת זמן יוצגה על ידי שלושה בארות משולשות, וכל הניסוי חזר באופן עצמאי 3 פעמים.

בידדנו RNA כולל באמצעות תגובת חילוץ מיוחדת, תוך הערכת ריכוז ואיכות התפוקה באמצעות ספקטרופוטומטר. כל הדגימות הציגו יחס ספיגה A₂₆/A₂₈₀ בטווח של 1.8 ו-2.0. ערכת שעתוק הפוך עם מגב gDNA שימשה לתמלול הפוך של cDNA מ-1 מיקרוגרם RNA כולל. ניתוח PCR בזמן אמת בוצע באמצעות מערכת PCR כמותית עם פריימרים ל-PI3K, AKT, p38, JNK, ERK וגן הייחוס GAPDH. פרטים על מערכת ה-PCR, המגיבים ושירות סינתזת הפריימרים מפורטים בטבלת החומרים. פריימרים תוכננו לאזורים ספציפיים בגנים האנושיים המתאימים. פרוטוקול qPCR: הפעלה חמה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריה 40 מחזורי דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ואנילינג/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. חישוב ביטוי mRNA של גן המטרה התבסס על שיטת PCR כמותית יחסית עם שיטת ^2-ΔΔCt .

אליסה
הסופרנטנטים נאספו ונוקרו באמצעות צנטריפוגה ב-1,200 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לצורך הסרת פסולת תאים. רמות המתווכים הדלקתיים (CRP, IL-6, TNF-α) ומדדי לחץ חמצוני (SOD, MDA, GSH) הוערכו באמצעות ערכות ELISA מסחריות בהתאם להנחיות הספציפיות של היצרנים. פרופילי הריכוז של מטרות אלו אומתו באמצעות נוסחאות בדיקה מסחריות לפי הוראות הספקים. כל קבוצת ניסוי כללה שלושה בארות שכפול, וההליך בוצע בשלוש קבוצות תרביות תאים נפרדות כדי לאשר שחזור נתונים ניסויים. בקצרה, 100 מיקרוליטר של סוכריות תקן או סופרנטנטים מובהקים הוזרקו ללוחות תגובה מצופים מראש ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר שלושה מחזורי שטיפה רצופים, כל חלל קיבל 100 מיקרוליטר של נוגדן זיהוי ספציפי לדגירה של 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואחריהם שלושה מחזורי שטיפה נוספים. לאחר מכן הוכנס תמיסת מצע (100 מיקרוליטר), והדגימות הוגנו מאור למשך 15 דקות לפני שחסימת התגובה האנזימטית עם 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה. צפיפות אופטית ב-450 ננומטר זוהתה באמצעות קורא מיקרופלט. הריכוזים עברו אינטרפולציה מהעקומות הסטנדרטיות המתאימות. כדי למזער הטיה הנגרמת מהבדלים במספר התאים או שינויים בשריות התאים שנגרמו על ידי טיפול, פרופילי MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α ו-IL-6 כויללו מול תכולת החלבון בכל דגימה אנליטית, כפי שנקבע במבחן BCA, והובאו לערכים יחסיים בהשוואה לקבוצת הביקורת.

זיהוי ROS תוך-תאי בתאי GES-1 באמצעות גלאי פלואורסצנטי DCFH-DA
כדי לכמת את רמות סוגי החמצן התוך-תאי (ROS), השתמשנו באינדיקטור הפלואורוגני החדיר לממברנה DCFH-DA. תאים שנקטפו הושמו מחדש ב-RPMI-1640 ללא תוספת עם 10 מיקרומול/ליטר DCFH-DA ונשמרו במשך 20 דקות בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 °C, 5% CO₂) בחושך. לאחר שלוש שטיפות רצופות עם מדיום ללא סרום עד ניקוי גלאי לא קשור, עוצמת הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות ציטומטריית זרימה עם עירור של 488 ננומטר ופליטה של 525 ננומטר. רמות ROS יחסיות דווחו כעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת לכל קבוצת טיפול, נורמל למספר התאים הרלוונטי שנקבע בבארות מקבילות באמצעות מבחן CCK-8, וביטאו ביחס לקבוצת הביקורת המתאימה.

קביעת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית (ΔΨm)
הערכנו שינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨm) באמצעות ערכת בדיקה מסחרית JC-1. בקצרה, תאים שנקטפו הושעו מחדש בתמיסת JC-1 טרייה—תערובת בנפח שווה של צבע JC-1 ובופ צביעה שסופקה על ידי הערכה—לריכוז סופי של 1 ×^{10 6} תאים למ"ל. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה המכילה 5% CO₂, מוגנת מאור למניעת הלבנה, הדגימה נאספה בצנטריפוגה (800 × גרם, 5 דקות) ונשטפה פעם אחת עם 1 מ"ל בופר JC-1 מקורר בקרח. פלואורסצנציה נרכשה לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה.

אגרגטים של JC-1 (המצביעים על ΔΨm שלם) נעקבו דרך ערוץ FL2 באמצעות עירור של 488 ננומטר ואורכי גל פליטה של 590 ננומטר, בעוד שמונומרי JC-1 (המצביעים על פיזור ΔΨm) נעקבו דרך ערוץ FL1 באמצעות הגדרות פליטה של 488 ננומטר ו-525 ננומטר. ה-ΔΨm הוצג כיחס אות הפלואורסצנציה אדום לירוק; ירידת ערכים מצביעה על דה-פולריזציה של המיטוכונדריה.

קביעת רמת ATP תוך-תאית
תפקוד המיטוכונדריה הוערך באמצעות כימות תוך-תאי של ATP באמצעות ערכת בדיקת ATP. תגובת לוסיפרין–לוסיפראז ביולומינסצנטית שימשה לקביעת תכולת ATP, אשר פרופורציונלית ישירות לפעילות המיטוכונדריאלית. לזמן קצר, התאים שנקטפו הושעו מחדש בבופר ליסיס ATP קר והוחזקו על הקרח למשך 5 דקות חלון ליזיס. לאחר מכן בוצעה צנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 20 מיקרו-ליטר מהסופרנטנט שהתקבל הועבר למיקרופלטות לבנות אטומות עם 96 בארות. בהמשך, 100 מיקרוליטר של תמיסת זיהוי ATP טרייה — תערובת של תגובת לוסיפראז ותת-לוסיפרין שהוכן לפי הפרוטוקול שסופק — הוכנס לכל חלל. אות הזוהר שנוצר נתפס במהירות באמצעות קורא מיקרופלט זוהר. כדי לקבל רמות ATP יחסיות, ערכי הזוהר הגולמיים ננורמו לריכוזי החלבון הסופרנטנטיים הכוללים הבודדים שנמדדו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA מסחרית, ובכך תיקנו שינויים במספר התאים.

זיהוי אפופטוזיס תאי באמצעות צביעת כפול ב-Annexin V/PI
זיהוי תאים אפופטוטיים בוצע באמצעות תצורת בדיקת מוות תאי Annexin V-FITC/PI מסחרית כפי שתוארה על ידי היצרן. לאחר השטיפה, הכדורים הושעו מחדש בבופר קישור Annexin V-FITC לצפיפות תאים של 1 ×^{10 6} תאים/מ"ל (195 מיקרוליטר לדגימה). לאחר מכן, כל צינור עצמאי קיבל 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC ואחריו 10 מיקרוליטר של תמיסת צביעה PI. הדגימה הועברה בעדינות לוורטקס ודגרה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר תהליך זה, תאי אפופטוטיה נבדקו באמצעות ציטומטר זרימה. התעלות הפלואורסצנטיות הרלוונטיות אפשרו את ההבדלה בין תאים ברי קיימא (Annexin V⁻/PI⁻), תאים אפופטוטיים מוקדמים (Annexin V⁺/PI⁻), ותאי אפופטוטיים מאוחרים/נקרוטיים (Annex V⁺/PI⁺). אחוז התאים האפופטוטיים בכל קבוצה נמדד בהתאם לפרמטרים אלו.

כתם מערבי
הממברנות דוגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד Bcl-2, Bax, Caspase-3 שחתך, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 ו-GAPDH. נוגדנים נבחרו לפי מידע אימות לדגימות אנושיות וליישומים של Western Blot. נוספו RRID לכל הנוגדנים עם רשומות זמינות במרשם הנוגדנים או בפורטל RRID. רמות החלבון היעד נורמל ל-GAPDH. לאחר פרוטוקולי שטיפה סטנדרטיים, הכתמים נחשפו לנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות זוהו באמצעות תמיסת מצע ECL. ערכי פס הכתמים המערביים הוערכו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית.

צביעת אימונופלואורסצנציה
מונוליירים של GES-1 הוקמו על כיסויי זכוכית בתוך לוחות עם 24 בארות לפני הטיפולים המיועדים. לאחר הטיפול, בוצעה קיבוע תוך שימוש ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חדירות ממברנה באמצעות 0.3% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, וחסימה באמצעות אלבומין סרום בקר 5% למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ה-coverslips הועברו לאחר מכן לדגירה לילית בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים שכונו ל-AKT, p38, JNK ו-ERK. לאחר שלוש שטיפות PBS רצופות, הדגימות נדגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני אנטי-ארנב עם פלואורסצנציה מוגן מאור. צביעת נגד DAPI בוצעה במשך 5 דקות כדי להמחיש גרעינים. כיסויי כיסוי הותקנו לאחר מכן עם תגובת אנטי-דהה, ואיסוף הנתונים השתמש במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי לסריקת חלבונים כדי לקבוע את התפלגות התת-תאית של חלבוני המטרה. כל תמונות האימונופלואורסצנציה צולמו תחת אותם פרמטרים של הדמיה באמצעות עדשת אובייקטיבית בקוטר 20×. פסי קנה מידה המתאימים ל-50 מיקרון נוספו לכל תמונות האימונופלואורסצנציה המייצגות.

ניתוח סטטיסטי
ערכים כמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), שמקורם בלפחות שלוש ריצות ניסוי עצמאיות כאשר כל דגימה מאומת בשלוש עותקים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות כלים מיוחדים לניתוח נומרי. כדי לקבוע שונות מובחנת בין קבוצות שונות, השתמשנו בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) לצד מבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואות בין קבוצות. סף דו-זנבי של P < 0.05 סימן מובהקות סטטיסטית.

תוצאות

ניתוח ביואינפורמטי של מנגנונים בתיווך SQBJ בכיב קיבה
כדי לבחון כיצד SQBJ עשויה להפעיל את פעולותיה הפרמקולוגיות על GU, חזינו בתחילה את היעדים התואמים לרכיבים הביואקטיביים העיקריים שלה. באמצעות תכנות R, חילצנו וניקינו ערכים מיותרים בין רכיבים ביואקטיביים אלו, ובסופו של דבר הניבו 411 יעדים מועמדים. בהמשך, מטרות פתולוגיות הקשורות ל-GU נאספו על ידי שאילתות GeneCards ופלטפורמות OMIM, ובודדו 1,643 לוקוסים ייחודיים למצב (קובץ משלים 1). חיתוך מטרות המחלה עם אלו של רכיבי SQBJ ז...

דיון

המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך האם SQBJ, נוסחה קלאסית של תרכובת TCM המורכבת מ-Panax notoginseng ו-Bletilla striata., מחזיקה בפעילות ציטו-הגנה נגד נזק אפיתל רירי קיבה המופעל על ידי אתנול בתוך מודל תאי GES-1, עם מעורבות של איתות PI3K/AKT והפחתה נלווית במתווכים דלקתיים, מדדי לחץ חמצוני, תפקוד לקוי של מיטוכונדריה ואירועים אפופטוטיים. הממצאים העיקריים של העבודה הנוכחית הם כדלקמן: ניתוח פרמקולוגיית רשת זיהה את ציר PI3K/AKT–MAPK כמרכז מכני פוטנציאלי ל-SQBJ בטיפול ב-GU; ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Apoptosis assay	Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	Beyotime	C1062L
ATP assay	Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027
Buffer	PBS	Solarbio	—
Cell digestion reagent	0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Cell line	GES-1 human gastric mucosal epithelial cells	Cell Bank, Chinese Academy of Sciences	SCSP-533
Cell viability assay	CCK-8 reagent	—	—
Confocal microscope	LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Culture medium	RPMI-1640	Gibco	—
ELISA kit	Human CRP ELISA Kit	R&D Systems	DCPR00
ELISA kit	Human IL-6 ELISA Kit	R&D Systems	DTAM00D
ELISA kit	Human TNF-α ELISA Kit	R&D Systems	—
Flow cytometer	FACSCalibur / FACSCanto II	BD Biosciences	—
Herbal material	Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber)	Anguo Traditional Chinese Medicine Market	Voucher No. BS-20240301
Herbal material	Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome)	Anguo Traditional Chinese Medicine Market	Voucher No. PN-20240301
Herbal material	Sanqi Baiji San powder	In-house preparation	Voucher No. SQBJ-20240301
HPLC column	ZORBAX SB-C18 column	Agilent Technologies	4.6 mm × 250 mm, 5 μm
HPLC system	1260 Infinity II HPLC system	Agilent Technologies	1260 Infinity II
IF secondary antibody	Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG	Invitrogen	A11012
Inverted microscope	CKX41 inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Luminescence reader	Infinite 200 PRO microplate reader	Tecan	Infinite 200 PRO
Membrane	PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microplate reader	iMark microplate reader	Bio-Rad	iMark
Mitochondrial membrane potential kit	JC-1 Assay Kit	Beyotime	C2006
Nuclear stain	DAPI	Beyotime	C1002
Online platform	Online bioinformatics plotting platform	Bioinformatics online analysis platform	Online platform
Online platform	Web-based enrichment analysis platform	Metascape	Online platform
Oxidative stress assay	GSH Assay Kit	Beyotime	S0052
Oxidative stress assay	MDA Assay Kit	Beyotime	S0131
Oxidative stress assay	SOD Assay Kit	Beyotime	S0109
PI3K inhibitor	LY294002	MCE	S1105
Positive control drug	Omeprazole	MCE	HY-B0053
Primary antibody	AKT	Cell Signaling Technology	4691
Primary antibody	Bax	Cell Signaling Technology	5023
Primary antibody	Bcl-2	Cell Signaling Technology	15071
Primary antibody	Cleaved Caspase-3 Asp175	Cell Signaling Technology	9664
Primary antibody	ERK1/2	Cell Signaling Technology	4695
Primary antibody	GAPDH	Abcam	ab8245
Primary antibody	JNK / SAPK-JNK	Cell Signaling Technology	9252
Primary antibody	p-AKT Ser473	Cell Signaling Technology	4060
Primary antibody	p-ERK1/2 Thr202/Tyr204	Cell Signaling Technology	4370
Primary antibody	p-JNK Thr183/Tyr185	Cell Signaling Technology	4668
Primary antibody	p-p38 MAPK Thr180/Tyr182	Cell Signaling Technology	4511
Primary antibody	p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199	Cell Signaling Technology	4228
Primary antibody	p38 MAPK	Cell Signaling Technology	8690
Primary antibody	PI3K p85	Cell Signaling Technology	4257
Primer	AKT forward	—	—
Primer	AKT reverse	—	—
Primer	ERK forward	—	—
Primer	ERK reverse	—	—
Primer	GAPDH forward	—	—
Primer	GAPDH reverse	—	—
Primer	JNK forward	—	—
Primer	JNK reverse	—	—
Primer	p38 forward	—	—
Primer	p38 reverse	—	—
Primer	PI3K forward:	—	—
Primer	PI3K reverse	—	—
Protease inhibitor	PMSF	Beyotime	ST506
Protein assay	BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0010
Protein lysis buffer	RIPA buffer	Beyotime	P0013B
Public database	DrugBank	DrugBank Online	Online database
Public database	GeneCards	Weizmann Institute of Science	Online database
Public database	Online Mendelian Inheritance in Man	Johns Hopkins University	Online database
Public database	PubChem compound database	National Center for Biotechnology Information	Online database
Public database	RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	Online database
Public database	STRING protein interaction database	STRING Consortium	Online database
Public database	Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform	TCMSP	Online database
Public database	Universal Protein Resource	UniProt Consortium	Online database
Real-time PCR system	CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad	CFX96
Reverse transcription kit	PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio	RR047A
RNA extraction reagent	TRIzol reagent	—	—
ROS probe	DCFH-DA	Beyotime	S0033
Secondary antibody	HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Cell Signaling Technology	7074
Software	Cytoscape	Cytoscape Consortium	3.9.1
Software	GraphPad Prism	GraphPad Software