מכשיר נייד לטיפול מקדים ברוק לשיפור זיהוי קורטיזול

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת קדם-טיפול מהיר ברוק לשיפור גילוי הקורטיזול. מכשיר סינון ידני משמש להסרת מוצינים וחומרים מפריעים אחרים תוך שמירה על האנליט המטרה. הרוק המטופל מראש מציג זרימה קפילרית משופרת, ובכך מאפשר ביצוע בדיקה עקבי וניתן לשחזור יותר.

תקציר

זיהוי קורטיזול רוק מציע חלופה לא פולשנית לניתוח מבוסס דם. עם זאת, היישום המעשי שלו מוגבל על ידי הצמיגות הפנימית של הרוק ונוכחות רכיבים מפריעים. במיוחד, מוצינים וחלבוני רוק מעכבים זרימה מונעת על ידי נימים ופוגעים באמינות של בדיקות זרימה צדדית (LFAs) לאחר מכן, ובכך מחייבות אסטרטגיות טיפול מוקדם יעילות ונגישות. כאן אנו מציגים מכשיר קדם-טיפול ברוק נייד, הנקרא SaliFilter, לזיהוי קורטיזול בנקודת טיפול. המכשיר עושה שימוש במנגנון סינון שמסיר באופן סלקטיבי רכיבים מפריעים בעלי משקל מולקולרי גבוה ומאפשר מעבר מולקולות קטנות, כולל קורטיזול. מופעל בלחץ ידני פשוט, הוא מאפשר עיבוד דגימות מהיר (~2 דקות) ללא צורך בציוד חיצוני, מה שהופך אותו למתאים להגדרות מבוזרות. ביצועי המכשיר הוערכו באמצעות מדידות עכירה, כימות חלבונים ו-SDS-PAGE, שאישרו הסרה יעילה של חלבוני המוצין והרוק. דגימות מטופלות הראו זרימה קפילרית מוגברת, מה שהוביל לפעולה יציבה ואמינה של LFA. ניתוח כמותי הראה שיפור בשחזור האות, וזיהוי קורטיזול השיג גבול גילוי של 1.47 ng mL⁻¹ בטווחי ריכוז קליניים רלוונטיים. פרוטוקול זה קובע אסטרטגיית קדם-טיפול יעילה ברוק המשפרת את הרגישות האנליטית והאמינות מבלי לפגוע בשלמות האנליט. הגישה המוצעת מספקת פתרון מעשי ונייד לאבחון מבוסס רוק, עם יישום פוטנציאלי לבדיקות בנקודת טיפול ולניטור עצמי.

מבוא

קורטיזול, הורמון גלוקוקורטיקואידי המופרש על ידי קליפת יותרת הכליה, הוא סמן ביולוגי מרכזי להערכת לחץ פיזיולוגי ^1,2. ניתן למדוד אותו במספר נוזלים ביולוגיים, כולל סרום, פלזמה, שתן, נוזל בין-תאי ורוק, כאשר דם ורוק הם הנפוצים ביותר בפרקטיקה קלינית³. למרות שמדידות מבוססות דם מספקות מידע כמותי אמין, הן דורשות ווניפונקציה פולשנית וכוח אדם מיומן, מה שמגביל את ההתאמה שלהן למעקב תכוף או לאורך זמן ^4,5,6. לעומת זאת, מדידת קורטיזול רוק מציעה אלטרנטיבה לא פולשנית ונוחה, המאפשרת יישומים בנקודת טיפול וניטור עצמי ^7,8. ראוי לציין שרמות הקורטיזול ברוק קשורות מאוד לריכוזי הדם, התומכות ברוק כדגימת פונדקאית אמינה⁹. עם זאת, הצמיגות הפנימית של הרוק ונוכחות רכיבים מפריעים פוגעים משמעותית בביצועים אנליטיים, ומחייבים טיפול מוקדם יעיל לפני הניתוח 10,11,12.

נבדקו אסטרטגיות טרום-טיפול שונות כדי להתמודד עם אתגרים אלו. צנטריפוגציה משמשת באופן נרחב להסרת רכיבים גדולים כמו מוצינים, חלבונים ופסולת תאים. עם זאת, הוא דורש ציוד מעבדה כבד ומספר שלבי עיבוד, מה שמגביל את יישומו בהגדרות מבוזרות^13,14. דילול באמצעות תמיסות בופר יכול להפחית צמיגות ולשפר את זרימת הדגימה¹⁵. עם זאת, הוא מוריד בו זמנית את ריכוז האנליטים, ובכך פוגע ברגישות האנליטית. כתוצאה מכך, הגישות הקיימות אינן מספקות ליישומים בנקודת טיפול, שבהם עיבוד מהיר וללא ציוד ושימור אנליטים יעדיים הם חיוניים.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו את SaliFilter, מכשיר נייד לטיפול מקדים ברוק, המותאם לזיהוי קורטיזול בנקודת טיפול. המכשיר משתמש במנגנון סינון שמסיר באופן סלקטיבי חומרים מפריעים בעלי משקל מולקולרי גבוה, תוך שהוא מאפשר מעבר מולקולות קטנות, כולל קורטיזול¹⁶. כאשר הוא מופעל ידנית, המכשיר מאפשר עיבוד מהיר וידידותי למשתמש ללא צורך במכשירים חיצוניים. על ידי הסרת רכיבים מפריעים, גישה זו משפרת את זרימת הנימים בבדיקות זרימה צדדית, ובכך משפרת את האמינות האנליטית. פרוטוקול זה מתאר את ייצור המכשיר ואת יישומו לטיפול מקדים מהיר ברוק לפני גילוי קורטיזול באמצעות בדיקות זרימה רוחבית.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש ברוק אנושי מאוגד שהושג מסחרית. לא גויסו משתתפים אנושיים, ולא נדרשה אישור אתי מוסדי.

1. הכנת דגימת רוק

1. הנחו את המשתתפים להימנע מאכילה או שתייה לפחות 30 דקות לפני איסוף הדגימות.
2. הכינו את דגימת הרוק לפי הוראות הספק.
   הערה: מחקר זה השתמש ברוק מאוחד מסחרי לצורך אימות ברמת הפרוטוקול.
3. ערבבו בעדינות את דגימת הרוק לפני השימוש כדי להבטיח הומוגניות.
4. אחסן את דגימות הרוק בטמפרטורה של 4°C והשתמש בהן בתוך תקופת האחסון המומלצת על ידי הספק.

2. הכנת הממברנה המצופה ב-RBCM (איור 1א)

1. לבודד RBCM מדם מלא לפי פרוטוקול^{שדווח קודם לכן 16}.
   1. השתמשו בנוגדי קרישה מסחריים של דם מלא אנושי עם K2EDTA כמקור RBCM.
   2. צנטריפוגה את כל הדם ב-800 × גרם למשך 5 דקות ואספו את חלק תאי הדם האדומים אחרי הסרת הפלזמה ופרוות באפי.
   3. שטפו את כדור תאי הדם האדומים המבודדים שלוש פעמים עם סליין קר 1× פוספט (PBS) באמצעות ערבוב ידני עדין.
   4. החזירו את כדור תאי הדם האדומים השטופים ב-0.25× PBS קרח למשך 30 דקות כדי לגרום להמוליזה.
   5. הפרדת ההמוגלובין החופשי על ידי צנטריפוגה של המתלה המפורע ב-20,000 × גרם למשך 30 דקות ואיסוף כדור ה-RBCM.
   6. שטפו את כדור ה-RBCM שנאסף שלוש פעמים נוספות עם PBS של 0.25× ואחסנו את כדור ה-RBCM הורוד הבהיר בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש נוסף.
2. הכינו ממברנת פוליאת'רסולפון (PES) עם גודל נקבובית של 30 ננומטר וקוטר של 13 מ"מ.
3. הפקדו 100 מיקרוליטר של תמיסת RBCM של 2% (w/v) בצד אחד של ממברנת ה-PES. מרחו בעדינות או זרקו את התמיסה לכיוון הטיפה עד שכל משטח הממברנה רטוב לחלוטין.
4. דגרו את הממברנה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח ציפוי וייבוש אחידים.
5. אחסן את הממברנה המצופה בטמפרטורת החדר והשתמש בה תוך 15 ימים לאחר ההכנה¹⁷.
   הערה: תיאור מפורט של ממברנת PES המצופה ב-RBCM תואר במחקר הקודם^{שלנו 16}.

3. ייצור מכשיר SaliFilter (איור 1B)

1. הניחו את הממברנה המצופה ב-RBCM בתוך מחזיק המסנן המיועד.
2. הרכיבו את המכשיר על ידי חיבור מאובטח של רכיבי הכניסה והיציאה.
3. חבר מזרק של 1 מ"ל לפתח הכניסה של המכשיר.
   זהירות: ודאו שכל הרכיבים אטומים היטב כדי למנוע דליפה במהלך ההפעלה.

4. טיפול מקדים ברוק

1. טעין 500 מיקרוליטר רוק לתוך המזרק שמחובר למכשיר SaliFilter.
2. הפעיל לחץ ידני עדין כדי להעביר את דגימת הרוק דרך הממברנה (~ 2 דקות).
3. אסוף את הרוק המטופל מראש מהשקע.
4. השתמש בדגימה המטופלת מראש מיד או שמור אותה בטמפרטורה של 4°C עד לניתוח נוסף.

5. ניתוח SDS-PAGE של חלבוני רוק

1. מערבבים 15 מיקרוליטר מהדגימה עם 5 מיקרוליטר של בופר דגימה של Laemmli.
2. העמיסו את התערובת לבארות נפרדות של ג'ל SDS-PAGE 8%.
3. בצע אלקטרופורזה ב-150 וולט למשך 40 דקות.
4. צבעי את הג'ל בכחול קומאסי ל-2 שעות.
5. הסר את הג'ל במים מזוקקים למשך הלילה.
6. צלם תמונות של הג'ל באמצעות סמארטפון או מערכת הדמיה.

6. זיהוי קורטיזול באמצעות בדיקת זרימה רוחבית (LFA)

1. מרחו 150 מיקרוליטר רוק מטופל מראש על משטח הדגימה של רצועת ה-LFA.
2. תן לדגימה לנדוד לאורך הרצועה למשך 10 דקות.
3. צלם תמונות של תוצאות הבדיקה באמצעות סמארטפון או מערכת הדמיה.
4. פתח את תמונת ה-LFA ב-ImageJ והשתמש בתמונה > צבע > ערוצים מפוצלים כדי להפריד בין ערוצי ה-RGB.
5. השתמשו בתמונת הערוץ הירוק לניתוח עוצמת קו בדיקה.
6. בחר אזור עניין מלבני (ROI) של 100 × 10 פיקסלים המכסה את שורת הבדיקה והחיל את אותו גודל ROI על כל תמונות הרצועה.
7. מדדו את ערך העוצמה הממוצע של תשואה על קו הבדיקה. בחר אזור ממברנה ריק סמוך עם אותו גודל ROI ומדוד את עוצמת הרקע.
8. חשב את עוצמת קו הבדיקה המנורמל כך: עוצמה מנורמלת = עוצמת קו בדיקה − עוצמת רקע.

7. ניתוח סטטיסטי

1. הצג נתונים כמותיים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), אלא אם צוין אחרת. הגדר שורות שגיאה כ-SD.
   הערה: במחקר זה, כל ערכי N המדווחים מייצגים שכפולים טכניים שבוצעו באמצעות אליקאוטים של רוק אנושי שהתקבל מסחרית.
2. לבצע ניתוח רגרסיה ליניארית באמצעות ערכי עוצמת קו הבדיקה המנורמל שהתקבלו מריכוזי קורטיזול של 0–8 ng mL⁻¹ וחישוב מקדם הקביעה (R²) מהעקומה המותאמת.
3. חשב את גבול הגילוי (LOD) באמצעות המשוואה הבאה: LOD = 3.3 × SE / |slope|, כאשר SE הוא השגיאה הסטנדרטית של ה-Y ו-|שיפוע| הוא הערך המוחלט של השיפוע המתקבל ממשוואת הרגרסיה הליניארית. השתמש בערך המוחלט של השיפוע כי ה-LFA התחרותי יוצר שיפוע שלילי.
   הערה: במחקר זה לא בוצעו מבחנים סטטיסטיים אינפרנציאליים, ולא הוחלו קריטריוני מובהקות.

תוצאות

טיפול מקדים יעיל ברוק דורש הסרת רכיבים מפריעים, כולל מוקינים וחלבונים, שמפגעים בביצועים האנליטיים בהמשך. יכולת הסינון של SaliFilter הוערכה לראשונה על ידי השוואת שינויים בעכירות לאלו שהושגו באמצעות ערכות איסוף רוק מסחריות (איור 2A). רוק לא מטופל הציג עכירות גבוהה, בעוד דגימות שטופלו ב-SaliFilter נראו ברורות לעין, מה שמעיד על הסרה יעילה של מוצינים ורכיבים תלויים. לעומת זאת, דגימות שעובדו באמצעות ערכות מסחריות הראו שיפור מוגבל בלבד בבהירות.

דיון

אבחון מבוסס רוק מציע חלופה לא פולשנית לניתוח דם. עם זאת, האימוץ הרחב יותר שלהם הוגבל בשל הצמיגות הפנימית של הרוק ונוכחות רכיבים מפריעים כמו מוצינים וחלבונים. גורמים אלו משבשים את הזרימה המונעת על ידי נימים ופוגעים בביצועי פלטפורמות אנליטיות פשוטות, כולל LFAs, ובכך דורשים טיפול מקדים יעיל בדגימה.

במחקר זה אנו מראים כי מכשיר הסינון המוצע ביד, SaliFilter, מסיר ביעילות חומרים מפריעים בעלי משקל מולקולרלי גבוה תוך שמירה על אנליטים קטנים כמו קורטיזול. ציפוי RBCM משמש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רוק מלאכותי	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	לצורך בדיקת Bradford
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	להדמיית רצועות חלבון
ערכת ELISA לקורטיזול	Abcam, UK	ab154996
קורטיזול LFA	In-house
צלחת חימום	Daihan Scientific, Republic of Korea)
הידרוקורטיזון (קורטיזול)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
מאגר דגימות Laemmli	GenDEPOT, USA	L1200-001	להדמיית חלבונים לפני SDS-PAGE
מחזיק ממברנה	GVS Filter Technology	1220950	מחזיק בקוטר 13 מ"מ
Mini-PROTEAN® Tetra Cell לג'לים של 0.75 מ"מ	Bio-Rad, USA	1658000	לצורך אלקטרופורזה של ג'ל
מוצין	Sigma-Aldrich, USA	M2378
ננו-דרופ 2000 ספקטרופוטומטר	Thermo Fisher Scientific, USA		לצורך בדיקת חלבון
ממברנות PES	STERLITECH, USA	PES00313100	ממברנת PES 0.03 מיקרון, 13 מ"מ
מלח פוספט מופרט (PBS)	DUKSAN, Republic of Korea	LB004
רוק אנושי מעורבב	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
מאגר ג'ל מפל ל-PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	להכנת ג'ל מפל
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Germany	51.1534.500	ערכת לאיסוף רוק
מאגר ג'ל מצע ל-PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	להכנת ג'ל מצע
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	ערכת לאיסוף רוק
מזרק	koreavaccine, Republic of Korea)		נפח 1 מ"ל
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	להפולימריזציה של אקרילאמיד