$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מחקר חישובי מבוסס מסד נתונים זה אינו כולל משתתפים אנושיים, ניסויים בבעלי חיים או דגימות קליניות. על פי סעיף 32 של צעדי סין לסקירה אתית של מדעי החיים ומחקר רפואי הכולל נבדקים אנושיים, מחקרים המשתמשים בנתונים שהושגו כחוק לציבור, אינם פוגעים בנבדקים אנושיים, אינם כוללים מידע אישי רגיש ואין להם אינטרסים מסחריים זכאים לפטור מסקירה אתית. לכן, אין צורך באישור אתי למחקר זה.
עיצוב הניסוי וצינור הניתוח של מחקר זה מוצגים בתרשים הזרימה (איור 1).
איור 1: זרימת העבודה הכוללת של המחקר. תרשים הזרימה ממחיש את תהליך העבודה הסדרתי של פרמקולוגיית הרשת וניתוחי עגינה מולקולרית, כולל רכישת רכיבים פעילים ומטרות של סישן דקוקציה (SSD), איסוף מטרות הקשורות לשיגדון, זיהוי מטרות חופפות, בניית רשת תרופה–רכיב–מטרה–מחלה ואינטראקציה בין חלבון–חלבון (PPI), ניתוחי העשרת אנציקלופדיה של גנים וגנומים של קיוטו (KEGG), וסימולציות עגינה מולקולרית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
רכישת רכיבים פעילים וחלבוני מטרה של SSD
ב-2 בינואר 2026, הרכיבים הכימיים הפעילים של חמשת הצמחים המרכיבים את SSD, כלומר Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu ו-Jinyinhua, נאספו ממאגר הנתונים של Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology (TCMSP)מספר 21. הוחלו קריטריוני סקר המבוססים על תכונות פרמקוקינטיות: זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) של ≥30% ודמויות תרופה (DL) של ≥0.1822). רכיבים שעמדו בקריטריונים אלו נחשבו לרכיבים פעילים פוטנציאליים. לאחר מכן נאספו מטרות תואמות לכל רכיב. מכיוון של-TCMSP לא היו נתונים מלאים עבור יואנז'י ושיהו, הרכיבים הכימיים של שני הצמחים הללו נשלפו גם ממאגר צמחי מרפא 2.0 באותו יום. לאחר קבלת שמות הרכיבים, בוצע חיפוש הפוך ב-TCMSP תוך שימוש בשמות הרכיבים ומספרי CAS המתאימים כמילות מפתח לשליפת מידע על היעד. עבור תרכובות שהושגו ממאגר ה-Herb, רק אלו שהותאמו בהצלחה לרשומות ב-TCMSP לפי שם רכיב או מספר CAS נשמרו. התרכובות המותאמות נחשפו לאחר מכן לאותם קריטריונים של סקר פרמקוקינטי (OB ≥ 30% ו-DL ≥ 0.18) באמצעות נתוני TCMSP, ותרכובות ללא מידע מלא על OB או DL הוצאו. כל התרכובות המותאמות והמסוננות אומתו ידנית מול רשומות ה-Herb 2.0 המקוריות כדי למנוע זיהוי שגוי. בהמשך, המידע המטרתי שנגזר ממאגר הצמחים מוזג עם זה של שאר הצמחים ליצירת מערך מלא של יעדי חומרים פעילים ל-SSD.
כל חלבוני המטרה שנאספו הותאמו לסמלים גנים רשמיים באמצעות מאגר הנתונים של UniProt. התכתבות אחד על אחד הוקמה על ידי שמירת רשומות שנבדקו על ידי אדם בלבד (Swiss-Prot) והחרגת רשומות לא נבדקות (TrEMBL). כאשר מספר איזופורמים התאימו לאותו סמל גן, נבחר האיזופורם הקנוני. מאגר הנתונים הסטנדרטי של היעד נשמר לניתוח גנים מצטלבים לאחר מכן.
אוסף מטרות הקשורות לשיגדון
ב-2 בינואר 2026 נערכו חיפושים שיטתיים במסד הנתונים של GeneCards ובמאגר OMIM תוך שימוש במונח "גאוט" כמילה המפתח למחלה כדי להשיג מטרות מחלות הקשורות לשיגדון. היעדים שהושגו משני מסדי הנתונים יוצאו ל-WPS Spreadsheets (גרסה 12.1.0). עמודת סמל הגנים מ-OMIM הוצבה בסמוך לעמודת סמל הגנים מ-GeneCards, ומטרות כפולות הוסרו באמצעות פונקציית "הסרת כפילות" בהתבסס על התאמות מדויקות של סמלי גנים רשמיים באופן שאינו רגיש לאותיות אותיות. היעדים משני מסדי הנתונים אוחדו לאחר מכן לבניית מערך מקיף של מטרות מחלות הקשורות לשיגדון.
זיהוי מטרות חופפות בין תרופות למחלות
מערך יעדי התרופות שהושג מסינון רכיבים פעילים וקבוצת יעדי מחלות הקשורות לשיגדון הונחו באותה תיקיית פרויקט (D:\Venn). תוכנת R (גרסה 4.4.0) הושקה, וחבילת readxl שימשה לייבוא קבצי Excel (.xlsx) המכילים את רשימות היעד. חבילת ה-dplyr שימשה למניפולציה של נתונים, כולל סינון ושינוי שמות של עמודות לפני ניתוח חיתוכים. שתי קבוצות היעדים הוסבו אז לווקטורי תווים, ומטרות חופפות זוהו באמצעות פונקציית calculate.overlap() מחבילת VennDiagram. חבילת VennDiagram הותקנה מ-CRAN באמצעות הפקודה install.packages("VennDiagram") ונשמרה בנתיב ברירת המחדל של ספריית R. אם הופיעה הודעה שהצביעה על כך שהחבילה כבר הותקנה, ההתקנה נחשבה להצלחה. תיקיית העבודה הוגדרה באמצעות הפקודה setwd("D:\\Venn"), שסימנה את התיקייה המכילה את קבצי הקלט ושימשה כתיקיית הפלט. לאחר מכן הופעל מרשם R כדי לחשב את החיתוך בין קבוצת יעד התרופה לבין קבוצת היעד הקשורה למחלות הקשורות לשיגדון. היעדים החופפים שנוצרו הוגדרו כמטרות טיפוליות פוטנציאליות של SSD לטיפול בגאוטה.
בניית רשת "רכיב-תרופה-מחלה-מטרה"
הגנים החותכים שזוהו מהחפיפה בין מטרות SSD ליעדים הקשורות לשיגדון נשמרו כקובץ overlapping_targets.txt , ומידע הרכיב הפעיל של SSD נשמר כקובץ drug_components.txt . שני הקבצים הונחו בתיקיית הפרויקט (D:\Network), ששימשה כתיקיית העבודה לניתוח. כדי להבטיח שחזוריות, ניתוח זה בוצע באמצעות R. פעולות קריאה, סינון ומיזוג נתונים בוצעו באמצעות שילוב של פונקציות בסיס R, כולל read.table(), write.table() ו-merge(), יחד עם חבילת dplyr למניפולציה של מסגרות נתונים. הפקודה setwd("D:\Network") הופעלה כדי להגדיר במפורש את תיקיית העבודה.
פונקציית ה-graph_from_data_frame() שימשה כפונקציית אינטגרציה מרכזית. כל שורה של drug_components.txt קישרה רכיב פעיל לגן היעד המתאים באמצעות סמלים גנים רשמיים. רק מטרות שהיו קיימות overlapping_targets.txt נשמרו, ולא הוחל סינון נוסף מעבר לדרישת הצומת. מאגר הנתונים של הרשת שהתקבל יוצא כ-network.txt בפורמט רשימת קצה. כל שורה הכילה שתי עמודות (node1 ו-node2), כאשר node1 ייצג או את נוסחת ה-SSD או רכיב פעיל, ו-node2 ייצג או רכיב פעיל או גן יעד. צומת המחלה ("גאוט") הייתה מחוברת לנוסחת ה-SSD כקצה נפרד. משקלי קשתות לא הוקצו, וכל הקשתות טופלו באופן שווה (רוחב קשת = 0.8).
קובץ ה-network.txt יובא לתוכנת הוויזואליזציה של רשת Cytoscape (גרסה 3.7.2). כלי NetworkAnalyzer המובנה נגיש דרך כלים → ניתוח רשת → ניתוח רשת כדי לקבל את מבנה הרשת הבסיסי, ו"הפצת דרגות" נבחרה כמסגרת האנליטית. צורות וצבעים של הצמתים הוקצו לפי סוגי הצמתים: יהלומים כחולים ייצגו את נוסחת ה-SSD, מלבנים כחולים ייצגו רכיבים פעילים, אליפסות כתומות ייצגו גנים למטרה של המחלה, ומתומנים אדומים ייצגו את הישות של מחלת הגאוט. גודל הצומת נקבע להיות פרופורציונלי לדרגת הצומת (גודל הצומת = 30 + מעלות × 5, גודל מקסימלי = 100).
בניית רשת האינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)
קבוצת הגנים המטרה המצטלבים המסוננת יובאה למסד הנתונים של STRING (גרסה 12.0) ב-2 בינואר 2026. המין הוגבל להומו ספיינס, סף האמון המינימלי של אינטראקציה הוגדר לביטחון גבוה (0.700), חלבונים מנותקים הוסתרו, מקורות האינטראקציה כללו את כל ערוצי הראיות הזמינים, וכל שאר הפרמטרים נשמרו בהגדרות ברירת המחדל שלהם כדי לקבל אינטראקציות ידועות וחזויות בין חלבונים. נתוני הרשת שהתקבלו יוצאו בפורמט TSV (ערכים מופרדים-טאבים) באמצעות אפשרויות הייצוא ברירת המחדל.
הרשת המיוצאת יובאה לתוכנת ויזואליזציה של רשת לצורך ויזואליזציה וניתוח טופולוגי. מאפייני הרשת חושבו באמצעות כלי NetworkAnalyzer המובנה (כלים → ניתוח רשת → ניתוח רשת). המדדים המחושבים כללו דרגה, מרכזיות ביניים ומרכזיות קרבה. גודל הצמתים מופו לערכי דרגה באמצעות פונקציית מיפוי רציפה (גודל צומת = 20 + מעלה × 3, גודל מקסימלי = 80).
מטרות המרכז זוהו על ידי דירוג כל הצמתים לפי ערכי דרגות בסדר יורד. צמתים עם ערכי דרגה גבוהים יותר נחשבו למרכזיים יותר ברשת. צמתים מבודדים (דרגה = 0) הוצאו מהויזואלציה. פריסת הרשת סודרה במעגלים קונצנטריים מהמרכז החוצה בהתאם לקישוריות הצמתים, וצבעי הצמתים מופו באמצעות גרדיאנט כחול לציאנית התואם לערכי דרגות עולים. הרשת שהתקבלה שימשה לזיהוי מטרות מרכזיות המעורבות בהשפעות הטיפוליות האפשריות של SSD נגד גאוט.
ניתוח העשרה של אונטולוגיית גנים (GO)
בהתבסס על הגנים החופפים שזוהו, בוצע ניתוח העשרה פונקציונלית של GO באמצעות R. חבילות ביו-מוליכים נדרשות הותקנו במסלול ספריית R ברירת המחדל ונטענו בסביבת הניתוח. קובץ הגנים החוצה נשמר בתיקיית הפרויקט (D:\GO), ותיקיית העבודה הוגדרה באמצעות פונקציית setwd().
המרת מזהה גנים והערות בוצעו באמצעות ארגון חבילת Bioconductor. Hs.eg.db (גרסה 3.20.0). סמלי גנים רשמיים הומרו ל-Entrez Gene ID באמצעות פונקציית bitr() בחבילת ניתוח העשרת clusterProfiler (גרסה 4.21.0). רק גנים שהראו מיפויים ייחודיים של אחד לאחד נשמרו לניתוחים במורד הזרם, בעוד שרשומות מעורפלות או לא ממופות הוצאו.
ניתוח העשרת GO בוצע באמצעות חבילת ניתוח ההעשרה. פונקציית enrichGO() שימשה עם קטגוריות האונטולוגיה תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ופונקציה מולקולרית (MF). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות שיטת תיקון בדיקות מרובות של בנג'מיני–הוכברג, כאשר ערך P מותאם < 0.05 נחשב למשמעותי.
לכל קטגוריית אונטולוגיה דורגו מונחים מועשרים משמעותית לפי גורם ההעשרה:
EF = (ספירת גנים / סך כל גני הרקע) ÷ (גודל מונח / גני גנום כולל)
עשרת המונחים המובילים נבחרו לניתוח מפורט. כאשר התרחשו גורמי העשרה זהים, מונחים עם ערכי P מותאמים נמוכים יותר דורגו גבוה יותר.
תוצאות ההעשרה הוצגו באמצעות ggplot2 (גרסה 3.5.1) ו-enrichplot (גרסה 1.24.0). גרפים בועות ותרשימי עמודות נוצרו באמצעות פונקציות dotplot() ו-barplot(). גודל הבועה ייצג את מספר הגנים המועשרים, בעוד שהצבע סימן את משמעות ההעשרה המובעת כ-−log10 (ערך P מותאם). פרמטרי גרפטינג ברירת מחדל שימשו לאורך כל הדרך.
ניתוח העשרת מסלולי KEGG
ניתוח העשרת מסלולי KEGG של מטרות ה-SSD והגאוט החוצה בוצע באמצעות R וחבילת ניתוח ההעשרה שתוארה קודם. סמלי גנים הומרו למזהים תואמי KEGG באמצעות פונקציית bitr() שסופקה על ידי חבילת ניתוח ההעשרה, כאשר KEGG שימש כמשאב ההערות. ניתוח העשרת מסלולים בוצע באמצעות פונקציית enrichKEGG() המבוססת על מבחן היפר-גאומטריה. המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות שיטת תיקון ריבוי בדיקות Benjamini–Hochberg (BH), ומסלולים עם ערך P מותאם < 0.05 נחשבו מועשרים באופן משמעותי.
תוצאות ההעשרה יוצאו לקבצי חוברת עבודה תואמי Microsoft Excel באמצעות חבילת openxlsx (גרסה 4.2.8.1) ופונקציית write.xlsx() לסקירה והכנת אישומים.
לאחר מכן נבנתה רשת אינטראקציה רב-רמתית בין יעד למסלול באמצעות תוכנת המחשת הרשת. נתוני הרשת יובאו באמצעות קובץ → ייבוא → רשת מהקובץ. הצמתים כללו צמתים גנטיים מטרה ונקודות מסלול KEGG מועשרות משמעותית (ערך P מותאם ל-BH < 0.05), בעוד שקשתות ייצגו קשרים מתועדים בין גני מטרה למסלולים מועשרים שזוהו במהלך ניתוח ההעשרה. ההמחשה ברשת בוצעה באמצעות לוח הסגנון של תוכנת ההמחשה הרשתית, כאשר גנים מטרה הוצגו כאליפסות אפורות והמסלולים הוצגו כמלבנים בצבע ציאן. לא נעשה שימוש בתוספים נוספים. הרשת נוצרה ידנית מטבלת פלט ההעשרה כדי להמחיש את הקשרים בין מטרות הליבה למסלולים מועשרים משמעותית.
אימות עגינה מולקולרית
קבצי המבנה התלת-ממדי (פורמט MOL2) של עשרת הרכיבים הפעילים המובילים המדורגים לפי קישוריות יעד ברשת "תרופה–רכיב–מטרה–מחלה' הורדו ממאגר הנתונים של TCMSP. קישוריות המטרה הוגדרה כמדרגת הצומת (כלומר, מספר הקשרים הישירים בין רכיב פעיל לגנים מטרה ברשת). רכיבים פעילים דורגו בסדר יורד לפי ערכי הדרגה, ועשרת הרכיבים הראשונים נבחרו לניתוח עגינה מולקולרי.
מבני הגביש של עשרת חלבוני המטרה המרכזיים שזוהו מרשת PPI התקבלו מבנק נתוני החלבונים של RCSB (PDB) ב-23 בינואר 2026. המין היה מוגבל להומו ספיינס. עבור כל חלבון יעד, המבנה עם הרזולוציה הקריסטלוגרפית הגבוהה ביותר (הערך הנמוך ביותר של Å), ללא מוטציות, והתגבש יחד עם ליגנד או מעכב טבעי, נבחר בהעדפה. אם מספר מבנים עמדו בקריטריונים אלו, נבחר המבנה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר וכיסוי רצף החלבונים המלא ביותר. מבני PDB הבאים שימשו: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (יוני), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6), ו-9CKJ (TP53).
סימולציות עגינה מולקולריות בוצעו באמצעות שרת CB-Dock 2 המקוון (גרסת רשת, נגישה ב-23 בינואר 2026), המשתמש ב-AutoDock Vina כמנוע העגינה. מבני החלבון עוברו עיבוד אוטומטי מראש על ידי השרת, כולל הסרת הטרואטומים והכנת מבני קולטנים. הליגנדים הועלו בפורמט MOL2. נעשה שימוש בזיהוי חללים בלתי תלוי בתבנית, כאשר חמישה חללי קישור פוטנציאליים זוהו אוטומטית עבור כל מבנה חלבון. חישובי עגינה בוצעו באמצעות פרמטרי ברירת המחדל של מנוע העגינה: מיצוניות = 8, טווח אנרגיה = 4, ומספר מצבי קישור מקסימלי = 9.
עבור כל זוג מטרה–תרכובת, העגינה בוצעה באופן עצמאי בתוך כל אחד מחמשת החללים שזוהו. תנוחות העגינה הוערכו באמצעות פונקציית הניקוד של מנוע העגינה, והתנוחה עם אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר בכל חלל נשמרה כקונפורמציה המייצגת של אותו חלל. מבין חמשת הקונפורמציות המייצגות, תנוחת העגינה עם אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר בעולם נבחרה כתוצאת העגינה הסופית עבור זוג המטרה–תרכובת ושימשה לניתוחים הבאים.
ערך האנרגיה המחייב הנמוך ביותר שהושג עבור כל תוצאת עגינה נרשם בגיליון אלקטרוני ויובא לפלטפורמת התכנון המקוונת Weishengxin (נגיש ב-23 בינואר 2026) ליצירת מפת חום באמצעות פרמטרים ברירת מחדל. מפת החום השתמשה בגרדיאנט צבע צהוב לאדום, אשכולות היררכיים בקישור מלא, ומרחק אוקלידי כמדד הקיבוצות.
אינטראקציות בין קשרי מימן זוהו אוטומטית על ידי מודול ניתוח שרת העגינה בהתבסס על קריטריונים גאומטריים. קשר מימן הוגדר כאינטראקציה עם מרחק תורם–מקבל ≤ 3.5 Å וזווית תורם–מימן–מקבל ≥ 120°. קשרי מימן הוצגו כקווים מקווקו בדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות ותלת-ממדיות. זוג החלבון היעד-רכיב הפעיל, שהפגין את אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר בעולם מכל שילובי העגינה, נבחר לניתוח אינטראקציה מפורט. בחירה זו התבססה על זוג מטרה–תרכובת יחיד ולא על תנוחת עגינה בודדת, ונועדה לזהות את האינטראקציה החזויה החזקה ביותר בתוך הרשת. תנוחת העגינה המייצגת הסופית המתאימה לזוג מטרה–תרכובת זה שימשה להמחשה וניתוח אינטראקציה.
דיאגרמות אינטראקציה תלת-ממדיות ודו-ממדיות נוצרו באמצעות ChimeraX גרסה 1.5 ו-LigPlot+ גרסה 2.2, בהתאמה. ב-ChimeraX, החלבונים הוצגו באמצעות ייצוג ברירת המחדל בקריקטורות, הליגנדים הוצגו במצב מקלקל, קשרי מימן הוצגו כקווים מקווקוים, ותכנית הצבעים ברירת המחדל הוחלה. ב-LigPlot+, זיהוי קשרי מימן בוצע באמצעות אלגוריתם HBPLUS עם סף מרחק בין תורם למקבל של 3.9 Å וסף זווית של 90°. כל שאר פרמטרי ההדמיה נשמרו בהגדרות ברירת המחדל שלהם.