הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

שינוי N6-מתילאדנוזין של Rab27A מקדם אוסטאופורוזיס על ידי השפעה על התמיינות אוסטאוקלטים במודל העכבר שעבר שחלות

50 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

11 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

YTHDC1 מעודד את ייצוא הציטופלזמה של Rab27A שעבר שינוי m6A, בעוד IGF2BP2 מייצב את Rab27A בציטופלזמה, ובכך משפר את התמיינות האוסטיאוקלסטים ותורם לאוסטאופורוזיס.

תקציר

פיתוח טיפולים חדשניים לאוסטאופורוזיס משך תשומת לב גוברת. Rab27A עובר ויסות גבוה במהלך התמיינות האוסטיאוקלסטים, ושינוי N6-מתילאדנוזין (m6A) הפך לווסת אפיגנטי חשוב במחלות אורתופדיות. ניתוחים ביואינפורמטיים חזו כי Rab27A מכיל מספר אתרי שינוי m6A ומקיים אינטראקציה עם מספר חלבונים הקשורים ל-m6A. נערכו ניסויי הנקה כדי להעריך את תפקיד Rab27A בהבדלה של אוסטאוקלסט ואוסטאופורוזיס באמצעות מודל עכבר שחלות (OVX). דלדול Rab27A הפחית את האוסטאופורוזיס והעלה את אחוז היווצרות העצם מ-14.73% ל-28.13% (P < 0.05) בעכברי OVX. ווסטרן בלוטינג ו-PCR כמותי הראו כי הפלת Rab27A הפחיתה את ביטוי החלבון וה-mRNA של סמני האוסטיאוקלסטים TRAP, NFATc1 ו-c-FOS, ובכך דיכאה התמיינות אוסטאוקלסטית של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) שנגרמו על ידי גורם מגרה מושבות מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל הקולטנים של ליגנד גורם גרעיני-κB (RANKL). צביעת TRAP הראתה בנוסף כי דלדול Rab27A הפחית משמעותית את פעילות TRAP מ-24.1% ל-12.9% (P < 0.01) לאחר השראה של M-CSF ו-RANKL. בדיקות אימונופרסיפיטציה של RNA אישרו אינטראקציות בין Rab27A לחלבוני הקורא m6A YTHDC1 ו-IGF2BP2. הפרדה גרעינית וציטופלזמית הראתה כי YTHDC1 מסייע לייצוא ציטופלזמי של Rab27A שעבר שינוי m6A. בנוסף, ניתוחי q-PCR ו-Western Blot הראו כי הפחתת YTHDC1 או IGF2BP2 הפחיתה את ביטוי Rab27A והפחיתה את ביטוי TRAP, NFATc1 ו-c-FOS, ובכך דיכאה התמיינות אוסטאוקלסטית שנגרמה על ידי M-CSF ו-RANKL. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שייצוא ציטופלזמה בתיווך YTHDC1 וייצוב IGF2BP2 של Rab27A מותאם על ידי m6A מקדמים התמיינות אוסטאוקלסטית ותורמים לאובדן עצם במודל העכבר OVX.

מבוא

אוסטאופורוזיס (OP) היא הפרעה שלדית נפוצה המאופיינת בהידרדרות של מיקרוארכיטקטורת העצם וירידה בצפיפות המינרלים של העצם, מה שמוביל לסיכון מוגבר לשברים ברחבי העולם 1,2,3. שברים אוסטאופורטיים מתרחשים בעיקר באמה, בהומרוס, בירך ובעמוד השדרה, והם נפוצים במיוחד בקרב מבוגרים. שברים אלו פוגעים משמעותית באיכות החיים ומטילים נטל פיזי, פסיכולוגי וחברתי-כלכלי משמעותי על המטופלים, משפחותיהם ומערכות הבריאות3. כתוצאה מכך, מניעה, ניהול וטיפול באוסטאופורוזיס נותרו עדיפויות מרכזיות קליניות ובריאות הציבור.

פותחו מגוון אסטרטגיות טיפוליות לאוסטאופורוזיס וניתן לסווג אותן בדרך כלל לשתי קטגוריות: תרופות ליצירת עצם וטיפולים אנטי-ספיגיים 4,5. תרופות אנטי-ספיגות מסורתיות כוללות ביספוספונטים, ראלוקסיפן וסטרונציום רנלט, בעוד שחומרים חדשים יותר כוללים דנוסומב, אודנקטיב וסראקטיניב. טיפולים ליצירת עצם כוללים הורמון פאראתירואיד (PTH 1–84), בעוד שמספר מועמדים נוספים, כגון MK-5442, AMG 785 ו-BHQ 880, נמצאים בפיתוח קליני5. למרות שטיפולים אלו יכולים להיות יעילים, רבים מהם קשורים לתופעות לוואי משמעותיות, יעילות מוגבלת לטווח הארוך, או הגבלות על שימוש ממושך 4,6,7,8,9. לדוגמה, מתן ארוך טווח של אמינוביספוספונטים ודנוסומב עלול לפגוע בעיצוב עצם תקין5. לכן, זיהוי מטרות טיפוליות בטוחות ויעילות יותר נותר מטרה חשובה במחקר האוסטאופורוזיס.

חלבוני ראב הם רגולטורים מרכזיים של תנועת ווסיקולות תוך-תאית ואותות תאים, ומשתתפים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל זיהום ויראלי, אוטופגיה וארגון ציטוסקלטל10. בשנים האחרונות, תשומת לב גוברת הופנתה לתפקידי חלבוני משפחת ראב במטבוליזם העצם ואוסטאופורוזיס. דווח כי Rab44 מווסת התמיינות אוסטאוקלסטית על ידי ויסות איתות Ca2⁺ תוך-תאי והפעלת גורם גרעיני של תאי T מופעלים 1 (NFATc1) במפעיל קולטנים של גורם גרעיני-ליגנד κB (RANKL)11. אוסטאוקלסטים הם תאים רב-גרעיניים שמקורם בקדומים בקו המקרופאגים ומשחקים תפקידים חיוניים בספיגת עצם ובהומאוסטזיס השלד 12,13,14,15,16,17,18,19. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים השולטים על התמיינות אוסטאוקלסט היא קריטית לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לאוסטאופורוזיס.

Rab27A הוא חבר חשוב במשפחת Rab GTPase ומתבטא באופן נרחב בתאי הפרשה וחיסוניים. הוא ממלא תפקידים מרכזיים בהעברת ווסיקולות, אקסוציטוזה ואיתות תוך-תאי 20,21,22,23,24,25,26,27. מחקרים קודמים הראו כי Rab27A מווסת דגרנולציה של אאוזינופיל במהלך דלקת דרכי הנשימה ומבקר את המוביליזציה הוזיקולרית הקשורה לפעילות NADPH אוקסידאז במקרופאגים מופעלים20.23. ראוי לציין כי ראיות מצטברות מצביעות על כך שהביטוי של Rab27A מווסת משמעותית במהלך התמיינות האוסטיאוקלסטית. שימדה-סוגווארה ואחרים דיווחו כי ביטוי Rab27A עולה במהלך התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) לאוסטאוקלסטים, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי באוסטאוקלסטוגנזה28. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-Rab27A עשוי להשפיע על היווצרות ותפקוד האוסטאוקלסטים על ידי ויסות תנועת וזיקולריות ומסלולי איתות תוך-תאיים28,29.

N6-מתילאדנוזין (m6A) הוא השינוי הפנימי השכיח ביותר ב-RNA שליח אאוקריוטי וב-RNA שאינו מקודד, ומשמש כרגולטור קריטי של חילוף החומרים והביטוי של הגן. כשינוי ה-mRNA הראשון שזוהה ביונקים, m6A היה מעורב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל יציבות RNA, חיבור, הובלה ותרגום. Wang ואחרים הראו כי שינויים ב-m6A, המופיעים בדרך כלל בתוך מוטיבים של רצפים משומרים, מזוהים על ידי חלבונים המכילים תחום YTH ותורמים לוויסות יציבות ה-mRNA והמטבוליזם30. יתרה מזאת, שינוי m6A היה מעורב בתפקודים ביולוגיים מגוונים, כולל יציבות הגנום, ויסות שעתוק, ארגון כרומטין, התקדמות סרטן ותגובות חיסוניות31. מחקרים עדכניים הדגישו גם תפקידים חשובים לאיתות m6A במחלות הקשורות לעצמות ובאוסטאופורוזיס32.

מבין חלבוני הקריאה m6A, YTHDC1 פועל כקורא גרעיני המווסת עיבוד RNA וייצוא גרעיני, בעוד שחלבון קושר mRNA 2 (IGF2BP2) דמוי אינסולין 2 מייצב תמלילים שעברו עיבוד m6A בציטופלזמה. צ'ן ועמיתיו הראו ש-YTHDC1 מקדם את ייצוא הגרעין של circNSUN2 שעבר שינוי m6A, אשר מתקשר לאחר מכן עם IGF2BP2 לייצוב mRNA של HMGA2 ולקידום גרורות סרטן המעי הגס33. ממצאים אלו מצביעים על כך שוויסות מתואם על ידי YTHDC1 ו-IGF2BP2 עשוי לייצג מנגנון כללי השולט בגורלם של תמלולים שעברו שינויים ב-m6A.

המחקר הנוכחי חקר אתרי שינוי חזויים של m6A בתוך mRNA של Rab27A ובחן את האינטראקציות שלו עם YTHDC1 ו-IGF2BP2. נמצא כי YTHDC1 מקל על ייצוא גרעיני של תמלילי Rab27A שעברו שינוי m6A, בעוד IGF2BP2 אינטראקציה עם Rab27A בציטופלזמה ושיפר את יציבותו. באמצעות מנגנון רגולציה זה, Rab27A קידם התמיינות אוסטאוקלסטית ותרם להתפתחות האוסטאופורוזיס. ביחד, הממצאים מזהים מסלול רגולטורי התלוי ב-m6A שלא זוהה קודם לכן, הכולל את YTHDC1, IGF2BP2 ו-Rab27A בהבדלת אוסטאוקלסט. תוצאות אלו מספקות תובנות חדשות לגבי הפתוגנזה המולקולרית של האוסטאופורוזיס ועשויות לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות הממוקדות בוויסות m6A של Rab27A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הגנת בעלי חיים וניצול בית החולים המסונף של אוניברסיטת סאות'ווסט לרפואה (אישור מס' 2024-Ethics-042). כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE, לחוק בעלי החיים הבריטי (נהלים מדעיים) 1986 ולהנחיות הנלוות, להוראת האיחוד האירופי 2010/63/EU, ולמדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (פרסום NIH מס' 8023, מתוקן 1978). העכברים חולקו באקראי לקבוצות ניסוי, ורצף ההקצאה הוסתר מהחוקר. כל איסוף הנתונים והניתוחים, כולל הערכה היסטולוגית, ניתוח תמונות מיקרו-CT וניתוחים סטטיסטיים, בוצעו על ידי חוקרים עיוורים להקצאת קבוצות. לא הוצאו בעלי חיים או דגימות מהניתוחים. כל התגובות, הציוד, התוכנה והמשאבים האחרים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. בניית מודל השחלות (OVX)

עשרים וארבע נקבות עכברים מסוג בר מסוג C57BL/6 בגיל 8 שבועות שימשו לבניית מודל אוסטאופורוזיס. לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, העכברים חולקו באקראי לקבוצת Sham או OVX. מודל OVX הוקם באמצעות כריתת שחלות דו-צדדית כפי שתואר קודם34,35. עכברים שניתחו בשמה עברו חשיפה ניתוחית של השחלות ללא הסרה.

להעברת גנים תוך-ירכית, וקטורים לנטיויראליים המבטאים sh-Rab27A או sh-NC הוזרקו 7 ימים לאחר ניתוח OVX כפי שדווח קודםלכן 36,37. בקצרה, חלקיקי לנטיוויראל מרוכזים (1 × 106 יחידות טרנסדוקציה למ"ל) הושמו לעצם הירך דרך מסלול הפיקה באמצעות מחט 22 גייג' תחת הרדמה. כל עכבר קיבל 20 מיקרו-ליטר של תליון לנטיויראלי. החתך נתפר לאחר מכן, והחיות נבדקו לאורך כל תקופת ההחלמה.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים. דגימות הירך נאספו 8 שבועות לאחר הניתוח. לפחות שישה עכברים בכל קבוצה שימשו לניתוחים היסטולוגיים ולחילוץ RNA או חלבון.

2. הדמיית מיקרו-CT ב-in-vivo

בוצעה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) להערכת מורפולוגיית עצם טרבקולרית. הטיביה הימנית של כל עכבר נסרקה ב-vivo לפני ניתוח OVX בגיל 14 שבועות. סריקות מעקב בוצעו מדי שבוע עד גיל 22 שבועות. לפחות שישה עכברים בכל קבוצה נכללו בניתוח המיקרו-CT.

העכברים הורדמו בפנטוברביטל נתרן תוך-פריטוניאלי (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף). הרדמה מספקת אושרה על ידי היעדר רפלקס צביטת האצבעות ועל ידי ניטור מתמיד של קצב הנשימה, והיא נשמרה לאורך כל תהליך ההדמיה. כל הליכי המתת החסד בוצעו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר, להנחיות רווחת בעלי חיים מוסדיות, ולתקנות הלאומיות להמתת חסד לבעלי חיים במעבדה.

בגיל 24 שבועות, עכברים הושמתו על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה עמוקה, ושתי הטיביות נלקחו לסריקת ex vivo באמצעות אותו פרוטוקול הדמיה. פרמטרי הסריקה כללו גודל ווקסלים של 10.4 מיקרון, מתח של 55 קילו-וולט, זרם של 145 מיקרואמבר, שדה ראייה של 32 מ"מ, 1500/750 דגימות לכל הקרנה, וזמן אינטגרציה של 100 מילישניות.

התמונות עובדו באמצעות אלגוריתם תיקון הקשחת קרן פולינומי מדרגה שלישית, מכויל מול פנטום של 1200 מ"ג HA/cm3 . שבר נפח העצם (BV/TV), עובי טרבקולר (Tb.Th) ומספר טרבקולר (Tb.N) נמדדו במטאפיזיזה הפמורלית הדיסטלית הממוקמת במרחק 1.0 מ"מ קרוב לפלטת הגידול.

3. טרנספקציה לפלסמיד

פלסמידים sh-Rab27A ו-sh-NC יוצרו ושימשו לייצור לנטיווירוס. פלסמידים ארוזים לנטיויראליים ומבני shRNA הועברו יחד לתאי HEK293T בהתאם להוראות היצרן. טיטרים ויראליים נקבעו לפני מתן תוך-ירך כפי שתואר קודם36. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

4. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)

דגימות הירך קיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד במשך 24 שעות, דה-קלציפיק ב-10% EDTA במשך 4 שבועות, הוגנו בקירור ב-30% סוכרוז/PBS, הוטמעו בפרפין, וחתכו בעובי של 5 מיקרון. חתכי הרקמה צובקו בהמטוקסילין ואאוזין ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ אור. לפחות שישה עכברים בכל קבוצה נותחו.

5. צביעת חומצה עמידה לטארטרט (TRAP)

צביעת TRAP של חתכי הירך בוצעה בהתאם להוראות היצרן38. פעילות TRAP במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) הוערכה באמצעות בדיקת צביעת TRAP. אוסטאוקלטים בוגרים הוגדרו כתאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAP המכילים לפחות שלושה גרעינים. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, כל אחד עם שלושה שכפולים טכניים.

6. q-PCR

סך ה-RNA בודד באמצעות תגובת טריזול לפי הוראות היצרן. DNA משלים סונתז באמצעות טרנסקריפטאז הפוך ונחשף ל-PCR כמותי בזמן אמת באמצעות כימיה של SYBR Green. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, כל אחד עם שלושה שכפולים טכניים.

רצפי הפריימר היו כדלקמן:

Rab27A: F, TTCCTGCTCTGTTTCGACCT; R, GGCAGCACTGTTTCAAAT

מלכודת: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGGAAAGGTGTGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCCCAGCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-אקטין: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. כתמים מערביים

תאים או רקמות עברו ליזה באמצעות בופר RIPA שהושלף עם מעכבי פרוטאז. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת ברדפורד. כמויות שוות של חלבון (20 מיקרוגרם) הופרדו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות פוליווינילידין פלואוריד (PVDF) או ניטרוצלולוזה. הממברנות נחסמו עם חלב דל שומן 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 או β-אקטין. לאחר השטיפה, הממברנות דוגרו עם נוגדנים משניים מתאימים למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות נהלי זיהוי סטנדרטיים. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

8. תרבית תאים

מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) בודדו כפי שתואר קודם39. תאי מח עצם שנקטפו מעצם עצם העכבר נגרמו במהלך הלילה במדיום חיוני מינימלי α עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 30 ng/mL גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. תאים לא דבקים נאספו ותרבתו במערכת נטולת תאי סטרומל המכילה 30 ng/mL M-CSF. לאחר 3 ימים, תאים דבקים נאספו כ-BMM והוגדרו בנוכחות 30 ng/mL M-CSF ומפעיל קולטנים של 50 ng/mL של ליגנד גרעיני-κB (RANKL) במשך 72 שעות כדי לעודד התמיינות אוסטאוקלסטית.

9. הפרעות RNA (RNAi)

RNA קטן מתערב (siRNAs) סונתז והועבר באמצעות מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים לפי הוראות היצרן. התאים נזרעו בצפיפות של 2 ×-10תאים באר בלוחות של שישה בארות לפני הטרנספקציה. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

רצפי היעדים היו כדלקמן:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. אימונופלואורסצנציה

התאים תוקנו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות וחדיר ב-0.1% טריטון X-100 למשך 10 דקות. לאחר חסימה עם אלבומין סרום בקר 5% למשך 30 דקות, התאים הוגברו עם נוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר הכביסה, הוחלו נוגדנים משניים מצומדים בפלואורופור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. גרעינים צובעו נגד ב-DAPI, והתמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

11. הפרדה גרעינית וציטופלזמית

שברים גרעיניים וציטופלזמיים בודדו לפי הוראות היצרן. התאים הונחו על קרח למשך 10 דקות וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט המכיל רכיבים ציטופלזמיים נאסף, בעוד שהגרעינים המכילים הכדור נשטף ועובד בנפרד.

12. אימונופרציפיטציה של חלבון קשור ל-RNA (RIP)

בדיקות אימונופרציפיטציה של RNA (RIP) בוצעו בהתאם להוראות היצרן. לזמן קצר, התאים היו מונחים על קרח למשך 30 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסופרנטנטים דוגרו במהלך הלילה עם נוגדנים וחרוזי אגרוז חלבון A/G. לאחר השטיפה, חלבונים עם אימונופרציפיטציה נותחו באמצעות Western blotting, ו-RNA קו-אימונופרציפיטציה נותח באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

13. בדיקת יציבות mRNA של Rab27A

סך ה-RNA הוצא בנקודות הזמן המצוינות לאחר IGF2BP2 ההפלה. לאחר מכן בוצעו שעתוק הפוך ו-PCR כמותי בזמן אמת. רמות ה-mRNA של Rab27A נורמל לקבוצת si-NC המתאימה ב-0 שעה. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

14. ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים בוצעו באופן עצמאי באמצעות לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים. עבור q-PCR, הפרעות RNA, צביעת TRAP, ווסטרן בלוטינג ובדיקות נוספות מבוססות תאים, כל שכפול ביולוגי כלל שלושה שכפולים טכניים אלא אם צוין אחרת. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה 9.0 של GraphPad Prism ותוכנת SPSS. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט. השוואות בין קבוצות מרובות נותחו באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA), ואחריו מבחן השוואות מרובות לאחר מכן של טוקי כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. ערך P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפלת Rab27A הפחיתה את האוסטאופורוזיס במצב חי.

כדי לחקור את תפקיד Rab27A באוסטאופורוזיס, בוצעה הפיכה של Rab27A במודל עכבר שחלה (OVX) שהוקם בשיטות שדווחו בעבר34,40. עיצוב המחקר הכולל מסוכם באיור 1. ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת הראה שצפיפות מינרלים בעצם, שבר נפח העצם (BV/TV), עובי טרבקולר (Tb.Th) ומספר טרבקולר (Tb.N) ירדו באופן משמעותי בעכברי OVX בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התמיינות האוסטיאוקלסטים ממלאת תפקידים חיוניים בעיצוב מחדש של עצם, ספיגת עצם, תיקון שברים, והומאוסטזיס השלדי12˒15˒17˒18˒42˒43. פעילות אוסטאוקלסטית מופרזת היא גורם מרכזי לאוסטאופורוזיס, מה שהופך את זיהוי מסלולים רגולטוריים השולטים בהבדלת אוסטאוקלטים למטרה מחקרית חשובה. מספר טיפולים אנטי-ספיגתיים המיועדים לתפקוד האוסטיאוקלסט הוכיחו יעילות קלינית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט שיתוף הפעולה האסטרטגי המדעי והטכנולוגי בין בית החולים העממי פנגג'ואו לאוניברסיטת הרפואה דרום-מערבית (מענק מס' 2023PZXNYD01) לליאן טאנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

מקורות

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מקרופאגים ממח העצםצביעת TRAPWestern BlotYTHDC1IGF2BP2
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.