מאמר שיטה

עוצמה ומשך זמן של אות TCR בהפעלה ובידול של תאי T מסוג CD8+ ראשוניים בעכבר: גישה סטנדרטית במעבדה (In Vitro)

83 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

25 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה שיטתית להפעלת תאי CD8 נאיביים ראשוניים מעכבר+ תאי T באמצעות גישתה של גירוי מדורג של TCR, המאפשרת ניתוח מקיף של פרוליפרציה, אקטיבציה והפקה של ציטוקינים על ידי CD8+ תאי T בעוצמות שונות של אותי TCR.

תקציר

עוצמת האות ומשכו של הקולטן של תאי T (TCR) הם קובעים קריטיים של הפעלה, התרבות ודיפרנציאציה פונקציונלית של תאי CD8⁺ T. עם זאת, מודלים סטנדרטיים in vitro המשווים באופן שיטתי כיצד קלטים שונים של אות TCR מעצבים את גורל תאי ה-T נותרו מוגבלים. מחקר זה מציג שיטה הניתנת לשחזור להפעלת תאי T ראשוניים של עכברים in vitro באמצעות anti-CD3 קשור ללוח ו-anti-CD28 מסיס, בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), ובודק כיצד שינוי בריכוז ה-anti-CD3 (עוצמת האות) ובזמן הגירוי (משך האות) משפיע על תוצאות ההפעלה של תאי T. אנו מפרטים פרוטוקול לבידוד תאי T נאיביים מעכברי C57BL/6, ולאחריו גירוי בטווח של ריכוזי anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) ומשכי זמן (6–48 h). ביצענו אנליזה באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי להעריך סיגנלינג מוקדם המושרה על ידי TCR באמצעות חלבון S6 ריבוסומלי זרחני (p-S6) תוך-תאי כמדד לפעילות של mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1), ולאחר מכן הערכנו אירועים במורד הזרם הכוללים סממני הפעלה על פני השטח (CD69, CD25, ICOS, PD-1), התרבות תאית באמצעות דילול של צבע מעקב אחר התרבות בסגול (CTV), וביטוי של מולקולות אפקטוריות (Granzyme B, TNF-α) כאינדיקטורים לדיפרנציאציה פונקציונלית. השיטה מספקת מדריך ויזואלי ברור ובשלבים לביצוע גירויים הניתנים לשחזור של תאי T, ומאפשרת לחוקרים לנתח כיצד פרמטרים ספציפיים של אות TCR מכוונים את החלטות הגורל של תאי T. גישה זו לא רק תומכת במחקרים מכניסטיים של הפעלה ודיפרנציאציה של תאי T, אלא גם מציעה פלטפורמה לאופטימיזציה של התניית תאי T עבור אימונות סלולרית מאמצת (adoptive immunotherapy) ובדיקות priming in vitro. על ידי שילוב של הדגמה בווידאו עם קריינות מפורטת של הפרוטוקול, פרוטוקול זה ישפר את השקיפות המתודולוגית ואת היכולת לשחזר את התוצאות במחקרים של אימונולוגיה של תאי T.

מבוא

תאי T חיוניים לתגובות חיסוניות מגנות מפני פתוגנים וגידולים. תאי T נאיביים נשמרים באופן פעיל במצב רדירה (quiescent state) כדי להבטיח את הישרדותם ואת נוכחותם לאורך זמן1. עם גירוי של אנטיגן, תאי T יוצאים ממצב הרדירה, עוברים התרחבות קלוניאלית ודיפרנציאציה של תאי אפקטור2. סיגנלינג של קולטן תאי T (TCR) משמש כתהליך הליבה ליזום ולהסדיר תגובות חיסוניות אדפטיביות3. עם זיהוי ספציפי של מולקולות קומפלקס פפטיד-MHC (pMHC) המוצגות על פני השטח של תאים מציגי אנטיגן (APCs), מופעל רצף של אירועי סיגנלינג, אשר מניע את ההתרחבות הקלוניאלית ואת הדיפרנציאציה התפקודית של תאי T4,5,6.

עוצמת הגירוי של ה-TCR, הנקבעת על ידי גורמי מפתח הכוללים אפיניות, אווידיות וריכוז של האנטיגן, ממלאת תפקיד קריטי בויסות עוצמת הפעלת תאי T, רכישת תפקודי אפקטור והמסלול של הדיפרנציאציה לעבר תתי-אוכלוסיות מובחנות של תאי T אפקטורים או תאי זיכרון7,8,9. מודלים נוכחיים in vitro לחקר הפעלת תאי T התלויה ב-TCR משתמשים בעיקר בנוגדנים anti-CD3 ו-anti-CD28 קשורים לפלטה או למסבים, המספקים בו-זמנית הן ליגציה של TCR והן אותות קו-סטימולטוריים10,11. למרות שמערכות כאלה נמצאות בשימוש נרחב, הן בדרך כלל עושות שימוש בריכוז בודד, ולעתים רווי, של נוגדן anti-CD3, מה שמאפשר רק השוואה בינארית של "הכל או כלום" בהפעלת תאי T, במקום ללכוד את הטווח הדינמי של עוצמות אות ה-TCR הניתנות להשגה באמצעות גרדיאנט מתומתן של גירויים12,13.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק מערכת in vitro סטנדרטית הניתנת לשחזור כדי להעריך באופן שיטתי כיצד עוצמות הדרגתיות של אות TCR מווסתות את האקטיבציה, השכפול והפנוטיפים התפקודיים של תאי T מסוג CD8+ ראשוניים של עכברים, תוך שימוש במדרגים של anti-CD3 במינונים שונים (0.1–10 µg/mL) ו-anti-CD28 קבוע (1 µg/mL). גישה זו מתבססת על ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית הלוכדת הן את השסעול המעלה — באמצעות חלבון S6 ריבוסומלי מפספור פנים-תאי (p-S6) כמדד לפעילות של complex 1 של המטרה המכנית של רפמיצין (mTORC1) — והן את התוצאות התאיות במורד המסלול, כולל שכפול שנמדד על ידי דילול CTV, סממני שטח של אקטיבציה (CD69, CD25, T-cell costimulatory inducible [ICOS], programmed cell death protein 1 [PD-1]), וביטוי של מולקולות אפקטוריות (Granzyme B, tumor necrosis factor-alpha [TNF-α]), לאורך מסגרת זמן של 6 עד 48 שעות.

הפרוטוקול שלנו משתמש בריכוז מדורג של נוגדי anti-CD3 קשורי-פלטה כדי לווסת במדויק את עוצמת הגירוי, ובכך לחקות את האפיניות הדיפרנציאלית של קישור TCR הנצפית בתנאים פיזיולוגיים. השיטה משיגה יעילות גבוהה בדילול צלוב (crosslinking) של TCR והפעלה חזקה של תאי T ראשוניים במצב מנוחה. הליך הציפוי הסטנדרטי מבטיח התפלגות אחידה של הנוגדנים על פני שטח הפלטה, מה שמוביל לגירוי עקבי בין תאים באותה סדרה וליכולת שחזור ניסויית מצוינת. פורמט זה מספק גישה חסכונית ופשוטה מבחינה תפעולית להפעלת תאי T.

עם זאת, יש להכיר במגבלות מסוימות של גישה זו. גרייה המתווכת על ידי נוגדי-CD3/CD28 שונה באופן ניכר מההקשר הפיזיולוגי in vivo. למרות ששיטות ניסיוניות המשתמשות אך ורק בנוגדים אגוניסטיים ל-CD3 ול-CD28 להערכת שפעול תאי T יכולות לספק מדדים יעילים לשפעול, הן אינן מצליחות לשחזר במלואן את האינטראקציות בין תאים מציגי אנטיגן לבין תאי T, כמו גם את המיקרו-סביבה הקו-סטימולטורית המתרחשת בתנאים פיזיולוגיים14.

על אף מגבלות אלה, פרוטוקול זה מציע פלטפורמה שיטתית הניתנת לשחזור, המשמשת ככלי בעל ערך ונגיש לחקירת תגובות של תאי T התלויות בעוצמת אות ה-TCR, ויכולה להוות השלמה למודלים מורכבים יותר הספציפיים לאנטיגן.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של Third Military Medical University.

1. הכנת ריאגנטים ולוחיות

  1. הכינו anti-CD3 לקשירה לפלטה ב-PBS סטרילי בריכוזים של 0.1, 0.5, 1, 5 ו-10 µg/mL.
  2. הוסיפו 50 µL של תמיסת הציפוי של anti-CD3 לכל באר בפלטות 96-בארים בעלות תחתית שטוחה.
  3. אטמו את הפלטות באמצעות סרט איטום והדגירו לדגירה למשך לילה ב-4 °C.
  4. שאבו את תמיסת הציפוי ושטפו כל באר פעמיים עם 200 µL של PBS סטרילי לפני הוספת התאים.

2. בידוד תאי T נאיביים מסוג CD8+ מטחול של עכבר

  1. בחרו עכברים זכרים בני 6–8 שבועות מדגם C57BL/6 (שנרכשו מ-Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) והשמידו אותם באמצעות שאיפת CO2  ואחריה פריקה צווארית (cervical dislocation). העכברים שוהים בתנאים נטולי פתוגנים ספציפיים (SPF), עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ומים. לפחות 3 עכברים משמשים לכל ניסוי עצמאי.
  2. בצעו חתך זהיר בפריטונאום בעזרת מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הטחול, תפסו והוציאו את הטחול באמצעות פינצטה, והניחו אותו בצלחת איסוף המכילה RPMI 1640 מקורר מראש, מועשר ב-2% סרום בקר עוברי (FBS) (R2). השאירו את הצלחת על קרח עד לשלב הדיסוציאציה.
    הערה: אספו את כל גופות בעלי החיים ופסולת תרביות התאים לשקיות פסולת ביולוגית ייעודיות והעבירו אותן באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 °C למשך 20 דקות לפני ההשלכה.
  3. הוציאו את הטחול מצלחת האיסוף והעבירו אותו לצלחת של 60 מ"מ המכילה 3 mL של 1 × ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer.
  4. הכינו תרחיף של תאים בודדים על ידי מעיכה עדינה של הטחול דרך מסנן תאים של 70 µm באמצעות הבוכנה של מזרק של 3 mL.
  5. דגרו את התרחיף למשך 1 דקה בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן הוסיפו 3 mL של מצע R2 מקורר מראש כדי לנטרל את ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer.
  6. העבירו את תרחיף התאים לפפלת קונוס של 15 mL וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 500 × g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 °C.
  7. לאחר הצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) ב-10 mL של באפר צביעה לציטומטריה זורמת (PBS עם 2% FBS).
  8. סננו את התרחיף דרך מסנן תאים של 70 µm לתוך פפלת קונוס חדשה של 15 mL, ולאחר מכן סובבו שוב בצנטריפוגה במהירות של 500 × g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 °C.
    הערה: יש להשמיט נתרן אזייד (Sodium azide) מבאפר הצביעה לציטומטריה זורמת כדי לשמר את חיוניות התאים עבור בדיקות תפקודיות. יש להחזיק את כל הדגימות בטמפרטורה של 4 °C ולנתח אותן באופן מיידי.
  9. שאבו את הנוזל העליון ותלו את משקע התאים ב-200 µL של תערובת נוגדנים מביוטין לכל טחול של עכבר (המכילה anti-CD16/32 (Fc block), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 ו-anti-F4/80).
  10. דגרו על קרח למשך 25 דקות תוך היפוך עדין של הפפלה בכל 5 דקות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  11. שטפו את התאים בנפח גדול של באפר צביעה לציטומטריה זורמת, סובבו בצנטריפוגה במהירות של 500 × g למשך 5 דקות והשליכו את הנוזל העליון.
  12. תלו את המשקע באותו נפח של באפר צביעה לציטומטריה זורמת ששימש עבור תערובת הנוגדנים המביוטין, הוסיפו חרוזי מגנט מצופים בסטרפטאבידין בחצי מהנפח הזה, ודגרו על קרח למשך 15 דקות תוך היפוך עדין של הפפלה בכל 5 דקות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  13. סובבו את הפפלה קצרה בצנטריפוגה, הניחו אותה על מעמד מגנטי למשך 2–3 דקות, והעבירו בזהירות את הנוזל העליון (תאי CD8+ T נאיביים מועשרים) לפפלת קונוס חדשה של 15 mL.
  14. שטפו את התאים שנאספו פעם אחת עם באפר צביעה לציטומטריה זורמת, וסובבו שוב בצנטריפוגה במהירות של 500 × g למשך 5 דקות.
  15. השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-RPMI 1640 מועשר ב-10% FBS (R10) עבור יישומים המשכיים.

3. סימון בצבע מעקב אחר התרבות בסגול (CTV) למעקב אחר התרבות

  1. הכינו תמיסת עבודה CTV טרייה בריכוז 2 × (10 µM) מיד לפני השימוש. ערבבו היטב את תמיסת המלאי של CTV בריכוז 5 mM (בדימתיל סולפוקסיד [DMSO]) באמצעות וורטקס, ודללו אותה עם PBS סטרילי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 µM.
    זהירות: טיפלו בתמיסת המלאי של CTV (שהוכנה ב-DMSO) באמצעות כפפות ניטריל תחת מapay, כיוון ש-DMSO מקל על ספיגת תרכובות רעילות דרך העור. הימנעו משאיפה וממגע עם העור.
  2. סספנדו מחדש מחצית מתאי T נאיביים CD8+ המבודדים ב-PBS מקורר מראש בצפיפות של 8 × 107 תאים/מ"ל.
  3. הוסיפו במהירות נפח שווה של תמיסת עבודה CTV בריכוז 2 × (10 µM) לסספנד התאים וערבבו היטב באמצעות פיפטינג, כדי להגיע לריכוז סופי של 5 µM עבור CTV.
  4. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר (RT) בחושך למשך 20 דקות, תוך הפיכה עדינה של המבחנות בכל 5 דקות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  5. הוסיפו 5 נפחים של מצע גידול (המכיל לפחות 10% FBS) לתאים ודגרו למשך 5 דקות על קרח כדי להסיר צבע חופשי.
  6. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 × g למשך 5 דקות וסספנדו מחדש את המשקע במצע מלא R10 שחומם מראש, בתוספת anti-CD28 (ריכוז סופי: 1 µg/mL) ו-IL-2 (ריכוז סופי: 10 ng/mL).
  7. הוסיפו 250 µL של סספנד תאים (המכיל 6 × 105 תאים) לכל באר בלוחיות 96-באריים המצופות מראש.
  8. גדלו את התאים ב-37 °C עם 5% CO₂ למשך עד 48 שעות.

4. זיהוי CTV באמצעות פלוו-ציטומטריה

  1. אספו תאים לפלטת 96 בארות בעלת קרקעית עגולה בנקודות זמן של 6, 36 ו-48 שעות. צנטריפגו במהירות של 500 × g למשך 5 דקות ושטפו פעמיים עם בופר לצביעה עבור ציטומטריה זורמת.
  2. עבור צביעה שטחית, דגרו את התאים עם 50 µL של תערובת נוגדנים המכילה anti-CD8, צבע חיוניות קבוע (fixable viability dye) ו-anti-CD44 למשך 30 דקות על קרח בחושך.
    הערה: אספו את כל העל-נוזלים המכילים נוגדנים מצומדים לפלואורופור למכלי פסולת ייעודיים בתוספת 0.5% sodium hypochlorite לצורך דה-קונטמינציה, והשליכו אותם בהתאם לפרוטוקולי פסולת ביו-סיכונה מוסדיים.
  3. שטפו את התאים פעמיים עם בופר לצביעה עבור ציטומטריה זורמת והשביו אותם ב-200 µL של בופר לצביעה עבור ציטומטריה זורמת לצורך רכישת נתונים בציטומטר זורם.
  4. בצעו רכישת דגימות בציטומטר זורם המצויד בשלושה לייזרים. הכינו מבחנות בקרה בעלות צבע יחיד באמצעות תאים צבועים כדי לקבוע את פרמטרי הפיצוי (compensation).
  5. יישמו את אסטרטגיית ה-gating הבאה: הסירו שרידים (debris) באמצעות gating של פיזור קדמי (FSC) מול פיזור צדי (SSC), הסירו דובלטים באמצעות gating של סינגלטים, ובחרו תאי CD8+ T חיוניים (שליליים לצבע חיונית קבוע) לצורך ניתוח.
  6. אספו לפחות 1 × 104 אירועים של תאי CD8+ T שעברו gating לכל דגימה. נתחו את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריה זורמת וחשבו את שיעור התאים שעברו חלוקה אחת או יותר באמצעות מודול ניתוח הפרוליפרציה.

5. צביעה פנימית ושטחית להערכת אקטיבציה ואיתות

  1. שחזר תליה של חצי נוסף מתאי CD8+ T נאיביים ב-R10 בתוספת anti-CD28 בריכוז 1 µg/mL ו-IL-2 בריכוז 10 ng/mL בריכוז של 2.4 × 106 תאים/mL.
  2. הוסף 250 µL של ת сусפנסיית תאים (6 × 105 תאים) לכל באר בפלטות 96-בארים מצופות מראש.
  3. תרבל את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO₂ למשך עד 48 שעות.
  4. בנקודות הזמן המצוינות (6, 10, 12, 24 ו-36 שעות), אסוף את התאים לפלטת 96-בארים בעלת תחתית עגולה.
    הערה: נקודת הזמן של 6 שעות לוכדת סיגנלינג TCR מוקדם (phospho-S6) ו-CD69; האחרון נבדק בנוסף ב-12, 24 ו-36 שעות כדי ללכוד את הקינטיקה המלאה שלו. CD25, PD-1 ו-ICOS מנוטרים ב-10, 12, 24 ו-36 שעות; נקודת הזמן של 48 שעות שמורה לבדיקת פרוליפרציה (סעיף 4) וזיהוי ציטוקינים (סעיף 6).
  5. סבב במספיב (צנטריפוגה) ב-500 × g למשך 1 דקה ושחזר תליה של משקע התאים ב-200 µL של בופר צביעה לציטומטריה זרימה.
  6. סבב במספיב ב-500 × g למשך 1 דקה ושאב את הנוזל העליון (סופרנאטנט). שטוף את התאים פעמיים עם 200 µL של בופר צביעה לציטומטריה זרימה.
  7. לצביעה שטחית, הדגר את התאים עם 50 µL של תערובת נוגדנים המכילה anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS וצבע חיוניות קיבוע (fixable viability dye) למשך 30 דקות על קרח בחושך.
  8. שטוף את התאים שלוש פעמים עם בופר צביעה לציטומטריה זרימה כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים.
  9. שחזר תליה של משקע התאים ב-200 µL של 1% פאראפורמאלדהיד, וקבע את התאים בטמפרטורת החדר (RT) בחושך למשך 15 דקות.
    אזהרה: בצע את כל השלבים הכוללים פאראפורמאלדהיד במכסה מილები כדי למנוע שאיפה של אדים. אסוף את כל הפסולת הנוזלית המכילה חומר קיבוע במיכל נפרד המסומן לפינוי כימיקלים מסוכנים.
  10. סבב במספיב ב-500 × g למשך 1 דקה ושטוף פעם אחת עם בופר צביעה לציטומטריה זרימה.
  11. חמם מראש בופר lyse/fix בריכוז 5 × בטמפרטורת החדר והכן תמיסת עבודה בריכוז 1 × עם מים מזוקקים.
  12. הוסף 200 µL מתמיסת העבודה (בופר lyse/fix בריכוז 1 ×) לכל באר, והדגר את התאים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
  13. שטוף פעמיים עם בופר permeabilization/wash בריכוז 1 × לצביעת phospho-epitope. שחזר תליה של המשקע עם בופר permeabilization/wash בריכוז 1 × לצביעת phospho-epitope והדגר בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות.
  14. סבב במספיב ב-500 × g למשך 1 דקה והסר את הנוזלים העליונים.
  15. לצביעה תוך-תאית, הדגר את התאים עם 50 µL של תערובת נוגדנים המכילה anti-p-S6 למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  16. שטוף את התאים שלוש פעמים עם בופר permeabilization/wash בריכוז 1 × לצביעת phospho-epitope.
  17. לצביעה בנוגדן משני, הדגר את התאים עם 50 µL של תערובת נוגדנים המכילה נוגדן משני anti-rabbit למשך 30 דקות על קרח בחושך.
  18. שטוף את התאים שלוש פעמים עם בופר permeabilization/wash בריכוז 1 × לצביעת phospho-epitope ושטוף פעם אחת עם בופר צביעה לציטומטריה זרימה.
  19. שחזר תליה של משקע התאים ב-200 µL של בופר צביעה לציטומטריה זרימה ורכוש את הדגימות באותו מכשיר ציטומטריה זרימה.
  20. החל את אותה אסטרטגיית gating כפי שמתואר בסעיף 4.5 ואסוף לפחות 1 × 104 תאי CD8+ T לכל דגימה.
  21. נתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) עבור כל סמן באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריה זרימה.

6. חסימה וזיהוי של ציטוקינים תוך-תאיים

  1. 5 שעות לפני הקציר, יש להוסיף 100 µL לכל באר של R10 טרי, בתוספת PMA (50 ננוגרם/מ"ל), laionomycin (1 µg/mL), מעכבי הובלה של חלבונים (monensin) (1:1000) ומעכבי הובלה של חלבונים (מבוססי brefeldin A) (1:1000). ערבבו בעדינות והחזירו את הפלטות אל ה- 37 °C אינקובטור לחסימת הפרשת ציטוקינים ולאפשר הצטברות תוך-תאית.
  2. בנקודת הזמן הרצויה, אספו את התאים לפלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה.
  3. סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 500 × במשך דקה אחת, ושנית להשעות את משק התאים ב- 200 µL של תמיסת צביעה לציטומטריה של זרימה.
  4. סבב במערך צנטריפוגה במהירות 500 × ב-g למשך דקה אחת ולשאוב את הנוזל העליון (supernatant). שטוף פעמיים עם 200 µL של תמיסת צביעה לציטומטריה של זרימה.
  5. לצורך צביעת סמנים פניים, גרע את התאים עם 50 µL של תערובת נוגדנים המכילה anti-CD44, anti-CD8 וצבע חיוניות ניתן לקיבוע (fixable viability dye), למשך 30 דקות על קרח בחושך.
  6. שטפו שלוש פעמים עם תמיצת צביעה לציטומטריה של זרימה (flow cytometry staining buffer) כדי להסיר נוגדנים שלא נקשרו.
  7. בצעו פרמביליזציה של התאים על ידי הוספה של 200 µL מתמיס קיבוע וחדירה (fixation and permeabilization) והדגירה למשך 30 דקות על קרח בחושך.
    זהירות: יש לבצע את כל השלבים הכוללים את תמיסת הקיבוע/חדירות (המכילה פאראפורמאלדהיד) במכסומה כדי למנוע שאיפת אדים. יש לאסוף את כל הפסולת הנוזלית המכילה חומר מקבע במכל נפרד המסומן לפינוי כימיקלים מסוכנים.
  8. סבב במרכז centrifuge במהירות 500 × ב-g למשך דקה אחת ולהשליך את הנוזל העליון (supernatant) לסל פסולת כימית מסוכנת.
  9. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 × בופר חדירה/שטיפה.
  10. עבור צביעה תוך-תאית של ציטוקינים, דגרו עם 50 µL של תערובת נוגדנים (antibody cocktail) המכילה anti-TNF-α ונוגדן own-anti-Granzyme B למשך 30 דקות על קרח, בחושך.
  11. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 × בופר חדירה/שטיפה להסרת נוגדים שאינם קשורים, וביצוע שטיפה סופית אחת עם בופר צביעה לציטומטריית זרימה.
  12. שחזר את משקע התאים ב- 200 µL של תמיסת צביעה לציטומטריה זרימה (flow cytometry staining buffer) ורכוש את הדגימות באותו ציטומטר זרימה.
  13. יישמו את אותה אסטרטגיית הגבוב (gating) כפי שמתואר בסעיף 4.5 ואספו לפחות 1 × 104 CD8+ תאי T לדגימה. נתחו את אחוז החיוביות ואת ה-MFI עבור כל סמן באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה.

תוצאות

כדי לחקור את ההשפעות של עצימויות שונות של גירוי anti-CD3 על שפעול תאי T, בידלנו splenocytes עכבריים וביצענו טיהור של תאי T מסוג CD8+ לתרבית in vitro, ולאחר מכן ביצענו בדיקות לשפעול תאי T ואנליזה בציטומטריה זרימה. לצורך ניתוח הנתונים, בוצע תחילה gating ללימפוציטים באמצעות שילוב של FSC-A ו-SSC-A, לאחר מכן gating של singlets באמצעות FSC-H ו-FSC-W, ואז SSC-H עם SSC-W. תאי T מסוג CD8+ חיים סוננו ב-gating נוסף באמצעות CD8 בשילוב עם צבע חיוניות קבוע (fixable viability dye) לצורך אנליזה המשכית (איור 1A).

כדי לתקף שמערכת הגירוי של הנוגדן הקשור לפלטה מפעילה ביעילות תאי T in vitro, בחנו את הפספורילציה של החלבון הריבוסומלי S6 (p-S6), המהווה מדד ידוע לפעילות mTORC1 ונקודת התכנסות עבור מסלולי ה-PI3K-mTOR וה-MEK-ERK MAPK במורד של אותי TCR15,16. בהתאם לממצאים אלה, צפינו בעלייה תלוית-מינון ברמות p-S6 בפרק זמן של 6 שעות לאחר הגירוי בריכוזים עולים של anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) (Figure 1B), מה שמאשר שמערכת ה-anti-CD3 הקשורה לפלטה מפעילה את ציר ה-TCR-mTORC1-S6 באופן התלוי בעוצמת האות. אירוע פספורילציה מוקיר זה עקבי עם מעורבות של מסלולים מטבוליים תלויי-mTORC1 התומכים בשגשוג תאי T ובבידול תאי אפקטור בהמשך.

שגשוג תאים הוערך באמצעות זרימה ציטומטרית של דילול CTV לאחר גירוי TCR בריכוזים מדורגים של anti-CD3 (‏0.1–10 µg/mL) בשלוש נקודות זמן לאחר הגירוי: 6, 36 ו-48 שעות. בנקודת זמן מוקדמת של 6 שעות של איתות, נצפה רק דילול פרוליפרטיבי מינימלי בכל תנאי הגירוי. עד לשעה ה-36, קבוצת הגירוי במינון נמוך (0.1 µg/mL) עדיין לא הצליחה להשריץ התרחבות קלומית מורגשת, בעוד שקבוצות במינון בינוני וגבוה הראו שיאי דילול CTV מובחנים (5 ו-10 µg/mL), המעידים על תחילת התקדמות במחזור התא. בשעה ה-48, הפנוטיפים הפרוליפרטיביים השונים בין ריכוזי הגירוי היו הבולטים ביותר. גירוי TCR חלש (0.1 µg/mL) הניב רק 1.25% תאים משגשגים ושיא CTV בודד שאינו מדולל, מה שמעיד על אקטיבציה סוב-אופטימלית. גירוי בינוני (1–5 µg/mL) השריץ שלושה שיאי חלוקה מובחנים, כאשר חלקיקי השגשוג עלו מ-70.8% ל-84.0%. גירוי חזק (10 µg/mL) הגיע לחלקיק השגשוג הגבוה ביותר (89.5%), תוך הצגת המספר המקסימלי של דורות חלוקה והוכחת זיהוי של רוויית שגשוג (איור 2).

בשלב הבא בחנו את הביטוי של סממני הפעלה מוקדמים, CD69 ו-CD25. ראוי לציין כי המחקר הנוכחי חשף ויסות חיובי (upregulation) מהיר ותלוי-מינון של ביטוי CD69, על סמך עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI). תחת גירוי בינוני וחזק (5 ו-10 µg/mL), CD69 עלה במהירות בתוך 24 שעות, ולאחריו נרשמה ירידה הדרגתית בין 24 ל-36 שעות. עם זאת, תחת גירוי חלש (0.1, 0.5 ו-1 µg/mL), רמת CD69 עלתה באופן הדרגתי לאורך כל חלון הגירוי. פרופיל הביטוי הקינטי של CD69 המתואר לעיל עולה בקנה אחד עם תפקידו כסמן הפעלה מוקדם של תאי T (איור 3A)17. באופן מעניין, השקיפנו כי ביטוי CD25 הראה עלייה הדרגתית באופן תלוי-מינון ותלוי-זמן (איור 3B). בדומה למחקרים קודמים, הוויסות החיובי של CD25 היה איטי יותר מזה של CD69, במיוחד בעת גירוי אופטימלי18,19.

כדי לחקור לעומק את ההשפעה הרגולטורית של עוצמת הגירוי של TCR על הביטוי של רספטורים מעכבים ומולקולות קו-סטימולטוריות בתאי T מסוג CD8+, בחנו את רמות הביטוי של PD-1 ו-ICOS. ביטוי הניתן להשראה של PD-1 נשען על גירוי TCR בעוצמה גבוהה. בקבוצת הגירוי בעוצמה נמוכה (0.5–1 µg/mL), PD-1 בוטה ברמה נמוכה לאורך כל תקופת הגירוי. לעומת זאת, בקבוצת הגירוי בעוצמה בינונית עד גבוהה (5–10 µg/mL), ביטוי PD-1 עלה בהדרגה החל מהשעה ה-10 והגיע לשיאו לאחר 36 שעות (איור 4A). גם הביטוי של ICOS עלה בהתאם לעלייה בעוצמת הגירוי והגיע לרמתו המקסימלית ב-5–10 µg/mL לאחר 36 שעות (איור 4B). תוצאות אלו מצביעות על כך שגירוי TCR בעוצמה גבוהה יכול להעלות באופן משמעותי את רמות הביטוי של PD-1 ו-ICOS.

לבסוף, בחנו את התפקוד של תאי T שעברו סטימולציה לאחר סטימולציה חוזרת באמצעות PMA ו-ionomycin בנקודות זמן של 24 ו-48 שעות לאחר הסטימולציה. ב-24 שעות, כימתנו את הייצור של TNF-α ו-Granzyme B ומצאנו כי השכיחויות של תאי TNF-α+, Granzyme B+, ו-TNF-α+Granzyme B+ עלו בהדרגה באופן התלוי במינון של anti-CD3 (איור 5A, B). באופן עקבי, גם ה-MFI של TNF-α ו-Granzyme B הראה עלייה תלוית ריכוז והגיע למקסימום תחת סטימולציה בעוצמה גבוהה (10 µg/mL) (איור 5C), מה שמשקף דיפרנציאציה של תאי אפקטור מוקדמים התלויה במינון ומונעת על ידי עוצמה מדורגת של אות ה-TCR. עם זאת, ב-48 שעות, דפוס זה התהפך באופן מובהק. ריכוזים גבוהים יותר של anti-CD3 הפחיתו באופן משמעותי את אחוזי התאים מסוג TNF-α+Granzyme B+ והורידו את רמות הביטוי של מולקולות האפקטור ברמה התאית.

כל הנתונים המוצגים הם נציגים של 3 ניסויים עצמאיים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני עם מבחן post-hoc של Tukey; הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. חיוניות התאים עלתה באופן עקבי על 90%, ולפחות 1 × 104 אירועים של תאי T מסוג CD8+ חיים נרכשו לכל דגימה.

נתוני ציטומטריה זרימה: דיאגרמות בחירה של אוכלוסיות תאים, היסטוגרמות של כימות חלבונים וגרף עמודות.
איור 1: הפעלה in vitro וניתוח בציטומטריה זרימה של תאי T מסוג CD8+. (A) תאי T מסוג CD8+ מופקים מספרנocytes של עכבר הופעלו in vitro בריכוזים משתנים של anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) בשילוב עם ריכוז קבוע של anti-CD28 (1 µg/mL) למשך 6 עד 48 שעות, לאחר מכן בוצע ניתוח של הפעלה תאית בציטומטריה זרימה. פסדתיים תאיים הוצאו על ידי בחירה (gating) לפי פיזור קדמי (FSC) ופיזור צדי (SSC), דאבלטים הוצאו באמצעות בחירת סינגלטים, ובסוף נב进行了 בחירה של תאי T מסוג CD8+ השליליים לצבע חיוניות קבוע (fixable viability dye) עבור ניתוחים המשכיים. (B) פוספורילציה של חלבון ריבוסומלי S6 (p-S6) בתאי T מסוג CD8+ ב-6 שעות לאחר הפעלה עם הריכוזים המצוינים של anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) בתוספת anti-CD28 קבוע (1 µg/mL). היסטוגרמה מייצגת (שמאל) וסיכום MFI (ימין). תרשימי הציטומטריה זרימה מייצגים 3 ניסויים עצמאיים. הנתונים מראים ממוצע ± SEM. סטטיסטיקה: מבחן ANOVA חד-כיווני למדידות חוזרות עם מבחן post-hoc של Tukey. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בדיקת שגשוג תאים, תרשים היסטוגרמה, המראה CTV לעומת אחוז השגשוג לאורך זמן.
איור 2: ניתוח שגשוג של תאי T CD8+ ראשוניים מעכבר המבוסס על צבע מעקב לשגשוג בסגול (CTV) תחת סטימולציית TCR מדורגת. תאי T CD8+ שסומנו עם CTV וסוטימולו in vitro עם anti-CD3 בריכוזים מדורגים של 0.1–10 µg/mL למשך 6 עד 48 שעות. שגשוג התאים הוערך על בסיס המיהול וההחלשה של פלואורסצנציית ה-CTV בתאי T CD8+ באמצעות ניתוח בציטומטריה של זרימה. ההיסטוגרמות מראות את התפלגות פלואורסצנציית ה-CTV של כל קבוצת ריכוז, כאשר אחוז התאים שעברו חלוקה אחת או יותר מסומן. תרשימי הציטומטריה של זרימה מייצגים 3 ניסויים עצמאיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח פלוו ציטומטריה, ביטוי CD69 ו-CD25, היסטוגרמה ותרשים קווי, הפעלת תאי חיסון.
איור 3: קינטיקת הביטוי של סמני הפעלה מוקדמים CD69 ו-CD25 על תאי T מסוג CD8+ בעקבות גרייה ב-anti-CD3. תאי T נאיביים מסוג CD8+ גורו בעזרת anti-CD3 קשור ללוחית בריכוזים המצוינים (0.1–10 µg/mL) ובתוספת anti-CD28 קבוע (1 µg/mL). ביטוי CD69 נמדד ב-6, 12, 24 ו-36 שעות; ביטוי CD25 נמדד ב-10, 12, 24 ו-36 שעות, והם נותחו באמצעות פלוו ציטומטריה. הפאנלים השמאליים מציגים היסטוגרמות מייצגות בנקודות הזמן המצוינות; הפאנלים הימניים מציגים את השינויים הדינמיים ב-MFI לאורך זמן. (A) CD69. (B) CD25. תרשימי הפלוו ציטומטריה הם מייצגים של 3 ניסויים בלתי תלויים. הנתונים מציגים ממוצע ± SEM. סטטיסטיקה: מבחן ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות ומבחן post-hoc של Tukey. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ציטומטריה זרימתית, ביטוי של PD-1 ו-ICOS, היסטוגרמות וגרפים, תגובה תאית לאורך זמן.
איור 4: קינטיקה של ביטוי הרצפטור המעכב PD-1 והמולקולה המעוררת ICOS על תאי CD8+ T בעקבות גירוי ב-anti-CD3. תאי CD8+ T נאיביים גורו באמצעות anti-CD3 קשור לפלטה בריכוזים המצוינים (0.1–10 µg/mL) בתוספת anti-CD28 בריכוז קבוע (1 µg/mL). התאים נאספו לאחר 10, 12, 24 ו-36 שעות ונ为了ותה באמצעות ציטומטריה זרימתית. הפנלים השמאליים מראים היסטוגרמות מייצגות בנקודות הזמן המצוינות; הפנלים הימניים מציגים את השינויים הדינמיים ב-MFI לאורך זמן. (A) PD-1. (B) ICOS. תרשימי הציטומטריה הזרימתית מייצגים 3 ניסויים בלתי תלויים. הנתונים מראים ממוצע ± SEM. סטטיסטיקה: repeated-measures two-way ANOVA עם Tukey’s post-hoc test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות ניתוח ציטומטריה של זרימה, ביטוי של TNF-α ו-Granzyme B, תרשימי עמודות ופיזור, מחקר אימונולוגי.
איור 5: ייצור ציטוקינים תוך-תאי על ידי תאי CD8+ T תלוי בעוצמת ה-TCR. תאי CD8+ T נאיביים עוררו בריכוזים עולים של anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) בתוספת anti-CD28 בריכוז קבוע (1 µg/mL). ב-24 שעות וב-48 שעות לאחר העירור, התאים נאספו לאחר אינקובציה של 5 שעות עם מעכבי הובלת חלבונים (monensin ו-brefeldin A) בנוכחות PMA ו-ionomycin כדי לחסום את הפרשת הציטוקינים ולאפשר הצטברות תוך-תאית. (A) תרשימי קונטור מראים את השכיחות של תאים חיוביים ל-TNF-α ול-Granzyme B בכל ריכוז ובכל נקודת זמן שצוינו. תאים שלא עוררו שימשו כביקורת שלילית. (B) הפרופורציות של תאי TNF-α+, Granzyme B+, ו-TNF-α+ Granzyme B+. (C) ה-MFI של TNF-α ו-Granzyme B. תרשימי ציטומטריה של זרימה הם מייצגים של 3 ניסויים בלתי תלויים. הנתונים מראים ממוצע ± SEM. סטטיסטיקה: two-way ANOVA למדידות חוזרות עם מבחן post-hoc של Tukey. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק שיטה שיטתית וניתנת לשחזור לחקר תגובות של תאי T התלויות בעוצמת אות ה-TCR. אסטרטגיית ציפוי מדורגת של anti-CD3 מאפשרת שליטה מדויקת בעוצמת הגירוי, ובכך מאפשרת לחוקרים לנתח את הקשר הכמותי בין קלט ה-TCR לבין תוצאות תפקודיות במורד המסלול. נקודות פרוצדורליות מרכזיות כוללות ניקוי של תאי CD8⁺ T נאיביים, שליטה מדויקת במדרג ריכוזי הציפוי של anti-CD3, ונורמליזציה קפדנית של מספר התאים בכל באר. כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים בין ניסויים, אנו ממליצים גם להשתמש בהגדרות מכשיר, מטריצות פיצוי ואסטרטגיות gating עקביות, ולהשתמש באותן סדרות של נוגדנים ובאותן מנות של צבעי חיות קיבועים (fixable viability dyes) במידת האפשר. המהימנות של שלבים קריטיים אלה קובעת באופן ישיר אם תוצאות הניסוי יכולות לשקף במדויק את ההשפעות של עוצמות גירוי משתנות של TCR על הדינמיקה הפנוטיפית של תאי T.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בגירוי באמצעות נוגדנים קשורי-פלטה, שבהם נוגדני anti-CD3 מצופים ישירות על פני השטח של פלטת התרבית כדי ליצור קשירה צולבת (crosslink) של קומפלקס TCR-CD3. גישה זו מציעה יעילות כלכלית, התפלגות אחידה של הנוגדנים, שונות מינימלית בין באריות ו reproducibility מצוינת. באופן בולט, טיטרציה של ריכוזי הנוגדן לציפוי מאפשרת modulates מדורג ומדויק של עוצמת הגירוי, מאפיין המבדיל מערכת זו מגירוי באמצעות חרוזיים (bead-conjugated stimulation), שבהם צפיפות הליגנד היא בדרך כלל קבועה ברמה רוויה, מה שמגביל את היכולת לבצע כיוונון עדין של האות14. עם זאת, גירוי קשור-פלטה מספק קשירה צולבת של TCR שהיא supraphysiological ומתמשכת, השונה מהותית מהמעורבות החולפת והתלויה-אפיניות המושרה על ידי קומפלקסים של peptide-MHC בתאים מציגי אנטיגן. למרות שגירוי מבוסס pMHC הוא רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, הוא תובעני מבחינה טכנית, דורש מומחיות ייעודית להפקת מולטמרים וכרוך בעלויות גבוהות משמעותית. לבידוד תאים, השתמשנו במיון אימונו-מגנטי שלילי, שהוא פשוט, מהיר ויעיל כלכלית. למרות שהוא מספק רמת טוהר נמוכה יותר בהשוואה ל-FACS, הוא מונע את הלחץ המכני ואת הסימון הפלואורסצנטי שעלולים לפגוע במצב הפיזיולוגי של התאים הממוינים20,21.

סוגיות מרכזיות שעשויות להיווצר במהלך ביצוע הפרוטוקול כוללות טהרה נמוכה של המיון, שגשוג חלש, ציטוטוקסיות מושרית CTV, חיוניות נמוכה לאחר תרבית וצביעה לא עקבית. במקרה של טהרה נמוכה, יש להבטיח ערבוב מספיק של התאים עם תערובת הנוגדנים הביוטיניליים ועם חרוזי הסטראפטווידין, להאריך את זמן ההפרדה המגנטית במידת הצורך, ולבצע אופטימיזציה ליחס בין החרוזים לנוגדנים עבור כל סדרת ריאגנטים חדשה. אם נצפה שגשוג מינימלי גם בריכוז הגבוה ביותר של anti-CD3, יש לוודא את החיוניות והטהרה (במיוחד זיהום של CD44hi) של התאים הנאיביים המבודדים, לאשר את הליך הציפוי ב-anti-CD3 (איטום פלטות עם סרט איטום במהלך דגירה לילה ב-4 °C והבטחת כיסוי אחיד של הנוגדנים), ולתקף את ריכוז ה-IL-2, שכן ציטוקין זה חיוני לתמיכה בהתרחבות תאי T. עבור ציטוטוקסיות מושרית CTV, יש להפחית את ריכוז הצביעה תוך שמירה על רזולוציה ברורה של שיאי החלוקה, ולהבטיח ששלב החסימה (quenching) יבוצע בקפידה על קרח למשך 5 min מלאים כדי להסיר שאריות של צבע חופשי22,23. במקרה של חיוניות נמוכה לאחר תרבית, יש לשלוט בצפיפות התאים, להבטיח נפח מצע מספיק ולשמור על טכניקה סטרילית. אם נצפתה צביעה לא עקבית או שונות גבוהה בציטומטריה של זרימה, יש להכין את תערובות הנוגדנים כ-master mixes, להגן על כל הדגימות הצבועות מאור, ולהשתמש באותן סדרות של נוגדנים ובאותן מנות של צבע חיוניות קבוע (fixable viability dye) בין החזרות.

עם זאת, לפרוטוקול זה יש מגבלות מסוימות. כמערכת in vitro, הוא אינו יכול לשחזר את מיקרו-הסביבה המורכבת של הרקמה, את האינטראקציות התאיות או את סביבת הציטוקינים של איברי לימפואידיים משניים. חלון התרבית מוגבל ל-48 h, מה שמגביל את הניתוח לאירועי הפעלה מוקדמים ומונע הערכה של דיפרנציאציה בשלבים מאוחרים, תשישות או יצירת זיכרון. יתרה מכך, הפרוטוקול נשען במידה רבה על קריאות של ציטומטריה זרימה, הדורשות סטנדרטיזציה קפדנית של הגדרות המכשיר, מטריצות פיצוי (compensation matrices) ואסטרטגיות gating בין ניסויים עצמאיים. בנוסף, הממצאים שהתקבלו במערכת זו המבוססת על anti-CD3/CD28 נגזרים אך ורק מתאי CD8+ T ועשויים שלא להיות ניתנים להכללה ישירה על תאי CD4+ T, שספי activation thresholds, דרישות co-stimulatory ומסלולי דיפרנציאציה תחתונים שלהם ידועים כשונים12,24,25. בנוסף, מצב ההפעלה הבסיסי של תאי T עשוי להשתנות בין מושבות עכברים בודדות בשל הבדלים במיקרוביוטה קומנסלית, דבר המהווה מקור פוטנציאלי לשונות בין מעבדות שיש להביאה בחשבון בעת פרשנות תוצאות בין מחקרים שונים.

מערכת הגירוי המדורגת המתוארת כאן מאפשרת לחוקרים להתאים את עוצמת אות ה-TCR למטרות ניסיוניות ספציפיות, בהתבסס על דפוסי התגובה השונים שנצפו במדדים שונים. נתונים אלו חושפים כי הבחירה בריכוז ה-anti-CD3 ובזמן הקצירה צריכה להיות מודרכת על ידי השאלה הביולוגית הנידונה. עבור סממני הפעלה מוקדמים, עלייה בביטוי של CD69 ניתנת לגילוי כבר בשעות 6–12 בכל הריכוזים, אך היא מציגה קינטיקה שונה: ריכוזים גבוהים (5–10 µg/mL) משרים שיא מהיר ואחריו ירידה, בעוד שריכוזים נמוכים (0.5–1 µg/mL) מביאים לעלייה הדרגתית ומתמשכת. עבור בדיקות פרוליפרציה, ריכוזים נמוכים מ-1 µg/mL הם תת-אופטימליים ועשויים לשמש כביקורות שליליות פנימיות, בעוד ש-5–10 µg/mL משרים באופן עקבי התרחבות קלוונלית חזקה הניתנת לגילוי באמצעות דילול CTV ב-48 h. ביטוי של הרספטור המעכב PD-1 והמולקולה המעוררת ICOS דורש גירוי בעוצמה גבוהה (5–10 µg/mL) ומגיע לשיאו ב-36 h, דבר המצביע על כך שמחקרים הבוחנים מולקולות אלו צריכים להימנע מתנאים מוקדמים יותר או ממינונים נמוכים יותר. עבור מדדי תפקוד אפקטורי (TNF-α ו-Granzyme B), הקשר בין עוצמת הגירוי לבין ייצור הציטוקינים תלוי בזמן ועוקב אחר דפוס דו-פאזי מובחן. ב-24 h, ייצור המולקולות האפקטוריות עולה באופן חיובי עם ריכוז ה-anti-CD3, כאשר מינונים גבוהים יותר מובילים לפלט ציטוקינים גדול יותר. עם זאת, ב-48 h, בעוד שהרמות המוחלטות של תאים מייצרי ציטוקינים גבוהות משמעותית בכל התנאים בהשוואה ל-24 h, קשר המינון-תגובה מתהפך: ריכוזי גירוי נמוכים יותר (0.5–1 µg/mL) מניבים תדירויות גבוהות יחסית של תאי TNF-α⁺ Granzyme B⁺ מאשר מינונים גבוהים (5–10 µg/mL). היפוך זה מרמז כי סיגנל TCR חזק ומתמשך, למרות שהוא מקדם התמיינות אפקטורית ראשונית, עשוי להטיל הגבלה יחסית על השמירה של קיבולת ייצור הציטוקינים לכל תא, מה שעשוי לשקף את תחילת התהליך של תשישות מושרית-הפעלה (activation-induced exhaustion) או תגובתיות חסרה (hyporesponsiveness).

בסיכומה, תצפיות אמפיריות אלו מציבות את הפרוטוקול שלנו כמסגרת ייחוס המאפשרת למשתמשים לבחור מראש תנאי סטימולציה בהתבסס על נקודות סיום (endpoints) ספציפיות, ובכך לשפר את יעילות התכנון הניסויי ואת יכולת פרשנות הנתונים. מעבר למחקרים מכניסטיים בסיסיים, מערכת זו יכולה גם לסייע באופטימיזציה של פרוטוקולי הרחבת תאי T עבור אימונותרפיה אדופטיבית, שבה רגולציה מדויקת של עוצמת אות ה-TCR עשויה לסייע בהכוונת הדיפרנציאציה לעבר פנוטיפים רצויים של תאי אפקטור או תאי זיכרון26,27,28.

גילויים

למחברים אין הצהרות על ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' T2394504, LY) וקרן ההקמה למחקר של המדען הראשי של Lilin Ye (מס' R2045, LY).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנה קונית 15 mLLabgicCD-002-15Aמבחנת צנטריפוגה קונית סטרילית 15 mL
4% פאראפורמאלדהידBeyotimeP0099מקבע מימי 4% לשימור תאים לפני צביעה
צלחת 60 mmLabgic12211צלחת לתרבית תאים 60 mm
מסנן תאים 70 µmLabgicBS-70-CSמסנן רשת ניילון 70 µm להכנת סספנסיות תאים בודדים
פלטה עם תחתית עגולה בעלת 96 בארותBeyotimeFPT016פלטה עם תחתית עגולה בעלת 96 בארות לתרבית תאים וצביעה
בופר ליזיס ACKBeyotimeC3702בופר ליזיס לתאי דם אדומים המבוסס על Ammonium-chloride
anti-mouse CD25Biolegend101910נוגדן anti-mouse CD25 מצומד ל-APC, clone 3C7, לציטומטריית זרימה
anti-mouse CD28Bio X CellBE0015-1נוגדן anti-mouse CD28 מופק, clone 37.51, לקו-סטימולציה של תאי T
anti-mouse CD3Bio X CellBP0001-1נוגדן anti-mouse CD3ε מופק, clone 145-2C11, להפעלה של תאי T
anti-mouse CD69BD Biosciences553237נוגדן anti-mouse CD69 מצומד ל-PE לצביעת סממני הפעלה
anti-mouse CD8Invitrogen17-0081-82נוגדן anti-mouse CD8a מצומד ל-APC, clone 53-6.7, לציטומטריית זרימה
anti-mouse GZMBBiolegend372212נוגדן anti-human/mouse granzyme B מצומד ל-PerCP/Cyanine5.5, clone QA16A02, לציטומטריית זרימה תוך-תאית
anti-mouse ICOSBD Biosciences565886נוגדן anti-mouse ICOS (CD278) מצומד ל-BV421 לציטומטריית זרימה
anti-mouse PD-1Biolegend135220נוגדן anti-mouse PD-1 (CD279) מצומד ל-BV605, clone 29F.1A12, לציטומטריית זרימה
anti-mouse TNF-αInvitrogen46-7321-82נוגדן anti-mouse TNF-α מצומד ל-PerCP-eFluor 710, clone MP6-XT22, לציטומטריית זרימה תוך-תאית
anti-mouse/human CD44Biolegend103030נוגדן anti-mouse/human CD44 מצומד ל-PE/Cyanine7, clone IM7, לציטומטריית זרימה
biotin anti-mouse CD11bBiolegend101204נוגדן anti-mouse CD11b מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD11cBiolegend117304נוגדן anti-mouse CD11c מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD16/32Biolegend156604נוגדן anti-mouse CD16/32 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD19Biolegend115504נוגדן anti-mouse CD19 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD4Biolegend100508נוגדן anti-mouse CD4 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD44Biolegend103004נוגדן anti-mouse CD44 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD45RBiolegend103204נוגדן anti-mouse CD45R/B220 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse CD49bInvitrogen13-5971-85נוגדן anti-mouse CD49b מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse F4/80Biolegend123106נוגדן anti-mouse F4/80 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse Ly6GBiolegend127604נוגדן anti-mouse Ly6G מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse NK1.1Biolegend108704נוגדן anti-mouse NK1.1 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
biotin anti-mouse TER119Biolegend116204נוגדן anti-mouse TER-119 מצומד לביוטין להסרת שושלות תאים
עכברים C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/Aזכרים בני 6–8 שבועות ששימשו לניסויים
אינקובטור פחמן דו-חמצני (CO2)Thermo Fisher3120אינקובטור CO2 עם לחות לתרבית תאי יונקים
צבע CellTrace VioletInvitrogenC34557צבע פלואורסצנטי סגול למעקב אחר proliferציה של תאים
DMSOSigmaD2650Dimethyl sulfoxide; ממס להכנת תמיסות מלאי של ריאגנטים
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206נוגדן משני donkey anti-rabbit IgG (H+L) מצומד ל-Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500תמיסת Dulbecco’s phosphate-buffered saline לשטיפה ולהכנת ריאגנטים
סרום עוברי בקר (FBS)GibcoC11995500BTתוסף סרום למצע לתרבית תאי יונקים
צבע חיוניות FixableInvitrogen65-0865-14צבע חיוניות Fixable להסרת תאים מתים במהלך ציטומטריית זרימה
תמיסת קיבוע וחדירה (Permeabilization)BD Biosciences51-2090KZריאגנט קיבוע וחדירה לצביעה תוך-תאית
פלטה עם תחתית שטוחה בעלת 96 בארותLabgic11510פלטה עם תחתית שטוחה בעלת 96 בארות לתרבית תאים ובדיקות סטימולציה
ציטומטר זרימהBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserציטומטר זרימה בעל שלושה לייזרים לרכישת פלואורסצנציה רב-צבעית
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZמעכב הובלת חלבונים המבוסס על Brefeldin A לצביעת ציטוקינים תוך-תאית
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZמעכב הובלת חלבונים המבוסס על Monensin לצביעת ציטוקינים תוך-תאית
מלח סידן של IonomycinSigmaI3909-1MLאיונופור סידן המשמש עם PMA לסטימולציה של תאים
בופר Perm/WashBD Biosciences51-20911KZבופר חדירה ושטיפה לצביעה תוך-תאית
בופר Phosflow Lyse/FixBD Biosciences558049בופר 5× לליזיס סימולטני של תאי דם אדומים וקיבוע לוקוציטים
בופר Phosflow Perm/Wash IBD Biosciences557885בופר חדירה מבוסס מתנול לצביעה תוך-תאית של חלבוני פוספו
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling4858Sנוגדן מונוקלונלי של ארנב ל-phospho-S6 ribosomal protein (Ser235/236), clone D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol 12-myristate 13-acetate; מפעיל המשמש לסטימולציה של תאים ex vivo
Interleukin-2 רקומביננטי לעכבריםGibco200-02-50UGInterleukin-2 רקומביננטי לעכברים לתרבית והרחבה של תאי T
RPMI 1640Life-LabAC01L064מצע Roswell Park Memorial Institute 1640 לתרבית תאי יונקים
חרוזי מגנט StreptavidinBEAVER22307חרוזי מגנט מצופים ב-Streptavidin להסרת תאים מבוססת נוגדן-ביוטין
בופר צביעה לציטומטריית זרימהלא צויןלא צויןבופר צביעה לציטומטריית זרימה; הספק או נוסחת ההכנה לא סופקו
סרט מעבדה Parafilm MAmcorPM996סרט מעבדה גמיש בעל איטום עצמי לאיטום פלטות, מבחנות וכלי תרבית
בופר Lyse/FixBD Biosciences558049בופר 5× לליזיס סימולטני של תאי דם אדומים וקיבוע לוקוציטים
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1תוכנה, גרסה 10.8.1, לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה

מקורות

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD8in vitroanti CD3anti CD28TmTORC1T
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.