מאמר שיטה

השפעת טואינה על ביטוי אורקסין-A בהיפותלמוס והתנהגות שינה במודל עכברוש של נדודי שינה ראשוניים

DOI:

10.3791/72000

⸱

17 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Xinjiang Uygur Autonomous Region Academy of Traditional Chinese Medicine, 2School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Yueyang Clinical Medical College, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 4Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה בוחן האם טואינה מפחיתה נדודי שינה במודל עכברוש על ידי ויסות ביטוי אורקסין-A היפותלמי, באמצעות בדיקות התנהגותיות, אימונוהיסטוכימיה ו-PCR כמותי בזמן אמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדודי שינה הם הפרעת שינה נפוצה הגורמת לפגיעה בתפקוד היום ולסיכון מוגבר למחלות נלוות, המשפיע משמעותית על איכות החיים של המטופלים. הטיפולים הנוכחיים, בעיקר טיפול קוגניטיבי-התנהגותי ותרופותרפיה, מוגבלים בשל בעיות כמו תלות בתרופות, סבילות וחזרה מהגמילה. הוכח כי טיפול טואינה מווסת את מערכת העצבים, האנדוקרינים והחיסון, בעוד שמערכת האורקסין היא רגולטור מרכזי של מחזור השינה-ערות. דבר זה הוביל לחקירה האם טואינה מקלה על נדודי שינה על ידי ויסות מערכת האורקסין ההיפותלמוסית. פרוטוקול זה מתאר את שיטות התערבות טואינה במודל עכברוש של נדודי שינה ראשוניים שנגרמו על ידי שיטת הסביבה המים הרב-פלטפורמית המותאמת. חילקנו 64 חולדות Wistar לארבע קבוצות: ביקורת, מודל, טואינה ואנטגוניסט אורקסין. בוצעו הערכות התנהגותיות (בדיקת שדה פתוח, בדיקת שינה מונעת פנטוברביטל), והביטוי של אורקסין-A בהיפותלמוס זוהה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה. הפרוטוקול שואף להעריך את יעילות טואינה ולחקור את המנגנון הפוטנציאלי שלה הקשור למערכת האורקסין, ולספק מקור ליישום ולמחקר מכני של טואינה בהפרעות שינה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדודי שינה, המאופיינים בחוסר שביעות רצון ממשך או איכות השינה המובילים לפגיעה בשעות היום, הם בעיה בריאותית עולמית נפוצה עם נטל משמעותי על אנשים ומערכות בריאות 1,2. בסין, שכיחות נדודי השינה גבוהה במיוחד, מה שמחמיר עוד יותר את השפעתה על בריאות הציבור3. הפרעה זו קשורה לפגיעה בתפקוד הקוגניטיבי, בסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם, ובתחלואה נלווים גבוהה למצבים פסיכיאטיים כמו דיכאון וחרדה. הניהול הקליני הנוכחי מתבסס בעיקר על טיפול קוגניטיבי-התנהגותי ותרופות, במיוחד בנזודיאזפינים והיפנוטיקה הרגעה שאינה בנזודיאזפינים. עם זאת, השימוש ארוך הטווח שלהם מוגבל על ידי תלות בתרופות, סבילות, השפעות שאריות במהלך היום ותסמיני גמילה, מה שמדגיש את הצורך בחלופות יעילות לא-פרמקולוגיות6. בפרקטיקה קלינית, טואינה מתאימה במיוחד למטופלים עם נדודי שינה ראשוניים כרוניים המחפשים התערבויות לא תרופתיות, במיוחד לאנשים מבוגרים בסיכון גבוה לתלות בתרופות, וכן לנשים בהריון או מניקות7.

כאבן יסוד בטיפול חיצוני ברפואה הסינית המסורתית, טואינה הפגינה יתרונות ייחודיים בטיפול באינסומניה8. ראיות מטא-אנליטיות מראות שטואינה עולה משמעותית על תרופות או דיקור סיני בלבד בשיעור היעילות הכולל (OR = 4.12), איכות שינה ומצבי חרדה-דיכאון, עם בטיחות גבוהה9. פרוטוקולי טואינה ספציפיים מציעים יתרונות ברורים: טואינה המסורתית משיגה יעילות של 89.5% לאינסומניה מסוג ליחה-חום, שפשוף בטן מפחיתה את שיעורי ההישנות ל-14.7% (לעומת 38.2% בטואינה קונבנציונלית)10. שיטת טואינה בת שלושה חלקים מעלה את יעילות הטיפול הצמחי מ-80.49% ל-92.68%, תוך שיפור ארכיטקטורת השינה ופרופילי הנוירוטרנסמיטרים11. מחקרים קליניים וסקירות שיטתיות אישרו כי טואינה יכולה לשפר משמעותית את איכות השינה, להפחית ציוני חרדה ודיכאון, ולווסת את רמות הנוירוטרנסמיטרים בסרום כמו 5-הידרוקסיטריפטמין (5-HT)12. מאמינים שהשפעותיו הטיפוליות מתווכות באמצעות ויסות הוליסטי של הרשת הנוירו-אנדוקרינית-אימונית. מחקרים עדכניים מתמקדים יותר ויותר במערכת האורקסין, מערכת נוירופפטידית מרכזית שמקורה בהיפותלמוס הלטרלי, שהיא חיונית לקידום ושימור ערנות13. פעילות יתר לא תקינה של נוירוני אורקסין קשורה לפתופיזיולוגיה של נדודי שינה, בעוד שעיכוב מסלול זה הראה פוטנציאל טיפולי14. עדויות ראשוניות מצביעות על כך שמניפולציות כמו שפשוף בטן יכולות להשפיע על רמות אורקסין-A במוח בעכברים חסרי שינה12, אך חסרה חקירה שיטתית האם טואינה מפעילה את השפעותיה נגד נדודי שינה במיוחד באמצעות ויסות מערכת האורקסין.

לכן, בהתבסס על מודל עכברוש לנדודי שינה ראשוניים, מחקר זה שואף ל: (1) להעריך את שיפור התנהגות השינה לאחר התערבות סטנדרטית של טואינה באמצעות מבחני התנהגות; ו-(2) לבחון את המנגנון הבסיסי על ידי בחינת האם השפעת טואינה קשורה לירידה בוויסות ביטוי אורקסין-A בהיפותלמוס, תוך השוואת יעילותו לזו של אנטגוניסט קולטני אורקסין. מחקר זה שואף לספק ראיות ניסיוניות למנגנון המרכזי של טואינה בטיפול בנדודי שינה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הניסיוניים והערכות רווחת בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת שינג'יאנג לרפואה (מספר אישור אתיקה: IACUC-20020158). הפרוטוקול פועל לפי הנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. עכברי וויסטאר מסוג בית 64 חסרי פתוגן ספציפיים (SPF) (משקל גוף 250 גרם ± 50 גרם, התפלגות שווה בין המינים) במערכת מחסום SPF בטמפרטורה של 18–22 מעלות צלזיוס עם מחזור אור-חושך של 12 שעות. ספקו אוכל ומים לפי רצונם.
  2. לאחר שבוע של האכלה אדפטיבית, חלקו את העכברים באקראי ל-4 קבוצות (n = 16 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת (קבוצה A), מודל (קבוצה B), טואינה (קבוצה C) ואנטגוניסט (קבוצה D).

2. הקמת מודל נדודי השינה הראשוני

הערה: למעט קבוצה A, חולדות בקבוצות B, C ו-D עוברות את הליך המידול הבא.

  1. הכינו מיכל פלסטיק גלילי (קוטר עליון: 30 ס"מ, גובה: 40 ס"מ) כארגז העכברים.
  2. התקן פלטפורמה גלילית (קוטר: 6 ס"מ, גובה: 10 ס"מ) בתחתית המיכל.
  3. הוסיפו מים למיכל עד שמפלס המים יהיה 1 ס״מ מתחת לפני הפלטפורמה. שמור על טמפרטורת מים ב-20 מעלות צלזיוס.
  4. הניחו רשת ברזל עגולה (קוטר: 25 ס"מ, גודל רשת: 1 ס"מ) אופקית בתוך המיכל, 15 ס"מ מעל הפלטפורמה. אבטח את הרשת לשפת המיכל באמצעות חוטי ברזל דקים.
  5. הנח מים לשתייה ואוכל על רשת הברזל. החלף מים מדי יום, ונקה וחטא את המיכל.
  6. הניחו עכבר אחד לכל מכולה על הפלטפורמה במשך 8 ימים רצופים.

3. הערכת מודל באמצעות בדיקת שינה סינרגטית של נתרן פנטוברביטל

  1. תמיסת הנתרן הפנטוברביטלית מוכנה על ידי הכנסת מים אולטרה-טהורים ישירות. שקלו 1.0 גרם אבקה, מוסיפים מים אולטרה-טהורים מחוקרים ל-100 מ"ל, המיססו ומסננים ב-0.22 מיקרון כדי לקבל תמיסה של 1% (10 מ"ג/מ"ל).
  2. ביום התשיעי, הזרקו לכל העכברים תוך-פריטונית בתמיסת נתרן פנטוברביטל במינון הסף המינימלי שמעורר שינה (נקבע בניסויים ראשוניים).
  3. תיעוד זמן השהייה בשינה (זמן מהזרקה ועד לאובדן הראשון של רפלקס יישור) ומשך השינה (זמן מאובדן עד התאוששות רפלקס ההקפה). הגדר אובדן רפלקס יישור למשך דקה אחת כתחילת שינה, וההחלמה שלו כסוף שינה.

4. התערבות טואינה

הערה: ההתערבויות מתחילות ביום שלאחר הערכת המודל המוצלחת ונמשכות פעם ביום במשך 14 ימים רצופים. קבוצות א' וקבוצה ב' עוברות ריסון במסגרת קיבוע למשך 10 דקות ביום. המפעילים עוברים הכשרה קפדנית לפני הניסוי כדי להבטיח עקביות בעוצמה, בתדירות ובקצב.

  1. בקבוצה C, תקבע את העכברוש במצב שכיבה על שולחן ניתוחים.
  2. קבע בעדינות את ארבעת הגפיים של העכברוש באמצעות חמשת אצבעות היד השמאלית, ומרחיב את הבטן במלואה.
  3. בצע טואינה בטנית ביד ימין: השתמש במוך של הפלאנקס הדיסטלי של האצבע האמצעית כדי להפעיל כוח בנקודת גואניואן (CV4, הממוקמת 25 מ"מ מתחת לטבור). שמור על ארבע האצבעות הנותרות מושטות באופן טבעי.
  4. הניעו את האצבע האמצעית בתנועות מעגליות קדמיות קטנות ממפרק הכתף, תוך ביצוע חיכוך תרגומי מעגלי נגד כיוון השעון על הבטן.
  5. עקבו אחרי מסלול מעגלי סגור שנוצר על ידי ג'יווי (CV15, 5 מ"מ מתחת לתהליך הזיפואיד), גואניואן (CV4), ונקודות דיימאי דו-צדדיות (GB26, נקודת אמצע בין הקצה החופשישל הצלע ה-12 לבין הגבול העליון של הרכס האיליאק).
  6. שמור על תנועה מעגלית חלקה, יציבה ורציבה במהירות של 5–7 מחזורים לדקה.
  7. בצע מניפולציה נגד כיוון השעון במשך 5 דקות, ואז מניפולציה בכיוון השעון במשך 5 דקות.
  8. ודא שהכוח יציב ויציב, כשהעכברוש נשאר רגוע ולא נאבק. יש להחיל את ההתערבות פעם ביום למשך 14 ימים.

5. ממשל אנטגוניסטים

  1. לקבוצה ד', ניתן לתת MK-4305 (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות גאבאז' תוך-קיבה פעם ביום למשך 14 ימים. המיס את MK-4305 במי מלח רגילים להכנת תמיסה של 5 מ"ל.

6. מבחן שדה פתוח

  1. לאחר תקופת ההתערבות, יש לבצע את מבחן השדה הפתוח באמצעות קופסה קובייבית שחורה (בסיס: 100 ס"מ × 100 ס"מ, גובה: 40 ס"מ). חלק את הרצפה ל-25 ריבועים שווים בקווים אפורים (16 פריפריאליים, 9 מרכזיים).
  2. הנח את העכבר בריבוע המרכזי והתחל בתזמון.
  3. רישום את המרחק הכולל שנעבר, מספר פרקי ההגדלה, והזמן באזור המרכזי במשך מעל 3 דקות באמצעות מערכת לכידת תמונה.
  4. לאחר כל בדיקה, הסר צואה ונקה את הרצפה והקירות הפנימיים עם 75% אתנול.
  5. הפעלת מערכת רכישת תמונות
    1. הגדר את מערכת רכישת התמונה. התקן מצלמת CCD דיגיטלית (רזולוציה: 1280 × 720 פיקסלים; קצב פריימים: 25 פריימים לשנייה) אנכית בגובה 1.5 מטר מעל השדה הפתוח. חבר את המצלמה למחשב דרך ממשק USB.
    2. הגדר את תוכנת המעקב והגדרות הניתוח. בצע מעקב אוטומטי באמצעות תוכנת ניתוח וידאו התנהגותי. הגדר את פרמטרי המעקב כך:
      1. הגדר את מוקד המעקב כנקודת המרכז (מרכז המסה) של העכברוש.
      2. הגדר את קצב הפריימים ל-25 פריימים לשנייה הן לרכישת תמונה והן לניתוח.
      3. כיייל את הרזולוציה המרחבית כך שכל פיקסל יתאים למרחק ממשי של 1.5 מ"מ בהתבסס על ממדי השדה הפתוח ורזולוציית הווידאו.
      4. הגדר את סף החיסור ברקע ל-15 רמות אפור (טווח: 0–255) כדי להבדיל בין העכברוש לרקע.
      5. הגדר את משך האירוע המינימלי ל-0.2 שניות (5 פריימים) כדי למזער זיהויי חיוביות שגויות הנגרמים מרעש.
      6. חלק את השדה הפתוח כמעט ל-5 × 5 ריבועים שווים (אזורים 1–25). הגדר את האזור המרכזי כאזורים 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 ו-19 (הריבועים המרכזיים 3 × 3, המייצגים 36% מהשטח הכולל). הגדר את האזור ההיקפי כריבועים שנותרו.
    3. רשום את פרמטרי הפלט הבאים: סך המרחק שנעבר (מ"מ), מהירות ממוצעת (מ"מ/שנייה), זמן שהייה ללא תנועה, זמן תנועה (ים), זמן שהוקדש לכל אזור, מרחק שהועבר בכל אזור (מ"מ), מספר הכניסות לכל אזור, ומספר פרקי ההרמה. אמת את התקפי ההגדלה ידנית.

7. פרפוזיה לאימונוהיסטוכימיה

הערה: השתמש ב-4 חולדות מכל קבוצה לאימונוהיסטוכימיה.

  1. הכינו תמיסת פרפורמלדהיד של 0.9% (מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס) ו-4% תמיסת פרפורמלדהיד (מאוחסנת ב-4 מעלות צלזיוס).
  2. הרדמה עמוקה של חולדות עם אוריתן תוך-פריטוניאלי (25% תמיסה, 0.6 מ"ל/100 גרם משקל גוף). אשר אובדן רפלקסים של הדוושה, הקרנית והיישור.
  3. אבטח את העכברוש על הגב על לוח קצף. פתח במהירות את חלל החזה על ידי חיתוך דרך העור, הפאשיה והחזה.
  4. משוך בעדינות את הלב כדי לחשוף את האאורטה. הכניסו מחט דרך הקצה הפנימי השמאלי לאאורטה עד שקצה המחט נראה בלומן האאורטה. ודא שהמחט, החדר השמאלי והאאורטה מיושרים אופקית.
  5. מהדק את האאורטה והמחט יחד עם מלקחיים המוסטטיים. חתכו מיד את העלייה הימנית כדי לאפשר יציאת דם.
  6. פרפיוז עם 150–200 מ״ל של מלח מחומם מראש (0.9% מלוחות) (37 מעלות צלזיוס). פרפוזיה מוצלחת מתבצעת על ידי החלפת הכבד, המזנטריה והגפיים הקדמיות, ונוזל נקי מהעלייה הימנית.
  7. עבור ל-4% פאראפורמלדהיד קר (4 מעלות צלזיוס) ולפרפיוז 400 מ"ל. בצע את הפרפוזיה הראשונית במהירות עד שיתרחשו פאסיקולציות שרירי גוף והתקשות בגפיים. לאחר מכן להוריד את קצב הזרימה ל-2 טיפות לשנייה עד שכל הקיבוע מתפוצץ.
  8. אשר קיבוע מוצלח כאשר המוח נראה חיוור ומוצק.

8. ניתוח מוחי

  1. לאחר הפרפוזיה, ערפו את ראשו של העכברוש והסירו בזהירות את כל המוח מהגולגולת.
  2. חתך את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי באמצעות מספריים. להסיר עצמות פריאטליות ועורפיטליות באמצעות רונג'ור עצם.
  3. הרם בעדינות את המוח עם מרית, חותך את עצבי הגולגולת והראייה במספריים עדינים.
  4. לאימונוהיסטוכימיה: העבר מיד את כל המוח ל-4% פאראפורמלדהיד ולבצע סידור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  5. ל-PCR כמותי בזמן אמת: שטפו את פני המוח במי מלח מקוררים מראש, ייבשו עם נייר סינון, הקפיאו בחנקן נוזלי למשך 5–10 דקות, ואחסנו בטמפרטורה של –80°C. בצע את כל השלבים על הקרח.

9. צביעה אימונוהיסטוכימית

  1. הטמעת רקמת ההיפותלמה בפרפין וחתוך חתכי קורונל בעובי 4–5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. התקן חלקים על מגלשות נגד נפילה, אפה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 1.5–2 שעות.
  2. הסרת חתכי שעווה בקסילן I ו-II (10 דקות כל אחד). התייבש מחדש באמצעות אתנול מדורג: אתנול חסר מים I ו-II (5 דקות כל אחד), ואז 95%, 90%, 80%, 70% אתנול (5 דקות כל אחד), ואז מים מזוקקים (5 דקות).
  3. בצע שליפת אנטיגנים על ידי הנחת חלקים בבופר ציטראט רותח של 0.01 מטר (pH 6.0) בסיר לחץ. חמם עד ששסתום הלחץ עולה, ואז כבה את החום. להשרות 10 דקות, ואז לקרר באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
  4. השבתת פרוקסידאז אנדוגני על ידי הטבלת חלקים ב-H₂O₂ טרי של 3% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף 3× עם PBS (5 דקות כל אחד).
  5. רקמת עיגול עם עט אימונוהיסטוכימיה. מרח נוגדן פוליקלונלי נגד HCRT/Orexin-A של ארנב (דילול 1:50, ~50 מיקרוליטר לכל שקופית). דגרו לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בקופסה לחה.
  6. למחרת, מחממים מחדש בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שטוף 3× עם PBS (5 דקות כל אחד).
  7. מרח נוגדן משני המסומן בפרוקסידאז חזרת. דגרו 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף 3× עם PBS (3 דקות כל אחד).
  8. מרח תמיסת עבודה עם תווית פרוקסידאז סטרפטווידין. דגרו 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף 3× עם PBS (5 דקות כל אחד).
  9. הכינו תמיסת כרוגן DAB (0.85 מ"ל מים מזוקקים + 50 מיקרוליטר כל אחד מחומרים A, B, C). מרח על חתכים ופתח במשך 3–10 דקות בטמפרטורת החדר, תוך ניטור תחת מיקרוסקופ. עצרו את התגובה על ידי טבילה במי ברז למשך 3 דקות.
  10. צבע נגד עם המטוקסילין למשך 3 דקות. התמייננו באלכוהול חומצה כלורית 1% למשך 1–2 שניות. כחול במי ברז למשך 5 דקות.
  11. ייבשו במים מזוקקים (3 דקות), 70%, 80%, 90%, 95% אתנול (3 דקות כל אחד), ואתנול חסר מים I ו-II (5 דקות כל אחד). שקוף בקסילן I ו-II (5 דקות כל אחד).
  12. מרחי בלסאם ניטרלי וכיסוי מגוון. יבש בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  13. צפו וצילמו קטעים באמצעות מיקרוסקופ אור (40×, 100×, 200×, 400×). ספירת תאי אורקסין-A חיוביים (משקע גרגירי חום בציטופלזמה) באמצעות ImageJ.
  14. חשב את הציון הכולל (0–12) כציון עוצמת צביעה (0 = שלילי, 1 = צהוב בהיר, 2 = חום בהיר, 3 = חום כהה) מוכפל באחוז התאים החיובי (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). הגדר 1–5 כביטוי נמוך, 6–12 כביטוי גבוה.

10. PCR כמותי בזמן אמת עבור mRNA אורקסין-A

  1. עיבוד ה-RNA לאחר הפשרת רקמות חייב להתבצע בתנאים ללא RNase. הדרישות הספציפיות ללא RNase הן כדלקמן:
    1. סביבת עבודה: השתמשו באזור עבודה ייעודי ל-RNA שננקה עם חומר ניקוי RNase ונחשף לקרינת UV.
    2. צרכנים: השתמש בצנטריפוגות וקצות פיפטה מוסמכים ללא RNase, או לחלופין, להשרות אותם במים של 0.1% DEPC ואחריהם אוטוקלב.
    3. מגיבים: השתמשו בבופר ליזיס ללא RNase ובמים שטופלו ב-DEPC.
    4. פעולה: לבש כפפות ללא אבקה לאורך כל ההליך, החלפת כפפות לעיתים קרובות, והימנעות ממגע ישיר עם פנים הצרכנים והדגימות.
    5. הליך ניסויי
      הערה: במהלך שלבי חילוץ ה-RNA וההפוך, כל החומרים והכלים שבאים במגע עם RNA או תגובות שעתוק הפוך חייבים להיות נטולי RNase. בשלב ההגברה של PCR, מאחר ש-cDNA הוא מבנה דו-גדילי ו-RNase אינו יכול לפרק DNA דו-גדילי, בשלב זה הכלים והכלים צריכים להיות נקיים רק מ-DNase וזיהומים אחרים העלולים לעכב תגובות PCR; טיפול נוסף ללא RNase אינו נדרש. לטחון רקמה היפותלמית קפואה תחת חנקן נוזלי. שקלו 50–100 מ"ג אבקת רקמה לתוך צינור עם 1 מ"ל טריזול. מערבבים ועומדים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  2. הוסיפו 200 מיקרוליטר כלורופורם, ערבבו בהיפוך, ועמדו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. העבר את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש. הוסיפו נפח שווה של איזופרופנול, ערבבו, ועמדו על –20°C למשך 35 דקות. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  4. שטפו את המשקעים עם 75% אתנול, צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליך את הסופרנטנט וחזר על השטיפה פעם אחת.
  5. משקעים יבשים באוויר בטמפרטורת החדר. המיס במים ללא RNase.
  6. מדדו ריכוז וטוהר RNA (יחס A260/A280 1.8–2.1). הערכו שלמות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% (פסים 28S ו-18S שקופים, פס 5S חלש או חסר).
  7. הכינו תגובת שעתוק הפוכה (20 מיקרוליטר): 800 ng RNA כולל, 1 מיקרוליטר פריימר אקראי (0.1 מיקרוגרם/μL), 10 מיקרוליטר 2× תערובת תגובה TS, 1 מיקרוליטר תערובת אנזימים TransScript RT/RI, 1 מיקרוליטר מסיר gDNA, ומים ללא RNase לנפח.
  8. דגרו ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז 85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות כדי לסנתז cDNA של הגדיל הראשון. לדלל cDNA 1:1 עם מים ללא RNase.
  9. הכינו תגובת qPCR (10 מיקרוליטר): 5 מיקרוליטר EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0.3 מיקרוליטר פריימר קדמי (10 מיקרומון), 0.3 מיקרוליטר פריימר הפוך (10 מיקרומואל), 1 מיקרוליטר תבנית cDNA, מים ללא RNase לנפח. רץ בשלוש עותקים.
    הערה: פריימרים: אורקסין-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3'; אורקסין-A-R: 5'-GCCGCTTTCCAGAGTGAG-3' (אורך המוצר 88 bp); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
    β-Actin-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (אורך המוצר 150 bp).
  10. הרץ תוכנית qPCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (לפני דנאטורציה); 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-5 שניות (דנאטורציה) ו-60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות (אנילינג/הארכה).
  11. אמת את עקומות ההגברה וההתכה. הרץ 5 מיקרולטר של מוצר על ג'ל אגרוז 2% כדי לאשר את הספציפיות.
  12. חשב ביטוי mRNA יחסי של Orexin-A באמצעות שיטת 2⁻ΔΔCt עם β-אקטין כבקרה פנימית.

11. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש ב-SPSS 26.0 לניתוח נתונים. בטא את כל הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ±. להשוואות בין שתי קבוצות, יש להשתמש במבחן t לדגימות עצמאיות אם הנתונים מחולקים כרגיל; אחרת השתמש במבחן Mann-Whitney U.
  2. להשוואות בין קבוצות מרובות, השתמשו ב-ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק LSD לשונות הומוגניות או במבחן טמהאנה לשונות הטרוגניות. אם הנתונים אינם מחולקים כרגיל, יש להשתמש בבדיקת Kruskal-Wallis H. נתייחס ל-P < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1 מראה שבהשוואה לקבוצה א', השהיה השינה בקבוצות ב', ג' וד' הייתה מוארכת באופן משמעותי, ומשך השינה התקצר משמעותית לאחר המודלים, מה שמעיד שמודל העכברושים הראשוני של נדודי שינה הוקם בהצלחה. הממצאים בטבלה 2 ובטבלה 3 מספקים תמיכה ראשונית להשפעה הטיפולית של טואינה בטיפול באינסומניה. מבחן השדה הפתוח (OFT) הוא אחד הפרדיגמות הקלאסיות והנפוצות ביותר במדעי המוח ההתנהגותיים להערכת התנהגות דמוית חרדה בקרב מכרסמים15. מחקרים הראו שהעדפה לאזור ארבע הפינות היא אינדיקטור רגיש למדידת התנהגות דמוית חרדה, והיא עשויה להיות מפלה יותר מהמדד המרכזי ברמות חרדה בינוניות עד נמוכות. חולדות מודל נדודי השינה הראו התנהגויות חרדה משמעותיותושינויים בהתנהגות חקרנית, בעוד שהתערבות טואינה הקלה ביעילות על ההתנהגויות הדמויות חרדה אצל חולדות אלו. תוצאות הביולוגיה המולקולרית המוצגות בטבלה 4 ובטבלה 5, ובאיור 1, מראות עוד יותר כי טואינה מפחיתה למעשה את הביטוי המופרז של אורקסין-A בהיפותלמוס של חולדות מודל נדודי שינה.

figure-results-1
איור 1: תוצאות צביעה אימונוהיסטוכימית של אורקסין-A בהיפותלמוס של חולדות בכל קבוצה (40×, 100×, 200×, 400×). (A) נצפו נוירונים חיוביים באורקסין-A ברקמת ההיפותלמה של העכברוש, שנראו כאותות גרגיריים כהים. ציון עוצמת הצביעה היה 3 נקודות, אחוז התאים החיוביים היה 40% (בטווח של 26%–50%, 2 נקודות), והציון הכולל היה 6 נקודות, שנמצא בטווח הביטוי הגבוה. (B) מספר הנוירונים החיוביים לאורקסין-A ברקמת ההיפותלמה של העכברוש עלה משמעותית בהשוואה לקבוצה הנורמלית, עם התפלגות צפופה יותר של תאים חיוביים. ציון עוצמת הצביעה היה 3 נקודות (חום כהה), אחוז התאים החיוביים הגיע ל-80% (בטווח 76%–100%, 4 נקודות), והציון הכולל היה 12 נקודות, שנמצא בטווח הביטוי הגבוה. (C) מספר הנוירונים החיוביים לאורקסין-A ברקמת ההיפותלמה של העכברוש הופחת בהשוואה לקבוצת המודל. ציון עוצמת הצביעה היה 3 נקודות (חום כהה), אחוז התאים החיוביים היה 75% (בטווח של 51%–75%, 3 נקודות), והציון הכולל היה 9 נקודות, שנמצא בטווח הביטוי הגבוה. (D) מספר הנוירונים החיוביים לאורקסין-A ברקמת ההיפותלמה של העכברוש הופחת גם הוא בהשוואה לקבוצת המודל. ציון עוצמת הצביעה היה 3 נקודות (חום כהה), אחוז התאים החיוביים היה 60% (בטווח 51%–75%, עם ציון 3), והציון הכולל היה 9 נקודות, שנמצא בטווח הביטוי הגבוה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קבוצההשהיית שינה / מינימוםמשך שינה / דקה
A4.13 ± 1.8049.75 ± 38.46
B6.31 ± 2.80*22.13 ± 11:41*
C6.33 ± 2.60*24.93 ± 14:43*
D6.53 ± 1.90*24.73 ± 17.59*

טבלה 1: השוואה בין בדיקות שינה מונעות על ידי פנטוברביטל נתרן בין קבוצות לאחר מודל. * מציין P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת.

קבוצהתדר העלאהזמן חוסר תנועהזמן תנועהמרחק תנועה (מ)זמן באזור המרכזימרחק באזור המרכז (מ)זמן באזור הפינהמרחק באזור הפינה (מ')זמן באזור הפינהמרחק באזור הרוחבי (מ)
A1.875 ± 0.83576,700 ± 34.324103.350 ± 34.30718.318 ± 16.3148,750 ± 7.7182.937 ± 5.112103,000 ± 28.5826.315 ± 3.89356,600 ± 27,7726.705 ± 3.666
B7.125 ± 5.66831.513 ± 10.964148.488 ± 10.96422,399 ± 9.15916.275 ± 10.7033.244 ± 2.99175.088 ± 21.5616.578 ± 1.97285.463 ± 23.37411.724 ± 4.959
ערך T-2.5923.547-3.545-0.617-1.613-0.1462.205-0.171-2.249-2.302
ערך P0.0350.007*0.007*0.5470.1290.8860.045*0.8670.041*0.037*

טבלה 2: ניתוח השפעת כל רמת אינדיקטור בין קבוצת הביקורת (A) לקבוצת המודל (B).* מצביע על P <0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת.

קבוצהתדר העלאהזמן חוסר תנועהזמן תנועהמרחק תנועה (מ)זמן באזור המרכזימרחק באזור המרכז (מ)זמן באזור הפינהמרחק באזור הפינה (מ')זמן באזור הפינהמרחק באזור הרוחבי (מ)
B5.875 ± 2.29529.819 ± 12.871150.219 ± 12.86719.165 ± 8.05424.838 ± 13.0683.178 ± 2.43869.075 ± 13.9925.823 ± 1.42283.019 ± 15.4649.878 ± 4.393
C6.357 ± 0.62735.993 ± 32.237144.021 ± 32.24623.291 ± 4.87314.321 ± 3.7743.106 ± 2.21487.057 ± 12.658 △8.087 ± 1.496 △68.943 ± 9.24010.420 ± 1.225
D6.667 ± 1.63330.808 ± 15.389149.200 ± 15.38018.584 ± 4.96927.792 ± 12.4603.085 ± 1.11474,600 ± 22.2485.744 ± 1.291▲74.192 ± 17.0119.465 ± 3.380

טבלה 3: ניתוח השפעת כל רמת מדד בקרב קבוצת המודל (B), קבוצת טואינה (C) וקבוצת האנטגוניסטים (D). △P < 0.05 בהשוואה לקבוצת המודל (B); ▲P < 0.05 בהשוואה לקבוצת טואינה (C).

קבוצהאורקסין-A
A1.011 ± 0.173
B10.436 ± 2.512△
C2.392 ± 0.998▲
D3.227 ± 1.703▲

טבלה 4: רמות ביטוי mRNA של אורקסין-A ברקמת ההיפותלמוס. △P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת (A); ▲P < 0.05 בהשוואה לקבוצת המודל (B).

קבוצהאורקסין-A
עוצמת צביעהאחוז התאים החיובייםציון אחוזיםפסקול
A340%26
B380%412
C375%39
D360%39

טבלה 5: ציוני צביעת אימונוהיסטוכימיה של אורקסין-A בהיפותלמוס של חולדות בכל קבוצה. קריטריוני דירוג עוצמת צביעה: 0 = צביעה שלילית (חסרת צבע), 1 = צהוב בהיר, 2 = חום בהיר, 3 = חום כהה. קריטריוני ציון אחוז התאים החיוביים: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. ציון כולל = ציון עוצמת צביעה × ציון אחוז. ציונים כוללים של 1–5 הוגדרו כביטוי נמוך, וציונים של 6–12 הוגדרו כביטוי גבוה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נועד להעריך את יעילות טואינה במודל עכברוש ראשוני לנדודי שינה ולחקור את המנגנון הפוטנציאלי שלה הקשור למערכת האורקסין ההיפותלמית. הממצאים הנוכחיים מראים כי פרוטוקול טואינה סטנדרטי שיפר משמעותית את השהיה השינה ומשך השינה, הקל על התנהגויות דמויות חרדה, והפחית למעשה את הביטוי המופרז של אורקסין-A הן ברמות mRNA והן ברמות החלבון בהיפותלמוס. ראוי לציין כי השפעת טואינה הייתה דומה לזו של האנטגוניסט לקולטן אורקסין MK-4305, מה שמרמז כי המודולציה של מערכת האורקסין עשויה להיות מנגנון מרכזי דרכו טואינה מפחיתה נדודי שינה.

בהשוואה להתערבויות פרמקולוגיות, טואינה, כטיפול חיצוני לא פולשני, מציעה יתרונות בבטיחות, מינימום תופעות לוואי וציות למטופל12,18. היתרונות הטיפוליים שלו לנדודי שינה נתמכים על ידי ראיות קליניות המראות שיפור באיכות השינה ובמצב הפסיכולוגי18,19. המנגנון רב-ממדי, הכולל ויסות של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אדרנל, הומאוסטזיס של מערכת העצבים האוטונומית, ונוירוטרנסמיטרים מרכזיים כמו 5-HT18,20. התוצאות מרחיבות הבנה זו על ידי סימון מערכת האורקסין כמטרה ספציפית. נוירוני אורקסין הם המניעים המרכזיים לערות, וההתעוררות שלהם קשורה לאי-יציבות בשינה 21,22,23. הירידה בוויסות של אורקסין-A שנצפתה לאחר טואינה נראית תואמת את השפעת תרופת הנדודי שינה החדשה אנטגוניסט קולטני אורקסין כפול, מה שמדגיש מסלול מתכנס אפשרי בין התערבויות פרמקולוגיות ולא פרמקולוגיות24,25.

בעוד שמחקר זה מתבסס על עבודתנו שפורסמה בעבר בנוגע לטואינה בטנית ותקנה25 של אורקסין-A, כתב היד הנוכחי מייצג הרחבה משמעותית ושיפור מתודולוגי מעבר לדוח המקורי. באופן ספציפי, מחקר זה מרחיב את גודל המדגם ל-64 חולדות כדי לשפר את הכוח הסטטיסטי ומציג סדרה מקיפה של הערכות התנהגות, כולל מבחן שדה פתוח ומבחני שינה שנגרמו בפנטוברביטל, כדי להעריך באופן שיטתי את מבנה השינה והתנהגויות דמויות חרדה, שלא טופלו במחקר הקודם. בניגוד לעבודות הקודמות, שהתמקדו רבות בלחץ חמצוני ובנוירוטרנסמיטרים קלאסיים, מאמר זה שם דגש על האימות התפקודי של מערכת האורקסין באמצעות תוצאות התנהגותיות משולבות ובדיקות מולקולריות, ומשמש כמחקר מכניסטי עצמאי שמשלים ולא משכפל את הממצאים הקודמים.

עיצוב הניסוי דבק בתיאוריה של הרפואה הסינית על ידי התמקדות בבטן ובנקודות דיקור ספציפיות כמו גואניואן (CV 4), שלכאורה מחזקת את הצ'י הקדמון ומווסת את תפקוד הוויסרל, במסלול מניפולציה סגורה26,27. הפרמטרים (תדירות, משך, מסלול) הוגדרו על בסיס עבודה ראשונית כדי להבטיח עקביות ושחזור, היבט קריטי למחקרים מכניים של בעלי חיים12.

עם זאת, לפרוטוקול זה יש מגבלות. ראשית, ההתערבות בוצעה בנקודת זמן אחת לאחר המידול. מחקרים עתידיים צריכים לחקור משך ותדירויות שונים של התערבות כדי לקבוע יחס מיטבי של "מינון-תגובה" לטוינה. שנית, מחקר זה הוא עיצוב מחקר תצפיתי. למרות שנמצאה מתאם בין טואינה לבין ביטוי מופחת של אורקסין-A לבין שיפור התנהגותי, עדיין לא ברור אם הקשר הזה הוא השפעה ישירה או עקיפה של טואינה או גורמים אחרים. מחקרים עתידיים יכולים להשתמש באסטרטגיות ניסיוניות כמו הדחת גן, עיכוב כימוגנטי או חסימת אנטגוניסטים כדי לאמת עוד יותר האם טואינה משפרת את התנהגות נדודי השינה על ידי ויסות ביטוי אורקסין-A, ובכך להבהיר את מנגנון הסיבתיות שלו. לבסוף, מחקר זה לא קבע קבוצת ביקורת של ניתוח מזויף או התערבות פלצבו. עם זאת, מחקר זה לקח זאת בחשבון במהלך התכנון, וכל קבוצות בעלי החיים קיבלו את אותה רמת פעולות אחיזה וקיבוע ששלטו במידה מסוימת בהשפעת גורמי לחץ לא ספציפיים. בנוסף, התדירות, העוצמה ומסלול הפעולה של תוכנית טואינה במחקר זה הוסדרו על בסיס ניסויים ראשוניים כדי להבטיח עקביות ושחזוריות של ההתערבות. המחקר העתידי צריך להתמקד בפיתוח שיטות בקרה מחמירות יותר, כגון שימוש בסימולציה ללא מגע או גירוי מישושי מינימלי, כדי להבהיר את ההשפעות הספציפיות של פעולות טואינה.

צעדים מרכזיים הקריטיים להצלחת פרוטוקול זה כוללים: ראשית, שליטה קפדנית בטמפרטורת המים וממדי הפלטפורמה בשיטת הסביבה המרובת לפלטפורמות מותאמת; שנית, טיטרציה טרום-ניסיונית של מינון פנטוברביטל נתרן תת-סף; שלישית, סטנדרטיזציה של פרמטרי מניפולציה של טואינה (תדירות של 5–7 מחזורים לדקה, מניפולציה נגד כיוון השעון ואז נגד כיוון השעון למשך 5 דקות כל אחד) ואימון מפעילים; ורביעית, הקפאה מהירה של רקמת ההיפותלמה בחנקן נוזלי ואחריה טיפול ללא RNase כדי להבטיח את יציבות ה-mRNA של Orexin-A.

שינויים אפשריים כוללים: ראשית, פיתוח מכשיר טואינה מכני אוטומטי להפחתת שונות בין מפעילים; שנית, שימוש בטלמטריית EEG/EMG להחלפת בדיקת השינה של הנתרן פנטוברביטל, המאפשרת ניטור רציף של שלב השינה; ושלישית, שילוב גישות כימוגנטיות או אופטוגנטיות לאימות הצורך בנוירוני אורקסין בתיווך השפעות טואינה.

השחזוריות של פרוטוקול זה מבוססת על: מסלולי תפעול מפורטים ופרמטרים, שימוש בתרופת ביקורת חיובית, גילוי דו-ממדי ברמות חלבון ו-mRNA, ודיווח סטטיסטי קפדני. השימושיות המעשית שלה משתקפת בהיבטים הבאים: דרישות ציוד נמוכות לבדיקות התנהגות ללא צורך במערכות טלמטריה יקרות; מחזור ניסויי כולל של 8 ימים בלבד למידול ו-14 ימים להתערבות טואינה, שהושלם תוך 4 שבועות, מה שמתאים היטב למחזורי המימון וללוחות הזמנים של רוב פרויקטי המחקר השגרתיים, ומאפשר איסוף נתונים מהיר ואימות מתודולוגי. יתרה מזאת, פרוטוקול המניפולציה של טואינה מוגדר בבירור במונחים של מסלול תפעולי (CV15 → CV4 → GB26 דו-צדדי → חזרה ל-CV15), תדירות (5–7 מחזורים לדקה), רצף כיווני (נגד כיוון השעון ואחריו כיוון השעון) ומשך (10 דקות למפגש). מפרטים אלו מאפשרים למפעילים שונים לשלוט בטכניקה לאחר אימון קצר, ובכך מפחיתים את הסיכון לשחזוריות לקויה הנגרמת מהבדלים אישיים הנפוצים במחקרי מניפולציה ידנית.

במהלך יישום פרוטוקול זה, עלולות להתעורר מספר בעיות נפוצות, ומומלץ לנקוט באמצעי פתרון תקלות מתאימים. ראשית, עכברים עלולים ליפול מהפלטפורמה במהלך הליך המים המותאם למספר פלטפורמות. בדרך כלל זה נגרם ממשטח פלטפורמה חלק מדי. הפתרון הוא להחליק בעדינות את משטח הפלטפורמה בנייר זכוכית דק כדי להגדיל את החיכוך. בנוסף, כל מיכל צריך להכיל רק חולדה אחת כדי למנוע הפרעה הדדית. שנית, מבחן השינה של פנטוברביטל נתרן עשוי לא להראות הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. הפתרון הוא להחזיר את המינון המינימלי מתחת לסף בקצב של 5 מ"ג/ק"ג במהלך ניסויי פיילוט באמצעות קבוצה נפרדת של בעלי חיים (3–4 לכל קבוצה). יש לבצע את ההזרקות באותו זמן בכל יום (רצוי בין 9:00 ל-11:00 בבוקר) כדי למזער את השינויים הצירקדיים. שלישית, עכברים עלולים להיאבק או להשמיע קולות במהלך מניפולציה של טואינה, מה שלרוב מעיד על כוח מופרז או שליטה לא נכונה. המפעיל צריך להפחית את הכוח עד שהעכברוש נשאר רגוע ללא מאבק. מומלץ לבצע אימון קודם באמצעות בובת חישה ללחץ כדי לתקן את יישום הכוח. העכברוש צריך להיות מונח על הגב עם כל ארבעת הגפיים מקובעות בעדינות אך בטוחות, כדי להבטיח חשיפה מלאה של הבטן. רביעית, שונות גדולה באחוז התאים החיוביים לאורקסין-A באותה קבוצה ניסיונית נובעת לעיתים קרובות ממישורי חתך לא עקביים בהיפותלמוס, הטיית ספירה סובייקטיבית, או שונות בצביעה בין אצווה. הפתרון המומלץ הוא לתקן את הרמה האנטומית על ידי התייחסות לאטלס מוח של עכברים (למשל, Paxinos & Watson), ואיסוף חתכים קורונליים מברגמה –1.8 מ״מ עד –3.3 מ״מ לניתוח היפותלמי. שני צופים עצמאיים עיוורים להקצאת קבוצות צריכים לבצע ספירת תאים, ויש להשתמש בערך הממוצע. כל הדגימות למדד תוצאה מסוים צריכות להיות צבועות באותה אצווה, וניתוח סף חצי-אוטומטי באמצעות ImageJ מעודד להפחתת הסובייקטיביות של הצופה.

לסיכום, מחקר זה קבע פרוטוקול התערבות סטנדרטי של טואינה ומערכת הערכה רב-רמתית במודל ראשוני של נדודי שינה. הוא מספק ראיות משכנעות לכך שטואינה משפרת התנהגויות נדודי שינה, ייתכן באמצעות מנגנון הכולל דיכוי ביטוי יתר של Orexin-A היפותלמי. מסגרת מתודולוגית זו לא רק מציעה פרדיגמה ניתנת לשחזור לחקר המנגנונים המרכזיים של טואינה, אלא גם מהווה נקודת ייחוס למחקרים מכניים של התערבויות לא-פרמקולוגיות אחרות להפרעות שינה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הטבעי של אזור אוטונומי אויגור שינג'יאנג (מס' 2025D01C219) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 81860885, 82474666). למממנים לא היה תפקיד בתכנון, בביצוע או בכתיבת המחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5x All-In-One RT MasterMixabmG492סינתזת cDNA
Acetylcholine (Ach)Nanjing JianchengA105-1חומר תגובה ELISA
Adhesion microscope slidesJiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.N/Aהרכבת קטע רקמות
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A811BA0014אלקטרופורזה של ג'ל
Anhydrous ethanolTianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aהתייבשות רקמות
Antibody diluentBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.ZLI-9029דילול נוגדן ראשוני
BasketFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.N/Aמחזיק שקופיות
Citrate powderFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.MVS-0066הכנת מאגר לשחזור אנטיגן
CoverslipJiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.N/Aמיקרוסקופיה
DAB chromogen kitFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.DAB-1031גילוי כרומוגני
DEPCSangon Biotech (Shanghai)B417BA0001טיפול ללא RNase
Dopamine (DA)Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08660rחומר תגובה ELISA
Electrophoresis cellBeijing Liuyi Instrument FactoryDYCZ-21אלקטרופורזה של ג'ל
Electrophoresis power supplyBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6Cאלקטרופורזה של ג'ל
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low RoxabmG891 / MasterMix-ELחומר תגובה qPCR
Gamma-aminobutyric acid (γ-GABA)AMOKEAE91068Raחומר תגובה ELISA של נוירוטרנסמיטר
Gel imaging systemShanghai Tanon2500תיעוד ג'ל
H2O2 (30%)Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aחסימת פרוקסידאז אנדוגני
Hematoxylin staining solutionFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.CTS-1097צביעת נגד
High-speed refrigerated centrifugeShanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.Nefuqe 15Rצנטריפוגה של דגימה
Histamine (HIS)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteEH171-1חומר תגובה ELISA
Hot air drying ovenShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.DHG seriesייבוש דגימות
IHC staining humidity chamberFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.BOX-1001תא דגירה לח
Immunohistochemistry staining kitBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.SP9000צביעה אימונוהיסטוכימית
IncubatorShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.DNP-9272דגירה מבוקרת טמפרטורה
Induction cookerGuangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.C21-RK2101מקור חימום
Microplate readerBio-Rad, ChinaxMarkמדידת ספיגה
MicroscopeNikonE200הדמיה מיקרוסקופית
MK-4305Meilun BioMB3773חומר תגובה ניסויי
Neutral balsamBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.ZLI-9555מדיום הרכבה
Norepinephrine (NA)Nanjing JianchengH096חומר תגובה ELISA
Nucleic acid and protein quantifierBeijing KaiaoK5500כימות חומצות גרעין
Orexin AWuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08860rחומר תגובה ELISA
PCR thermal cyclerBio-Rad, USAMyCycler Thermal Cyclerהגברה של PCR
Phosphate-buffered saline (PBS)Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.PBS-0060/0061חיץ שטיפה
PipetteEppendorf, GermanyDragon labטיפול בנוזלים
Pressure cookerZhejiang Supor Co., Ltd.YW20F1שחזור אנטיגן
Protein quantification kitTransGen BiotechDQ111-01ערכת בדיקת חלבון BCA
Rabbit anti-HCRT (Orexin-A) polyclonal antibodySangon Biotech (Shanghai)D163595נוגדן ראשוני
Real-time PCR instrumentABI (Thermo Fisher)QuantStudio 6 Flexניתוח qPCR
RefrigeratorHefei Meiling Co., Ltd.BCD-249LCKאחסון דגימות
Serotonin (5-HT)Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08364rחומר תגובה ELISA
Staining jarGenericN/Aמיכל צביעת שקופיות
Super immunohistochemistry penFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.PEN-0002עט מחסום הידרופובי
Trans2K DNA MarkerTransGen BiotechBM101סולם DNA
TRIzol ReagentAmbion15596026חילוץ RNA
Vortex mixerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.GL-88Bמכשיר ערבוב מעבדה
XyleneTianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aהסרת פרפין

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MedicineEffectiveness

מאמרים קשורים