מחקר זה בוחן את הביטוי של YTHDC2 בסרטן ריאותה שאינו תאי קטנים באמצעות ביואינפורמטיקה ו-qRT-PCR. בעוד שניתוחי מאגרי נתונים מצביעים על ביטוי נמוך (downregulation) ועל רלוונטיות פרוגנוסטית, תיקוף קליני אינו מראה הבדל משמעותי. הממצאים מדגישים חוסר עקביות, המעיד על דיוק אבחנתי מוגבל ועל הצורך בתיקוף נוסף לפני יישום קליני.
מאמר מחקר
ביטוי של חלבון הקורא m6A YTHDC2 בסרטן ריאותה של תאים לא קטנים בקוהורט קליני סיני
נפתח בלשונית חדשה
במאמר זה
סיכום
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תקציר
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) נותר גורם מוביל לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, כאשר קיימים ביומרקרים מוגבלים לאבחון מוקדם ולפרוגנוזה. המודיפיקציה של RNA מסוג N6-methyladenosine (m6A) וחלבונים קוראים (reader proteins) כגון YTHDC2, ממלאים תפקידים קריטיים בבקרה גנטית ובתהליכי קרצינוגנזה. מחקר זה נועד להעריך את פרופיל הביטוי של YTHDC2 ברקמות NSCLC באמצעות ביואינפורמטיקה ו-quantitative real-time PCR (qRT-PCR), לבחון את הקשר בין YTHDC2 למאפיינים קליניו-פתולוגיים, ולחקור את הרלוונטיות הקלינית והביולוגית הפוטנציאלית שלו למחקרים עתידיים. נתוני ביטוי גנים והישרדות ממאגרי נתונים נותחו כדי לבחון את הדיוק הפרוגנוסטי. ביטויו של YTHDC2 נמדד ברקמות NSCLC בקוהורט קליני סיני, ומאפיינים קליניו-פתולוגיים נותחו. ניתוחים של מאגרי נתונים ציבוריים הראו כי YTHDC2 היה בעל ביטוי מופחת (downregulated) ברקמות NSCLC (p < 0.05) והיה קשור להישרדות המטופלים, אם כי ביצועיו הפרוגנוסטיים היו דלים (AUC ≈ 0.5). ניתוח qRT-PCR של 19 זוגות של רקמות גידול ורקמות נורמליות סמוכות לא הראה הבדל מובהק סטטיסטית (p = 0.537) בביטוי של YTHDC2 בין רקמות הסרטן לרקמות הסמוכות. באופן כולל, ניתוחים של מאגרי נתונים ציבוריים מרמזים כי YTHDC2 עשוי להיות בעל ביטוי מופחת ובעל רלוונטיות פרוגנוסטית פוטנציאלית ב-NSCLC, אך תיקוף קליני עצמאי בקוהורט שלנו לא אישש ביטוי דיפרנציאלי מובהק. ממצאים אלו מדגישים הטרוגניות משמעותית בין מאגרי נתונים רחבי היקף לבין קוהורטים מהעולם האמיתי, ומצביעים על כך שסביר ש-YTHDC2 לא ישמש כביומרקר אבחנתי או פרוגנוסטי מהימן באופן עצמאי, ועשוי לדרוש שילוב עם סמנים מולקולריים נוספים לצורך יישום קליני.
מבוא
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
סרטן ריאות מסוג תאי לא קטנים (NSCLC), הכולל קרצינומה של תאי קשקש ואדנוקרצינומה, הוא סרטן הריאות המאובחן בשכיחות הגבוהה ביותר וגורם מוביל לתמותה מסרטן בעולם1. נתונים סטטיסטיים עולמיים על סרטן מראים כי סרטן הריאות הוא אחת הסיבות המרכזיות למוות מסרטן2. התפתחויות אחרונות באבחנה, בניתוחים, ברדיותרפיה ובטיפול מולקולרי ממוקד לא שיפרו באופן משמעותי את הפרוגנוזה של NSCLC, כיוון שהאבחנה הראשונית מתבצעת בשלב מאוחר, והמחלה לרוב אינה מלווה בתסמינים בשלבים המוקדמים3. נתון זה מדגיש את הצורך בביו-מרקרים חדשים לזיהוי, לחיזוי הפרוגנוזה ולהערכת יעילות הטיפול בחולי NSCLC.
m6A הוא המודיפיקציה הראשונה שזוהתה והנפוצה ביותר של RNA באיקריוטים, והוא מעורב ביציבות של RNA, בתרגום ובשעתוק4. מודיפיקציות m6A הן דינמיות והפיכות, ומתוּמכות על ידי מתילטרנספראזים (writers), דמתילאזים (erasers) וחלבוני קישור ספציפיים (readers)5. מבין אלו, YTHDC2, חלבון reader מרכזי של m6A, מווסת את יציבות ה-RNA ואת קצב התרגום6. מחקרים עדכניים מעידים כי YTHDC2 מעורב בבקרה של סוגי סרטן מרובים, בין אם על ידי דיכוי גדילת תאים ופלישה ובין אם על ידי השראת מוות תאי7. מחקרים הדגישו גם את הרלוונטיות הקלינית של חלבוני m6A reader אחרים, כולל YTHDF1, YTHDF2 ו-YTHDC1, בהתקדמות סרטן ריאה, בבקרת חיסונית ובפרוגנוזה, מה שמדגיש את החשיבות של הערכה סיסטמטית של m6A readers בודדים בקוהורטות עצמאיות של חולים8,9,10. ב-NSCLC קיימות רמות נמוכות באופן משמעותי של YTHDC2, דבר שנמצא קשור לשלבי גידול מתקדמים, גרורות בקשרי לימפה ופרוגנוזה גרועה עבור החולים, מה שמעיד על כך שהוא עשוי להוות גורם אנטי-גידולי11. ניסויי in vitro ו-in vivo חושפים גם כי ביטוי גבוה של YTHDC2 מעכב פרוליפרציה של תאים וגרורות בסרטן ריאה7.
במחקר זה, נבחנה הרגולציה של YTHDC2 ב-NSCLC באמצעות ניתוחים חישוביים משולבים ותיקוף ניסיוני באמצעות qRT-PCR. כמו כן, נבחן הקשר בין הביטוי של YTHDC2 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים ולפרוגנוזה של המטופלים. למרות הראיות הגוברות ממאגרי נתונים ציבוריים המצביעות על הפרה ברגולציה של YTHDC2 ב-NSCLC, מחקרים שפורסמו דיווחו על ממצאים לא עקביים בנוגע להיקף ולמשמעות הקלינית של הפרה זו, ותיקוף עצמאי בקוהורטות קליניות מאפיינות בעולם האמיתי, ובמיוחד באוכלוסיות אסייתיות, נותר מוגבל. יתרה מכך, מרבית המחקרים הקודמים הסתמכו בעיקר על מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ציבוריים או על מודלים ניסיוניים, ומספרם של מחקרים ששילבו ממצאים ביואינפורמטיים עם תיקוף קליני עצמאי היה קטן יחסית. על ידי שילוב של ניתוחים טרנסקריפטומיים ציבוריים רחבי היקף עם תיקוף qRT-PCR עצמאי בקוהורט קלינית סינית, מחקר זה שאף להעריך את השחזוריות של ממצאים קודמים ולגשר על הפער התרגומי בין ניתוחי מאגרי נתונים ציבוריים לבין דגימות קליניות מהעולם האמיתי. לפיכך, מטרת מחקר זה הייתה להעריך באופן שיטמתי את הביטוי של YTHDC2 באמצעות גישות משולבות של ביואינפורמטיקה ותיקוף קליני, ולבחון את הרלוונטיות הביולוגית והקלינית הפוטנציאלית שלו ב-NSCLC. ההשערה הייתה כי הביטוי של YTHDC2 מופר ב-NSCLC, וששילוב של ניתוחים ביואינפורמטיים עם תיקוף קליני עצמאי יספק הערכה מהימנה יותר של המשמעות האבחנתית והפרוגנוסטית שלו מאשר כל אחת מהגישות לבדה.
פרוטוקול
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
המחקר אושר על ידי הוועדה לאתיקה של אוניברסיטת היינאן לרפואה (מספר אישור HMC1984.24) ובוצע בהתאם להצהרת הלסינקי (כפי שעודכנה בשנת 2013).
נשואי המחקר
מחקר של 50 חולי סרטן ריאה שאובחנו בין השנים 2017 ל-2024 בבית החולים המרכזי בסניה (Sanya Central Hospital) במחוז היינאן נערך בהתאם להנחיות הקליניות של איגוד הרופאים הסיני לאבחון וטיפול בסרטן ריאה (מהדורת 2024). שלב ה-CSCO (2024) הותאם למהדורה השמינית של AJCC כדי להבטיח השוואתיות בין מחקרים, כפי שתוקף בקוהורטות סיניות12, ובוצעו שתי סקירות עצמאיות של אונקולוגים כדי להבטיח עקביות. תהליך בחירת המטופלים, זמינות הרקמות, הערכת איכות ה-RNA והכללת הדגימות הסופית לניתוח qRT-PCR מסוכמים ב-איור 1.
נתוני המחקר
מחקר זה השתמש בביואינפורמטיקה כדי לנתח את רמות הביטוי של YTHDC2 ב-NSCLC ואת הקשר שלהן למאפיינים קליניקו-פתולוגיים, ובכך סיפק תובנות לגבי מנגנונים פוטנציאליים. ניתוחים ביואינפורמטיים בוצעו אך ורק באמצעות נתוני ריצוף RNA הזמינים לציבור מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA), כולל אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה של תאי קשקית בריאה (LUSC), ודגימות תאי ריאה נורמליים תואמות שהורדו דרך GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). מערך הנתונים שהורד כלל נתוני ביטוי של ריצוף RNA יחד עם משתנים קליניים זמינים (מזהה מטופל, מזהה דגימה, גיל, מין, שלב פתולוגי, סטטוס הישרדות וזמן הישרדות כולל) עבור מקרי TCGA-LUAD ו-TCGA-LUSC מתאימים. דגימות שחסרו מידע על ביטוי גנים או על הישרדות הוצאו מניתוחי ההישרדות וניתוחי ה-ROC העוקבים. מערך הנתונים ששימש במחקר זה מסופק כקובץ משלים 1 (Supplementary File 1). לא נעשה שימוש בדגימות קליניות שנאספו בבית החולים המרכזי בסניה (Sanya Central Hospital) עבור הניתוחים הביואינפורמטיים. הליכים מפורטים עבור ניתוחי GEPIA, Kaplan–Meier Plotter ו-survivalROC מופיעים בסעיף הניתוח הביואינפורמטי להלן. זרימת העבודה הביואינפורמטית המלאה, הכוללת רכישת נתונים, עיבוד מקדמי, ניתוח ביטוי גנים, ניתוח הישרדות וניתוח ROC, מסוכמת ב-איור 2.
קריטריוני הכללה והחרגה
קריטריוני ההכללה וההחרגה של המטופלים מוצגים ב-טבלה 1. ניתוח עוצמה באמצעות תוכנה לניתוח עוצמה סטטיסטית קבע כי לפחות 26 מקרים לכל קבוצה יספקו עוצמה של 80% לזיהוי גודל אפקט בינוני (d = 0.8, α = 0.05, דו-זנבי). בעוד שגיוס המשתתפים הראשוני שHפ ל-50 זוגות בקבוצת סרטן הריאה, ניתוח ה-qRT-PCR הסופי כלל 30 דגימות גידול ו-19 דגימות של רקמה נורמלית סמוכה, לאחר החרגות בשל איכות הרקמה או ה-RNA. הפחתה זו בגודל המדגם משקפת מגבלות קליניות מהשטח ומדגישה את חשיבות שלמות ה-RNA וזמינות הרקמה במחקרי תרגום (translational studies). עבור n = 19 להשוואות, גודל האפקט המינימלי הניתן לזיהוי הוא d = 1.0 (עוצמה של 80%, α = 0.05). לפיכך, הניסוי היה בעל עוצמה מספקת כדי לזהות הבדלים גדולים בביטוי של YTHDC2, אך לא הבדלים קטנים עד בינוניים.
דגימות רקמה ו-PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
האבחנות הפתולוגיות נקבעו באופן סמיות-כפולה על ידי שני פתולוגים שונים. טהרת הגידול נאמדה על ידי הפתולוגים (>70% תאים ממאירים) ואושרה באמצעות ESTIMATE (TCGA). רקמות נורמליות סמוכות נגזרו באמצעות מקרו-דיסקציה כדי למזער זיהום סטרומלי. סוגי ההיסטולוגיה של סרטן הריאה כללו אדנוקרצינומה של הריאה וקרצינומה של תאי קשקש, עם 26 מקרים של אדנוקרצינומה של הריאה ו-4 מקרים של קרצינומה של תאי קשקש. השיוך הקליני (staging) של 50 חולי סרטן הריאה בוצע בהתאם לקריטריוני השיוך המפורטים ב-"Chinese Medical Association Clinical Guidelines for Lung Cancer (2024 Edition)". דגימות NSCLC שאושרו פתולוגית (n = 50) ייצגו התפלגויות קליניות טיפוסיות (ראה Table 2). מתוך 50 החולים שגויסו בתחילה, 30 דגימות רקמת גידול ו-19 דגימות רקמה נורמלית סמוכה תואמות עמדו בקריטריוני האיכות של ה-RNA. מכיוון שניתוח סטטיסטי מזווג דורש דגימות תואמות מאותו חולה, השוואת הביטוי ברקמת גידול לעומת רקמה נורמלית סמוכה בוצעה באמצעות 19 הזוגות התואמים שהיו זמינים. דגימות קליניות אלו שימשו אך ורק לאישור ניסויי באמצעות qRT-PCR, ונותחו באופן בלתי תלוי ממאגרי הנתונים הציבוריים של TCGA ששימשו לניתוח ביו-אינפורמטי. דגימות נבחרות אלו עובדו מיד לאחר האישור הפתולוגי וטופלו בתנאים נטולי RNase לפני הפקת ה-RNA. תת-קבוצה זו משקפת את המקרים שבהם ניתן היה להשיג הן כמות רקמה מספקת והן RNA כולל באיכות גבוהה (מדד שלמות RNA, RIN >7.0). ריכוז וטהרת ה-RNA הכולל נמדדו לפני שעתוק הפוך, ורק דגימות עם איכות RNA מספקת (RIN >7.0) נכללו בניתוחים הבאים. כמויות שוות של RNA כולל שעתקו הפוך ל-DNA משלים (cDNA) בהתאם לפרוטוקול היצרן לפני ביצוע PCR כמותי. תהליך זה הבטיח את תקפות נתוני ביטוי הגנים שנותחו. ניסויי ה-qRT-PCR בוצעו במכשיר real-time PCR thermocycler באמצעות בדיקת PCR כמותית מבוססת גשש (probe). כל התגובות בוצעו בשלישייה, יחד עם בקרים ללא תבנית (no-template controls) כדי להבטיח שחזור אנליטי. הגברה של ה-PCR בוצעה תחת תנאי מחזור הבאים: שלב ראשוני של הפעלה אנזיתית/דנטורציה ב-95°C למשך 10 min, ולאחריו 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 15 s והתאמה/הארכה ב-60°C למשך 60 s. אותות פלואורסצנציה נרכשו בסוף כל מחזור הגברה. כל הרכיבים והמתכלים נרכשו מספקים מסחריים (ראה Table of Materials). רצפי הפריימרים והגששים ששימשו ב-qRT-PCR מופיעים ב-Table 3.
ניתוח ביו-אינפורמטיקה
ניתוח של ביטוי הגן YTHDC2 באמצעות מאגר הנתונים GEPIA
בסיס הנתונים GEPIA שימש לניתוח הביטוי של YTHDC2 ב-NSCLC. הגישה לשרת האינטרנט של GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) בוצעה באמצעות דפדפן. נבחר מודול Expression DIY, הוזן סמל הגן "YTHDC2", נבחרה קבוצת הנתונים של LUAD ו-LUSC, פרמטרי הנורמליזציה כברירת המחדל נשמרו, ותרשימי קופסה של ביטוי דיפרנציאלי הופקו ישירות דרך ממשק GEPIA. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ- p < 0.05.
מאגר נתוני Kaplan-Meier plotter לניתוח הישרדות של חולי סרטן ריאות
המחקר ניתח את הקשר בין הביטוי של YTHDC2 לבין הפרוגנוזה במטופלים עם סרטן ריאות באמצעות מאגר הנתונים Kaplan-Meier Plotter. נבחר מאגר הנתונים של סרטן ריאות, הוזן סמל הגן "YTHDC2", הוחלה אפשרות ה-cutoff האופטימלית שנבחרה באופן אוטומטי, ועקומות קפלן-מייר (Kaplan–Meier) להישרדות כללית ולהישרדות לאחר התקדמות המחלה הופקו באמצעות הגדרות הניתוח ברירת המחדל. המטופלים סווגו באופן אוטומטי לקבוצות של ביטוי גבוה ונמוך באמצעות ה-cutoff האופטימלי שנקבע על ידי פלטפורמת Kaplan–Meier Plotter, ומדדי סיכון (hazard ratios) עם רווחי סמך של 95% תואמים הופקו באמצעות הגדרות ברירת המחדל של הפלטפורמה.
הרצת חבילות R בתוכנת R לצורך שרטוט עקומות ROC
נתוני ביטוי של רצף RNA ומטא-נתונים קליניים תואמים עבור מקרים מתאימים של TCGA-LUAD ו-TCGA-LUSC הורדו מפורטל הנתונים GDC. מאגרי הנתונים שהורדו אוחדו לפי מזהה המטופל ויובאו ל-R לצורך ניתוחים המשכיים. חבילת survivalROC שימשה להפקת עקומות ROC תלויות-זמן בנקודות זמן לחיזוי של שנה אחת, 3 שנים ו-5 שנים, וערכי השטח תחת העקומה (AUC) התואמים חושבו כדי להעריך את ביצועי הפרוגנוזה של ביטוי YTHDC2. בניתוח ה-ROC להישרדות נכללו רק חולי TCGA-LUAD ו-TCGA-LUSC עם מידע זמין על ביטוי RNA-seq והישרדות. הקוהורט הקליני המקומי לא שימש לחיזוי הישרדות מכיוון שלא היו זמינים נתוני מעקב ארוכי טווח.
בדיקת ביטוי YTHDC2 ברקמה באמצעות qRT-PCR
כדי לנתח את רמות ביטוי הגנים, בוצע qRT-PCR. נפחים שווים של cDNA הוספו לכל תגובה בהתאם לתנאי התגובה המומלצים על ידי היצרן. ההגברה בוצעה באמצעות בדיקת PCR כמותית מבוססת גשושית (probe), ונתוני פלואורסצנציה נאספו באופן אוטומטי בסיום כל מחזור הגברה. בקצרה, תהליך הפקת ה-RNA כלל מספר שלבים, הכוללים הכנת דגימה, הסרת פאראפין (deparaffinization), הסרת נוזל שאריות, עיכול באמצעות proteinase K, דגירה, צנטריפוגה, טיפול ב-DNase, הוספת DNase I והשקעה באתנול. לאחר מכן, הדגימה נקשרה לעמודת טהרת RNA מבוססת סיליקה וסובבה בצנטריפוגה ב-8,000 × g למשך 30 s. לאחר מכן העמודה נשטפה עם wash buffer 1, wash buffer 2 ו-wash buffer 2 מדולל באתנול, ויובשה ב-13,000 × g למשך 2 min. ה-RNA הוצא מהעמודה (eluted) על ידי הוספה של 70 µL של RNase-Free Water למרכז ממбраנת העמודה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-13,000 × g למשך 1 min. כל זוג פריימרים הראה תוצר הגברה יחיד, דבר שאושר באמצעות ניתוח עקומת התכה (melting-curve analysis) לפני חישוב ביטוי הגנים היחסי. יעילות הפריימרים (90–110%) תוקפה באמצעות עקומות סטנדרט לפני ניתוח הדגימות. ניתוחי עקומת התכה אישרו את נוכחותם של אמפליקונים יחידים ואת היעדרם של דימרים של פריימרים. ביטוי יחסי של YTHDC2 חושב באמצעות שיטת 2-ΔCt, שבה ערכי Ct נורמלו מול הגן הפנימי GAPDH. מכיוון שערכי הביטוי הוצגו כרמות ביטוי מנורמלות ולא כשינויי קיפול (fold changes) ביחס לדגימת כיול, התוצאות דווחו כערכי 2−ΔCt. GAPDH נבחר כגן הבית (housekeeping gene) מכיוון שביטויו הראה שונות מינימלית (CV < 5%) בהשוואה לחלופות שנבדקו (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), בהתאם לקריטריונים לבחירת גן ייחוס במחקרי m6A.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית, כולל יצירת גרפיקות ותרשימים. לצורך ניתוח נתונים כמותיים וקטגוריאליים של ביטוי הגן YTHDC2 בחולי NSCLC, נעשה שימוש בתוכנת R לצורך ניתוחים ביואינפורמטיים ויצירת עקומות ROC. עקומות ROC וערכי AUC שימשו להערכת הביצועים האבחנתיים של ביטוי YTHDC2 בניבוי הישרדות. עבור ניתוחים מבוססי רגרסיה, דווחו הערכות השפעה (odds ratios) עם רווחי סמך של 95% תואמים, במידת הצורך. מבחן הדירוגים הסימניים של וילקוקסון (Wilcoxon signed-rank test) שימש להשוואת ביטוי YTHDC2 בין דגימות גידול תואמות לדגימות רקמה נורמלית סמוכה, בעוד שניתוח מתאם פירסון שימש להערכת הקשר בין ביטוי YTHDC2 למאפיינים קליניקופתולוגיים. מקדמי מתאם (r) וערכי p תואמים דווחו. מכיוון שנתוני ה-qRT-PCR כללו דגימות גידול ורקמה נורמלית סמוכה מזוגים של אותם חולים, ונתוני ביטוי הגנים לא היו בעלי התפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחן הדירוגים הסימנתיים של וילקוקסון להשוואת רמות ביטוי YTHDC2 בין רקמות זוגיות. מבחן זה אינו מניח נורמליות של הנתונים ונפוץ בשימוש עבור נתונים ביולוגיים בעלי התפלגות אסימטרית. כל המבחנים הסטטיסטיים היו דו-צדדיים, וערך p <0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. משתנים רציפים נבדקו לנורמליות לפני הניתוח. משתנים רציפים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן או כחציון (טווח בין-רבעוני), לפי העניין.
תוצאות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ביטוי של הגן YTHDC2 בגידולים על בסיס מאגר הנתונים TCGA
איור 3 ממחיש את הקשר בין NSCLC ל-YTHDC2 על ידי בחינת רמות הביטוי של YTHDC2 בסוגים שונים של סרטנים באמצעות כלי ה-GDC במאגר הנתונים TCGA.
ביטוי של הגן YTHDC2 ב-NSCLC במסד הנתונים GEPIA
483 דגימות רקמה של אדנוקרצינומה של הריאה, 347 דגימות רקמת ריאה נורמלית, 486 דגימות רקמה של קרצינומה של תאי קשקש של הריאה ו-338 דגימות רקמת ריאה נורמלית התקבלו מסריקה נוספת של רמות הביטוי של YTHDC2 באדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) ובקרצינומה של תאי קשקש של הריאה (LUSC) במאגר הנתונים GEPIA. באמצעות ניתוחים סטטיסטיים, נמצא כי הן ברקמות אדנוקרצינומה של הריאה והן ברקמות קרצינומה של תאי קשקש של הריאה קיימות רמות ביטוי של YTHDC2 נמוכות במידה ניכרת מאשר ברקמות ריאה נורמליות (p < 0.05), כפי שמוצג ב-איור 4.
ניתוח GEPIA של ביטוי YTHDC2 במספר שלבים פתולוגיים
בסיס הנתונים GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) שימש ליצירת גרף שלבים (stage plot) להערכת הביטוי הדיפרנציאלי של YTHDC2 בשלבי NSCLC שונים. כפי שמוצג ב-איור 5, לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בביטוי של YTHDC2 בין השלבים הפתולוגיים של NSCLC (p = 0.644).
ניתוח קפלאן-מייר (Kaplan-Meier) של YTHDC2 והישרדות בסרטן ריאות
מסד הנתונים Kaplan-Meier Plotter שימש לביצוע ניתוח הישרדות לפי Kaplan-Meier עבור הגן YTHDC2. על פי הממצאים, למטופלים עם ביטוי גבוה של YTHDC2 הייתה הישרדות כוללת (OS) גבוהה באופן משמעותי מזו של מטופלים עם ביטוי נמוך (p < 0.05). כפי שמוצג ב-איור 6A (OS), למטופלים עם סרטן ריאה שהביעו רמות גבוהות יותר של YTHDC2 הייתה פרוגנוזה טובה יותר, והבדל זה היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05). על פי איור 6B (PPS), לקבוצה עם ביטוי גבוה של YTHDC2 הייתה פרוגנוזה טובה יותר מאשר לקבוצה עם ביטוי נמוך במערך הנתונים של הישרדות לאחר התקדמות המחלה (PPS); ההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05).
מודל לניבוי שיעור הישרדות של YTHDC2
ניתוח ROC תלוי-זמן, המבוסס על נתוני ביטוי RNA-seq ונתוני הישרדות מ-TCGA, חשף יכולת ניבוי מוגבלת של ביטוי YTHDC2 לבדו להישרדות של NSCLC, עם ערכי AUC של 0.50 (95% CI: 0.38-0.62), 0.51 (95% CI: 0.39-0.63), 0.52 (95% CI: 0.40-0.64), ו-0.52 (95% CI: 0.39–0.65) בנקודות זמן של 1, 3, 5 ו-8 שנים, בהתאמה (איור 7). כל רווחי הסמיכות של ה-AUC כללו את הערך 0.5, מה שמעיד על ביצועים השקולים להסתברות מקרית. ממצאים אלה מצביעים על כך שביטוי YTHDC2 לבדו חסר כושר הבחנה לניבוי הישרדות ואין לראות בו סמן פרוגנוסטי עצמאי. שילוב עם משתנים קליניקו-פתולוגיים או חתימות רב-גניות עשוי לשפר את ביצועי הניבוי.
ביטוי של YTHDC2 ברקמות סרטניות לעומת רקמות נורמליות באמצעות qRT-PCR
ביטוי הגן YTHDC2 נבדק הן ברקמות ממאירות והן ברקמות נורמליות סמוכות מחולים עם NSCLC באמצעות qRT-PCR. הביטוי הנורמל של YTHDC2 (2−ΔCt) היה 3.24 ± 2.34 ברקמות ממאירות ו-3.60 ± 1.70 ברקמות נורמליות סמוכות. לא נמצא הבדל מובהק בביטוי YTHDC2 בין 19 זוגות של רקמות גידול NSCLC לרקמות נורמליות סמוכות תואמות (p = 0.537), כפי שמוצג ב-איור 8. בעוד שניתוח ביו-אינפורמטי של מערכי נתונים גדולים הצביע על Downregulation מובהק של YTHDC2 ב-NSCLC, בדיקת qRT-PCR בקוהורט שלנו לא הראתה הבדל מובהק, דבר המדגיש פערים פוטנציאליים הנובעים מגודל הקוהורט, מהטרוגניות של הדגימות ושונות טכנית. בנוסף, ערך AUC נמוך (0.5) מעיד על כך ש-YTHDC2 לבדו אינו בעל דיוק אבחנתי או פרוגנוסטי.
ביטוי YTHDC2 ומאפיינים פתולוגיים קליניים ב-NSCLC
מחקר זה כלל 50 אנשים עם NSCLC. היו 32 מטופלים גברים (64.00%) ו-18 מטופלות נשים (36.00%), עם גיל ממוצע של 63.10 ± 9.85 שנים. טווח הגילאים היה בין 37 ל-86. מבין המטופלים, 25 עישנו בעבר ו-25 מעולם לא עישנו. בין הסוגים הפתולוגיים היו תשעה מקרים של קרצינומה של תאי קשקש (18.00%) וארבעים ואחד מקרים של אדנוקרצינומה של הריאה (82.0%). 22 מטופלים היו בשלבים III–IV (44.00%) ו-28 בשלבים I–II (56.00%) לפי הדירוג הקליני של CSCO. לעשרים וארבעה מטופלים לא היו גרורות בבלוטות הלימפה, בעוד שלעשרים ושישה אנשים (54.00%) היו. לתשעה מטופלים היו סרטנים עםבדיפרנציאציה נמוכה (18.00%), בעוד ש-41 מטופלים סבלו מגידולים עם דיפרנציאציה טובה עד בינונית (82.00%).
נבדק הקשר בין מאפיינים פתולוגיים קליניים לבין רמות הביטוי של YTHDC2 ברקמות NSCLC. נצפו הבדלים בביטוי של YTHDC2 בין תת-סוגים פתולוגיים ובהתאם למצב גרורות בקשריים לימפטיים (p < 0.05). עם זאת, מכיוון שרק ארבע דגימות של קרצינומה של תאי קשקש היו זמינות, יש לפרש את ההשוואה בין התת-סוגים הפתולוגיים בזהירות ולהחשיבה אותה כחקרית. כפי שמוצג ב-איורים 9A,B, הביטוי של YTHDC2 היה גבוה באופן מובהק בקרצינומה של תאי קשקש מאשר באדנוקרצינומה של הריאה, והיה גבוה באופן מובהק ברקמות NSCLC עם גרורות בקשריים לימפטיים מאשר באלו ללא גרורות בקשריים לימפטיים (5.70 ± 2.53 לעומת 3.83 ± 0.91, p = 0.027). עם זאת, מכיוון שרק ארבע דגימות של קרצינומה של תאי קשקש נכללו, יש לפרש את ההשוואה בין התת-סוגים הפתולוגיים בזהירות ולהחשיבה אותה כחקרית עד לתיקוף בקבוצות גדולות יותר. ביטוי גבוה יותר של YTHDC2 בחולים עם גרורות בקשריים לימפטיים עשוי להצביע על קשר פוטנציאלי בין YTHDC2 לבין מצב גרורות בקשריים לימפטיים; עם זאת, יש לפרש ממצא זה בזהירות בשל גודל המדגם המוגבל והוא דורש תיקוף בקבוצות עצמאיות גדולות יותר. עם זאת, גיל, היסטוריית עישון, שלב קליני לפי CSCO ודיפרנציאציה היסטולוגית לא השפיעו באופן מובהק על ביטוי YTHDC2 (p > 0.05). מידע נוסף כלול ב-טבלה 4, טבלה 5, וב-איור 9.
רגרסיה לוגיסטית בינארית של גרורות בקשרי לימפה ב-NSCLC
בדומה לניתוח הקורלציה, ביטוי של YTHDC2 היה קשור באופן מובהק לגרורות בקשרי לימפה (p < 0.05). ביצוע ניתוח רגרסיה לוגיסטית בינארית בחולי NSCLC, כאשר גרורות בקשרי לימפה הן המשתנה התלוי, והגיל, המין, היסטוריית עישון, שלב הגידול, הסוג הפתולוגי, רמת הביטוי של YTHDC2 ודרגת הדיפרנציאציה הם המשתנים הבלתי תלויים. התוצאות הראו כי ביטוי של YTHDC2 בחולי NSCLC היה קשור באופן מובהק לגרורות בקשרי לימפה (p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748).
בנתונים הקליניים הכלליים, שלב הגידול של חולי NSCLC נמצא במתאם מובהק סטטיסטית עם גרורות בקשרי לימפה (p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186). עם זאת, גיל, מגדר, היסטוריית עישון, סוג פתולוגי ודרגת דיפרנציאציה לא היו במתאם מובהק עם גרורות בקשרי לימפה ב-NSCLC (p > 0.05), כפי שמוצג ב-טבלה 6.
זמינות נתונים: מערכי הנתונים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים במאגר Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). המאגר כולל את המטא-נתונים הקליניים של TCGA, הערות לדגימות, מפרטי שליפת נתונים ומניפסט הניתוח ששימשו לניתוחים הביואינפורמטיים. נתונים נוספים זמינים מהמחבר המקשר על פי בקשה סבירה.
איור 1: תרשים זרימה של בחירת חולים ושילוב רקמות לניתוח qRT-PCR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2תהליך העבודה של ניתוחי הביואינפורמטיקה שבוצעו להערכת הביטוי של YTHDC2 והמשמעות הפרוגנוסטית שלו ב-NSCLC אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של דמות זו.
איור 3: ביטוי של הגן YTHDC2 במאגר הנתונים TCGA. רמות הביטוי של YTHDC2 באדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) ובקרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC) הושוו לאלו של רקמות ריאה נורמליות, תוך שימוש בנתוני ריצוף RNA שהתקבלו מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA) דרך פורטל הנתונים Genomic Data Commons (GDC) ונאחלו באמצעות פלטפורמת האינטרנט GEPIA. הנתונים נותחו באמצעות פלטפורמת GEPIA. מובהקות סטטיסטית נקבעה עבור ערך p-value < 0.05. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי דיפרנציאלי של YTHDC2 ב-NSCLC על בסיס ניתוח מסד הנתונים GEPIA. רמות הביטוי של YTHDC2 באדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) ובקרצינומה של תאי קשקש של הריאה (LUSC) הושוו לאלו של רקמות ריאה נורמליות, תוך שימוש בנתונים מפרויקטים של The Cancer Genome Atlas (TCGA) ו-Genotype-Tissue Expression (GTEx) באמצעות פלטפורמת GEPIA. תרשימי קופסה מייצגים רמות ביטוי גנים מנורמלות. מובהקות סטטיסטית נקבעה עם p-value < 0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 5: ניתוח ביטוי של YTHDC2 לפי שלבים ב-NSCLC באמצעות מאגר הנתונים GEPIA. רמות הביטוי של YTHDC2 נותחו בשלבים פתולוגיים שונים (I–IV) של NSCLC באמצעות פלטפורמת GEPIA. תרשים השלבים ממחיש את השונות בביטוי הגן על פני שלבי הגידול. לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בביטוי YTHDC2 בין השלבים (p = 0.644). אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 6: ניתוח הישרדות קפלן-מייר של ביטוי YTHDC2 בחולי NSCLC (Kaplan–Meier Plotter). (A) הישרדות כוללת (OS): עקומות הישרדות קפלן-מייר המשוות את ההישרדות הכוללת בחולי NSCLC שחולקו לקבוצות של ביטוי YTHDC2 גבוה (n = 140) ונמוך (n = 364), תוך שימוש בהגדרת נקודת החיתוך האופטימלית (“auto-select best cutoff”) המסופקת על ידי כלי ה-Kaplan–Meier Plotter. מבחן log-rank שימש להערכת מובהקות סטטיסטית (p = 0.0093); יחס סיכון (HR) = 0.61; רווח ברטחון (CI) של 95%: 0.42–0.89. ביטוי מוגבר של YTHDC2 קשור להישרדות כוללת טובה באופן מובהק. (B) הישרדות לאחר התקדמות המחלה (PPS): עקומות הישרדות קפלן-מייר המשוות את ההישרדות לאחר התקדמות המחלה בחולי NSCLC שחולקו לקבוצות של ביטוי YTHDC2 גבוה (n = 181) ונמוך (n = 296), תוך שימוש בהגדרת נקודת החיתוך האופטימלית (“auto-select best cutoff”) המסופקת על ידי כלי ה-Kaplan–Meier Plotter. מבחן log-rank שימש להשוואה סטטיסטית (p = 4.2 × 10⁻5); יחס סיכון (HR) = 0.63 (רווח ברטחון של 95%: 0.51–0.79). ביטוי גבוה של YTHDC2 קשור להישרדות ארוכה יותר באופן מובהק לאחר התקדמות המחלה. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מודל לניבוי שיעורי הישרדות של YTHDC2. עקומות מאפיין Operating Characteristic (ROC) המעריכות את הדיוק הניבויי של YTHDC2 להישרדות כללית בחולי TCGA-LUAD ו-TCGA-LUSC עם נתוני ביטוי RNA-seq והישרדות זמינים בנקודות זמן של שנה אחת, 3 שנים, 5 שנים ו-8 שנים. ערכי AUC: שנה אחת = 0.50, 3 שנים = 0.51, 5 שנים = 0.52, ו-8 שנים = 0.52. קו אלכסוני מקווקו מציין סיכוי מקרי (AUC = 0.5). הניתוח בוצע באמצעות חבילת survival ROC ב-R. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8ביטוי של YTHDC2 ברקמות גידול של NSCLC וברקמות נורמליות סמוכות שהושלמו בזוגות, כפי שנמדד באמצעות qRT-PCR. הביטוי היחסי של YTHDC2 חושב באמצעות שיטת $2^{-\Delta\Delta\text{Ct}}$–ΔCt בשיטה ונורמלו ל-GAPDH. ערכי הביטוי מייצגים רמות ביטוי מנורמלות ולא שינויים במכפלות (fold changes) ביחס לדגימת כיול. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות 19 זוגות של רקמת גידול ורקמה נורמלית סמוכה שהיו זמינים להשוואה בזוגות. הנתונים מוצגים כתצפיות זוגיות בודדות עם ממוצע ± סטיית תקנית. הבדלים בין דגימות בזוגות נותחו באמצעות מבחן סימני הדרגה של וילקוקסון (p = 0.537). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9: הקשר בין ביטוי YTHDC2 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים בחולי NSCLC. (A) ביטוי YTHDC2 בסוגים פתולוגיים שונים, המראה ביטוי גבוה יותר בקרצינומה של תאי קשקש מאשר באדנוקרצינומה (p < 0.05). (B) ביטוי YTHDC2 לפי מצב גרורות בקשרי לימפה, המדגים ביטוי גבוה יותר בחולים עם גרורות בקשרי לימפה מאשר באלה ללא גרורות (p < 0.05). (C) ביטוי YTHDC2 בדרגות בידוד היסטולוגיות שונות, ללא הבדל מובהק סטטיסטית (p = 0.181). (D) ביטוי YTHDC2 לאורך שלבי CSCO קליניים, ללא הבדל מובהק סטטיסטית (p = 0.08). רמות ביטוי YTHDC2 נמדדו באמצעות qRT-PCR (quantitative real-time PCR) וחושבו בשיטת 2–ΔCt, בנורמליזציה ל-GAPDH. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. *p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| מס' רץ | קריטריוני הכללה | קריטריוני הדרה |
| 1 | גיל ≥18 שנים, ללא קשר למגדר. | אבחנה של גידולים ממאירים אחרים. |
| 2 | אבחנה מאושרת של NSCLC בהתאם להנחיות הקליניות לסרטן ריאה של איגוד הרופאים הסיני (מהדורת 2024). | נוכחות של מחלות נשימה או מחלות קרדיו-וסקולריות כרוניות (למשל, COPD, מחלת לב ריאתית, אי-ספיקת לב). |
| 3 | זמינות של נתונים קליניים מלאים, כולל פרטים דמוגרפיים, סמני גידול בנסיוב, והדמיית CT חזה עם חומר ניגוד, בלווי הסכמה מדעת חתומה. | שיבוש תפקודי חמור של איברים, כולל אי-ספיקת כליות (eGFR <30 ml/min/1.73m²) או שחמת הכבד. |
| 4 | מטופלים שלא קיבלו טיפול קודם (treatment-naive) ללא טיפולים קודמים המכוונים לגידול. | אוכלוסיות מיוחדות, כולל נשים בהריון או מניקות (מאושר על ידי בדיקת β-hCG במידת הצורך). |
| 5 | זמינות של דגימות גידול ו/או רקמה סמוכה מספיקות המתאימות לאנליזה מולקולרית. | איכות דגימה נמוכה, כולל רקמה לא מספקת או RNA מדוּגדר (מאושר על ידי סקירת פתולוג). |
טבלה 1: קריטריונים להכללה ולהדרה של חולי NSCLC במחקר
| סוג רקמה | דגימות זוגיות שנבדקו (n) | ביטוי יחסי (Mean ± SD) |
| רקמת גידול | 19 | 3.24 ± 2.34 |
| רקמה נורמלית סמוכה תואמת | 19 | 3.60 ± 1.70 |
טבלה 2: ביטוי של YTHDC2 בגידולי NSCLC וברקמות נורמליות סמוכות בזיווגים. ביטוי יחסי של YTHDC2 נמדד בשיטת 2–ΔCt ונורמל ל-GAPDH. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). השוואה סטטיסטית של 19 זיווגים של רקמת גידול ורקמה נורמלית סמוכה בוצעה באמצעות מבחן הדירוגים המסומנים של וילקוקסון (p = 0.537).
| גן מטרה | פריימר/גשושית (Probe) | רצף (5′→3′) |
| YTHDC2 | קדמי (F) | CCTGTCACCAATAAAGAGCG |
| אחורי (R) | CACTGGAATCTGAGGTATGCC | |
| גשושית (P) | AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA | |
| GAPDH | קדמי (F) | AATCCCATCACCATCTTCCAG |
| אחורי (R) | ATGACCCTTTTGGCTCCC | |
| גשושית (P) | CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT |
טבלה 3: רצפי הפריימרים והפרובים ששימשו ל-PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). הביטוי של YTHDC2 נמדד באמצעות כימיית TaqMan, כאשר GAPDH שימש כבקרה פנימית.
| מאפיין | קטגוריה | n | % |
| סוג פתולוגי | אדנוקרצינומה | 41 | 82 |
| קרצינומה של תאי קשקש | 9 | 18 | |
| דירוג CSCO | I–II | 28 | 56 |
| III–IV | 22 | 44 | |
| גרורות בקשרי לימפה | לא | 24 | 48 |
| כן | 26 | 52 | |
| דרגת דיפרנציאציה | דיפרנציאציה נמוכה | 9 | 18 |
| דיפרנציאציה בינונית–גבוהה | 41 | 82 | |
| גיל | ≥60 שנים | 36 | 72 |
| <60 שנים | 14 | 28 | |
| מגדר | גבר | 32 | 64 |
| אישה | 18 | 36 | |
| היסטוריית עישון | כן | 25 | 50 |
| לא | 25 | 50 |
טבלה 4: מאפיינים קליניים ופתולוגיים של חולי NSCLC. הנתונים מוצגים כמספרים (n) ואחוזים (%) בהתבסס על סך כל אוכלוסיית המחקר (n = 50).
| מאפיין קליני-פתולוגי | קבוצה | n | ביטוי YTHDC2 (ממוצע ± SD) | p-value |
| סוג רקמה | גידול | 30 | 3.24 ± 2.34 | 0.537 |
| נורמלי סמוך | 19 | 3.60 ± 1.70 | ||
| סוג פתולוגי | אדנוקרצינומה | 26 | 4.13 ± 1.29 | 0.022* |
| קרצינומה של תאי קשקש | 4 | 7.50 ± 3.41 | ||
| דירוג CSCO | I–II | 22 | 4.29 ± 1.94 | 0.08 |
| III–IV | 8 | 5.05 ± 1.51 | ||
| גרורות בבלוטות לימפה | אין | 19 | 3.83 ± 0.91 | 0.027* |
| יש | 11 | 5.70 ± 2.53 | ||
| דיפרנציאציה היסטולוגית | דיפרנציאציה מתונה–טובה | 25 | 4.33 ± 1.90 | 0.181 |
| דיפרנציאציה גרועה | 5 | 5.18 ± 1.60 | ||
| גיל | ≥60 שנים | 20 | 4.62 ± 2.10 | 0.835 |
| <60 שנים | 10 | 4.16 ± 1.12 | ||
| היסטוריית עישון | יש | 12 | 4.62 ± 2.40 | 0.845 |
| אין | 18 | 4.38 ± 1.40 |
טבלה 5: הקשר בין ביטוי YTHDC2 לבין מאפיינים קליניקו-פתולוגיים בחולי NSCLC. ביטוי YTHDC2 נמדד באמצעות qRT-PCR וחושב באמצעות שיטת 2–ΔCt, ונורמל ל-GAPDH. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). גדלי הקבוצות (n) מייצגים את מספר הדגימות התקינות שנותחו. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. p < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.
| משתנה | β | Wald | ערך p | OR | 95% CI |
| גיל (≥60 מול <60) | 0.07 | 0.01 | 0.93 | 1.08 | 0.20–5.68 |
| מגדר (נקבה מול זכר) | 0.53 | 0.4 | 0.525 | 1.7 | 0.33–8.67 |
| היסטוריה של עישון (כן מול לא) | 0.54 | 0.46 | 0.496 | 1.71 | 0.36–8.09 |
| שלב הגידול (III–IV מול I–II) | 3.3 | 7.38 | 0.007* | 27 | 2.50–291.18 |
| דיפרנציאציה (דלה מול בינונית-טובה) | –1.29 | 1.62 | 0.204 | 0.28 | 0.04–2.02 |
| ביטוי YTHDC2 | 0.83 | 4.91 | 0.027* | 2.29 | 1.10–4.75 |
טבלה 6: ניתוח רגרסיה לוגיסטית רב-משתנית של גורמים הקשורים לגרורות בבלטות לימפה בחולי NSCLC. רגרסיה לוגיסטית בינארית בוצעה כאשר גרורות בבלטות לימפה שימשו כמשתנה התלוי. מדווחים יחסי סיכויים (ORs) עם רווחי סמך (CI) של 95%. קטגוריות ייחוס: גיל (<60 שנים), מגדר (זכר), היסטוריית עישון (לא), שלב הגידול (I–II), ודיפרנציאציה (בינונית–טובה). *p < 0.05 מעיד על מובהקות סטטיסטית.
דיון
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
YTHDC2, חלבון קישור ה-N6-methyladenosine (m6A) הגדול ביותר במשפחת YTH, ייחודי בזכות פעילות הליקאז של RNA התלויה ב-ATP, המגדירה אותו כרגולטור מרכזי של מטבוליזם של RNA13. בניגוד לחברים אחרים במשפחת YTH, YTHDC2 נמצא הן בגרעין והן בציטופלזמה, שם הוא מווסת את תרגום ה-mRNA ואת יציבות ה-RNA14. מחקרים ניסויים קודמים הראו כי YTHDC2 מדכא את התקדמות אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) על ידי עיכוב ביטוי של mRNA של ADIRF ו-MRPL12, הגברת אפופטוזה והפחתה של שגשוג תאים וגרורות15,16. מחקרים ניסויים קודמים הצביעו גם על כך ש-YTHDC2 מייצב lncRNAs כגון ZNRD1-AS1 כדי לדכא את שגשוג LUAD, ומווסת mRNAs שעברו מודיפיקציית m6A כגון CYLD ו-SLC7A11, ובכך מעכב את נתיב השילוח של NF-κB, ספיגת ציסטאין ותהליכים נוגדי חמצון, תוך קידום פרופטוזה ופעילות אנטי-סרטנית17,18.
במחקר זה, נבחנו הביטוי והמשמעות הקלינית של חלבון ה-m6A reader ששמו YTHDC2 ב-NSCLC באמצעות גישה אינטגרטיבית המשלבת ניתוחים ביו-אינפורמטיים ותיקוף ניסויי. ניתוח ביו-אינפורמטי זה של מאגרי הנתונים TCGA ו-GEPIA חשףירידה משמעותית בביטוי של YTHDC2 ברקמות גידול של NSCLC בהשוואה לרקמות ריאה נורמליות, וביטוי גבוה יותר של YTHDC2 היה קשור להישרדות כוללת והישרדות לאחר התקדמות מחלה משופרת, מה שמרמז על תפקיד פרוגנוסטי פוטנציאלי. באופן מעניין, ניסויי qRT-PCR שביצענו באמצעות 19 דגימות זוגיות זמינות של גידול ורקמה נורמלית סמוכה בקוהורט הנוכחית לא הצליחו להראות הבדל מובהק סטטיסטית בביטוי של YTHDC2 בין רקמות גידול לרקמות נורמליות סמוכות. אי-התאמה זו מדגישה את האתגרים שבמעבר מממצאים ממאגרי נתונים ציבוריים רחבי היקף לקוהורטים קליניות עצמאיות, ומדגישה את הצורך בפרשנות זהירה של ניתוחי in silico. הבנת הסיבות להבדלים אלו היא קריטית להערכה מדויקת של התועלת של YTHDC2 כסמן ביולוגי וכמטרה טיפולית ב-NSCLC. ההתמקדות של המחקר הנוכחי ב-YTHDC2 תואמת את פעילות ההליקאז הייחודית שלו בקרב קוראי YTH19, אך ניתוחי pan-cancer מהעת האחרונה חושפים תפקידים תלויי-הקשר עבור בני משפחה אחרים. לדוגמה, Li et al. הראו כי YTHDF1/2 נמצאים בביטוי מוגבר ברוב הסרטנים (למשל, LIHC, LUAD) ומתואמים עם פרוגנוזה גרועה, בעוד ש-YTHDC1/2 מראים השפעות מדכאות גידול ב-KIRC וב-BRCA20. ראוי לציין שתפקידו האונקוגני של YTHDF1 באמצעות הפעלת Wnt/β-catenin עומד בניגוד לתפקוד האנטי-מטסטטי של YTHDC2 ב-NSCLC, מה שמדגיש את הצורך באסטרטגיות של סמנים ביולוגיים ספציפיים לסוג הגידול. בהשוואה לסמנים פרוגנוסטיים מבוססים (למשל, PD-L1 לתגובה לאימונותרפיה), ניתן להגביר את כוח הניבוי של YTHDC2 על ידי שילובו עם ווסתי m6A אחרים (למשל, METTL3, YTHDF1) או גנים של נקודות בקרה חיסוניות, כפי שעולה מניתוחי חדירה חיסונית ב-pan-cancer. למרות שמחקרים קודמים מרמזים כי YTHDC2 מווסת את נתיב ה-NF-κB/CYLD12, המחקר הנוכחי היה מוגבל עקב היעדר תיקוף ברמת החלבון באמצעות immunohistochemistry או Western blotting, וכן היעדר תיקוף תפקודי. עבודות עתידיות צריכות לשלב בדיקות knockdown עם m6A-sequencing כדי למפות מטרות ישירות.
ניתוחים קודמים חשפו כי ביטוי YTHDC2 מופחת ברקמות של NSCLC ומתאם עם פרוגנוזה גרועה21. ניתוח Kaplan-Meier הצביע על הישרדות ארוכה יותר בחולים עם ביטוי YTHDC2 גבוה יותר, אך ניתוח עקום ROC העלה כי כושר הניבוי להישרדות מוגבל20. ניתוח ROC להישרדות במחקר הנוכחי בוצע באמצעות נתוני ביטוי RNA-seq ונתוני הישרדות של TCGA, מאחר שמידע על מעקב ארוך טווח לא היה זמין עבור когоה הקלינית המקומית שלנו. חשוב לציין כי ערכי ה-AUC הנמוכים (~0.5) שנצפו במחקר זה מעידים כי לביטוי YTHDC2 חסרות רגישות וסגוליות מספיקות לשימוש קליני כסמן ביולוגי עצמאי22. מגבלה זו תואמת ראיות עולות הגורסות כי סמנים ביולוגיים של גן בודד אינם מספיקים לרוב עבור מחלות מורכבות כגון NSCLC, שבהן נדרשים יותר ויותר גישות מולטי-אומיקה ופאנלים משולבים של סמנים ביולוגיים כדי להשיג ביצועי ניבוי בעלי משמעות קלינית. ביטוי YTHDC2 גבוה יותר נצפה ברקמות NSCLC עם גרורות בבלוטות הלימפה, מה שמרמז על קשר פוטנציאלי בין ביטוי YTHDC2 לבין סטטוס גרורות בבלוטות הלימפה בקוהה הנוכחית. למרות שנדו דומה גם בביטוי YTHDC2 בין אדנוקרצינומה לקרצינומה של תאי קשקש, יש לפרש השוואה זו בזהירות, שכן רק 4 דגימות של קרצינומה של תאי קשקש היו זמינות לניתוח, מה שהגביל משמעותית את העוצמה הסטטיסטית של השוואה זו בין תתי-הקבוצות. לא נצפו הבדלים משמעותיים בשלב הקליני, בדיפרנציאציה, בגיל או בהיסטוריית עישון, ככל הנראה בשל מגבלות המחקר, כולל גודל המדגם ועיצוב של מרכז בודד. למרות שהקשר שנצפה בין ביטוי YTHDC2 מופחת לבין גרורות בבלוטות הלימפה מרמז על תפקיד ביולוגי פוטנציאלי ב-NSCLC, כושר ההבחנה הדל שלו (AUC ~0.5) והגילוי הבלתי עקבי באמצעות qRT-PCR שוללים את השימוש בו כסמן קליני עצמאי. מחקרי עתיד צריכים לבחון האם שילוב של YTHDC2 עם חלבונים אחרים הקשורים ל-m6A משפר את ערך הניבוי.
ניתוחי הביואינפורמטיקה הצביעו על כך שהביטוי של YTHDC2 מופחת ב-NSCLC ועשוי להיות קשור לתוצאות טובות יותר עבור המטופלים. למרות שביטוי מופחת נצפה גם בחולים עם גרורות לקשרי לימפה ונרשמו הבדלים בין תתי-סוגים פתולוגיים, יש לפרש ממצאים אלו בתתי-קבוצות בזהירות בשל גודל המדגם המוגבל, ובמיוחד עבור קרצינומה של תאי קשקש. עם זאת, ממצאים אלו לא אומתו בניתוח qRT-PCR בקוהורט הקלינית שלנו, מה שעשוי לשקף הבדלים במאפייני הקוהורט, בגודל המדגם, בשונות טכנית, בבקרת פוסט-טרנסקריפציונית, או בהיעדר תיקוף ברמת החלבון. מחקרי עתיד צריכים לבחון את המנגנונים של YTHDC2 בתתי-סוגים אחרים של סרטן ריאה באמצעות ניסויי in vitro ו-in vivo. מחקרים כאלה עשויים להבהיר עוד יותר את התפקיד הביולוגי של YTHDC2 ולקבוע אם יש לו תועלת קלינית כחלק מגישת רב-סמנים (multimarker approach) ולא כסמן ביולוגי עצמאי.
מגבלות
למחקר זה מספר מגבלות. זה היה מחקר רטרוספקטיבי במרכז אחד עם גודל מדגם קטן יחסית, דבר שעשוי להגביל את היכולת להכליל את הממצאים. השימוש ברקמות FFPE עשוי היה להשפיע על איכות ה-RNA ועל הרגישות של ה-qRT-PCR. בנוסף, הוערך ביטוי ה-mRNA של YTHDC2 בלבד, ולא בוצע אישור ברמת החלבון באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) או Western blotting. מכיוון שביטוי mRNA לא תמיד נמצא במתאם עם שפע החלבון בשל בקרה פוסט-טרנסקריפציונית, הדבר עשוי להסביר חלקית את הפער בין הממצאים הקליניים שלנו לבין ניתוחי מאגרי המידע הציבוריים. כמו כן, במחקר היו חסרים נתוני מעקב ארוכי טווח, וניתוחי תתי-קבוצות (למשל, קרצינומה של תאי קשקשת) לא היו בעלי עוצמה סטטיסטית מספקת.
כיוונים עתידיים
מחקרים עתידיים צריכים לבחון את מנגנוני YTHDC2 ב-NSCLC באמצעות ניסויים in vitro ו-in vivo כדי להבין טוב יותר את תפקידו הפונקציונלי. נדרשים מחקרים רב-מרכזיים עם גדלי מדגם גדולים יותר כדי לתקף את הממצאים ולשפר את היכולת להכלילם. בנוסף, שילוב של YTHDC2 עם רגולטורים אחרים הקשורים ל-m6A ומשתנים קליניקופתולוגיים עשוי לשפר את התועלת החיזויית והפרוגנוסטית שלו. מחקרים נוספים המשלבים גישות מולטי-אומיקה (multi-omics), כולל טרנסקריפטומיקה, פרוטאומיקה ואפיגנומיקה, נחוצים כדי להבהיר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס הדיסרגולציה של YTHDC2. יש לבצע גם תיקוף ברמת החלבון באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) או Western blotting כדי להעריך את ההלימה בין ביטוי ה-mRNA לביטוי החלבון. סטנדרטיזציה של עיבוד הדגימות וטכניקות התיקוף תהיה קריטית גם היא כדי להבטיח הדירות וישימות קלינית.
סיכום
מחקר זה מספק הערכה גישושית של ביטוי YTHDC2 ב-NSCLC על ידי שילוב של ניתוחי ביואינפורמטיקה עם תיקוף קליני באמצעות qRT-PCR. עם זאת, הגילוי הבלתי עקבי שלו בפלטפורמות אנליטיות שונות ודיוק אבחנתי מוגבל (AUC ≈0.5) מונעים כעת את השימוש בו כסמן ביולוגי קליני עצמאי. בעוד שניתוחי ביואינפורמטיקה מרמזים על חשיבות פרוגנוסטית פוטנציאלית, תיקוף קליני בלתי תלוי אינו תומך באמינותו ליישום אבחנתי או פרוגנוסטי. יש לפרש ממצאים אלו בזהירות, והם דורשים תיקוף בקוהורט רב-מרכזי גדול יותר, הכולל מחקרי רמה חלבונית ומחקרים פונקציונליים, בטרם יישקל כל יישום קליני.
גילויים
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
למחברים אין אינטרסים רלוונטיים, פיננסיים או שאינם פיננסיים, להצהיר עליהם.
תודות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעים טבעיים של מחוז היינאן (מספר 821RC735).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פריימרים ופרובים בהתאמה אישית | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | סינתזה מותאמת אישית | רצפי הפריימרים והפרובים מפורטים בטבלה 6 |
| DNase I | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | DNase I (HiPure FFPE RNA Kit) | הסרת זיהום של DNA גנומי |
| אלגוריתם ESTIMATE | Yoshihara et al. | חבילת R (גרסה 1.0.13) | הערכת טוהר הגידול |
| ערכה למיצוי RNA מ-FFPE | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02) | מיצוי RNA מרקמה ב-FFPE |
| פורטל הנתונים GDC | National Cancer Institute (NCI), NIH, USA | https://portal.gdc.cancer.gov | הורדה של מערכי נתונים מ-TCGA |
| שרת האינטרנט GEPIA | Peking University, China | http://gepia.cancer-pku.cn | ניתוח ביטוי גנים |
| Kaplan–Meier Plotter | Semmelweis University, Hungary | https://kmplot.com | ניתוח הישרדות |
| מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5424 R | נהלי טיהור RNA |
| ספקטרופוטומטר NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | NanoDrop 2000/2000c | כימות RNA |
| תערובת מאסטר qPCR מבוססת פרובים | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040) | הגברה של PCR כמותי |
| תוכנת הסטטיסטיקה R | R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria | גרסה 4.4.1 | ניתוחים סטטיסטיים וניתוח ROC |
| מערכת PCR בזמן אמת | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA | CFX Opus 96 | PCR כמותי בזמן אמת |
| ערכה לשעתוק הפוך | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) | סינתזת cDNA |
| עמודת טיהור RNA | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure Mini Column I | עמודת טיהור RNA עם ממברנת סיליקה |
| מים נטולי RNase | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | RNase-Free Water | אלוציה של RNA |
| SPSS Statistics | IBM Corp., Armonk, NY, USA | IBM SPSS Statistics גרסה 27.0 | ניתוחים סטטיסטיים |
| חבילת survivalROC | CRAN (R Foundation for Statistical Computing) | גרסה 1.0.3.1 | ניתוח ROC תלוי זמן |
| מסד נתוני TCGA | National Cancer Institute (NCI), NIH, USA | https://portal.gdc.cancer.gov | מסד נתונים גנומי ציבורי לסרטן |
| בופר שטיפה RW1 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW1 | בופר שטיפה לטיהור RNA |
| בופר שטיפה RW2 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW2 | בופר שטיפה לטיהור RNA |
מקורות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Shen, Y., Chen, J. Q., Li, X. P. Differences between lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma: Driver genes, therapeutic targets, and clinical efficacy. Genes Dis. 12 (1), 101374 (2025).
- Cao, W., Qin, K., Li, F., Chen, W. Comparative study of cancer profiles between 2020 and 2022 using global cancer statistics (GLOBOCAN). J. Natl. Cancer Cent. 4 (2), 128-134 (2024).
- Alduais, Y., Zhang, H., Fan, F., Chen, J., Chen, B. Non-small cell lung cancer (NSCLC): A review of risk factors, diagnosis, and treatment. Medicine (Baltimore). 102 (13), e32899 (2023).
- Sun, H., Li, K., Liu, C., Yi, C. Regulation and functions of non-m6A mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 24 (11), 714-731 (2023).
- Zhang, W., Qian, Y., Jia, G. The detection and functions of RNA modification m6A based on m6A writers and erasers. J. Biol. Chem. 297 (2), 100973 (2021).
- Li, Y. et al. Autophagy activation is required for N6-methyladenosine modification to regulate ferroptosis in hepatocellular carcinoma. Redox Biol. 69, 102971 (2024).
- Wang, J. et al. Downregulation of m6A reader YTHDC2 promotes the proliferation and migration of malignant lung cells via the CYLD/NF-κB pathway. Int. J. Biol. Sci. 17 (10), 2633-2651 (2021).
- Koh, Y. W., Han, J. H., Haam, S., Lee, H. W. Prognostic and predictive value of YTHDF1 and YTHDF2 and their correlation with tumor-infiltrating immune cells in non-small cell carcinoma. Front. Oncol. 12, 996634 (2022).
- Tsuchiya, K. et al. YTHDF1 and YTHDF2 are associated with better patient survival and an inflamed tumor-immune microenvironment in non-small-cell lung cancer. Oncoimmunology. 10 (1), 1962656 (2021).
- Diao, H. et al. The m6A reader YTHDF1 promotes lung carcinoma progression via regulating ferritin-mediated ferroptosis in an m6A-dependent manner. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 185 (2023).
- Sun, S. et al. Downregulation of m6A reader YTHDC2 promotes tumor progression and predicts poor prognosis in non-small cell lung cancer. Thorac. Cancer. 11 (11), 3269-3279 (2020).
- Chen, S., Wang, Z., Sun, B. Chinese Society of Clinical Oncology Non-small Cell Lung Cancer (CSCO NSCLC) guidelines in 2024: Key update on the management of early and locally advanced NSCLC. Cancer Biol. Med. In Press (2025). doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2024.0592. (2025).
- Fan, S., Xu, X., Chen, J., Yin, Y., Zhao, Y. Genome-wide identification, characterization, and expression analysis of m6A readers-YTH domain-containing genes in alfalfa. BMC Genomics. 25, 18 (2024).
- Shi, R. et al. Linking the YTH domain to cancer: The importance of YTH family proteins in epigenetics. Cell Death Dis. 12 (4), 346 (2021).
- Wu, X. et al. The biological function of the N6-methyladenosine reader YTHDC2 and its role in diseases. J. Transl. Med. 22, 490 (2024).
- Teng, Y., Zhao, X., Xi, Y., Fu, N. N6-methyladenosine-regulated ADIRF impairs lung adenocarcinoma metastasis and serves as a potential prognostic biomarker. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2249173 (2023).
- Ma, L. et al. The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol. 38, 101801 (2021).
- Ma, L. et al. Targeting SLC3A2 subunit of system XC− is essential for m6A reader YTHDC2 to be an endogenous ferroptosis inducer in lung adenocarcinoma. Free Radic. Biol. Med. 168, 25-43 (2021).
- Lin, Y. et al. Pan-cancer analysis reveals m6A variation and cell-specific regulatory network in different cancer types. Genomics Proteomics Bioinformatics. 22 (4), qzae052 (2024).
- Li, L. et al. Bioinformatic analysis of m6A "reader" YTH family in pan-cancer as a clinical prognosis biomarker. Sci. Rep. 13, 17350 (2023).
- Sun, Y., Liu, Y., Wang, P., Chang, L., Huang, J. The m6A reader YTHDC2 suppresses lung adenocarcinoma tumorigenesis by destabilizing MRPL12. Mol. Biotechnol. 66 (8), 1051-1061 (2024).
- Hajian-Tilaki, K. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis for medical diagnostic test evaluation. Caspian J. Intern. Med. 4 (2), 627-635 (2013).
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה