קרדיואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים שנגרמו על ידי אדם כמודל להערכת אספקת אוליגונוקלאוטידים

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר יצירת קרדיואידים מבוססי קרדיומיוציטים מאורגנים עצמיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים על ידי אדם, לצורך הערכה מיקרוסקופית של קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית.

תקציר

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים מייצגים קבוצה מתקדמת במהירות של תרופות עם פוטנציאל משמעותי לטיפול במחלות לב וכלי דם; עם זאת, השגת אספקה יעילה לרקמת הלב נותרה אתגר קריטי ובלתי פתור. מכשול מרכזי הוא הזמינות המוגבלת של מודלים אנושיים פיזיולוגיים חזקים ורלוונטיים במבחנה , המסוגלים לתמוך בהערכה כמותית של קליטת תאים של אוליגונוקלאוטידים ותפוצה תוך-תאית. מוצג פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, ליצירת קרדיואידים תלת-ממדיים מארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) שנגרמו על ידי אדם, ויישומם כפלטפורמה להערכת קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים בתהליך התמיינות לבבית מכוונת בתרבות השעיה על ידי ויסות זמני של איתות Wnt/β-catenin, ומאפשר הגדרה רציפה של iPSCs דרך שלבי המזודרם, המזודרם הלבבי והקדמון של הקרדיומיוציטים. בתנאים אלו, התאים מתאספים באופן ספונטני למבנים תלת-ממדיים המכילים חללים, המבטאים סמנים קנוניים של קרדיומיוציטים. הקרדיואידים המתקבלים מספקים פלטפורמה ניתנת להרחבה וניסיונית להערכה מבוססת הדמיה של יעילות קליטת האוליגונוקלאוטידים, התומכת בפיתוח ואופטימיזציה של אסטרטגיות אספקה ליישומי לב.

מבוא

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים, בעיקר אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים (ASOs) ו-RNA מתערב קטן (siRNAs), מתפתחים במהירות כגישה טרנספורמטיבית וספציפית מאוד לטיפול במגוון רחב של מחלות, כולל מצבים תורשתיים ונרכשים ^1,2,3. מודאליות אלו מאפשרות ויסות ישיר של ביטוי גנים ברמת ה-mRNA באמצעות קישור ספציפי לרצף לטרנסקריפטים יעדיים, ומאפשרות שתיקון ההשתקה או החיתוך של גנים הקשורים למחלה שלרוב אינם ^נגישים לטיפולים קונבנציונליים של מולקולות ^קטנות. לפיכך, טיפולים גנטיים מבוססי אוליגונוקלאוטידים מספקים פלטפורמה גמישה למיקוד במנגנונים פתוגניים מגוונים במגוון תחומי מחלה, כולל מחלות לב וכלי^דם. עד כה, מספר תרופות מבוססות אוליגונוקלאוטידים, כולל ASOs, siRNAs וסוכני חיבור, אושרו לשימוש קליני⁷. למרות ההתקדמות הזו, היעילות הטיפולית שלהם הן בסביבות פרה-קליניות והן בסביבות קליניות נותרה מוגבלת בשל מתן תוך-תאי לא יעיל⁸. הערכות עדכניות מצביעות על כך שפחות מ-1% מהאוליגונוקלאוטידים הפנימיים בורחים מהאזורים האנדוזומליים כדי להגיע לציטוזול ולהפעיל את ה-RNA המטרה שלהם, ובכך מגבילים פעילות פונקציונלית ^9,10. מגבלה זו בולטת במיוחד ברקמת הלב, שם הספיגה והתנועה התוך-תאית אינם מובנים היטב.

היסטורית, הערכה פרה-קלינית של טיפולים קרדיווסקולריים התבססה במידה רבה על מודלים בעלי חיים, שנותרו חיוניים להערכת פרמקוקינטיקה, הפצה ביולוגית, יעילות ובטיחות בחיים החיים. עם זאת, הבדלים חשובים בין מינים בפיזיולוגיה לבבית, ויסות גנים ותגובות תאיות מגבילים לעיתים קרובות את יכולתם לחזות במדויק יעילות טיפולית ורעילות בבני אדם. מגבלות אלו דחפו את פיתוח מודלים מבוססי אדם במבחנה עם רלוונטיות פיזיולוגית משופרת. בין אלה, טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי האדם (iPSC) חוללה מהפכה במודלים של מחלות לב וכלי דם בכך שסיפקה מקור כמעט בלתי מוגבל לתאים שניתן להבדיל לקו קרדיווסקולרי. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושיים (iPSC-CMs) משחזרים רבות מהתכונות המולקולריות, המבניות והתפקודיות של שריר הלב האנושי והפכו לפלטפורמה מאומצת באופן נרחב לחקר מנגנוני מחלה, תגובות תרופתיות ושיטות טיפול מתפתחות¹¹. עם זאת, לתרבויות דו-ממדיות קונבנציונליות של iPSC-CMs אנושיים יש מגבלות חשובות. רוב פרוטוקולי ההתמיינות מייצרים קרדיומיוציטים הדומים לתאים עובריים ולא בוגרים, ומפגינים תכונות מבניות, אלקטרופיזיולוגיות, מטבוליות וכיווץ לא בשלות¹².

יתרה מזאת, תרביות חד-שכבתיות חסרות את ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית (3D), האינטראקציות הרב-תאיות והרכב המטריצות החוץ-תאיות המשפיעות על תפקוד הקרדיומיוציטים ב-vivo. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו מודלים לביים תלת-ממדיים מתקדמים יותר^{ויותר 13}. ביניהם, רקמות לב מהונדסות (EHTs), שנוצרות על ידי הטמעת iPSC-CMs בתוך פיגומי ביומטריה ויישום גירוי מכני וחשמלי, מקדמות בגרות מבנית ותפקודית תוך שיחזור קרוב יותר לסביבה הביומכנית של שריר הלב^{הטבעי 13}. למרות ש-EHTs מספקים פלטפורמות פיזיולוגיות רלוונטיות מאוד למידול מחלות ובדיקות תרופות, ייצורם דורש בדרך כלל מומחיות ביו-הנדסית מיוחדת וציוד ייעודי. בקצה השני של הספקטרום, פרוסות רקמת הלב אקס-ביבו שומרות בנאמנות רבה על ארכיטקטורת רקמה טבעית והרכב תאי אך תלויות בגישה לרקמת הלב הראשונית, יש להן יכולת מוגבלת בתרבית, ואינן ניתנות להרחבה בקלות.

לאחרונה, אורגנואידים לבביים הופיעו כמערכות מודל תלת-ממדיות נגישות שמסכמות היבטים מרכזיים של ארגון ותפקוד רקמת הלב¹⁴. קרדיואידים הם אורגנואידים לבביים מתאספים מעצמם, המורכבים בעיקר מקרדיומיוציטים שעוברים הגדרה פנימית, דפוסים מרחביים ומורפוגנזה ליצירת מבנים דמויי תא, המכילים חלל^15,16. שיטות ליצירת קרדיואידים מתבססות בדרך כלל על הפעלה ראשונית של איתות Wnt כדי לעורר מפרט מזודרם, ואחריה עיכוב נוסף לקידום מחויבות שושלת לבבית. קרדיואידים יכולים להיווצר בתרביות מתלה סטטיות או מעורבות, התומכות בייצור בקנה מידה ומגבירות את הארגון העצמי של הרקמות 15,16,17,18,19. אורגנואידים לבביים מורכבים יותר, רב-שושלתיים, הכוללים סוגי תאים אנדותליים, אפיקרדיאליים או סוגי תאים אחרים מגדילים את הרלוונטיות הפיזיולוגית אך דורשים פרוטוקולי התמיינות מורכבים יותר, תקופות תרבית ארוכות יותר, ואופטימיזציה נרחבת^13,14.

מוצג פרוטוקול פשוט, ניתן לשחזור ויעיל ליצירת קרדיואידים מבוססי קרדיומיוציטים מאורגנים עצמיים מ-iPSCs אנושיים וליישם להערכת קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית. הפרוטוקול צפוי להיות בעל ערך לחוקרים המעוניינים לאופטימיזציה של כימיה ואסטרטגיות העברת אוליגונוקלאוטידים ליישומים קרדיווסקולריים. כל החומרים בהם השתמשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

פרוטוקול

1. תרבות והכנה של iPSCs להבחנה

אזהרה: יש לבצע טיפול פתוח בתאים ובמדיה בארון בטיחות ביולוגית מוסמך מסוג Class II. לבש חלוק מעבדה וכפפות. חטא משטחי עבודה ופסולת נוזלית עם חומר חיטוי מתאים.

1. תשמור על iPSCs.
   1. לוחות תרבית ציפוי עם מטריצת ממברנה-בסיס מתאימה לפי הוראות היצרן.
   2. הזן את iPSCs במדיום תאי גזע פלוריפוטנטי מוגדר, ללא הזנה, והחלף את המדיום כל 24 שעות.
   3. שמרו תרביות מתחת למתחם יתר ותאי מעבר כאשר הם מגיעים ל-70–80% מפגש תמים.
      הערה: ודאו ש-iPSCs שומרים על מורפולוגיה איכותית, לא מובחנת, ומאושרים כנקיים ממיקופלסמה לפני תחילת התמיינות.
2. מעבר לפני התמיינות.
   1. הפשיר את ה-iPSC והרחבת תאים לפחות לשני מעברים לפני תחילת התמיינות לבבית.
   2. תאי מעבר המשתמשים בשיטת דיסוציאציה ללא אנזימים, PBS-EDTA, התואמת לתחזוקת iPSC.
      נקודת הפסקה: שמור על iPSCs בתרבות עד שהם מגיעים ל-70–80% מפגש ולשמור על מורפולוגיה טיפוסית ללא סימני התמיינות ספונטנית.

2. הכנת אגרגטים של iPSC בלוחות מיקרווול

1. הפרדת iPSCs למתלה חד-תאים.
   1. שואף מדיום ושוטף תאים פעם אחת עם 1 מ"ל של 1× PBS.
   2. הוסיפו תמיסת ניתוק תאים (אקווטאז) ב-500 מיקרו-ליטר לבאר של לוח עם 6 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–7 דקות.
   3. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום כביסה לכל באר, ותלו בעדינות ליצירת מתלה חד-תא.
   4. העבר את המתלה לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. שאיבת הסופרנטנט והשתה מחדש את כדור התא במדיום iPSC ללא הזנה בתוספת מעכב ROCK (10 מיקרומול אחרונים).
      הערה: כוונו את זמן הדגירה של הדיסוציאציה לכל קו iPSC על ידי בדיקת ניתוק ב-5 דקות והארכה בקצבים קצרים במידת הצורך.
2. ספרו תאים והכינו את צפיפות הציפוי.
   1. ספירת תאים ברי קיימא באמצעות שיטת ספירת תאים סטנדרטית.
   2. הכינו מתלה חד-תאי ב-0.9 × 10⁶ תאים/מ"ל לכל באר של לוח אגרגציה מיקרובאר של 800 מיקרון (פורמט 24 בארות, ~300 מיקרובארות לבאר).
      הערה: אופטימיזציה של מספר התאים לכל באר, שכן גודל המצטברות או יעילות ההתמיינות משתנים בין קווי iPSC.
3. פריימר את צלחת המיקרווול והסר בועות.
   1. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום iPSC ללא הזנה המכיל מעכב ROCK (10 מיקרומטר אחרונים) לכל באר.
   2. צנטריפוגה את לוח המיקרווול ב-300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות אוויר מהמיקרובארות.
      קריטי: הסר את כל הבועות לחלוטין כדי לאפשר הצטברות תאים אחידה בתחתית כל מיקרובאר ולתמוך ביצירת אגרגט יעילה.
4. זרע iPSCs למיקרובארות.
   1. הוסף 1.0 מ"ל מהמתלה החד-תאית המוכן (0.9 × 10⁶ תאים/מ"ל) לכל באר, המקביל ל-0.9 × 10⁶ תאים לכל באר.
   2. תליית בעדינות בתוך הבאר 3–5 פעמים באמצעות P1000 והימנע מהכנסת בועות אוויר.
   3. צנטריפוגה את הפלטה בעוצמה של 200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכניס תאים למיקרובארות.
   4. יש לוודא תחת מיקרוסקופ שהתאים התיישבו במיקרובארות לפני שמניחים את הלוח בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 24 שעות.
      קריטי: טפל בפלטה בזהירות אחרי הצנטריפוגה. אין לערבב או לנער את הצלחת, כי זה עלול לגרום לתאים להתרומם מהמיקרובארות.

3. התרחבות של אגרגטים של iPSC במיקרובארות

1. שאפו בזהירות והחליפו את המדיום מבלי להפריע או לשחרר את האגרגטים.
   1. הטית את הפלטה ושאיבה לאט כ-1.0 מ"ל מדיום מכל באר באמצעות פיפטת P1000, כדי להבטיח שהאגרגטים יישארו יושבים במיקרו-בארות.
   2. שאופים לאט את ~500 מיקרוליטר המדיום הנותרים באמצעות פיפטת P1000.
   3. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום iPSC ללא הזנה לכל באר על ידי הזרקה איטית לאורך צדי הבאר באמצעות פיפטה סרולוגית.
   4. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ וחזרו על החלפת המדיום מדי יום.
      קריטי: שפוך מדיום על קיר הבאר והימנע מזרימה ישירה על אגרגטים.

4. התמיינות קרדיאלית של אגרגצי iPSC (יום 0 עד יום 12)

1. השראת מזודרם (יום 0).
   1. הסר את המדיום באמצעות שיטת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
   2. הוסף 1.5 מ"ל לבאר של מדיום בסיסי בתוספת 2% B27 פחות אינסולין ומפעיל מסלול Wnt/β-catenin (CHIR99021, ריכוז סופי: 11 מיקרומון).
      הערה: יש להכין תמיסה של 10 מ"מ של CHIR99021, מעכב מולקולות קטנות של גליקוגן סינתאז קינאז-3 (GSK-3). כדי להגיע לריכוז סופי של 11 מיקרומון, מוסיפים 1.65 מיקרוליטר מהתמיסה המקורית ל-1.5 מ"ל של מדיום.
2. שינוי בינוני לאחר ההשראה (יום 1).
   1. ב-24 שעות לאחר הוספת CHIR99021, שאבו בעדינות את המדיום מכל באר.
   2. הוסף 1.5 מ"ל לבאר של מדיום בסיסי טרי עם תוספת של 2% B27 פחות אינסולין, ואז דגר במשך 48 שעות.
      קריטי: יש להקפיד על תזמון שלבי המודולציה של Wnt, שכן סטיות עלולות לפגוע ביעילות הדיפרנציאציה.
      הערה: צפוי מוות תאי מסוים לאחר חשיפה למפעיל מסלול Wnt/β-catenin. אם נצפה אובדן מצטבר נרחב, שקול להפחית את ריכוז המפעיל בניסויים עתידיים.
3. מחויבות לבבית באמצעות עיכוב WNT (יום 3).
   1. הכינו מדיום מותאם על ידי העברת 760 מיקרו-ליטר של מדיום משומש מכל באר לצינור קוני סטרילי של 50 מ"ל.
   2. לכל באר, הוסף 760 מיקרוליטר של מדיום בסיסי טרי עם 2% B27 פחות אינסולין לצינור המכיל את המדיום המאוחסן, וערבב בעדינות.
   3. הוסף את מעכב מסלול ה-Wnt, IWP4, למדיום המעורבב לריכוז סופי של 5 מיקרומטר והפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים לערבוב.
   4. שאבו בזהירות את המדיום הנותר מכל באר, ואז הוסיפו 1.5 מ"ל לכל באר של מדיום מותאם בתוספת IWP4.
   5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
      הערה: הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"מ של מעכב מסלול ה-Wnt IWP4. כדי להגיע לריכוז סופי של 5 מיקרומון, הוסף 7.6 מיקרוליטר של תמיסת המלאי לכל 1.52 מ"ל מדיום כולל (760 מיקרוליטר מדיום מותאם + 760 מיקרוליטר מדיום בסיסי טרי) לכל באר.
4. שינוי בינוני במיקרובארות (יום 5).
   1. החלפת המדיום באמצעות גישת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
   2. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום בסיסי בתוספת 2% B27 פחות אינסולין לכל באר, ואז דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
5. העברת אגרגטים ממיקרובארות ללוחות בעלי 6 בארות (יום 7).
   1. שאפו בזהירות את המדיום מכל באר באמצעות שיטת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
   2. הוסף 1.0 מ"ל מדיום בסיסי עם תוספת של 2% B27 ואינסולין לכל באר בלוח המיקרווול. באמצעות פיפטת P1000, הפיפטה בעדינות על המדיום למעלה ולמטה חמש פעמים תוך הזזת קצה הפיפטה בתנועה מעגלית על פני הבאר כדי לשחרר את האגרגטים במיקרובארות ולהעביר אותם לתלייה.
   3. העבר את תליית האגרגט לבאר אחת של לוח תרבית לא מטופל עם 6 בארות.
   4. שטפו כל באר מלוח המיקרווול עם עוד 1.0 מ"ל מדיום טרי פעמיים עד שלוש כדי לשחזר את שאר החומרים המצטברים, והעבירו כל שטיפה לאותו באר של צלחת 6 הבארות.
   5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 72 שעות.
      הערה: נוכחות של תאים מתים ופסולת תאית לאחר העברת האגרגט צפויה. רוב הפסולת תוסר במהלך שינוי המדיה הבא.
6. שינוי בינוני במהלך תרבות ההשעיה (יום 10).
   1. ערבב בעדינות את הפלטה כדי לשחרר כל אגרגט שמחובר ברפיון.
   2. הטה את הלוח כדי לאפשר לאגרגטים לשקוע בתחתית הבאר באמצעות כוח הכבידה.
   3. שאפו בזהירות את המדיום המשומש מבלי להפריע או לשאוף את האגרגטים.
   4. הוסיפו 2.0 מ"ל מדיום בסיסי טרי בתוספת 2% B27 עם אינסולין לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 48–72 שעות.
      הערה: מכות ספונטניות נצפות בדרך כלל מהיום העשירי ואילך.
      נקודת הפסקה: ניתן לשמור על קרדיואידים מכה בתרבות השעיה לתקופת הבשלה ממושכת על ידי החלפת המדיום כל 2–3 ימים.

5. אפיון מיקרוסקופי של קרדיואידים

הערה: שיטה זו מספקת תהליך עבודה לאפיון היסטולוגי של קרדיואידים באמצעות קריוסקטים. החתכים המתקבלים יכולים לשמש למגוון ניתוחים היסטולוגיים, כולל צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) להערכת ארכיטקטורת הרקמה הכוללת וסימון אימונופלואורסצנציה להערכת זהות הקרדיומיוציטים.

1. קיבוע וכריתת קריו-סקציה.
   1. תקן קרדיואידים ב-4% פאראפורמלדהיד בלילה בטמפרטורה של 4°C.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד רעיל וסביר להניח שהוא מסרטן; לטפל בו עם קפוצ'ון אדים כימי תוך כדי לבישת ציוד מגן אישי מתאים. אסוף את כל הפסולת המכילה פאראפורמלדהיד (קיבוע ושטיפה) במיכל מסומן בבירור לפסולת אלדהיד/כימית מסוכנת, והשליך אותה בהתאם לנהלים מוסדיים לפסולת מסוכנת.
      בטיחות: בצע את כל הקיבוע והטיפול בפרפורמלדהיד בתוך מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
   2. שטפו שלוש פעמים עם PBS וקריופרוטקט את הקרדיואידים הקבועים בסוכרוז של 30% (בלי צילום) ב-PBS בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. הטמיעו את הקרדיואידים בג'לטין, הקפיאו וחתכו חתכי קריוסקט בעובי 10 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ. אחסן את החלקים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. תיוג חיסוני.
   1. הפשיר את החלקים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את החלקים ב-PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, פעמיים.
   3. הקיפו את אזור העניין בכל שקופית עם עט הידרופובי כדי ליצור באר ששומרת את חסימת החומרים ותמיסות הנוגדנים.
   4. הידרציה מחדש של החתכים למשך 2–3 דקות בבופר חדירות (PB; PBS המכיל 0.1% Tween-20) בצנצנת קופלין.
   5. הסר את המגלשות מ-PB, נקז את התמיסה העודפת, והניח את המגלשות בתא לח.
      קריטי: מהנקודה הזו ואילך, חשוב לא לתת לחלקים להתייבש.
   6. חסמו את החתכים עם 200–300 מיקרוליטר של PB המכילים 5% סרום בקר עוברי (FBS) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
   7. הסר את תמיסת החסימה ודגר את החלקים ללילה בטמפרטורה של 4°C עם 100 מיקרוליטר נוגדן ראשוני (anti-cMYBP-C; 1:50) מדולל בתמיסת חסימה (PB המכיל 1% FBS).
   8. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PB ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני ירוק פלואורסצנטי לעכבר (1:200), פאלואידין פלואורסצנטי אדום רחוק (1:400) ו-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל).
   9. שטוף שלוש פעמים ב-PB והתקן עם מדיום הרכבה נגד פייד.
      אזהרה: אסוף את כל התמיסות המכילות צבע פלואורסצנטי (נוגדנים משניים, פאלואידין, תמיסות צביעה DAPI והשטיפות המתאימות) במיכל והפנות אותן כפסולת כימית בהתאם להנחיות המוסדיות.
3. רכישת תמונה.
   1. לרכוש תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד בגלאי מערך להדמיה ברזולוציה על, באמצעות אובייקטיב טבילה בשמן 10× ו-63×/1.40.
   2. עוררו את הפלואורופור האדום הרחוק, הפלואורופור הירוק והצבע הגרעיני באמצעות קווי לייזר של 639 ננומטר, 488 ננומטר ו-405 ננומטר בשידור לייזר של 4.0%, 4.0% ו-1.0%, בהתאמה.
   3. לרכוש קטעים אופטיים בודדים בגודל פיקסל של 0.0353 × 0.0353 מיקרו^מ"ר, סריקה חד-כיוונית, מהירות סריקה 6, זום 1.7, ממוצע קו 1, וזמן שהייה של פיקסלים של 0.935 מיקרושניות לפיקסל.
   4. החלו עיבוד תמונה ברזולוציה על-גבוהה של גלאי מערך באמצעות סינון וינר אוטומטי.

6. בדיקת קליטה של אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים

1. הכינו תמיסה מלאית של האוליגונוקלאוטיד המסומן בפלואורסצנטית, המחובר לחומצה פלמיטית כדי להגדיל את הליפופיליות.
   1. לשחזר את האוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטי במים נטולי נוקלאז לריכוז סופי של 1 מ"מ. מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף את התמיסה בתחתית הצינור.
   2. הכינו אליקוטים חד-פעמיים של תמיסת המלאי של 1 mM ואחסנו בטמפרטורה של −20°C מוגנים מאור.
   3. ביום הניסוי, מוסיפים 1 מיקרוליטר מהמאגר של 1 מ"מ ל-1 מ"ל של מדיום תרבית קרדיואידים כדי לקבל ריכוז אוליגונוקלאוטיד סופי של 1 מיקרומון. מערבבים על ידי ערבוב עדין של לוח.
2. דגרו קרדיואידים עם האוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטית (ריכוז סופי של 1 מיקרומול) במדיום ללא סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 24 שעות.
3. שטפו את הקרדיואידים שלוש פעמים עם מי מלח עם בופר פוספט (PBS) להסרת אוליגונוקלאוטידים חוץ-תאיים.
4. קיבעו את הקרדיואידים ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו שלוש פעמים עם PBS, והמשיכו עם סימון פלואורסצנטי לפני ההדמיה.
5. דגרו קרדיואידים קבועים שלמים ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור, ב-PBS המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל אגלוטינין של נבט חיטה (WGA) בשילוב עם פלואורופור ירוק ו-1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI. שטוף שלוש פעמים ב-PBS והתקן עם מדיום הרכבה נגד פייד.
   אזהרה: אספו את כל המדיום והשטיפות המכילים אוליגונוקלאוטידים וצבע פלואורסצנטי, כולל מדיום הדגירה המסומן של אוליגונוקלאוטידים משלב 6.2 ותמיסת הצביעה WGA/DAPI, במיכל נפרד והשליכו אותם כפסולת כימית/ביולוגית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות.
6. לרכוש תמונות קונפוקליות של קליטת והפצת אוליגונוקלאוטידים.
   1. לצלם תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר המצויד בגלאי מערך להדמיה ברזולוציה על-גבוהה ומטרה של טבילה במים ב-40×. רכוש תמונות כערימות z בנות 8 חתכים עם גודל z-step של 2 מיקרון, המכסים עומק כולל של 16 מיקרון.
   2. עוררו את הכתם הגרעיני, סמן הממברנה והאוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטית באדום רחוק באמצעות קווי לייזר של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-639 ננומטר בשידור לייזר של 0.9%, 0.2% ו-3.0% בהתאמה.
   3. רכוש תמונות בגודל ווקסל 0.0449 × 0.0449 × 2 מיקרומטר³, סריקה דו-כיוונית, מהירות סריקה 5, ממוצע קו 1, וזמן שהייה פיקסל של 1.51 מיקרושניות לפיקסל. יישם עיבוד תמונות Airyscan/סופר-רזולוציה באמצעות סינון Wiener אוטומטי.
   4. שמרו על כל הגדרות הרכישה (עוצמת לייזר, רווח גלאי, z-step וגודל ווקסלים) קבועות בכל מיקומי ה-z ובכל הדגימות כדי לאפשר השוואה תקפה של אות האוליגונוקלאוטידים בין תנאים.

תוצאות

איור 1 מסכם את תהליך ההתמיינות וממחיש את השינויים המורפולוגיים האופייניים הצפויים בכל שלב של הפרוטוקול, מהצטברות iPSC ועד ליצירת קרדיואידים מאורגנים עצמיים. אגרגציה מבוססת מיקרובאר על בסיס תלייה מספקת גישה פשוטה וסטנדרטית ליצירת מספר רב של קרדיואידים מבוקרי גודל. הבחנה מוצלחת מאופיינת ביצירת אגרגטים בגודל אחיד, ואחריהם התפתחות חללים פנימיים ותחילת הכאה ספונטנית, בדרך כלל החל מהיום העשירי ואילך. ביחד, תכונות מורפולוגיות אלו מספקות נקודות ביקורת מעשיות לבקרת איכות להערכת היעילות והשחזוריות של יצירת קרדיואידים.

ניתן להעריך את ארכיטקטורת הקרדיואידים וארגון הרקמות באמצעות ניתוח היסטולוגי של קריוסקציאציה. כפי שמוצג באיור 2, צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של קרדיואידים שהתמיינו בהצלחה מגלה רקמות תלת-ממדיות מאורגנות היטב המכילות חלל פנימי אחד או יותר מוקפים בשכבות תאיות קומפקטיות, בהתאם לארגון דמוי תא. קרדיואידים מוצלחים בדרך כלל אינם מציגים אזורים נקרוטיים ועם פיצול מבני מינימלי. לעומת זאת, התמיינויות תת-אופטימליות לעיתים קרובות מייצרות מבנים לא סדירים או קרסים ללא חללים נראים לעין, מה שמעיד על פגיעה בארגון עצמי של הרקמה.

ניתן להעריך את התמיינות הקרדיומיוציטים על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה של כריו-חתך. כפי שמודגם באיור 3A–B, קרדיואידים מוצלחים מציגים ביטוי נרחב של הסמן הסרקומירי cMYBP-C, המאורגן לפסים מחזוריים ומסודרים מאוד, האופייניים לסרקומרים. מבנים מפוספסים אלו מפוזרים באופן רחב ברקמה ולעיתים קרובות מיושרים לאורך הציר האורכי של הקרדיומיוציטים, המשקפים התמיינות לבבית יעילה. לעומת זאת, קרדיואידים תת-אופטימליים מציגים צביעות סרקומריות חלשות, כתומות או מוגבלות אזורית, לעיתים קרובות מוגבלות לאזורים פריפריאליים, עם אזורים נרחבים ללא אות שניתן לזיהוי, מה שמעיד על התמיינות לא יעילה של הקרדיומיוציטים.

קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ניתנת להערכה באמצעות הדמיה של תאים חיים או מיקרוסקופיה קונפוקלית של קרדיואידים קבועים. כפי שמוצג באיור 4, קליטה מוצלחת מאופיינת בפלואורסצנציה תוך-תאית המזוהה עם אוליגונוקלאוטידים, המפוזרת כפנקטה בדידה, בהתאם למיקום אנדוסומלי. WGA מפרט את ממברנות התאים ו-DAPI נגד גרעיני צבעים, ומאפשר אישור מיקום אוליגונוקלאוטידים תוך-תאי. בנוסף למתן ויזואליזציה איכותית של קליטת האוליגונוקלאוטידים, ניתן להשתמש בערימות התמונות שנרכשו לניתוחים כמותיים, כולל עוצמת פלואורסצנציה לכל נקודה פנקטום, מספר פונקטה לתא, ואחוז התאים החיוביים לאוליגונוקלאוטידים. כפי שמוצג באיור 5A–C, הדמות ב-Z-stack מאפשרת הערכה נוספת של התפלגות האוליגונוקלאוטידים ברקמה התלת-ממדית, כאשר זוהה פלואורסצנציה על פני מספר חתכים אופטיים המתפרסים מהמשטח אל פנים הקרדיואיד, מה שמעיד על חדירה יעילה של הרקמה.

איור 1: זרימת עבודה ליצירת קרדיואידים אנושיים שמקורם ב-iPSC. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי האדם (iPSCs) מצטברים בלוחות מיקרווול (Day−2) ועוברים התמיינות לבבית מכוונת באמצעות מודולציה זמנית של איתות Wnt. השראת המזודרם מתחילה ביום 0 על ידי טיפול במפעיל מסלול ה-Wnt CHIR99021 בתווך בסיסי עם תוספת B27 ללא אינסולין, ולאחר מכן הסרת המפעיל ביום הראשון. בדיקת הלב מושרה ביום השלישי על ידי טיפול במעכב מסלול ה-Wnt IWP4, שמוסר ביום החמישי. ביום השביעי, האגרגטים מועברים ללוחות בעלי 6 בארות ומתוחזקים במדיום בסיסי עם תוספת אינסולין של B27. עד היום ה-14, קרדיואידים מאורגנים עצמיים מתבססים ומתאימים ליישומים במורד הזרם, כולל בדיקות קליטה של אוליגונוקלאוטידים. תמונה זו נוצרה על ידי המחברים באמצעות Biorender, ורישיון זכויות היוצרים הנדרש מצורף. תמונות בירות-שדה מייצגות שצולמו בנקודות הזמן המצוינות ממחישות את ההתקדמות המורפולוגית הצפויה מאגרגטים iPSC בגודל אחיד לקרדיואידים מאורגנים מקוטביים. פס קנה מידה = 500 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון היסטולוגי של קרדיואידים שמקורם ב-iPSC אנושי. חתכים קריוציונליים ייצוגיים עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) של קרדיואידים ביום 14 המראים חללים פנימיים מוקפים בשכבות תא קומפקטיות, בהתאם לארגון רקמות דמויי תא. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ הדמיה. כימות תוצאות התמיינות הראה כי 94.0 ±-2.6% מהקרדיואידים הראו פעימות ספונטניות ו-60.3 ±-20.6% הכילו עששת פנימית גלויה אחת או יותר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש הבדלות עצמאיות, כאשר כ-115 קרדיואידים נותחו בכל התמיינות. פס קנה מידה = 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

איור 3: אפיון אימונופלואורסצנציה של התמיינות קרדיומיוציטים. כריחות קריוסקטיביות מייצגות של קרדיואידים ביום 14. (א) צביעת DAPI המראה את התפלגות גרעיני התא. (B) תמונת אימונופלואורסצנציה המציגה גרעינים המסומנים ב-DAPI (כחול) וסרקומרים המסומנים בנוגדן נגד חלבון C הקשור למיוזין הלב (cMYBP-C, ירוק), המדגים מבנים סרקומריים מאורגנים בקרדיומיוציטים מופרדים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי סורק בלייזר באמצעות אובייקטיב יבש 10×/0.30 (משמאל) ומטרת טבילה בשמן של 63×/1.40 (מימין). פסי קנה מידה = 10 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיית קליטת אוליגונוקלאוטידים על ידי קרדיואידים. תמונות קונפוקליות המציגות את המיקום התוך-תאי של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים מסומנים פלואורסצנטית (ASOs, צהוב) בקרדיואידים של יום 14. ממברנות התא מסומנות באגלוטינין של חיטה פלואורסצנטית (WGA, מג'נטה), והגרעינים מוצבעים ב-DAPI (כחול). פלואורסצנציה הקשורה ל-ASO מזוהה כפנקטות תוך-תאיות בדידות (חצים). הפאנלים התחתונים מראים קרדיואידים שליליים בשליטה שלא הוטמעו עם זרמי פלואורסצנטיים (ANO). תמונות בפאנלים הימניים מתאימות לתצוגות בהגדלה גבוהה יותר של האזורים המרוגזים בפאנלים השמאליים. תמונות מייצגות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר עם הדמיה ברזולוציה על-גבוהה של גלאי מערך, תוך שימוש באובייקט טבילה במים בעומק של 40×. פסי סולם = 10 מיקרון (שמאל) ו-5 מיקרון (ימין). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: הערכת חדירת אוליגונוקלאוטידים ברחבי הקרדיואידים. (א) סכמטי המדגים את רכישת חתכים אופטיים בעומקים הולכים וגדלים בתוך הקרדיואיד. תמונה זו נוצרה על ידי המחברים באמצעות Biorender, ורישיון זכויות היוצרים הנדרש מצורף. (B) תמונות קונפוקליות מייצגות המציגות את התפלגות ה-ASO המסומנים פלואורסצנטית במיקומי z של 0 מיקרון, 6 מיקרון ו-10 מיקרון ביחס לפני הרקמה. הגדרות ההדמיה נשמרו קבועות בכל עמדות ה-z. פס סולם = 10 מיקרון. (C) כימות אחוז התאים המכילים לפחות אות נקר אחד הקשור ל-ASO בכל עומק הדמיה הראה ספיגת אוליגונוקלאוטידים דומה בכל הרקמה, עם 83.1 ± 2.5%, 84.9 ± 4.5% ו-84.0 ± 4.5% תאים חיוביים ל-ASO ב-0 מיקרון, 6 מיקרון ו-10 מיקרון, בהתאמה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה קרדיואידים, עם שלושה חתכים אופטיים שנותחו לכל קרדיואיד וסך הכל 1,305 תאים כמותיים. תמונות מייצגות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר עם הדמיה ברזולוציה על-גבוהה של גלאי מערך, תוך שימוש באובייקט טבילה במים בעומק של 40×. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

וידאו 1: רצף טיים-לאפס. וידאו שצולם בקצב של 40 פריימים לשנייה מדגים פעילות כיווץ ספונטנית בקרדיואידים. הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ רחב-שדה המצויד במצלמת sCMOS. אנא לחצו כאן להורדת הסרטון הזה.

דיון

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים הפכו לקטגוריה חזקה של שיטות מיקוד גנטיות, הנתמכות בעשורים של התקדמות בכימיה של אוליגונוקלאוטידים ששיפרו את הספציפיות של המטרה, יציבות מטבולית וסבילות אימונוגנית ^7,8. למרות מספר הולך וגדל של טיפולי RNA מאושרים קלינית, היישום הרחב יותר שלהם מוגבל בשל אספקה תוך-תאית לא יעילה ^7,8. בשל גודלם, מטעןם והידרופיליותם, אוליגונוקלאוטידים אינם יכולים להתפשט באופן פסיבי דרך ממברנת הפלזמה ובמקום זאת הם מופנמים דרך מסלולי אנדוציטיים ^9,10. לאחר הקליטה, רוב מוחלט (~99%) של האוליגונוקלאוטידים הפנימיים נשארים סגורים בתוך תאים אנדוסומליים ^9,10. התנועה האנדוזומלית מתבצעת בתהליך הבשלה מאנדוזומים מוקדמים למאוחרים ולבסוף מליזוזומים; עם זאת, האזורים המדויקים מהם אוליגונוקלאוטידים בורחים לציטוזול עדיין אינם מובנים במלואם ועשויים לכלול אוכלוסיות אנדוזומליות מרובות⁹. שחרור ציטוזולי מוגבל זה מהווה מחסום קריטי להגבלת קצב הקצב ומדגישה את הצורך במערכות ניסוי פיזיולוגיות רלוונטיות המאפשרות הערכה כמותית של קליטת אוליגונוקלאוטידים, תנועה תוך-תאית ובריחה אנדוזומלית²⁰.

הפרוטוקול המתואר כאן פותח כדי לענות על צורך זה על ידי שילוב קרדיואידים שמקורם ב-iPSC אנושי עם קריאות מבוססות הדמיה של קליטת אוליגונוקלאוטידים. החוסן של מערכת זו נשען על מספר שלבים קריטיים המשפיעים ישירות על השחזוריות והתוצאות הניסיוניות. ראשית, איכות התרביות ההתחלתיות של iPSC היא גורם מרכזי להבחנה מוצלחת של הבדלה לבבית. המחברים ממליצים על ניתוח קריוטיפ תקופתי כדי להבטיח יציבות גנומית ארוכת טווח והערכה שגרתית של מורפולוגיה, שלמות ודינמיקת הצמיחה של המושבות. תרביות איכותיות מאופיינות במושבות קומפקטיות ומוגדרות היטב עם גבולות חלקים, הבחנה ספונטנית מינימלית והתרבות עקבית. תרביות המציגות קצוות מושבות לא סדירים, מורפולוגיית תאים הטרוגנית או אזורי התמיינות צריכות להיזרק ולהחליפן במאגרים קפואים בעלי מעבר נמוך לפני תחילת התמיינות.

שלב קריטי שני הוא היווצרות מבוקרת של אגרגטים iPSC באמצעות לוחות מיקרווול, המעודדים יצירת מבנים תלת-ממדיים אחידים ומוגדרי גודל, החיוניים להבדלה לבבית שניתנת לשחזור²¹. אגרגציה מבוססת מיקרובאר יוצרת גופים עובריים בקוטר מוגדר (אופטימלי 200–230 מיקרון), ובכך מאחדת אינטראקציות תא-תא וחשיפה לגרדיאנטים מורפוגנים במהלך מודולציה זמנית של איתות Wnt. מניסיוננו, גודל זה מושג בעקביות על ידי זריעה של כ-3,000 תאים לכל מיקרובאר בודדת (שלב 2.2), מצב שאופטימיזציה ואומת אמפירית על פני קווי iPSC אנושיים רבים, כולל קווים מסחריים זמינים וקווים שתכנתו מחדש בתוך החברה. עם זאת, מכיוון ששיעורי התרבות iPSC יכולים להשתנות, צפיפות הזריעה האופטימלית עשויה לדרוש התאמה לשמירה על גודל האגרגט הרצוי. כישלון בשליטה בפרמטרים אלו עלול להוביל למבנים הטרוגניים, ירידה בחיוניות ופגיעה ביעילות ההתמיינות.

ניתוח היסטולוגי, כפי שמוצג באיור 2, מספק הערכת בקרת איכות נוחה של היווצרות קרדיואידים. בפרט, היעדר חללים פנימיים או נוכחות של מבנים קרסו או מפורקים עשויים להעיד על יצירת אגרגט לא אופטימלית או שליטה זמנית לא מספקת באיתות Wnt במהלך שלבי ההתמיינות (שלבים 4.1–4.3). בכמה התמיינויות לא מוצלחות, אוכלוסיות תאים לא מכווצות מתפתחות בתוך או סביב הקרדיואידים. תאים אלו בדרך כלל נראים צהבהבים במיקרוסקופ שדה בהיר ונוטים להיצמד ללוחות תרבית עם חיבור נמוך, בעוד שקרדיואידים עשירים בקרדיומיוציטים בדרך כלל אפורים, נשארים כמבנים תלת-ממדיים קומפקטיים, ואינם מתחברים בקלות. אם חלק משמעותי מהאגרגטים מציג פנוטיפ דבק ולא-כיווצי זה, יש לראות את ההבדלה כלא אופטימלית. במקרה כזה, יש להתחיל בבדיקת מורפולוגיית מושבות iPSC לפני ההתמיינות, באישור גודל המצטבר בין יום −1 ליום 0, ואם יש צורך, אופטימיזציה מחדש של צפיפות הזריעה וריכוזי CHIR99021 ו-IWP4 עבור קו iPSC הספציפי.

הכאה ספונטנית נמוכה או חסרה ביום 10–12 בדרך כלל משקפת השראה לא יעילה של המזודרם או מפרט לבבי, לרוב כתוצאה מריכוז או תזמון לא מתאים של מודולטור ה-Wnt, או ממוות תאים מופרז לאחר טיפול CHIR99021 (שלב 4.2). מניסיוננו, טיטרציה של CHIR99021 בטווח של 9–13 מיקרומולר לכל קו iPSC ואימות ריכוז ופעילות תמיסות המלאי יכולים לשפר משמעותית את יעילות ההבדלה. ניתוח אימונופלואורסצנציה של ארגון חלבונים סרקומריים, כפי שמוצג באיור 3, מספק הערכת בקרת איכות נוחה של התמיילות קרדיומיוציטים. צביעת חלבון סרקומרי חלשה או כתומה, במיוחד כאשר היא מוגבלת לאזורים היקפיים של הקרדיואיד, בדרך כלל מצביעה על התמיינות לא שלמה או הטרוגנית של הקרדיומיוציטים. במקרים אלו, מומלץ להאריך את תקופת הבשלת תרבית ההשעיה (שלב 4.6 ונקודת הפסקה) לפני הקיבוע ולוודא תנאי קיבוע וצביעת נוגדנים.

בעוד שמודל קרדיואיד זה מספק מיקרו-סביבה תלת-ממדית של הלב האנושי המשפרת משמעותית את תרביות הקרדיומיוציטים הדו-ממדיות המסורתיות, הוא אינו מסכם במלואו את המורכבות של לב האדם הבוגר. קרדיואידים מייצגים שלב מוקדם בהתפתחות הלב האנושי, כאשר הקרדיומיוציטים שומרים על פנוטיפ לא בוגר דמוי עובר¹⁴. יתרה מזאת, הרקמות חסרות פרפוזיה וסקולרית, עצבוב, תאי חיסון תושבים והארכיטקטורה המלאה של שריר הלב הבוגר. לכן, למרות שפלטפורמה זו מתאימה לחקר קליטה תאית ותפוצה תוך-תאית של אוליגונוקלאוטידים בתנאי ניסוי מבוקרים, יש לנקוט זהירות בעת הסקת קינטיקת קליטה ומנגנוני העברה ישירות לסביבה ה-in vivo . שילוב עתידי של סוגי תאי לב נוספים, רשתות כלי דם ואסטרטגיות הבשלה של רקמות אמור לשפר עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של פלטפורמה זו.

הערכה אמינה של קליטת האוליגונוקלאוטידים על ידי הקרדיואידים המתוארים בפרוטוקול זה דורשת אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של ריכוז ASO, זמן הדגירה והגדרות רכישת הדמיה, כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5. בחירת הפלואורופור חשובה במיוחד, שכן צבעים שונים בבהירות, ביציבות האור וברגישות להשפעות סביבתיות. במחקר זה השתמשנו ב-Janelia Fluor 646 (JF646)²², פלואורופור סיליקון-רודמין אדום רחוק עם בהירות גבוהה ויציבות פוטו-יציבות, המספק זיהוי אותות חזק תוך מזעור אוטופלואורסצנציה של רקמות בדגימות תלת-ממדיות. תכונות אלו הופכות אותו למתאים להדמיית קליטת אוליגונוקלאוטידים בקרדיואידים חיים או קבועים. ראוי לציין כי הצמידי הפלואורופורים יכול להשפיע על התנהגות האוליגונוקלאוטידים, כולל קליטה וסחר בהם, ולכן יש לאמת אותו עבור כל מערכת ניסויית.

בצורתו הנוכחית, פרוטוקול זה מספק הערכה איכותנית וכמותית של קליטת אוליגונוקלאוטידים. הדמיה קונפוקלית של פונקטות תוך-תאיות הקשורות ל-ASO מאפשרת ויזואליזציה של מיקום האוליגונוקלאוטידים בתוך קרדיואידים, בעוד שיעילות הקליטה נמדדת על ידי קביעת אחוז התאים החיוביים ל-ASO באמצעות תוסף Cell Counter בפיג'י/ImageJ. למרות שגישה זו מתאימה היטב לניתוחים בעלי תפוקה בינונית המוצגים כאן, ניתוח תמונות ידני דורש עבודה רבה ועלול להיות חשוף להטיית צופה, במיוחד כאשר הוא מיושם על מערכי נתונים גדולים. התקדמות אחרונה בלמידה עמוקה בפיקוח עצמי למיקרוסקופיה תלת-ממדית מציעה הזדמנויות מבטיחות להתגבר על מגבלות אלו. ניתוח תמונה מבוסס בינה מלאכותית יכול לקטע, לזהות ולעקוב במדויק אחר מבנים תת-תאיים הטרוגניים בסביבות תלת-ממדיות מורכבות, ומאפשר כימות אוטומטי של קליטת אוליגונוקלאוטידים ותנועה תוך-תאית, כולל דינמיקה אנדוזומלית²³. שילוב גישות אלו ביישומים עתידיים של הפרוטוקול אמור לשפר את קצב התפוקה, השחזור והדיוק האנליטי.

בהסתכלות קדימה, השילוב של קרדיואידים שמקורם ב-iPSC אנושי עם דימות כמותי, ניתוח תמונות מבוסס למידת מכונה ומתודולוגיות של חלקיק יחיד מציע מסגרת עוצמתית לחקירת המנגנונים השולטים בהעברת אוליגונוקלאוטידים ברקמת הלב האנושית. שילוב מודלים תלת-ממדיים תלת-ממדיים רלוונטיים פיזיולוגית עם כלים אנליטיים מתקדמים המסוגלים לפתור ארגון ודינמיקה תת-תאית יאפשר אפיון כמותי מקיף של קליטת אוליגונוקלאוטידים, תנועה תוך-תאית, ועם בדיקות משלימות מתאימות, בריחה אנדוסומית. גישות משולבות כאלה צפויות להקל על זיהוי שיטתי של גורמים שקובעים את יעילות המסירה, לתמוך באופטימיזציה רציונלית של כימיות וכלי העברת אוליגונוקלאוטידים, ולספק פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת טיפולים מתפתחים באוליגונוקלאוטידים בהקשר של מחלות לב וכלי דם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021