הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קרדיואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים שנגרמו על ידי אדם כמודל להערכת אספקת אוליגונוקלאוטידים

219 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר יצירת קרדיואידים מבוססי קרדיומיוציטים מאורגנים עצמיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים על ידי אדם, לצורך הערכה מיקרוסקופית של קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית.

תקציר

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים מייצגים קבוצה מתקדמת במהירות של תרופות עם פוטנציאל משמעותי לטיפול במחלות לב וכלי דם; עם זאת, השגת אספקה יעילה לרקמת הלב נותרה אתגר קריטי ובלתי פתור. מכשול מרכזי הוא הזמינות המוגבלת של מודלים אנושיים פיזיולוגיים חזקים ורלוונטיים במבחנה , המסוגלים לתמוך בהערכה כמותית של קליטת תאים של אוליגונוקלאוטידים ותפוצה תוך-תאית. מוצג פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, ליצירת קרדיואידים תלת-ממדיים מארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) שנגרמו על ידי אדם, ויישומם כפלטפורמה להערכת קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים בתהליך התמיינות לבבית מכוונת בתרבות השעיה על ידי ויסות זמני של איתות Wnt/β-catenin, ומאפשר הגדרה רציפה של iPSCs דרך שלבי המזודרם, המזודרם הלבבי והקדמון של הקרדיומיוציטים. בתנאים אלו, התאים מתאספים באופן ספונטני למבנים תלת-ממדיים המכילים חללים, המבטאים סמנים קנוניים של קרדיומיוציטים. הקרדיואידים המתקבלים מספקים פלטפורמה ניתנת להרחבה וניסיונית להערכה מבוססת הדמיה של יעילות קליטת האוליגונוקלאוטידים, התומכת בפיתוח ואופטימיזציה של אסטרטגיות אספקה ליישומי לב.

מבוא

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים, בעיקר אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים (ASOs) ו-RNA מתערב קטן (siRNAs), מתפתחים במהירות כגישה טרנספורמטיבית וספציפית מאוד לטיפול במגוון רחב של מחלות, כולל מצבים תורשתיים ונרכשים 1,2,3. מודאליות אלו מאפשרות ויסות ישיר של ביטוי גנים ברמת ה-mRNA באמצעות קישור ספציפי לרצף לטרנסקריפטים יעדיים, ומאפשרות שתיקון ההשתקה או החיתוך של גנים הקשורים למחלה שלרוב אינם נגישים לטיפולים קונבנציונליים של מולקולות קטנות. לפיכך, טיפולים גנטיים מבוססי אוליגונוקלאוטידים מספקים פלטפורמה גמישה למיקוד במנגנונים פתוגניים מגוונים במגוון תחומי מחלה, כולל מחלות לב וכלידם. עד כה, מספר תרופות מבוססות אוליגונוקלאוטידים, כולל ASOs, siRNAs וסוכני חיבור, אושרו לשימוש קליני7. למרות ההתקדמות הזו, היעילות הטיפולית שלהם הן בסביבות פרה-קליניות והן בסביבות קליניות נותרה מוגבלת בשל מתן תוך-תאי לא יעיל8. הערכות עדכניות מצביעות על כך שפחות מ-1% מהאוליגונוקלאוטידים הפנימיים בורחים מהאזורים האנדוזומליים כדי להגיע לציטוזול ולהפעיל את ה-RNA המטרה שלהם, ובכך מגבילים פעילות פונקציונלית 9,10. מגבלה זו בולטת במיוחד ברקמת הלב, שם הספיגה והתנועה התוך-תאית אינם מובנים היטב.

היסטורית, הערכה פרה-קלינית של טיפולים קרדיווסקולריים התבססה במידה רבה על מודלים בעלי חיים, שנותרו חיוניים להערכת פרמקוקינטיקה, הפצה ביולוגית, יעילות ובטיחות בחיים החיים. עם זאת, הבדלים חשובים בין מינים בפיזיולוגיה לבבית, ויסות גנים ותגובות תאיות מגבילים לעיתים קרובות את יכולתם לחזות במדויק יעילות טיפולית ורעילות בבני אדם. מגבלות אלו דחפו את פיתוח מודלים מבוססי אדם במבחנה עם רלוונטיות פיזיולוגית משופרת. בין אלה, טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי האדם (iPSC) חוללה מהפכה במודלים של מחלות לב וכלי דם בכך שסיפקה מקור כמעט בלתי מוגבל לתאים שניתן להבדיל לקו קרדיווסקולרי. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושיים (iPSC-CMs) משחזרים רבות מהתכונות המולקולריות, המבניות והתפקודיות של שריר הלב האנושי והפכו לפלטפורמה מאומצת באופן נרחב לחקר מנגנוני מחלה, תגובות תרופתיות ושיטות טיפול מתפתחות11. עם זאת, לתרבויות דו-ממדיות קונבנציונליות של iPSC-CMs אנושיים יש מגבלות חשובות. רוב פרוטוקולי ההתמיינות מייצרים קרדיומיוציטים הדומים לתאים עובריים ולא בוגרים, ומפגינים תכונות מבניות, אלקטרופיזיולוגיות, מטבוליות וכיווץ לא בשלות12.

יתרה מזאת, תרביות חד-שכבתיות חסרות את ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית (3D), האינטראקציות הרב-תאיות והרכב המטריצות החוץ-תאיות המשפיעות על תפקוד הקרדיומיוציטים ב-vivo. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו מודלים לביים תלת-ממדיים מתקדמים יותרויותר 13. ביניהם, רקמות לב מהונדסות (EHTs), שנוצרות על ידי הטמעת iPSC-CMs בתוך פיגומי ביומטריה ויישום גירוי מכני וחשמלי, מקדמות בגרות מבנית ותפקודית תוך שיחזור קרוב יותר לסביבה הביומכנית של שריר הלבהטבעי 13. למרות ש-EHTs מספקים פלטפורמות פיזיולוגיות רלוונטיות מאוד למידול מחלות ובדיקות תרופות, ייצורם דורש בדרך כלל מומחיות ביו-הנדסית מיוחדת וציוד ייעודי. בקצה השני של הספקטרום, פרוסות רקמת הלב אקס-ביבו שומרות בנאמנות רבה על ארכיטקטורת רקמה טבעית והרכב תאי אך תלויות בגישה לרקמת הלב הראשונית, יש להן יכולת מוגבלת בתרבית, ואינן ניתנות להרחבה בקלות.

לאחרונה, אורגנואידים לבביים הופיעו כמערכות מודל תלת-ממדיות נגישות שמסכמות היבטים מרכזיים של ארגון ותפקוד רקמת הלב14. קרדיואידים הם אורגנואידים לבביים מתאספים מעצמם, המורכבים בעיקר מקרדיומיוציטים שעוברים הגדרה פנימית, דפוסים מרחביים ומורפוגנזה ליצירת מבנים דמויי תא, המכילים חלל15,16. שיטות ליצירת קרדיואידים מתבססות בדרך כלל על הפעלה ראשונית של איתות Wnt כדי לעורר מפרט מזודרם, ואחריה עיכוב נוסף לקידום מחויבות שושלת לבבית. קרדיואידים יכולים להיווצר בתרביות מתלה סטטיות או מעורבות, התומכות בייצור בקנה מידה ומגבירות את הארגון העצמי של הרקמות 15,16,17,18,19. אורגנואידים לבביים מורכבים יותר, רב-שושלתיים, הכוללים סוגי תאים אנדותליים, אפיקרדיאליים או סוגי תאים אחרים מגדילים את הרלוונטיות הפיזיולוגית אך דורשים פרוטוקולי התמיינות מורכבים יותר, תקופות תרבית ארוכות יותר, ואופטימיזציה נרחבת13,14.

מוצג פרוטוקול פשוט, ניתן לשחזור ויעיל ליצירת קרדיואידים מבוססי קרדיומיוציטים מאורגנים עצמיים מ-iPSCs אנושיים וליישם להערכת קליטת אוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית. הפרוטוקול צפוי להיות בעל ערך לחוקרים המעוניינים לאופטימיזציה של כימיה ואסטרטגיות העברת אוליגונוקלאוטידים ליישומים קרדיווסקולריים. כל החומרים בהם השתמשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות והכנה של iPSCs להבחנה

אזהרה: יש לבצע טיפול פתוח בתאים ובמדיה בארון בטיחות ביולוגית מוסמך מסוג Class II. לבש חלוק מעבדה וכפפות. חטא משטחי עבודה ופסולת נוזלית עם חומר חיטוי מתאים.

  1. תשמור על iPSCs.
    1. לוחות תרבית ציפוי עם מטריצת ממברנה-בסיס מתאימה לפי הוראות היצרן.
    2. הזן את iPSCs במדיום תאי גזע פלוריפוטנטי מוגדר, ללא הזנה, והחלף את המדיום כל 24 שעות.
    3. שמרו תרביות מתחת למתחם יתר ותאי מעבר כאשר הם מגיעים ל-70–80% מפגש תמים.
      הערה: ודאו ש-iPSCs שומרים על מורפולוגיה איכותית, לא מובחנת, ומאושרים כנקיים ממיקופלסמה לפני תחילת התמיינות.
  2. מעבר לפני התמיינות.
    1. הפשיר את ה-iPSC והרחבת תאים לפחות לשני מעברים לפני תחילת התמיינות לבבית.
    2. תאי מעבר המשתמשים בשיטת דיסוציאציה ללא אנזימים, PBS-EDTA, התואמת לתחזוקת iPSC.
      נקודת הפסקה: שמור על iPSCs בתרבות עד שהם מגיעים ל-70–80% מפגש ולשמור על מורפולוגיה טיפוסית ללא סימני התמיינות ספונטנית.

2. הכנת אגרגטים של iPSC בלוחות מיקרווול

  1. הפרדת iPSCs למתלה חד-תאים.
    1. שואף מדיום ושוטף תאים פעם אחת עם 1 מ"ל של 1× PBS.
    2. הוסיפו תמיסת ניתוק תאים (אקווטאז) ב-500 מיקרו-ליטר לבאר של לוח עם 6 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–7 דקות.
    3. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום כביסה לכל באר, ותלו בעדינות ליצירת מתלה חד-תא.
    4. העבר את המתלה לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שאיבת הסופרנטנט והשתה מחדש את כדור התא במדיום iPSC ללא הזנה בתוספת מעכב ROCK (10 מיקרומול אחרונים).
      הערה: כוונו את זמן הדגירה של הדיסוציאציה לכל קו iPSC על ידי בדיקת ניתוק ב-5 דקות והארכה בקצבים קצרים במידת הצורך.
  2. ספרו תאים והכינו את צפיפות הציפוי.
    1. ספירת תאים ברי קיימא באמצעות שיטת ספירת תאים סטנדרטית.
    2. הכינו מתלה חד-תאי ב-0.9 × 106 תאים/מ"ל לכל באר של לוח אגרגציה מיקרובאר של 800 מיקרון (פורמט 24 בארות, ~300 מיקרובארות לבאר).
      הערה: אופטימיזציה של מספר התאים לכל באר, שכן גודל המצטברות או יעילות ההתמיינות משתנים בין קווי iPSC.
  3. פריימר את צלחת המיקרווול והסר בועות.
    1. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום iPSC ללא הזנה המכיל מעכב ROCK (10 מיקרומטר אחרונים) לכל באר.
    2. צנטריפוגה את לוח המיקרווול ב-300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות אוויר מהמיקרובארות.
      קריטי: הסר את כל הבועות לחלוטין כדי לאפשר הצטברות תאים אחידה בתחתית כל מיקרובאר ולתמוך ביצירת אגרגט יעילה.
  4. זרע iPSCs למיקרובארות.
    1. הוסף 1.0 מ"ל מהמתלה החד-תאית המוכן (0.9 × 106 תאים/מ"ל) לכל באר, המקביל ל-0.9 × 106 תאים לכל באר.
    2. תליית בעדינות בתוך הבאר 3–5 פעמים באמצעות P1000 והימנע מהכנסת בועות אוויר.
    3. צנטריפוגה את הפלטה בעוצמה של 200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכניס תאים למיקרובארות.
    4. יש לוודא תחת מיקרוסקופ שהתאים התיישבו במיקרובארות לפני שמניחים את הלוח בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 24 שעות.
      קריטי: טפל בפלטה בזהירות אחרי הצנטריפוגה. אין לערבב או לנער את הצלחת, כי זה עלול לגרום לתאים להתרומם מהמיקרובארות.

3. התרחבות של אגרגטים של iPSC במיקרובארות

  1. שאפו בזהירות והחליפו את המדיום מבלי להפריע או לשחרר את האגרגטים.
    1. הטית את הפלטה ושאיבה לאט כ-1.0 מ"ל מדיום מכל באר באמצעות פיפטת P1000, כדי להבטיח שהאגרגטים יישארו יושבים במיקרו-בארות.
    2. שאופים לאט את ~500 מיקרוליטר המדיום הנותרים באמצעות פיפטת P1000.
    3. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום iPSC ללא הזנה לכל באר על ידי הזרקה איטית לאורך צדי הבאר באמצעות פיפטה סרולוגית.
    4. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ וחזרו על החלפת המדיום מדי יום.
      קריטי: שפוך מדיום על קיר הבאר והימנע מזרימה ישירה על אגרגטים.

4. התמיינות קרדיאלית של אגרגצי iPSC (יום 0 עד יום 12)

  1. השראת מזודרם (יום 0).
    1. הסר את המדיום באמצעות שיטת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
    2. הוסף 1.5 מ"ל לבאר של מדיום בסיסי בתוספת 2% B27 פחות אינסולין ומפעיל מסלול Wnt/β-catenin (CHIR99021, ריכוז סופי: 11 מיקרומון).
      הערה: יש להכין תמיסה של 10 מ"מ של CHIR99021, מעכב מולקולות קטנות של גליקוגן סינתאז קינאז-3 (GSK-3). כדי להגיע לריכוז סופי של 11 מיקרומון, מוסיפים 1.65 מיקרוליטר מהתמיסה המקורית ל-1.5 מ"ל של מדיום.
  2. שינוי בינוני לאחר ההשראה (יום 1).
    1. ב-24 שעות לאחר הוספת CHIR99021, שאבו בעדינות את המדיום מכל באר.
    2. הוסף 1.5 מ"ל לבאר של מדיום בסיסי טרי עם תוספת של 2% B27 פחות אינסולין, ואז דגר במשך 48 שעות.
      קריטי: יש להקפיד על תזמון שלבי המודולציה של Wnt, שכן סטיות עלולות לפגוע ביעילות הדיפרנציאציה.
      הערה: צפוי מוות תאי מסוים לאחר חשיפה למפעיל מסלול Wnt/β-catenin. אם נצפה אובדן מצטבר נרחב, שקול להפחית את ריכוז המפעיל בניסויים עתידיים.
  3. מחויבות לבבית באמצעות עיכוב WNT (יום 3).
    1. הכינו מדיום מותאם על ידי העברת 760 מיקרו-ליטר של מדיום משומש מכל באר לצינור קוני סטרילי של 50 מ"ל.
    2. לכל באר, הוסף 760 מיקרוליטר של מדיום בסיסי טרי עם 2% B27 פחות אינסולין לצינור המכיל את המדיום המאוחסן, וערבב בעדינות.
    3. הוסף את מעכב מסלול ה-Wnt, IWP4, למדיום המעורבב לריכוז סופי של 5 מיקרומטר והפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים לערבוב.
    4. שאבו בזהירות את המדיום הנותר מכל באר, ואז הוסיפו 1.5 מ"ל לכל באר של מדיום מותאם בתוספת IWP4.
    5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
      הערה: הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"מ של מעכב מסלול ה-Wnt IWP4. כדי להגיע לריכוז סופי של 5 מיקרומון, הוסף 7.6 מיקרוליטר של תמיסת המלאי לכל 1.52 מ"ל מדיום כולל (760 מיקרוליטר מדיום מותאם + 760 מיקרוליטר מדיום בסיסי טרי) לכל באר.
  4. שינוי בינוני במיקרובארות (יום 5).
    1. החלפת המדיום באמצעות גישת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
    2. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום בסיסי בתוספת 2% B27 פחות אינסולין לכל באר, ואז דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
  5. העברת אגרגטים ממיקרובארות ללוחות בעלי 6 בארות (יום 7).
    1. שאפו בזהירות את המדיום מכל באר באמצעות שיטת השאיפה העדינה המתוארת בשלבים 3.1.1–3.1.2.
    2. הוסף 1.0 מ"ל מדיום בסיסי עם תוספת של 2% B27 ואינסולין לכל באר בלוח המיקרווול. באמצעות פיפטת P1000, הפיפטה בעדינות על המדיום למעלה ולמטה חמש פעמים תוך הזזת קצה הפיפטה בתנועה מעגלית על פני הבאר כדי לשחרר את האגרגטים במיקרובארות ולהעביר אותם לתלייה.
    3. העבר את תליית האגרגט לבאר אחת של לוח תרבית לא מטופל עם 6 בארות.
    4. שטפו כל באר מלוח המיקרווול עם עוד 1.0 מ"ל מדיום טרי פעמיים עד שלוש כדי לשחזר את שאר החומרים המצטברים, והעבירו כל שטיפה לאותו באר של צלחת 6 הבארות.
    5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 72 שעות.
      הערה: נוכחות של תאים מתים ופסולת תאית לאחר העברת האגרגט צפויה. רוב הפסולת תוסר במהלך שינוי המדיה הבא.
  6. שינוי בינוני במהלך תרבות ההשעיה (יום 10).
    1. ערבב בעדינות את הפלטה כדי לשחרר כל אגרגט שמחובר ברפיון.
    2. הטה את הלוח כדי לאפשר לאגרגטים לשקוע בתחתית הבאר באמצעות כוח הכבידה.
    3. שאפו בזהירות את המדיום המשומש מבלי להפריע או לשאוף את האגרגטים.
    4. הוסיפו 2.0 מ"ל מדיום בסיסי טרי בתוספת 2% B27 עם אינסולין לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 48–72 שעות.
      הערה: מכות ספונטניות נצפות בדרך כלל מהיום העשירי ואילך.
      נקודת הפסקה: ניתן לשמור על קרדיואידים מכה בתרבות השעיה לתקופת הבשלה ממושכת על ידי החלפת המדיום כל 2–3 ימים.

5. אפיון מיקרוסקופי של קרדיואידים

הערה: שיטה זו מספקת תהליך עבודה לאפיון היסטולוגי של קרדיואידים באמצעות קריוסקטים. החתכים המתקבלים יכולים לשמש למגוון ניתוחים היסטולוגיים, כולל צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) להערכת ארכיטקטורת הרקמה הכוללת וסימון אימונופלואורסצנציה להערכת זהות הקרדיומיוציטים.

  1. קיבוע וכריתת קריו-סקציה.
    1. תקן קרדיואידים ב-4% פאראפורמלדהיד בלילה בטמפרטורה של 4°C.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד רעיל וסביר להניח שהוא מסרטן; לטפל בו עם קפוצ'ון אדים כימי תוך כדי לבישת ציוד מגן אישי מתאים. אסוף את כל הפסולת המכילה פאראפורמלדהיד (קיבוע ושטיפה) במיכל מסומן בבירור לפסולת אלדהיד/כימית מסוכנת, והשליך אותה בהתאם לנהלים מוסדיים לפסולת מסוכנת.
      בטיחות: בצע את כל הקיבוע והטיפול בפרפורמלדהיד בתוך מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    2. שטפו שלוש פעמים עם PBS וקריופרוטקט את הקרדיואידים הקבועים בסוכרוז של 30% (בלי צילום) ב-PBS בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. הטמיעו את הקרדיואידים בג'לטין, הקפיאו וחתכו חתכי קריוסקט בעובי 10 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ. אחסן את החלקים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. תיוג חיסוני.
    1. הפשיר את החלקים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שטפו את החלקים ב-PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, פעמיים.
    3. הקיפו את אזור העניין בכל שקופית עם עט הידרופובי כדי ליצור באר ששומרת את חסימת החומרים ותמיסות הנוגדנים.
    4. הידרציה מחדש של החתכים למשך 2–3 דקות בבופר חדירות (PB; PBS המכיל 0.1% Tween-20) בצנצנת קופלין.
    5. הסר את המגלשות מ-PB, נקז את התמיסה העודפת, והניח את המגלשות בתא לח.
      קריטי: מהנקודה הזו ואילך, חשוב לא לתת לחלקים להתייבש.
    6. חסמו את החתכים עם 200–300 מיקרוליטר של PB המכילים 5% סרום בקר עוברי (FBS) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
    7. הסר את תמיסת החסימה ודגר את החלקים ללילה בטמפרטורה של 4°C עם 100 מיקרוליטר נוגדן ראשוני (anti-cMYBP-C; 1:50) מדולל בתמיסת חסימה (PB המכיל 1% FBS).
    8. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PB ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני ירוק פלואורסצנטי לעכבר (1:200), פאלואידין פלואורסצנטי אדום רחוק (1:400) ו-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל).
    9. שטוף שלוש פעמים ב-PB והתקן עם מדיום הרכבה נגד פייד.
      אזהרה: אסוף את כל התמיסות המכילות צבע פלואורסצנטי (נוגדנים משניים, פאלואידין, תמיסות צביעה DAPI והשטיפות המתאימות) במיכל והפנות אותן כפסולת כימית בהתאם להנחיות המוסדיות.
  3. רכישת תמונה.
    1. לרכוש תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד בגלאי מערך להדמיה ברזולוציה על, באמצעות אובייקטיב טבילה בשמן 10× ו-63×/1.40.
    2. עוררו את הפלואורופור האדום הרחוק, הפלואורופור הירוק והצבע הגרעיני באמצעות קווי לייזר של 639 ננומטר, 488 ננומטר ו-405 ננומטר בשידור לייזר של 4.0%, 4.0% ו-1.0%, בהתאמה.
    3. לרכוש קטעים אופטיים בודדים בגודל פיקסל של 0.0353 × 0.0353 מיקרומ"ר, סריקה חד-כיוונית, מהירות סריקה 6, זום 1.7, ממוצע קו 1, וזמן שהייה של פיקסלים של 0.935 מיקרושניות לפיקסל.
    4. החלו עיבוד תמונה ברזולוציה על-גבוהה של גלאי מערך באמצעות סינון וינר אוטומטי.

6. בדיקת קליטה של אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים

  1. הכינו תמיסה מלאית של האוליגונוקלאוטיד המסומן בפלואורסצנטית, המחובר לחומצה פלמיטית כדי להגדיל את הליפופיליות.
    1. לשחזר את האוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטי במים נטולי נוקלאז לריכוז סופי של 1 מ"מ. מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף את התמיסה בתחתית הצינור.
    2. הכינו אליקוטים חד-פעמיים של תמיסת המלאי של 1 mM ואחסנו בטמפרטורה של −20°C מוגנים מאור.
    3. ביום הניסוי, מוסיפים 1 מיקרוליטר מהמאגר של 1 מ"מ ל-1 מ"ל של מדיום תרבית קרדיואידים כדי לקבל ריכוז אוליגונוקלאוטיד סופי של 1 מיקרומון. מערבבים על ידי ערבוב עדין של לוח.
  2. דגרו קרדיואידים עם האוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטית (ריכוז סופי של 1 מיקרומול) במדיום ללא סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 24 שעות.
  3. שטפו את הקרדיואידים שלוש פעמים עם מי מלח עם בופר פוספט (PBS) להסרת אוליגונוקלאוטידים חוץ-תאיים.
  4. קיבעו את הקרדיואידים ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו שלוש פעמים עם PBS, והמשיכו עם סימון פלואורסצנטי לפני ההדמיה.
  5. דגרו קרדיואידים קבועים שלמים ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור, ב-PBS המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל אגלוטינין של נבט חיטה (WGA) בשילוב עם פלואורופור ירוק ו-1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI. שטוף שלוש פעמים ב-PBS והתקן עם מדיום הרכבה נגד פייד.
    אזהרה: אספו את כל המדיום והשטיפות המכילים אוליגונוקלאוטידים וצבע פלואורסצנטי, כולל מדיום הדגירה המסומן של אוליגונוקלאוטידים משלב 6.2 ותמיסת הצביעה WGA/DAPI, במיכל נפרד והשליכו אותם כפסולת כימית/ביולוגית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות.
  6. לרכוש תמונות קונפוקליות של קליטת והפצת אוליגונוקלאוטידים.
    1. לצלם תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר המצויד בגלאי מערך להדמיה ברזולוציה על-גבוהה ומטרה של טבילה במים ב-40×. רכוש תמונות כערימות z בנות 8 חתכים עם גודל z-step של 2 מיקרון, המכסים עומק כולל של 16 מיקרון.
    2. עוררו את הכתם הגרעיני, סמן הממברנה והאוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטית באדום רחוק באמצעות קווי לייזר של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-639 ננומטר בשידור לייזר של 0.9%, 0.2% ו-3.0% בהתאמה.
    3. רכוש תמונות בגודל ווקסל 0.0449 × 0.0449 × 2 מיקרומטר3, סריקה דו-כיוונית, מהירות סריקה 5, ממוצע קו 1, וזמן שהייה פיקסל של 1.51 מיקרושניות לפיקסל. יישם עיבוד תמונות Airyscan/סופר-רזולוציה באמצעות סינון Wiener אוטומטי.
    4. שמרו על כל הגדרות הרכישה (עוצמת לייזר, רווח גלאי, z-step וגודל ווקסלים) קבועות בכל מיקומי ה-z ובכל הדגימות כדי לאפשר השוואה תקפה של אות האוליגונוקלאוטידים בין תנאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מסכם את תהליך ההתמיינות וממחיש את השינויים המורפולוגיים האופייניים הצפויים בכל שלב של הפרוטוקול, מהצטברות iPSC ועד ליצירת קרדיואידים מאורגנים עצמיים. אגרגציה מבוססת מיקרובאר על בסיס תלייה מספקת גישה פשוטה וסטנדרטית ליצירת מספר רב של קרדיואידים מבוקרי גודל. הבחנה מוצלחת מאופיינת ביצירת אגרגטים בגודל אחיד, ואחריהם התפתחות חללים פנימיים ותחילת הכאה ספונטנית, בדרך כלל החל מהיום העשירי ואילך. ביחד, תכונות מורפולוגיות אלו מספקות נקודות ביקורת מעשיות לבקרת א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טיפולים מבוססי אוליגונוקלאוטידים הפכו לקטגוריה חזקה של שיטות מיקוד גנטיות, הנתמכות בעשורים של התקדמות בכימיה של אוליגונוקלאוטידים ששיפרו את הספציפיות של המטרה, יציבות מטבולית וסבילות אימונוגנית 7,8. למרות מספר הולך וגדל של טיפולי RNA מאושרים קלינית, היישום הרחב יותר שלהם מוגבל בשל אספקה תוך-תאית לא יעילה 7,8. בשל גודלם, מטעןם והידרופיליותם, אוליגונוקלאוטידים אינם יכולים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לחברי מרכז האתגר של קרן נובו נורדיסק ל-Optimized Oligo Escape, במיוחד Knud Jensen על עיצוב וסינתזה של אוליגונוקלאוטידים, ולניקוס ס. הצאקיס ותומאס קירכהאוזן על הכוונה חשובה בהדמיה כמותית וניתוח תנועה תוך-תאי. עבודה זו מומנה על ידי מרכז האתגר של קרן נובו נורדיסק לאוליגו סקייפ (NNF23OC0081287). מ.פ. קיבל מלגה מקרן הטכנולוגיה (FCT), פורטוגל (2020.04836.BD). אנו מודים ל-GIMM Bioimaging ולפלטפורמות ההיסטופתולוגיה של GIMM (ליסבון, פורטוגל) על הסיוע הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

מקורות

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרייםמודל קרדיואידגבייה לבביתסיגנל Wntמזודרם לבביתאי אב של קרדיומיוציטיםאוליגוניוקלאוטידים פלואורסצנטייםעיכול תאיקרדיואידים תלת-ממדיים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.