פרמקולוגיה רשת ומחקר ניסויי של β-סיטוסטרול בטיפול במחלת ריאות חסימתית כרונית באמצעות קולטן גלוקוקורטיקואידי

Xiaohong Deng; Tianhao Wang; Jianying Wang; Kun Wang

doi:10.3791/72018

מאמר מחקר

פרמקולוגיה רשת ומחקר ניסויי של β-סיטוסטרול בטיפול במחלת ריאות חסימתית כרונית באמצעות קולטן גלוקוקורטיקואידי

DOI:

10.3791/72018

⸱

7 באוגוסט 2026

Xiaohong Deng^*¹ , Tianhao Wang^*² , Jianying Wang³ , Kun Wang⁴

¹Bishan Hospital of Chongqing Medical University, Bishan Hospital of Chongqing, ²Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³Geriatrics Department, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, ⁴Department of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Yuhua Hospital

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-סיטוסטרול הקל על COPD והגביר את היעילות של דקסמתזון, כאשר קולטן הגלוקוקורטיקואיד מתווך השפעה זו. בנוסף, β-סיטוסטרול הפחית דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות תאית הן בתאי אפיתל ברונכיאלי מונעים על ידי CSE והן בעכברי COPD שנגרמו מעשן סיגריות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא הפרעת ריאה נפוצה המאופיינת בדלקת מתמשכת, לחץ חמצוני וירידה מתקדמת בתפקוד הריאות. הפוטנציאל הטיפולי של β-סיטוסטרול ב-COPD עדיין לא ברור. מחקר זה נועד לחקור את ההשפעות המגנות של β-סיטוסטרול נגד COPD ולהבהיר את המנגנון הבסיסי שלו. סקר במאגר זיהה את קולטן הגלוקוקורטיקואיד (GR) כמטרה פוטנציאלית ל-β-סיטוסטרול. הוקמו מודל עכבר COPD שנגרם מעשן סיגריות ומודל תאי BEAS-2B המופעל על ידי CSE (CSE). תפקוד ריאתי, סמנים הקשורים לפגיעות ריאות, דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות תאית הוערכו באמצעות ערכות (RT-qPCR), בדיקות גלאי פלואורסצנטי DCFH-DA וערכות גילוי הזדקנות. השפעות ה-β-סיטוסטרול לבדו או בשילוב עם דקסמתזון (DEX) הוערכו גם הן. β-סיטוסטרול שיפר משמעותית את תפקוד הריאות, נרמל את הסמנים הקשורים לפגיעות ריאות, והפחית דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות תאית הן בתאי BEAS-2B המונעים על ידי CSE והן בעכברים החשופים לעשן סיגריות. השפעות הגנה אלו לוו בביטוי מוגבר של GR. יתרה מזאת, β-סיטוסטרול שיפר את התגובה ל-DEX, וטיפול משולב עם β-סיטוסטרול ו-DEX הניבו שיפורים גדולים יותר בתפקוד הריאות, בסמני פגיעות ריאות, בדלקות, ברמות מיני חמצן תגובתיות ובהזדקנות תאית מאשר טיפול ב-DEX בלבד. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-β-סיטוסטרול מקל על שינויים פתולוגיים הקשורים ל-COPD, לפחות בחלקו, על ידי הגברת ביטוי GR והגברת היעילות הטיפולית של DEX, ומדגיש את הפוטנציאל שלו כאסטרטגיה מסייעת לטיפול ב-COPD.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא מחלת נשימה מתקדמת המתאפיינת בדלקת מתמשכת בדרכי הנשימה, נזק אלוואולרי וחסימת זרימת אוויר בלתי הפיכה, הפוגעת בתפקוד הנשימה ומפחיתה את איכות החיים¹. השכיחות שלו עולה משמעותית עם הגיל, והסיכון לאנשים בגיל 65 ומעלה הוא פי חמישה מזה של אנשים מתחת לגיל⁴². מגמה דמוגרפית זו קשורה לעלייה בשכיחות מחלות, תמותה ונכות³. תחזיות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שעד 2030, COPD עשוי להפוך לסיבת המוות הרביעית בגודלה בעולם, ומהווה כ-5% מכלל מקרי המוות ^4,5,6. נכון להיום, גורמי הסיכון שזוהו כוללים רגישות גנטית, דיספלזיה ריאתית, חשיפה לחלקיקים, ברונכיטיס כרוני וזיהום נשימתי⁷.

מבין גורמי הסיכון, עשן סיגריות הוא הגורם הפתוגני החשוב ביותר ל-COPD⁸. הוא מכיל אלפי כימיקלים שיכולים לגרום לנזק אפיתל לסימפון, לקדם חדירת תאים דלקתיים ולהוביל לעיצוב מחדש של רקמת הריאה^. חשיפה ממושכת יכולה לגרום לפגיעה אפיתלית מתמשכת ובלתי הפיכה, לקדם שחרור של מספר רב של כימוקינים פרו-דלקתיים, להגדיל משמעותית את ייצור ה-ROS, ולגרום לאפופטוזיס תא¹⁰. מחקרים רבים הראו כי רמות העלייה של כימוקינים פרו-דלקתיים כגון אינטרלוקין-8 (IL-8) ופקטור נמק-α גידולי (TNF-α), יחד עם ייצור יתר של ROS והזדקנות תאית, קשורים קשר הדוק לחומרת COPD^11,12. דבר זה מדגיש את הצורך בסוכנים שיכולים לווסת ביעילות ובבטחה את הגורמים הפתוגניים המרכזיים הללו כדי להפעיל השפעות מגן וטיפוליות ב-COPD.

פיטוסטרולים הם תרכובות ביואקטיביות טבעיות הנמצאות באופן נרחב בממברנות תאי הצמח. מתוכם, β-סיטוסטרול הוא השכיח ביותר ונפוץ במזונות עשירים בשומנים שמקורם בצמחים כגון ירקות, אגוזים, זרעים ושמן זית 13,14,15,16. מחקרים אישרו כי מתן β-סיטוסטרול במינונים של עד 1000 מ"ג/ק"ג בחולדות ועכברים אינו קשור לציטוטוקסיות או גנוטוקסיות¹⁷. יתרה מזאת, מחקרים הראו כי β-סיטוסטרול מציג תכונות נוגדי חמצון דרך השפעותיו על אנזימי נוגדי חמצון וקולטני אסטרוגן בבני אדם.

β-סיטוסטרול מציג מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות, כולל אנטי-דלקתי¹⁹, אנטי-פיראטי²⁰, משכך כאבים²¹, ואנטי-סוכרת¹³. הוא גם הראה פוטנציאל טיפולי במודלים שונים של מחלה, כגון קוליטיס ודלקת מעיים²², ויש לו תכונות אנטי-טרשת^{עורקים 23} ותכונות אימונומודולטוריות²⁴. בנוסף, יש לו פרופיל בטיחות חיובי. בהתחשב בתכונות אלו, β-סיטוסטרול זכה לעניין רב כמועמד תרופתי פוטנציאלי. עם זאת, תפקידו המדויק והמנגנונים הבסיסיים שלו ב-COPD נותרו ברובם לא ברורים.

לכן, המחקר הנוכחי נועד לחקור את ההשפעות הטיפוליות הפוטנציאליות והמנגנונים הבסיסיים של β-סיטוסטרול ב-COPD. באופן ספציפי, מודל פגיעה בתאי BEAS-2B המושרה על ידי תמצית עשן סיגריות (CSE) שימש להערכת האם β-סיטוסטרול יכול להקל ביעילות על נזק תאי המתווך על ידי CSE, ובכך לזהות מולקולה מועמדת חדשה לאסטרטגיות טיפוליות ל-COPD.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נערך בהתאם להנחיות היסוד והקליני לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה למחקרים ניסיוניים וקליניים²⁵. כל פרוטוקולי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני המסונפ, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (אישור מס' 20230102), וכל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי החיים. המחקר נערך בהתאם להנחיות ARRIVE.

סינון רכיבים ויעדים מרכזיים באמצעות פרמקולוגיה רשתית

רכיבים פעילים של Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., ו-Adenophora stricta Miq. נלקחו ממאגר הנתונים של מערכות פרמקולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP; ניגש ב-12 במרץ 2024). התרכובות המועמדות נבדקו לפי קריטריוני ADME הבאים: זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30%, דמיון תרופה (DL) ≥ 0.18, וחדירות Caco-2 ≥ −0.4²⁵. תרכובות שעומדות בכל שלושת הקריטריונים נשמרו כמרכיבים פעילים מועמדים לניתוחים הבאים.

המבנה הקנוני של מערכת כניסת קו קלט מולקולרית מפושטת (SMILES) של β-סיטוסטרול התקבל מ-PubChem (ניגש ב-18 במרץ 2024) ויובא ל-SwissTargetPrediction (ניגש ב-21 במרץ 2024) לחיזוי יעד. הומו ספיינס נבחר כמין היעד. היעדים הפוטנציאליים נחזו בהתבסס על דמיון מבני דו-ממדי ותלת-ממדי בין β-סיטוסטרול לליגנדים ידועים במאגר הנתונים. מטרות חזויות עם הסתברות גבוהה מ-0 נשמרו, ורשומות כפולות הוסרו.

גנים הקשורים ל-COPD נאספו ממאגר המטרה הטיפולית (TTD; ניגש ב-25 במרץ 2024) וממאגר הנתונים השוואתי לטוקסיגנומיקה (CTD; ניגש ב-28 במרץ 2024) באמצעות מילת המפתח "מחלת ריאות חסימתית כרונית". לאחר הסרת גנים כפולים, הגנים הקשורים ל-COPD הצטלבו עם היעדים החזויים של β-סיטוסטרול כדי לזהות מטרות מועמדות המעורבות פוטנציאליות להשפעות הטיפוליות של β-סיטוסטרול נגד COPD.

עגינה מולקולרית של β-סיטוסטרול ו-GR

המבנה התלת-ממדי של β-סיטוסטרול בפורמט SDF נשלף ממאגר PubChem (נגיש ב-2 ביוני 2026), בעוד שמבנה הגביש של קולטן הגלוקוקורטיקואידים (GR) התקבל מבסיס נתוני חלבוני Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; נגיש ב-3 ביוני 2026). לאחר הכנה סטנדרטית של הליגנד ומבני הקולטנים, בוצעה עגינה מולקולרית באמצעות פלטפורמת CB-Dock2 המקוונת (נגיש ב-3 ביוני 2026). קבצי הליגנד והקולטנים שהוכנו הועלו לפלטפורמה, וחישובי העגינה בוצעו באמצעות הפרמטרים המוגדרים כברירת מחדל.

ניתוח העשרה פונקציונלית של אונטולוגיית גנים (GO) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG)

כל הגנים המטרה החזויים של β-סיטוסטרול עברו ניתוחי העשרת תפקוד GO וניתוחי העשרת מסלולי KEGG. תוצאות העשרה, כולל תהליכים ביולוגיים מועשרים משמעותית, רכיבים תאיים, פונקציות מולקולריות ונתיבי איתות, מוינו ונשמרו בקובץ משלים 1 לניתוח ביואינפורמטי נוסף.

מידול וקיבוץ בעלי חיים

גודל המדגם נקבע לשישה בעלי חיים לכל קבוצה בהתבסס על מחקר קודם שביצע ניתוח הספק מראש באמצעות תוכנת G*Power (α = 0.05, עוצמה = 0.80) והראה כי n = 6 מספיק לזיהוי הבדלים ביולוגיים רלוונטיים בתנאים ניסיוניים דומים²⁶. עכברים זכרים עם C57BL/6 בגילאי 6–8 שבועות (20 ± 2 גרם) חולקו באקראי לחמש קבוצות: קבוצת הביקורת, קבוצת מודל COPD, קבוצת COPD + דקסמתזון (DEX), קבוצת COPD + β-סיטוסטרול, וקבוצת COPD + DEX + β-סיטוסטרול. העכברים אוחסנו בתנאי מעבדה סטנדרטיים (25 °C, 12 שעות מחזור אור/חושך) עם גישה חופשית לאוכל רגיל ומים והורשו להסתגל למשך שבוע לפני הניסויים.

לצורך הקמת מודל COPD, העכברים הונחו בתא חשיפה לעשן סיגריות בכל הגוף (63 ס"מ × 55 ס"מ × 45 ס"מ) ונחשפו לעשן סיגריות רגיל למשך 12 שבועות. כל סיגריה הכילה 10 מ"ג זפת, 0.9 מ"ג ניקוטין ו-10 מ"ג פחמן חד-חמצני. חשיפה לעשן בוצעה פעמיים ביום (5 ימים בשבוע) בשעה 9:30 בבוקר ו-15:00, כאשר עשן שנוצר מ-18 סיגריות הועבר לתא למשך 90 דקות^{בכל מפגש}.

כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של ההתערבויות, החלה מתן התרופה לאחר 8 שבועות של חשיפה לעשן סיגריות ונמשך במשך 4 השבועות הנותרים. החל מהשבוע התשיעי, עכברים בקבוצות הטיפול המתאימות קיבלו תזונה יומית תוך-קימתית של DEX (1 מ"ג/ק"ג)²⁸ או β-סיטוסטרול (50 מ"ג/ק"ג)^29.30 שעה לפני החשיפה לעשן סיגריות. מחקרים פרמקוקינטיים קודמים דיווחו על זמינות ביולוגית דרך הפה של כ-4% עבור β-סיטוסטרול במכרסמים³¹. בנוסף, מספר מחקרים על עכברים השתמשו במינונים הנעים בין 20 ל-50 מ"ג/ק"ג³². לכן, נבחר מינון של 50 מ"ג/ק"ג כדי להבטיח חשיפה מערכתית מספקת תוך שמירה על טווח הנפוץ במחקרים פרה-קליניים.

עכברים בקבוצת הביקורת נחשפו לאוויר מסונן בחדר, בעוד שעכברים בקבוצת המודל והטיפול קיבלו נפח דומה של סליין רגיל כרכב. בסוף תקופת הניסוי, העכברים הורדמו עמוקות עם איזופלוראן עד לאובדן רפלקס הפדלים, והועברו בהרדמת דם דרך איסוף דם באאורטה הבטנית. חלל בית החזה נפתח מיד, ורקמות הריאה הדו-צדדיות השלמות נחתכו בקפידה, נשטפו במלח פוספט קר (PBS), והונחו על קרח. לאיסוף נוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF), קנה הנשימה עברה קנולציה והוטפה ב-PBS סטרילי קר, שהוחדרה בעדינות ונמשכה שוב ושוב כדי לאסוף נוזל שטיפה. רקמות ריאה ודגימות BALF נשמרו על קרח ועברו לאחר מכן לניתוחים במורד הזרם.

תרבית תאים BEAS-2B

תאי האפיתל הברונכיאליים האנושיים BEAS-2B נשמרו ב-Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) של Dulbecco, המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין מתחת ל-5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הכנת CSE וחשיפה לתאי BEAS-2B

תאי BEAS-2B נשטפו עם מלח מפופר פוספט והוזרעו ללוחות של 24 בארות בשלוש כפילים בצפיפות של 5 ×-10-4 תאים בכל באר. לאחר 12 שעות של תרבית, התאים הגיעו לכ-60% קונפלינציה ואז נחשפו ל-CSE. CSE הוכן טרי כפי שתואר קודם, עם שינויים קלים³³. בקצרה, סיגריה מסחרית לא מסוננת אחת נשרפה ברצף, והעשן הרגיל בובע לתוך 10 מ"ל מדיום ללא סרום באמצעות משאבת ואקום בקצב זרימה קבוע של 1.05 ליטר לדקה (כ-11 קילופסקל לחץ שלילי) למשך כ-5 דקות עד שהסיגריה נשרפה לחלוטין. התמיסה שהושגה עברה תחילה סינון מוקדם להסרת זיהומים גדולים של חלקיקים, ולאחר מכן חוטאה באמצעות מסנן מיקרופורוסי סטרילי בגודל 0.22 מיקרון להסרת חלקיקים שנותרו; פתרון המלאי שהתקבל הוגדר כ-100% CSE. כל ה-CSE הטרי שימש לטיפול תאים מיד לאחר הסינון ללא אחסון. תאים הוגרו עם מדיום המכיל 2.5% CSE. לאחר 24 שעות של טיפול ב-CSE, נאספו ואוחסנו הסופרנטנטים של התרבית בטמפרטורה של מינוס 40°C לניתוח הבא³⁴.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)

סך ה-RNA הופק מתאי BEAS-2B באמצעות ערכת חילוץ RNA כוללת והועתק לאחור ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך לפי הוראות היצרנים. RT-qPCR בוצע לאחר מכן באמצעות מערכת זיהוי PCR בזמן אמת ומיקס מאסטר qPCR מבוסס SYBR Green. כל ניסויי RT-qPCR בוצעו עם שלושה שכפולים ביולוגיים ושלושה שכפולים טכניים לכל דגימה, כדי להבטיח אמינות נתונים.

כל תגובת qPCR בוצעה בנפח כולל של 20 מיקרוליטר, וכללה 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר SYBR Green qPCR, 0.4 מיקרוליטר פריימר קדמי, 0.4 מיקרוליטר פריימר הפוך, 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA מדוללת, ו-7.2 מיקרוליטר מים ללא RNase. תנאי ההגברה היו כדלקמן: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 40 מחזורי דנאטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ואנילינג/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. רמות ביטוי הגנים היחסיות חושבו בשיטת 2^−ΔΔCt, כאשר GAPDH משמש כגן ההתייחסות הפנימי. רצפי הפריימרים ששימשו במחקר זה מוזכרים בטבלה משלימה 1.

ניתוח מיני חמצן תוך-תאי (ROS)

ייצור ROS תוך-תאי בתאי BEAS-2B הוערך באמצעות הגלאי הפלואורוגני 2′,7′-דיכלורודיהידרופלואורסאין דיאצטט (DCFH-DA) ונותח באמצעות ציטומטריית זרימה. במהלך רכישת ציטומטריית זרימה, יושמה אסטרטגיית שער סטנדרטית של פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (SSC) כדי להוציא פסולת תאית ולבחור תאים בודדים שלמים. בסך הכל נרכשו 10,000 אירועים תאיים תקפים עבור כל דגימה. אורכי הגל של העירור והפליטה נקבעו ל-488 ננומטר ו-525 ננומטר, בהתאמה. נתוני זרימה ציטומטריים נותחו לאחר מכן כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה התוך-תאית של ROS.

קביעת רמת מלונדיאלדהיד (MDA)

תכולת ה-MDA התוך-תאית נמדדה באמצעות ערכת בדיקה לפרוקסידציה של שומן בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, תאי BEAS-2B שטופלו נקטפו ופורקו, ואז צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה לאיסוף הסופרנאנט. לאחר מכן בוצעה תגובת הצבע הקולורמטרית של חומצה תיובארביטורית (TBA), והספיגה נמדדה ב-532 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. רמות MDA יחסיות חושבו לפי עקומת הסטנדרטית.

הערכת הזדקנות תאית

הזדקנות תאית הוערכה באמצעות בדיקת גילוי הזדקנות המבוססת על פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות. תאי SA-β-gal-חיוביים נמדדו באמצעות ציטומטריית זרימה. במקביל, רמות ביטוי ה-mRNA של הסמנים הקשורים להזדקנות p53 ו-p21 נקבעו באמצעות RT-qPCR.

בדיקת התרבות תאים

התרבות התאים הוערכה באמצעות ערכת בדיקת עמידות תאים קולורימטרית. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.

מבחן הדחיפה של GR

העברת תאים בוצעה באמצעות תגובת טרנספקציה מבוססת שומן. האוליגונוקלאוטידים הבאים עברו טרנספקטים: RNA קטן מתערב (si-GR) המכוון לקולטני גלוקוקורטיקואידים ו-RNA קטן מתערב בביקורת שלילית (si-NC). רצפי siRNA מועמדים המיועדים ל-GR תוכננו באמצעות פלטפורמת הביואינפורמטיקה המקוונת siDirect 2.0. לאחר הטרנספקציה, התאים תורבו במשך 48 שעות, וכל הסי-RNA שימשו בריכוז סופי של 50 ננומטר. יעילות ההדחפה אושרה על ידי מדידת ביטוי mRNA של GR באמצעות RT-qPCR.

קבוצות ביקורת של הרכב נכללו הן בניסויי טיפול β-סיטוסטרול והן בניסויי טרנספקציה. בהתערבות β-סיטוסטרול, תאים שטופלו בממס רכב בלבד שימשו כקבוצת ביקורת הרכב (מסומנת כ-CSE+0). הניתוח הסטטיסטי אישר כי לא נצפו הבדלים משמעותיים בין קבוצת הביקורת לקבוצת הביקורת הריקה.

ניתוח סטטיסטי

כל התוצאות הכמותיות הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± משלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים במבחנה . ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. מבחן שפירו–וילק שימש לבחינת הנורמליות של התפלגות מערכי הנתונים לפני בדיקות סטטיסטיות; תיקון פוסט-הוק של Bonferroni אומץ כדי להתאים ערכי P להשוואות מרובות לאחר ניתוח שונות (ANOVA). השוואות בין שתי קבוצות הוערכו באמצעות מבחן t סטודנט לא מזווג, בעוד ש-ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני שימש להשוואות רב-קבוצתיות. ערך p ≤ 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-סיטוסטרול היה מוצר טבעי פוטנציאלי לטיפול ב-COPD

עקב ההשפעות הריפוי המדווחות של Fritillaria cirrhosa D. Don, פרח מיובש של Lonicera japonica Thunb., שורש יבש של Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., ו-Adenophora stricta Miq. בטיפול במחלות ריאות 35,36,37,38, מחקר זה השתמש במאגר הנתונים של TCMSP כדי לזהות באופן שיטתי את הרכיבים הפעילים של עשבי הרפואה הסינית המסורתית (TCM) β סיטוסטרול זוהו כמרכיב פעיל חשוב המשותף לצמחי הרפואה הסינית הסינית (איור 1A). כדי לחקור באופן שיטתי את המנגנון המולקולרי הבסיסי של β-סיטוסטרול, המידע המבני של SMILES נאסף ממאגר PubChem ויובא למסד הנתונים SwissTargetPrediction לחיזוי מטרות; כל היעדים החזויים עם הסתברות חיזוי מעל 0 נשמרו לניתוח מאוחר יותר. רשת האינטראקציה בין רכיב-מטרה שנוצרה בין β-סיטוסטרול לבין היעדים המועמדים שלו הוצגה וצוגה באיור 1B. סך הכל 43 גני מטרה משוערים של β-סיטוסטרול נחזו באמצעות מאגר הנתונים SwissTargetPrediction. בהמשך, בוצעו ניתוחי העשרת תפקוד GO והעשרת מסלולי KEGG על הגנים המטרה של β-סיטוסטרול, וכל מאגרי הנתונים המלאים של ההעשרה נשמרו בקובץ משלים 1. ראוי לציין כי תהליכי מטבוליזם של סטרואידים זוהו כאחד המסלולים המועשרים משמעותית המובילים. הספרות המצטברת הראתה את הקשר ההדוק בין חילוף חומרים חריג של סטרואידים לבין עמידות לגלוקוקורטיקואידים ב-COPD³⁹. יתרה מזאת, GR היה מועשר באופן ברור בתוך אשכולות תפקודיים הקשורים למטבוליזם של סטרואידים. ממצא זה מספק תמיכה ביואינפורמטית מרכזית לניסויים התאיים הבאים שלנו, שבחנו את המנגנון שבו β-סיטוסטרול משפר את רגישות DEX ומשנה את רמות הביטוי של GR.

הגנים הקשורים ל-COPD נאספו ממאגרי TTD ו-CTD. ניתוח חיתוך ון מאוחר יותר (איור 1C) חשף שני גנים חופפים בין מטרות β-סיטוסטרול לבין גנים הקשורים ל-COPD שמקורם ב-TTD, שני גנים חופפים נוספים בין מטרות β-סיטוסטרול לגנים הקשורים ל-CTD, וחמישה גנים משותפים בין מאגרי הנתונים של TTD ו-CTD. בסופו של דבר, GR היה הגן המשותף לכל שלושת מערכי הנתונים והוגדר כמטרה המרכזית של β-סיטוסטרול נגד COPD. נתונים מספריים מפורטים של ניתוח ון מופיעים בקובץ המשלים 2. לצורך אימות נוסף של זיקת קשר, בוצעה עגינה מולקולרית של β-סיטוסטרול עם GR (איור 1D). כיסי קשירה עם ציוני Vina נמוכים מ-−7.0 קק"ל/מול נחשבו כמפגינים זיקה חיובית לקשר. ציוני ה-Vina של כיסי C1 ו-C5 היו −8.8 ו-−7.2 קקלורי/מול, בהתאמה, מה שמעיד על אינטראקציה חזויה חזקה בין β-סיטוסטרול ל-GR.

β-סיטוסטרול הגן על תאי BEAS-2B מפני נזק ל-CSE, שעשוי להיות קשור לביטוי GR מוגבר

β-סיטוסטרול הראה אפקט הגנה משמעותי במודל פגיעת תאי BEAS-2B שנגרמה על ידי CSE. קבוצת CSE + 0 תוכננה כקבוצת בקרת רכב המקבלת CSE בתוספת נפח שווה של ממס תרופות ללא β-סיטוסטרול. כצפוי, לא נמצא הבדל מובהק בין קבוצות CSE ו-CSE + 0. התרכובת עיכבה את ייצור TNF-α ו-IL-6 שנגרם על ידי CSE באופן תלוי בריכוז (איור 2A). הוא גם הפחית את רמות ROS התוך-תאי (איור 2B). β-סיטוסטרול גם הפחית משמעותית את תכולת ה-MDA (איור 2C), דיכא הזדקנות תאית שנגרמה על ידי CSE (איור 2D), והוריד את הסמנים הקשורים להזדקנות p53 ו-p21 (איור 2E). השפעות אלו לוו בביטוי mRNA GR מוגבר (איור 2F), מה שמרמז כי תפקידו המגן עשוי להיות קשור קשר הדוק להגברת השעתוק של GR. בטווח הריכוז שנבדק, β-סיטוסטרול לא הפעיל סיטוטוקסיות ברורה על חיוניות תאי BEAS-2B (איור 2G), מה שמעיד על סבילות תאית חיובית לתרכובת זו. בהינתן ש-20 מיקרוגרם/מ"ל (כ-48.2 מיקרומון) הציגו את ההשפעות המעכבות החזקות ביותר, מינון זה נבחר לניסויים הבאים. למרות שלא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בין קבוצות 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-20 מיקרוגרם/מ"ל בנוגע לדיכוי ציטוקינים פרו-דלקתיים, 20 מיקרוגרם/מ"ל β-סיטוסטרול הראה ירידה קלה ברמות גורמי הדלקת. יתרה מזאת, בהשוואה ל-10 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מיקרוגרם/מ"ל השיגו יעילות גבוהה יותר בעיכוב הצטברות ROS ו-MDA שנגרמו על ידי CSE, בהפחתת הזדקנות תאית ובהגברת ביטוי ה-GR mRNA. דבר זה תמך בבחירת 20 מיקרוגרם/מ"ל כרכוז העבודה האופטימלי לבדיקות חילוץ המשך.

תוצאות RT-qPCR (איור 2H) אישרו הפלת GR מוצלחת. רמות mRNA ה-GR בקבוצת si-GR ירדו בכ-78% בהשוואה לבקרת si-NC, מה שמאשר את יעילות השתקת ה-GR לבדיקות חילוץ עתידיות. לאחר הפחתת GR, ההשפעות המעכבות של β-סיטוסטרול על גורמים דלקתיים ו-ROS התהפכו באופן משמעותי (איור 2I, J). באופן דומה, גם החלשת הזדקנות התאים על ידי β-סיטוסטרול בוטלה (איור 2K). ביחד, התוצאות הללו הראו כי β-סיטוסטרול מילא תפקיד מגן מפני פגיעה באפיתל הסימפונות הנגרמת על ידי CSE באמצעות מנגנונים אנטי-דלקתיים, נוגדי חמצון ואנטי-הזדקנות בתיווך GR.

β-סיטוסטרול שיפר את ההשפעות הטיפוליות של DEX על תפקוד הריאות ודלקת במודל עכבר של COPD

במודל עכברים של COPD שנקבע מחשיפה לעשן סיגריות, טיפול ב-β-סיטוסטרול, DEX או שילובם כולם הפעיל השפעות הגנה ברורות. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות שונות נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. חמישה סגנונות סמלים מובחנים יושמו להבחנה בין קוהורטות ניסיוניות: עיגולים לקבוצת הביקורת, משולשים לקבוצת המודלים, כוכביות לקבוצת מודל + DEX, ריבועים לקבוצת מודל + β-סיטוסטרול, ויהלומים לקבוצת מודל + DEX + β-סיטוסטרול. כל סוגר אופקי מייצג השוואה סטטיסטית בין שתי קבוצות ניסוי מקושרות.

בהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים בקבוצת מודל COPD הראו ירידה משמעותית בנפח הנשיפה הכפוי ב-0.1 שניות (FEV₀.₁), בקיבולת חיונית כפויה (FVC), בזרימת נשיפה שיא (PEF), וביחס FEV₀.₁/FVC. כפי שמוצג באיור 3A–D, יחס FEV₀.₁/FVC מתחת ל-70% אישר הצלחת להקים את מודל ה-COPD. מתן DEX או β-סיטוסטרול לבדו הפך משמעותית את הליקויים בתפקוד הריאות ביחס לעכברים מודליים, והטיפול המשולב הוביל לשיפורים נוספים לעומת מתן יחיד. בנוסף, יחס MMP-9/TIMP-1 משתנה הוא סמן מולקולרי אופייני לשינוי דרכי הנשימה, וביטוי מוגבר של MUC5AC מייצג הפרשה מופרזת של ריר^40,41. זיהינו בנוסף את רמות ה-mRNA של MMP-9, TIMP-1 וסמן הריר MUC5AC, וחישבנו את יחס MMP-9/TIMP-1 (איור 3E, F). קבוצת המודל הראתה שיפור משמעותי ביחס MMP-9/TIMP-1 ובביטוי מוגבר של MUC5AC. DEX או β-סיטוסטרול לבדו הפחיתו ביעילות את שני הפרמטרים, והטיפול המשולב השיג יעילות מעכבת גבוהה יותר בהשוואה לטיפול מונותרפי.

עכברי מודל COPD הראו עליות בולטות ברמות BALF של TNF-α ו-IL-6, וכן עלייה בתכולת ROS הריאתיות ביחס לעכברי הביקורת. DEX או β-סיטוסטרול לבדו הפחיתו באופן משמעותי הן את רמות הציטוקינים הדלקתיים והן את הלחץ החמצוני, והטיפול המשולב יצר השפעות מעכבות חזקות יותר (איור 3G, H). יתרה מזאת, ביטוי mRNA של GR ריאתי היה מופחת באופן ניכר בעכברי מודל COPD. DEX או β-סיטוסטרול לבדם הגבירו משמעותית את ביטוי ה-GR, והטיפול המשולב העלה עוד יותר את רמות ה-GR (איור 3I).

ביחד, ממצאים אלו הצביעו על כך ש-β-סיטוסטרול מגן מפני שינויים פתולוגיים הקשורים ל-COPD בעכברים על ידי שמירה על תפקוד ריאות, עיכוב דלקת, הפחתת לחץ חמצוני והגברת ביטוי GR. יתרה מזאת, מתן משולב של β-סיטוסטרול חיזק את יעילות ההגנה של DEX במודל זה.

β-סיטוסטרול שיפר את היעילות הטיפולית של DEX, ככל הנראה באמצעות ויסות מסלול ה-GR במודל תאי BEAS-2B המושרה על ידי CSE

במודל תאי BEAS-2B המושרה על ידי CSE, מונותרפיה ב-DEX הפחיתה משמעותית את ביטוי ה-mRNA של ציטוקינים פרו-דלקתיים, הורידה את רמות ROS ו-MDA תוך-תאי, והפחיתה את שיעור התאים המזדקנים וכן את ביטוי סמני ההזדקנות p53 ו-p21. תוצאות אלו מאשרות את הפעילות האנטי-דלקתית, נוגדת החמצון והאנטי-הזדקנה של DEX. ראוי לציין כי מתן משותף של β-סיטוסטרול חיזק עוד יותר את ההשפעות המגנות של DEX, והוביל לדיכוי חזק יותר של דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות תאית בהשוואה למונותרפיית DEX. לאחר הפחתת GR (si-GR) בקבוצת הטיפול המשותף DEX + β-סיטוסטרול, התגובה התאית לטיפול המשולב הייתה מטושטשת באופן ניכר. כפי שמוצג באיור 4A–E, עיכוב דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות על ידי DEX ו-β-סיטוסטרול התהפך באופן משמעותי, מה שמעיד כי חוסר ב-GR החליש את ההשפעות החיוביות של β-סיטוסטרול על יעילות DEX.

ביחד, ממצאים אלו הראו כי β-סיטוסטרול משפר את יעילות DEX, ככל הנראה על ידי ויסות תהליכים הקשורים ל-GR, ובכך הגביר את ההשפעות המגנות של DEX מפני פגיעה בתאי האפיתל הברונכיאלי הנגרמות על ידי CSE.

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי המחקר מסופקים בחומרים המשלימים (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2).

figure-results-1
איור 1: תפקיד מרכזי של β-סיטוסטרול בטיפול ב-COPD. (א) רכיבים פעילים ב-Fritillaria cirrhosa D. Don, פרח מיובש של Lonicera japonica Thunb., ושורש יבש של Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. ו-Adenophora stricta Miq. נבדקו דרך מסד הנתונים של TCMSP. (ב) המטרות הפוטנציאליות של β-סיטוסטרול. (ג) ניתוח חיתוך של מטרות β-סיטוסטרול במורד הזרם וגנים הקשורים ל-COPD. (D) ניתוח עגינה מולקולרית בין β-סיטוסטרול לחלבון GR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: מעורבות GR בהגנה הקשורה ל-β-סיטוסטרול מפני פגיעה תאית הנגרמת מ-CSE. (א) מודולציה תלויה בריכוז של מתווכים דלקתיים מונעים על ידי CSE (TNF-α, IL-6) באמצעות β-סיטוסטרול. (ב)השפעות מינון β-סיטוסטרול על רמת ROS בתאים חשופים ל-CSE. (C) השפעות של β-סיטוסטרול על תכולת MDA המוסדרת על ידי CSE. (ד) השפעת β-סיטוסטרול על הזדקנות תאית המעודדת על ידי CSE. (ה) מודולציה של p53 ו-p21 הקשורים להזדקנות באמצעות β-סיטוסטרול תחת גירוי CSE. (F) ויסות ביטוי GR התלוי בריכוז β-סיטוסטרול תחת גירוי CSE. (G) חיוניות התאים של β-סיטוסטרול בריכוזים שנבדקו בתאי BEAS-2B. (ח)זיהוי RT-qPCR של ביטוי mRNA ב-GR לאימות יעילות ההנקה לאחר העברת siRNA ממוקדת GR. (I) קשר רגולטורי בין GR ל-β-סיטוסטרול לבין גורמים דלקתיים שנגרמו על ידי CSE. (J) קשר רגולטורי בין GR ל-β-סיטוסטרול לבין הצטברות ROS המושרה על ידי CSE. (K) קשר רגולטורי בין GR ל-β-סיטוסטרול לבין הזדקנות תאית הנגרמת על ידי CSE. *p < 0.05; **p < 0.01; עמוד < 0.001; NS, לא משמעותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: השפעות של β-סיטוסטרול בשילוב עם DEX על תפקוד הריאות, דלקת, לחץ חמצוני וביטוי GR בעכברי מודל COPD. (א) שינויים בנפח הנשיפה הכפוי ב-0.1 שניות (FEV₀.₁) בעכברי COPD. (ב) שינויים בקיבולת חיונית כפויה (FVC) בעכברי COPD. (C) השפעות על זרימת נשיפה שיא (PEF) בעכברי COPD. (ד)יחס FEV₀.₁/FVC בעכברי מודל COPD. (E) יחס mRNA יחסי של MMP-9/TIMP-1 משקף שינוי דרכי האוויר. (ו) ביטוי יחסי של mRNA של MUC5AC מצביע על הפרשה יתר של ריר ברקמות הריאות של העכברים. (G) רמות TNF-α ו-IL-6 בנוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF). (ח)ייצור ROS ברקמת הריאות של עכברי COPD. (I) ביטוי יחסי של mRNA של GR ברקמת ריאה של עכבר. *עמוד < 0.05; **p < 0.01; עמוד < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: השפעת β-סיטוסטרול על עמידות DEX בתיווך GR בתאי BEAS-2B המושרים על ידי CSE. (A) ביטוי יחסי של mRNA של גורמים דלקתיים (TNF-α, IL-6) בכל קבוצה. (ב)רמת ROS בכל קבוצה. (C)תוכן MDA בכל קבוצת ניסוי. (D) אחוז תאי BEAS-2B מזדקנים בכל קבוצה. (ה) רמות mRNA יחסיות של סמנים הקשורים להזדקנות p53 ו-p21. **p < 0.01; עמוד < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה משלימה 1: רצפי פריימר המשמשים לניתוח RT-qPCR. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 1: מאגרי נתונים מלאים לניתוח העשרת GO ו-KEGG עבור גני יעד β-סיטוסטרול. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: תוצאות מספריות מפורטות של ניתוח ון המזהות את המטרות החופפות בין β-סיטוסטרול ל-COPD. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COPD מטיל נטל מחלה עולמי משמעותי ונותר אתגר משמעותי לבריאות העולמית¹. הניהול הנוכחי של COPD כולל הן התערבויות פרמקולוגיות והן התערבויות לא-פרמקולוגיות⁴². מבין הטיפולים הפרמקולוגיים, גלוקוקורטיקוסטרואידים (GCs) משמשים באופן נרחב בהפרעות דלקתיות כרוניות. הם פועלים על ידי קישור ל-GR וגיוס היסטון דה-אצטילז 2 לתוך קומפלקסים שעתוקיים כדי להפוך את אצטילציה של היסטונים⁴³. עם זאת, מחקרים רבים הראו ירידה ברגישות ל-GC בחולי COPD^44,45, ומחקרים סיפקו ראיות לעמידות ל-GC במחלה זו⁴⁶. ממצאים אלו מצביעים על כך שהתגברות על עמידות ל-GC היא אתגר קליני משמעותי, המדגיש את הצורך בסוכנים טיפוליים חדשניים. לכן, זיהוי אפשרויות טיפוליות יעילות יותר ל-COPD הוא חשוב מאוד.

מחקרים קודמים הראו כי γ-סיטוסטרול מפעיל אפקט אנטי-רבלרטיבי על תאי אפיתל ברונכיאלי ב-COPD⁴⁷. מכיוון ש-γ-סיטוסטרול ו-β-סיטוסטרול הם רכיבים ביואקטיביים נפוצים בפיטוסטרולים, המחקר הנוכחי מרחיב את ההבנה הנוכחית של פעולות פיטוסטרול ב-COPD ומדגיש את הערך המגן הפוטנציאלי של β-סיטוסטרול בפתוגנזה של מחלה. הממצאים שלנו הראו כי β-סיטוסטרול עיכב משמעותית את שחרור גורמי דלקת, הפחית לחץ חמצוני ודיכא הזדקנות תאית. דבר זה תואם לדיווחים קודמים שהראו כי β-סיטוסטרול מדכא ביעילות את ההגברה של מתווכים דלקתיים המושרים על ידי ליפופוליסכרידים כגון IL-6, סינתאז תחמוצת חנקן מושרה ו-TNF-α⁴⁸. ממצאים אלו מאשרים את פעילותו האנטי-דלקתית ותומכים בעקביותה במודלים דלקתיים שונים.

גרסלים שנשאפים הם סוכנים אנטי-דלקתיים יעילים לשליטה בדלקת בדרכי הנשימה. הם פועלים בעיקר על ידי קשירה והפעלה של GR⁴⁹. עם זאת, מאפיין פתולוגי מרכזי של COPD הוא הרגישות המופחתת של התאים להשפעות האנטי-דלקתיות של GCs⁴⁴. ירידה בוויסות או פגיעה תפקודית ב-GR נחשבת למנגנון מרכזי העומד בבסיס התפתחות העמידות ל-GC בחולי COPD⁵⁰. מחקרים קודמים הראו שתרופות מסוימות יכולות לשפר את הרגישות ל-GC. לדוגמה, השילוב של אזיתרומיצין ובודזוניד יוצר אפקט מעכב משמעותית גדול יותר על ייצור IL-4 ו-CXCL8 מאשר כל אחד מהסוכן⁵¹ בלבד.

ראוי לציין כי המחקר הנוכחי מצא שהן במודלים של COPD חשוף לעשן סיגריות והן במודלים של תאי BEAS-2B שנגרמו על ידי CSE, השילוב של β-סיטוסטרול עם DEX יצר השפעות מעכבות חזקות משמעותית על גורמים דלקתיים, לחץ חמצוני והזדקנות תאית מאשר DEX בלבד. שילוב זה גם שיפר משמעותית את יעילות ההגנה של DEX נגד שינויים פתולוגיים הקשורים ל-COPD ופגיעת תאי אפיתל ברונכיאלי בעכברים. תוצאה זו מצביעה על כך ש-β-סיטוסטרול עשוי לשפר את הרגישות של תאי האפיתל הברונכיאלי ל-DEX, ומספק גישה חדשנית לטיפול באי-רגישות או עמידות ל-GC אצל חלק מהמטופלים ב-COPD. בהתאם לתוצאות ה-PCR הכמותי במבחנה , β-סיטוסטרול מעלה את רמות ה-GR mRNA באופן התלוי בריכוז במקום לשמש ישירות כאגוניסט או אנטגוניסט GR. יעילות ההפלה של si-GR מאומתת ובדיקות הצלה פונקציונלית מאשרות עוד יותר כי β-סיטוסטרול משפר את התגובה לתאי GC על ידי העלאת רמות GR התוך-תאי הכוללות במקום על ידי הפעלה ישירה של GR, ובכך יוצר השפעות טיפוליות משופרות בשילוב עם DEX, אגוניסט GR קנוני. בהתאם לכך, שינויים בביטוי GR עשויים להיות קשורים לפעולה של β-סיטוסטרול, התואם תצפיות קודמות של ירידה משמעותית ב-GR ובאיזופורם הפעיל GRα בתאי שריר חלק בדרכי הנשימה אצל חולי COPD⁵². חשוב לציין שניסויי הדחיפה של GR חשפו עוד יותר את התפקיד המרכזי של קולטן זה בהגנה על ציטו-סיטוסטרול β-סיטוסטרול, מה שמצביע על כך שחלק מהתפקודים הביולוגיים של β-סיטוסטרול תלויים בשלמות מסלול ה-GR.

יחד, המחקר הנוכחי לא רק מגלה כי GR עשוי לשמש כמתווך מרכזי של β-סיטוסטרול בהתערבות COPD, אלא גם מספק גישה חדשה אפשרית להתמודדות עם האתגר הקליני של עמידות ל-DEX, ומניח בסיס ניסיוני לפיתוח טיפולים טבעיים משלמים המיועדים למסלול GR.

עם זאת, למחקר הנוכחי היו מספר מגבלות. ראשית, תפקוד הריאות הוערך רק כדי לאשר את הקמת מודל העכבר COPD בהצלחה, ולא בוצעו צביעות המטוקסילין-אאוזין (HE) ומסון כדי לאמת תכונות פתולוגיות טיפוסיות, כולל אמפיזמה, שיקום דרכי הנשימה והפרשה מוגדרת של הריר. מכיוון שכל דגימות הריאות הקבועות נצרכו בניסויים קודמים, שחזור מודל עכבר COPD שנגרם מעשן סיגריות במשך 12 שבועות לא היה אפשרי בתקופת המחקר הזמינה. כדי להתמודד חלקית עם מגבלה זו, רמות הביטוי של MMP-9/TIMP-1 ורמות הביטוי של mRNA ב-MUC5AC נמדדו באמצעות דגימות RNA ריאות שמורות. שנית, רק מינון משולב יחיד של β-סיטוסטרול ו-DEX הוערך ב-vivo, ולא נחקרו באופן שיטתי השפעות של תגובת מינון או סינרגטיות. מחקרים נוספים המשלבים שילובי מינונים מרובים נדרשים כדי לאפיין אינטראקציות סינרגטיות פוטנציאליות. שלישית, בשל מגבלות ניסוי ועלויות מחקר, נכללו רק שישה עכברים בכל קבוצה. גודל המדגם הקטן יחסית עשוי להגדיל את הרגישות לשונות בין-חיות ולהגביל את החוסן הסטטיסטי של הממצאים. נדרשים מחקרים עתידיים עם גודל מדגם גדול יותר כדי לאמת עוד יותר את התוצאות הנוכחיות. רביעית, קווי תאים עמידים ל-DEX לא הוקמו; לכן, לא ניתן היה להעריך ישירות את היכולת של β-סיטוסטרול להפוך את העמידות הקיימת לגלוקוקורטיקואידים. נדרשים מחקרים נוספים המשתמשים במודלים עמידים לגלוקוקורטיקואיד מאומתים כדי להמשיך לחקור את המנגנון הפוטנציאלי הזה.

לסיכום, ממצאים אלו מצביעים על כך שאיתות GR עשוי להיות מעורב בהשפעות ההגנה של β-סיטוסטרול נגד פגיעה הנגרמת על ידי CSE בתאי BEAS-2B, כולל עיכוב שחרור גורמי דלקת, לחץ חמצוני והזדקנות תאית, וכן שיפורים בתפקוד הריאות ובסמנים ביולוגיים של פגיעות ריאות. יתרה מזאת, β-סיטוסטרול שיפר את הרגישות הטיפולית של תאים אלו ל-DEX. ביחד, ממצאים אלו מזהים את β-סיטוסטרול כמולקולה מועמדת טבעית פוטנציאלית שעשויה לתרום לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות ל-COPD.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר/ים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכותבים אין הכרות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי אפיתל ברונכיאלי אנושיים BEAS-2B	SunnCell, סין	SC-0218	שורת תאים אפיתל ברונכיאלית אנושית למחקר in vitro
עכברי C57BL/6	Vital River Laboratories, סין	213	מודל בעלי חיים עבור COPD בניסוי in vivo
CB-DOCK2	סין	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	עבור סימולציית עגינה מולקולרית בין ליגנד לחלבון קולטן
ערכת ספירת תאים Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, סין	C0038	גילוי של תאים תקינים וריבוי תאים
ערכת גילוי ירוק סנססנציה CellEvent™	Thermo Fisher, ארה"ב	C10851	גילוי של הזדקנות תאים
סיגריות	Hongta, סין	לא נמסר	סיגריה המשמשת לחשיפה לעשן והכנת CSE
CTD	ארה"ב	https://ctdbase.org/	להשגת גנים הקשורים ל-COPD
חומר חומצה מדולל פלואורסצנטי DCFH-DA	Sigma-Aldrich, ארה"ב	D6883-50MG	גילוי רמת ROS תוך-תאי
דקסמטזון (DEX)	Yeasen, סין	40323ES03	גלוקוקורטיקואיד להתערבות משולבת
מדיום DMEM/F12	Gibco, ארה"ב	11330032	מדיום בסיסי לתרבית תאים BEAS-2B
סרום בקר עוברית (FBS)	Gibco, ארה"ב	10270106	תוסף למדיום תרבית התאים
GraphPad Prism	GraphPad Software, ארה"ב	9.3.1	ניתוח סטטיסטי של נתונים ושרטוט גרפים
איזופלוראן	RWD Life Science, סין	R510-22-10	הרדמה נשמתית למתת חיות
ערכת בדיקת פרוקסידציה ליפית MDA	Beyotime Biotechnology, סין	S0131S	גילוי תכולת מלאוndialdehyde (MDA) תוך-תאי
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, ארה"ב	11668030	חומר טרנספקציה למסירת siRNA
קורא מיליפלט מצבים מרובים	Thermo Fisher, ארה"ב	VL0000D0	גילוי ערך ספיגה ופלואורסצנציה
ציטומטר זרימה Navios EX	Beckman Coulter, ארה"ב	B80912	ניתוח של ROS ותאים מזדקנים
פניצילין/סטרפטומיצין	HyClone, ארה"ב	SV30010	אנטיביוטיקה למניעת זיהום חיידקי
תערובת Power SYBR™ Green Master	Thermo Fisher, ארה"ב	4367659	הגברה PCR פלואורסצנטית כמותית
ערכת PrimeScript™ RT reagent	Takara, יפן	RR037Q	טרנסקריפציה הפוכה לסינתזת cDNA
מאגר מידע PubChem	ארה"ב	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	להשגת רצף SMILES קנוני והורדת מידע מבני 3D SDF של בטא-סיטוסטרול
מכשיר QuantStudio Dx PCR	Thermo Fisher, ארה"ב	4479889	גילוי RT-qPCR בזמן אמת
RCSB PDB	ארה"ב	https://www.rcsb.org/	להשגת קובץ מבנה תלת-ממדי של גביש GR
ערכת בידוד RNA/חלבון	Beyotime Biotechnology, סין	R0018S	מיצוי RNA תאי מלא ורקמת ריאות
si-GR	עוצב in silico באמצעות siDirect 2.1	סינתזה מותאמת אישית	הדרכה: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; נוסעת: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, השתקה ל-GR
si-NC	Thermo Fisher, ארה"ב	4390843	משמש כבקר טרנספקציה שלילי לניסויים תאיים וב-vivo
מאגר מידע SwissTargetPrediction	שוויץ	http://swisstargetprediction.ch/	להשגת חיזוי in silico של מטרות חלבון פוטנציאליות הקשורות לתרופות
מאגר מידע TCMSP	סין	https://www.tcmsp-e.com/	להקניית מרכיבים צמחיים וחיזוי מטרות
TTD	סינגפור	https://db.idrblab.net/ttd/	להשגת אוסף גנים הקשורים ל-COPD מאומתים
תא חשיפה לעשן בגוף השלם	Teague Enterprise, ארה"ב	TE-2	הקמה של מודל COPD הנגרם מעישון סיגריות
β-סיטוסטרול	ChemicalBook, סין	83-46-5	פיטוסטרול פעיל לטיפול תרופתי

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

234 234

פרמקולוגיה רשת ומחקר ניסויי של β-סיטוסטרול בטיפול במחלת ריאות חסימתית כרונית באמצעות קולטן גלוקוקורטיקואידי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים