Method Article

פרוטוקולים לגידול יעיל וניתוח תפקודי של הצרעה האנדופרזיטואידית Asobara japonica והמארח שלה Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/72035

⸱

July 24th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Degree Programs in Life and Earth Sciences, Graduate School of Science and Technology, University of Tsukuba, 2Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 3Doctoral Program in Humanics, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת הפרוטוקול היא להקל על ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ב-Asobara japonica וב-Drosophila melanogaster. באמצעות שיטות גידול אופטימליות, בדיקת זיהום בביצת ביצים יחידה, והפלת גנים בתיווך RNAi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טפילים הוא אינטראקציה ביולוגית שבה אורגניזם אחד מנצל את גופו או משאביו של אורגניזם אחר (המארח), וגורם לנזק משמעותי או מוות למארח. מבין בעלי החיים הטפיליים, צרעות טפיליות הן אחת השושלות העשירות ביותר במינים, ומהוות כמעט 20% מכלל מיני החרקים. במיוחד, צרעות אנדופרזיטואידיות מטיפות ביציות ישירות לגוף המארח ומשמשות מגוון רחב של גורמי ארס כדי לשלוט בהתפתחות המארח, במערכת החיסון ובפיזיולוגיה. בתגובה למתקפת צרעות, המארחים מנסים לחסל ביצי פרזיטואידים באמצעות מנגנוני חיסון מולדים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והתאיים שבאמצעותם רכיבי הארס הבודדים מווסתים את ביולוגיית המארח ומקדמים פרזיטיזם מוצלח עדיין אינם מובנים היטב. כאן אנו מתארים פרוטוקול מעבדה סטנדרטי לגידול צרעת האנדופרזיטואיד Asobara japonica והמארח שלה Drosophila melanogaster. זנים פרתנוגנטיים ומיניים של A. japonica זמינים, והזן הפרתנוגנטי מציג שיעור הצלחה גבוה בטפילים, מה שמאפשר שמירה יציבה על מלאי המעבדה לניתוח גנום ובדיקות טפיל. בדיקת זיהום בביצת ביצים אחת ושיטת הפלת גנים מבוססת RNA דו-גדילי אופטימיזציה לניתוח פונקציונלי של גני ארס. יחד, פרוטוקולים אלו מספקים מסגרת ניסויית מעשית לפירוק המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח, ויסייעו במחקר עתידי בביולוגיה התפתחותית, אימונולוגיה ופיזיולוגיה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טפילים הוא אורח חיים שבו אורגניזם אחד מנצל את משאבי התזונה של אורגניזם אחר והוא נפוץ בין טקסונים. ההערכה היא שעד מחצית מכל האורגניזמים הידועים מציגים טפילים במחזור החייםשלהם 1. מבין הטפילים, צרעות טפיליות הן קבוצה מגוונת במיוחד, ומהוות כ-20% מכלל החרקים2. הם מנצלים מגוון רחב של מארחי פרוקי-רגליים, כגון חרקים, עכבישים וקרדיות, ומפגינים גיוון מרשים בהיסטוריית חייהםובאסטרטגיות הטפיל שלהם. תכונות אלו הופכות את צרעות הטפיל לאחת מקבוצות החרקים המצליחות ביותר מבחינה אבולוציונית ואקולוגית.

אינטראקציות בין פרזיטואידים למארחיהם נחקרו בהרחבה כמערכות מודל של "מרוצי חימוש" אבולוציוניים. במיוחד, צרעות אנדופרזיטואידיות מפעילות מגוון רחב של גורמים, כולל ארסים, וירוסים סימביוטיים וטרטוציטים 4,5. גורמים אלו משפיעים על הפיזיולוגיה וההתפתחות של המארח, ובכך מבטיחים התפתחות מוצלחת בתוך המארח. למרות ההתקדמות הזו, המנגנונים המולקולריים שמאחורי הטפיל נותרו מובנים היטב ברוב מיני הטפילים. מגבלה עיקרית אחת היא גודל הגוף הקטן שלהם, מה שמקשה על זיהוי רכיבי הארס הביוכימיים. בנוסף, מאתגר טכנית לשמור על פרזיטואידים ומארחיהם בשלבי התפתחות מסונכרנים בתנאי מעבדה.

התקדמות אחרונה בריצוף הדור הבא ובטכנולוגיות אומיקס נוספות מאפשרת כיום ניתוחים כלל-גנומיים גם במינים פרזיטואידים קטנים מאוד. גישות אלו פתחו דרכים חדשות לחקר מנגנונים מולקולריים שבעבר לא היו נגישים, ומאפשרות לחקור אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ברזולוציה חסרת תקדים. בהקשר זה, המעבדה שלנו מתמקדת ב-Asobara japonica Belokobylskij  (הימנופטרה: Braconidae), מין שזוהה במקור ביפן 6,7,8. A. japonica כוללת זן פרתנוגנטי תליטוקוס, שבו הנקבות מייצרות צאצאים ללא הזדווגות. תכונה זו מאפשרת לנו לאסוף כמויות משמעותיות של DNA גנומי אחיד גנטית לצורך ריצוף גנומי מלא9. בנוסף, מין זה מטפיל מגוון רחב של מיני דרוזופילה, כולל האורגניזם המודל D. melanogaster,  שמציע יתרונות ניסיוניים משמעותיים בזכות תנאי הגידול המבוססים היטב ושלבי ההתפתחות המוגדרים במדויק, המאפשרים בדיקות זיהום שחזוריות ושליטה מדויקת בהתפתחות הפרזיטואידים.

במהלך הטפיל של A. japonica, נקבת צרעה מזריקה ארס יחד עם ביצה אחת לזחל זבוב, שבתוכה צמח זחל צרעה לצד המארח שלו. ראוי לציין כי A. japonica מציג שיעור הצלחה גבוה בפרזיטיזם אצל המארח D. melanogaster, מה שהופך את זוג הטפיל-מארח הזה למודל ניסיוני חזק. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגידול יציב, בדיקת זיהום ביצית אחת, ושיטת הפלת גנים מבוססת RNA דו-גדילי (dsRNA) ב-A. japonica. פרוטוקולים אלו מספקים מסגרת אמינה לפירוק מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס אינטראקציות בין טפילים למארח.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה סכמטית של שיטת הגידול הסינכרון של D. melanogaster ו-A. japonica מוצגת באיור 1.

1. גידול זבוב הפרי המארח Drosophila melanogaster במעבדה

  1. לשמור על כל בעלי החיים הניסיוניים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50-60% במחזור אור/חושך של 12:12 שעות. השתמשו בזן הפראי Oregon-R (OR) כמארח ל-A. japonica (איור 2A).
  2. העבר זבובים בוגרים לבקבוקון מזון חדש המכיל מדיום סטנדרטי של קמח תירס-שמרים-אגר (0.55% אגר, טבלה 1). סמנו את הבקבוקון בתאריך ההעברה ואת שם הזן כ"OR".
  3. פנה את הזבובים הבוגרים יום לאחר ההעברה כדי למנוע כמות מופרזת של ביצים במזון. ודא שזחלי הצאצאים ניזונים על פני השטח של המזון.
    הערה: כהנחיה, יש לשמור על כ-200-250 ביצים לכל בקבוקון מזון (φ30×100 מ"מ). צפיפות ביצים גבוהה יותר עשויה להפחית את הצלחת הטפילים ולהגביר את השונות בהתפתחות המארח והצרעות.
  4. ארבעה ימים לאחר שלב 1.2, העבר כף של זחלי זבובים (4 ימים אחרי הטלת הביצה, dAEL) לבקבוקון מזון חדש. שמרו על הזחלים הללו ללא חשיפה לפרזיטואידים לדור הבא. הליך זה גם מסייע לשלוט בצפיפות הזחלים בבקבוקון.

2. גידול צרעת האנדופרזיטואיד Asobara japonica במעבדה

  1. השתמש בזן פרתנוגנטי טוקיו (TK) וזן מיני איריומוט-ג'ימה (IR) (איור 2B). הראשון מורכב מנקבות, בעוד שהשני מורכב מנקבות וגברים. הזכרים מתקרבים ביומיים-ארבעה לפני הנקבות. לכן, יש לאשר את נוכחות הנקבות על ידי המטינים שלהן לפני ההעברה.
  2. העבר 10-20 צרעות בוגרות ישירות מהבקבוקון המקורי אל הבקבוקון המכיל זחלים של זבובים ב-4 dAEL. סמנו את הבקבוקון עם תאריך ההעברה ושם הזן "TK" או "IR". שמרו על הצרעות באותם תנאים כמו שלב 1.1.
  3. אפשר לצרעות בוגרות להטיח ביצים בזחלי זבובים. פנו את הצרעות הללו יום עד יומיים לאחר מכן כדי למנוע טפילות-על, שיכולה להוביל למוות מארח. הסירו זבובים בוגרים סגורים שברחו מטפיל 10 ימים או יותר לאחר שלב 2.2.
  4. שבועיים לאחר שלב 2.2, צרעות בוגרות מתחילות להתקרב ממארז הגולם של זבוב המארח. העבר את הצרעות הבוגרות החדשות הללו לבקבוקון מזון חדש עם נייר סינון המכיל 25% גלוקוז ותמיסת ויטמין C של 50 מ"מ. חתיכות נייר הסינון צריכות להיות מחוטאות בטמפרטורה של 130 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. מתן הפתרון על נייר סינון מקדם התנהגויות ביציות ומאריך את חיי הצרעות הבוגרות. הגישה שלנו לשימוש בוויטמין C לשיפור הביוץ הושפעה מתצפיות במחקרי דרוזופילה 11.

3. מבחן זיהום עם ביוץ יחיד

  1. סנכרנו את שלב ההתפתחות של זחלי הזבובים ששימשו לניסוי ההדבקה.
    1. הניחו את הזבובים הבוגרים בצינור של 50 מ"ל עם צלחת אגר של מיץ ענבים (3% אגר) עם משחת שמרים טרייה, ותנו להם להטיל ביצים במשך 24 שעות.
    2. אספו זחלים חדשים מהשלב הראשון על צלחת האגר של מיץ הענבים והעבירו אותם לבקבוקון קטן (12 מ"ל) המכיל 2-3 גרם משחת מזון זבובים (מזון זבובים מעורבב עם כמות מתאימה מים). 20-30 זחלים מונחים בבקבוקון. זחלי הזבובים מורשים לגדול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  2. בנקודת הזמן המתאימה, יש להכין צלחת פטרי באורך 4 ס"מ המכילה שכבה דקה ואחידה של משחת מזון זבובים, המכסה שטח בקוטר של כ-1.5-2.0 ס"מ (להלן ייקרא זירת בדיקת זיהום). בנוסף לזירת בדיקת הזיהום, יש להכין בקבוקון קטן חדש (12 מ"ל) המכיל כמות מתאימה של משחת מזון לזבובים. בקבוקון זה משמש לגידול זחלי המארח לאחר בדיקת הזיהום.
  3. אספו זחלים מדורגים והעבירו אותם לצלחת המכילה מים דה-יוניים (התנגדות = 15 MΩ·cm, 25 °C). שטוף את הזחלים בצלחת בערבוב עדין כדי להסיר שאריות מזון מגופם.
  4. לאחר השטיפה, הסר בעדינות את עודף הלחות מהזחלים באמצעות מגבוני נייר נטולי סיבים, שכן עודפי מים מפריעים להתנהגות הביוץ של הצרעות באזור בדיקת הזיהום. לאחר מכן העבירו את הזחלים לזירה. שלב זה מגביר את פעילות הזחלים במהלך ניסוי ההדבקה.
  5. הרדימו צרעות בוגרות בגזCO2 בקצב זרימה של 5 L·min-1 ולחץ של 0.2 MPa. לאחר מכן, הכניסו בעדינות כשלוש נקבות צרעות לזירת בדיקת הזיהום. סגרו את המכסה של הצלחת ותנו להם להתאושש על משחת מזון לזבובים.
  6. התבוננו בהתנהגות הביוץ של הצרעות תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ (הגדרת זום: 10× עד 15×).
    הערה: כאשר צרעה נוגעת בגוף זחל זבוב בתנועה, היא מכניסה במהירות את האוביפוזיטור שלה לגוף הזבוב ומזריקה רכיבי ארס. למרות שזחל הזבוב מתפתל ומתנודד בגופו, הוא מיד משתתק. לאחר מכן, הצרעה רוטטת את בטנה ומניחה ביצה בגוף הזחל של המאכסן, ולאחר מכן הביופוזיטור נשלף. התנהגות ההטלה הזו נקראת זיהום.
  7. לאחר ההדבקה, פתחו את המכסה והעבירו את זחל הזבובים הנגוע לבקבוקון קטן חדש המכיל משחת מזון זבובים שהוכנה בשלב 3.2. כדי לתקן את זמן ההדבקה, יש לבצע את ניסוי ההדבקה בתוך 15 דקות.
  8. יש לסמן את הבקבוקון הקטן במידע ניסיוני, כגון תאריך, שם המדגם, זמן ההדבקה ומספר האנשים. הבקבוקים נסתמים ואז מונחים במיכל לח ונשמרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

4. יצירת צרעות RNAi (RNAi) באמצעות הזרקת dsRNA

  1. סינתז dsRNA באורך 400 bp ומעלה להפלת גנים בתיווך dsRNA (הפרעות RNA, RNAi) באמצעות מערכת סינתזת dsRNA מבוססת שעתוק במבחנה . דגימות ה-dsRNA צריכות להישמר בטמפרטורה של מינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. פרוטוקולים מפורטים הם כפי שתואר קודם9.
  2. הכינו צלחת פטרי באורך 5.5 ס"מ המכילה 2% אגר למיקום גופות צרעות. מלאו שני שלישים מכל צלחת באגר כדי ליצור שכבה עבה של צלחת אגר להזרקה.
  3. הנח מגבון נייר ללא סיבים ולח במים על מכסה של כלי פלסטיק.
  4. אסוף גולמי זבובי מארח 7 ימים לאחר ההדבקה (DPI) מהבקבוקון והניח אותם על מגבוני נייר נטולי סיבים שהוכנו בשלב 4.3. הוספת טיפה של מים לדופן הבקבוקון עוזרת להפריד את קופסאות הגולם של זבוב המארח מהבקבוקון.
  5. מתחת לסטריאומיקרוסקופ (הגדרת זום: 20×), הסר את מארז הגולם של זבוב המארח וחשף גוף צרעה עם מלקחיים. ב-7 dpi, רוב הצרעות נמצאות בשלב הגולם, שבו ניתן להבחין בין חלקי הראש, החזה והבטן. גוף צרעה הוא בלתי נייד.
  6. הניחו את גופות הצרעות שנאספו על לוח האגר שהוכנה בשלב 4.2, תוך יישור צירי הגוף באותו כיוון. סדר 20-30 גופים של צרעות כשהצד הגבי שלהן כלפי מעלה בקו אחד עד שתיים. הסר לחות עודפת מפלטת האגר באמצעות מגבון נייר ללא סיבים כדי למנוע החלקה של צרעות.
  7. בהתאם להוראות היצרן, התקן את מכשיר ההזרקה ומיקרוסקופ הסטריאו (איור 3A). השתמש במערכת מיקרוהזרקה המצוידת במחט זכוכית קפילרית המאפשרת שליטה מדויקת בנפח ההזרקה. הנח את לוח האגר שבו ראשי הצרעות מכוונים לכיוון קצה מחט ההזרקה. נפח ההזרקה הוא 50 nL·wasp-1 ומהירות ההזרקה היא 50 nL·sec-1 במזרק.
  8. הכינו מחטים קפילריות מזכוכית באמצעות מושך מחטים. צורת נימי הזכוכית ניתנת לכיוון עם טמפרטורת המחמם.
  9. הנח את מחט הזכוכית הקפילרית על מטחנת המחט בזווית של 30-35°. שחיקו את המחט עד שאורך הקצה מגיע ל-0.04 מ"מ (ארבע חלוקות על רשתית העינית, איור 3B).
  10. רגע לפני ההזרקה, הפשרה של dsRNA. ריכוז ה-dsRNA הוא 0.25-1 מיקרוג·μL-1. לצורך המחשה, תמיסת ה-dsRNA צבועה בצבע כחול (מלח אריוגלאוצין די-נתרן, 2% משקל·נפח 1). באמצעות קצה פיפטה מיקרולודר, מלא את נימי הזכוכית בתמיסת dsRNA בצבע כחול. 4 מיקרוליטר מספיקים להזרקת 30 גופים של צרעות. ודא שאין בועות אוויר בתוך התמיסה.
    הערה: לאחר טעינת תמיסת ה-dsRNA, הקישו בעדינות על צד המחט עם ציפורן כדי להסיר בועות אוויר כלואות. בועות אוויר שנותרו עלולות לחסום את זרימת התמיסה ולהפריע להזרקה מוצלחת.
  11. באמצעות מזרק של 1 מ"ל ומחט, מלא את החלק הפנוי של נימי הזכוכית בשמן מינרלי, כדי להבטיח שלא יישארו בועות אוויר בתוך הנימים.
  12. חבר את מחט הזכוכית הקפילרית המכילה תמיסת dsRNA ושמן מינרלי למחזיק המחט ואז התקן אותה על מכשיר ההזרקה.
  13. כוונן את מיקום פלטת האגר ומחט הזכוכית הקפילרית על המזרק, כך שהמחט תהיה ממוקמת בזווית של 30-45° יחסית לגופי הצרעות (איור 3A).
  14. הכנס את המחט הקפילרית מזכוכית לצד הגבי של גוף הצרעה, כאשר הצד הצידי מעט לקו האמצע הגב. הזרקת מיקרו לתמיסת ה-dsRNA בתוך הגוף. תמיסת ה-dsRNA המוזרקת נראית בצבע  כחול (איור 3C).
  15. לאחר ההזרקה, הניחו את לוחות האגר במיכל לח (70-80% לחות יחסית) ושמרו אותן בתנור של 25 מעלות צלזיוס למשך שבוע, עד שהצרעות הבוגרות מתקרבות למקום. גופות צרעות פצועות, יש להסיר מלוח האגר כדי למנוע זיהום חיידקים.
    נקודת הפסקה: בשלב 4.6, ניתן לשמור את גולם הצרעה על לוח האגר במשך מספר שעות לפני ההזרקה. מחטים יכולות להיות מוכנות מראש (שלב 4.8 ו-4.9); עם זאת, הם נוטים לסתימה לאורך זמן. מחטים טריות בדרך כלל מספקות ביצועי הזרקה אמינים יותר.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזנים הא-מיניים והמיניים של Asobara japonica
A. japonica נפוצה ברחבי יפן. זנים פרתנוגנטיים תליטוקוס דומיננטיים באיים המרכזיים, בעוד שזנים מיניים ארנוטוקוס נמצאים באיים הסובטרופיים, כולל איי אמאמי-אושימה ואיריאומוטה-ג'ימה 8,12. בזנים מיניים, הזכרים יוצאים מוקדם יותר מהנקבות בכמה ימים, כך שמועד ההעברה של הבוגרים מובחן ביניהם. פרתנוגנזה תליטוקוס ב-A. japonica נגרמת על ידי זיהום בוולבאכיה, חיידק אנדוסימביוטימועבר מהאם 13. הסרת וולבכיה באמצעות טיפול אנטיביוטי גורמת לייצור זכרים 9,14, והשתלת וולבכיה לזנים מיניים גורמת לפרתנוגנזה15. גם זנים א-מיניים וגם זנים מיניים של A. japonica מציגים הצלחה גבוהה בטפילים במספר מיני דרוזופילה. לדוגמה, הם יכולים לטפיל את D. suzukii, מזיק פירות חשוב כלכלית, ונחשבים לסוכני שליטה ביולוגיים פוטנציאליים בחקלאות16. מבין הזנים הזמינים, השתמשנו בעיקר בזן TK שנדבק בוולבאצ'יה בניסויים שלנו. זן TK מציג פעילות טפילים גבוהה יותר כלפי זחלי המארח בהשוואה לזן IR14, מה שהופך אותו מתאים לניתוחים.

הצלחה בפרזיטיזם תלויה בתנאי הגידול
שיעור ההצלחה בטפילות של A. japonica בדרך כלל גבוה, אך הוא מושפע מאוד ממצב הגידול של זבובי הפונדקאי. בתנאים דלים בחומרים מזינים, תקופת הגדילה של זחלי הזבוב מוארכת ומועד ההפניה מתעכב17. בתנאים אלה, צרעות עלולות להיכשל בניצול נכון של משאבי המארח ולסנכרן את התפתחותן עם המארחים. כדי לבחון אפשרות זו, גידלנו זבובים וצרעות בתנאים של שמרים רגילים (1×) ועניים בשמרים (0.1×). לאחר מכן הערכנו את הצלחת הפרזיטיזם ואת תזמון ההתפתחות (איורים 2C, 2D). הצלחת הטפיל חושבה כיחס בין צרעות בוגרות שצמחו לזחלים המארחים.

בתנאי שמרים רגילים, שיעור ההצלחה בטפיל היה 81.7% בבדיקת הזיהום בביצת ביצה אחת (איור 2C, שמאל; טבלה 2). כאשר תכולת השמרים ירדה ל-10% (מצב דל בשמרים), שיעור ההצלחה בטפיל ירד ל-35.0% (איור 2C, מימין; טבלה 2). הפחתה הזו עשויה להיות מוסברת בכך שכ-50% מהזחלים מתו לאחר ההדבקה. תוצאות אלו מצביעות על כך שהקצאת המשאבים בין מארח לטפיל מופרעת בתנאים דלים בחומרים מזינים.

ראוי לציין כי תזמון הסרת הצרעות לא התעכב באותה מידה בתנאים דלים לשמרים כמו בתנאי שמרים רגילים. בעוד שמועד אקלוזיית הזבובים התעכב עד 9 ימים, תזמון אקלוזיית הצרעות התעכב רק עד 4-5 ימים. תוצאה זו מרמזת שזמינות חומרים מזינים משפיעה בעיקר על התפתחות המארח. תזמון האקלוזיה עקבי הן בזבובים והן בצרעות בתנאי שמרים רגילים, אך לא בתנאי שמרים עניים, מה שמרמז כי התפתחות מסונכרנת בין פרזיטואידים למארחים תלויה בזמינות החומרים התזונתיים.

גישה מבוססת RNAi לניתוח פונקציונלי של גני ארס
למרות שניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים של בלוטת הארס מזהים מולקולות מועמדות רבות, עדיין לא ברור אילו מהן נדרשות לטפיל מוצלח. כדי לקבוע את התפקידים הפיזיולוגיים של מולקולות מועמדות אלו, נדרשים ניתוחים פונקציונליים ב-vivo באמצעות גישות של הפללת גנים.

לאחרונה דיווחנו כי טפילת A. japonica גורמת לאפופטוזיס, אוטופגיה ועצירה מיטוטית בדיסקים הדמיוניים של זחלי D. melanogaster, מה שמוביל לפירוק רקמתי חמור, תופעה הנקראת התדרדרות דיסקית דמיונית (IDD)10. כדי לזהות את המולקולות האחראיות ל-IDD, ביצענו סקר RNAi של גנים מועמדים שזוהו בניתוחים טרנסקריפטומיים, פרוטאומיים והשוואתיים. כתוצאה מכך, זוהו שני גנים, גורם התדרדרות דיסק דמיוני (IDDF)-1 ו-IDDF-2. גם IDDF-1 וגם IDDF-2 מכילים את תחום הפונקציה הלא ידועה 4803 (DUF4803). ראוי לציין כי לאחר הדו"ח הראשוני שלנו, מחקר עצמאי זיהה מספר חלבוני ארס של A. japonica (המכונים פירוק מושרה על ידי ארס, VID) הקשורים ל-IDD, שלכולם יש גם את תחום DUF480318.

בהתבסס על תוצאות אלו, שיפרנו עוד יותר את פרוטוקול ה-RNAi לשיפור השחזוריות והיעילות. במיוחד, השימוש ב-Nanoject III אפשר שליטה מדויקת בנפח ובמהירות ההזרקה, מה שהוביל לתוצאות הפללה עקביות יותר.

כדי להעריך את יעילות פרוטוקול ה-RNAi האופטימלי, ביצענו הפלת IDDF-1. בצרעות בוגרות סגורות, רמת הביטוי של IDDF-1 ירדה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3D). לצורך אימות פונקציונלי, ביצענו בדיקות זיהום ביצית אחת באמצעות צרעות RNAi וזחלי זבוב מארח שהביעו את דיווח האפופטוזיס GC3Ai באזור כיס הכנפיים19. אות GC3Ai זוהה בכיס הכנף לאחר זיהום בצרעות השליטה (GFP RNAi). לעומת זאת, אות ה-GC3Ai ירד משמעותית לאחר הדבקה בצרעות RNAi IDDF-1 (איור 3E, 3F). תוצאות אלו תואמות ממצאים קודמים, ומאשרות כי תפקוד IDDF-1 מדוכא למעשה על ידי RNAi.

figure-results-1
איור 1. סקירה סכמטית של נהלי הגידול של D. melanogaster ו-A. japonica. 
הליכים מדורגים לפי שלבי ההתפתחות של D. melanogaster. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. טפילים על ידי Asobara japonica. (A) סכמטיקה של הקשר ההתפתחותי בין D. melanogaster לטפיל שלה A. japonica. נקבת צרעה מטילה ארסים וביצה אחת לזחל זבוב. לאחר הבקיעה, זחל הצרעה מתפתח במקביל לזחל המארח, אשר לאחר מכן מתגלם. לאחר הגלם, הצרעה אוכלת את כל גוף הזבוב ולבסוף מתרחקת ממארז הגולם של הזבוב. (B) צרעות בוגרות מהזן הא-מיני (משמאל) ושל הזן המיני (מימין) של A. japonica. פס קשקש, 1 מ"מ. (C) קצב יציאה של זבובים או צרעות בתנאים רגילים (1×) ועניים בשמרים (0.1×). בדיקות זיהום בהטלת ביצים בודדות בוצעו באמצעות זחלי זבוב מארח 4 ימים לאחר הטלת ביצים (dAEL). n = 267 (1×, זבובים), 120 (0.1×, זבובים), 85 (1×, צרעות), ו-80 (0.1×, צרעות), בהתאמה. (ד) תזמון הסרת זבובים וצרעות תחת שני תנאי התזונה המוצגים ב -(C). היחס בין הבוגרים לגולמים מצוין במיוחד. n = 250, 107, 61 ו-41, בהתאמה. החץ השחור מציין את מועד ההדבקה בצרעה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. תהליך RNAi אופטימלי באמצעות Nanoject III. (א) הקמת מכשיר המיקרוהזרקה תחת מיקרומיקרוסקופ. המחט הקפילרית מזכוכית הוצבה בזווית של 30-45° יחסית לפלטת האגר. (ב) קצה המחט הקפילרית מזכוכית הושחז באמצעות מטחנת מחטים. (ג) תמיסה צבועה בכחול הוזרקה מיקרו לגוף צרעה באמצעות מחט קפילרית מזכוכית. הצד הקדמי של הצרעה מסומן על ידי A בתמונה. P, אחורית. פס סולם, 1 מ"מ. (D) רמות הביטוי של IDDF-1 בצרעות RNAi GFP ו-IDDF-1 RNAi נמדדו באמצעות שיטת דלתא-דלתא Ct . רמות הביטוי נורמל ל-RpL32-Aj. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SD עם נקודות נתונים בודדות (n = 5). P < 0.005 (מבחן t לתלמיד). (E ו-F) אותות GC3Ai בדיסקי כנף של זחלים וזחלים לא נגועים לאחר 6 שעות לאחר ההדבקה (hpi) לאחר זיהום בצרעות RNAi בקרה (GFP RNAi)  או IDDF-1 . דיסקי הכנפיים מסומנים בקווים לבנים מנוקדים בהתבסס על צביעת DAPI של גרעינים (1:10000, 62247; תרמו פישר סיינטיפיק). היחס בין שטח ה-GC3Ai החיובי לשטח כיס הכנף נמדד. P < 0.005 (ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי). n = 11 שכפולים ביולוגיים לכל קבוצה. פס קנה מידה, 100 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

רכיביםסכום
מים1 ליטר
אגר5.5 גרם
שמרים40 גרם
קמח תירס90 גרם
גלוקוז100 גרם
חומצה פרופיונית3 מ"ל
10% בוטיל p-הידרוקסיבנזואט ב-70% EtOH3.5 מ"ל

טבלה 1: רכיבים של מדיום סטנדרטי של קמח תירס-שמרים-אגר (מזון זבובים).

סוג המזוןמצב# של סך כל הפרטים# של יחידים סגורים או מתיםקצב יציאה של זבובים או צרעות (%)
תעופצרעהגולם קטלניזחל קטלני
1×לא נגועים267248021792.88389513
A. japonica נגועה12009891381.66666667
0.1×לא נגועים85380232444.70588235
A. japonica נגועה80028133935

טבלה 2: מספר פרטים ושיעורי הופעה בתנאים תקינים (1x) ועניים בשמרים (0.1x).

שם ראשירצף (5'>3')מטרה
AjRpL32_qPCR_FwdCCCGTCACATGCTTCCTACTqRT-PCR
AjRpL32_qPCR_RevGAATTTGCGATTCTGCATCAqRT-PCR
qPCR_gene007424_FwdTGGGCAATGATGTGTGTGAGTqRT-PCR
qPCR_gene007424_RevGCGTCCCTGTATCGAAGGTAqRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_FwdATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAGשיבוט CDS
Aj_gene007424_ex10_RevTCAGCACCTTCTACCCGGCAAATTשיבוט CDS, תבנית dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_FwdGAGGAGAGTGGCAGGgtgtagתבנית dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_RevGGATCCTAATACGACTACTATAGGT
CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT		תבנית dsRNA
T7_Aj_gene007424_
RNAi_Fwd		GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAGAGG
GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG		תבנית dsRNA
※ פריימרים ותבניות dsRNA אלו מדווחים ב-Kamiyama ואחרים. 2022.
※ gene007424 מייצג IDDF-1.

טבלה 3: רצפים של פריימרים ותבניות dsRNA ששימשו במחקר זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה הקמנו פלטפורמה ניסויית רב-שימושית לחקר אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ברמה המולקולרית. על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול, בדיקת זיהום עם ביוץ יחיד ופרוטוקול RNAi, אנו מספקים מערכת איתנה למחקרים פונקציונליים של גורמים שמקורם בפרזיטואידים. פלטפורמה זו תסייע במחקרים עתידיים שמטרתם לחשוף את המנגנונים שבאמצעותם צרעות טפיליות מפעילות את התפתחות המארח, וייתכן שגם תתרום לפיתוח אסטרטגיות ביולוגיות להדברת מזיקים.

זן ה-TK הנגוע בוולבאצ'יה של A. japonica מספק מערכת ניסויים שניתנת לשחזור רבה לניתוח טפילים. במחקרים רבים על מארח פרזיטואידי, תוצאות ניסוי משתנות לעיתים, כאשר הישרדות המארח והצלחת הפרזיטואידים תלויות ברגישות בתנאים הסביבתיים והפיזיולוגיים. לעומת זאת, זן ה-TK מציג הצלחה גבוהה בעקביות בטפילות, ויוצר למעשה מצב "דומיננטי טפילי" שבו תוצאת ההדבקה אחידה ברובה. יתרה מזאת, כזן פרתנוגנטי, הוא מפחית את השונות הניסיונית בין פרטים בשל הרקע הגנטי האחיד שלו. שחזוריות זו מאפשרת מעקב אמין אחר תהליך הטפיל ומקלה על ניתוחים כמותיים של תגובות מארח וגורמים נגזרים מטפילים.

בנוסף, רביית תליטוקוס מקלה מאוד על ניתוחים גנומיים בכך שהיא מאפשרת יצירת DNA גנומי הומוגני במיוחד, דבר קריטי להרכבת גנום איכותית9. למרות שזנים פרתנוגנטיים כאלה אינם זמינים בכל מיני הפרזיטואידים, התוצאות שלנו מדגישות את הפוטנציאל של תליטוקי המושרה על ידי וולבכיה כאסטרטגיה לשיפור משאבי הגנום. הקמת קווים נגועים בוולבאצ'יה במינים פרזיטואידים אחרים עשויה להיות גישה עוצמתית להרחבת משאבי הגנום ולהאיץ מחקרים מולקולריים השוואתיים בין פרזיטואידים.

תוצאות הפרזיטיזם מושפעות מאוד מתנאי תזונה של מאכסן, מה שמעיד שתנאי הגידול הם גורם קריטי להצלחת הפרזיטואידים. מכיוון שפרזיטיזם מוצלח תלוי בתיאום זמני מדויק עם התפתחות המארח והצרעה, תנאי תזונה לא מבוקרים עלולים להפריע לתהליך זה ולהפחית את השחזור. לכן, תקנון זהיר של תנאי גידול המארח חיוני להקמת מערכת ניסויים אמינה לחקר אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח. יתרה מזאת, יש לשמור על בקבוקוני הקת זבובים בנפרד מבקבוקוני צרעות, שכן נוכחות הצרעות מפחיתה את התנהגויות הביוץ של הזבובים20,21.

כדי לאפשר הערכה כמותית של אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח, פיתחנו מבחן זיהום עם ביוץ יחיד שבו ביצית אחת מונחת בכל מארח. בדיקה זו מנוגדת לבדיקות זיהום בכמויות גדולות קונבנציונליות, שלרוב כוללות אירועי ביוץ מרובים שמובילים לנזק מופרז למארח ולמוות. כדי לקדם ביציות יעילות בתוך חלון זמן מוגבל (~15 דקות), הצרעות הבוגרות שזה עתה נסגרו קיבלו תמיסת גלוקוז וויטמין C, ובכך שיפרו את יעילות ההטלת הביצים ואת השחזור הכולל.

בנוסף, אופטימיזציה של פרוטוקול RNAi לניתוח תפקוד גנים אצל צרעות פרזיטואידיות. באמצעות מערכת המיקרו-הזרקה השגנו שליטה מדויקת בנפח ההזרקה ושיפרנו את העקביות ביעילות ההשלכה. אימות פונקציונלי באמצעות IDDF-1 אישר ששיטה זו מדכאת ביעילות ביטוי גנים ומניבה תוצאות פנוטיפיות ששחזוריות. בהינתן שמחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים ממשיכים לזהות מספר רב של גורמי ארס מועמדים, זמינות פלטפורמת סקר פונקציונלית תהיה חיונית לקביעת תפקידם הביולוגי.

מגבלה של פרוטוקול RNAi זה היא שאינו מתאים לניתוח גנים הפועלים בשלבים הראשונים של התפתחות הצרעות, שכן מבחינה טכנית קשה להזריק dsRNA לביצי צרעות שנמצאות בתוך גופי המארח. כדי להתגבר על כך, הקמת מערכת גידול אקס ביבו עשויה לספק גישה שימושית22. חלופה נוספת היא גישות ניקוי גנים באמצעות הורים ישירים (DIPA)-CRISPR עשויות לספק אסטרטגיה משלימה, שבה מוזרקים מגיבים לנקבות בוגרות ליצירת צאצאים ערוכים גנום23. למעשה, גישה זו הצליחה ליצור פרטים שמחליקים גנטית באקטופרזיטואיד הגולם Nasonia vitripennis על ידי הזרקת תגובות לנקבות בוגרות או לפרטים בשלב הגולם המאוחר24. בשילוב עם שיטת הפקת הגנים המבוססת על RNAi, גישות אלו יאפשרו ניתוחים מקיפים יותר של תפקודי הגנים המעורבים בתהליך הטפיל.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו ניגוד עניינים שיש לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לקנאטה טאצ'יבנה, שיון קודו, טושיה מקינו, שנטה יורימוטו, שוג'י שיגנובו, אקיקו קוואמורה, ארי פוג'ינוקי ומסאקו אידה על הסיוע הטכני. אנו מודים גם לכל שאר החברים במעבדה שלנו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL tubeGreiner Bio-One210261Infection assay 
1 mL syringeTERUMOSS-01TdsRNA injection
AgarDaisin, Ltd.P-700Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mmAs One Corporation1-8549-01Infection assay 
Asnol Petri Dish φ55×17mmAs One Corporation1-8549-02dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)Sigma-Aldrich Co. Llc.861146-25GdsRNA injection
Butyl p-HydroxybenzoateNacalai Tesque, Inc.06327-15Rearing
CO2 pressure regulatorYAMATOSANGYOYR-507F-2Infection assay
Confocal laser scanning microscopeZeissLSM700Image analysis
Corn mealSunny Maize Co., Ltd.No.4MRearing
DAPIThermo Fisher Scientific Inc.PI62247Nuclei staining, 1:10000
Deionized waterMillipore Inc.ZLXEV030WWInfection assay
Dual-Stage Glass Micropipette PullerNarishigePC-10dsRNA injection
FijiNAhttps://fiji.scImage analysis
Filter paperAdvantecITEM 526Rearing
Fly food vialChiyoda Science Co., Ltd.KFB-3MRearing
Fly food vial plugChiyoda Science Co., Ltd.AS-275Rearing
ForcepsDumont Biologie11252-20Dissection
Freezer, -20 °CNihon FreezerGS-3120HCSample storage
Freezer, -80 °CNihon FreezerCLN-52UD2Sample storage
Glass slidesMatsunami Glass Ind., LtdS7213Infection assay 
GlucoseShowa Sangyo Co., Ltd. Not availavleRearing
KOD Plus NeoToyoboKOD-401dsRNA synthesis
IncubatorPanasonicMIR-254-PJRearing
Ligation high Ver.2ToyoboLGK-201dsRNA synthesis
Micropipette GrinderNarishigeEG-401dsRNA injection
Mineral oilNacalai Tesque, Inc.23306-84dsRNA injection
Nanoject IIIDrummond Scientific Company3-000-207dsRNA injection
Nanoject Glass CapillariesDrummond Scientific Company3-000-203-G/XdsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmidNot availavleNot availavledsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmidNot availavleNot availavledsRNA synthesis
PrimeScript reverse TranscriptaseTakara2680AdsRNA synthesis
Propionic acidNacalai Tesque, Inc.29018-55Rearing
PROWIPEDaio Paper Corporation2-2624-02Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA RemoverToyoboFSQ-301qRT-PCR
RNAiso Plus reagentTakara9108qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)SarstedtREF 58.487Infection assay 
Small vial plugChiyoda Science Co., ltd.QD-S4Infection assay 
SpatulaAs One Corporation6-522-02Rearing
Square petri dishEiken Chemical Co., Ltd.64-2192-55, AW2000dsRNA injection
StereomicroscopeLeica Microsystemslvesta3 (C-Mount)Infection assay 
StereomicroscopeNikon Solutions Co., Ltd.SMZ1000dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time SystemTakaraTP815qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlasAstelG02dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR MixToyoboQPS-201qRT-PCR
TissueLyser IIQiagenNot availavleqRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic AcidNacalai Tesque, Inc.03420-65Rearing
Welch's grape 100 juiceAsahi Soft drinks Co., Ltd.32390Infection assay 
YeastAsahi Group Foods, Ltd.HB-P02Rearing

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Developmental Biologyparasitoid waspDrosophila MelanogasterAsobara japonicaparasitismRNA interferencerearing conditionsa single oviposition infection assay
Video Coming Soon

Related Articles