מטרת הפרוטוקול היא להקל על ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ב-Asobara japonica וב-Drosophila melanogaster. באמצעות שיטות גידול אופטימליות, בדיקת זיהום בביצת ביצים יחידה, והפלת גנים בתיווך RNAi.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקולים לגידול יעיל וניתוח תפקודי של הצרעה האנדופרזיטואידית Asobara japonica והמארח שלה Drosophila melanogaster
במאמר זה
סיכום
תקציר
טפילים הוא אינטראקציה ביולוגית שבה אורגניזם אחד מנצל את גופו או משאביו של אורגניזם אחר (המארח), וגורם לנזק משמעותי או מוות למארח. מבין בעלי החיים הטפיליים, צרעות טפיליות הן אחת השושלות העשירות ביותר במינים, ומהוות כמעט 20% מכלל מיני החרקים. במיוחד, צרעות אנדופרזיטואידיות מטיפות ביציות ישירות לגוף המארח ומשמשות מגוון רחב של גורמי ארס כדי לשלוט בהתפתחות המארח, במערכת החיסון ובפיזיולוגיה. בתגובה למתקפת צרעות, המארחים מנסים לחסל ביצי פרזיטואידים באמצעות מנגנוני חיסון מולדים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והתאיים שבאמצעותם רכיבי הארס הבודדים מווסתים את ביולוגיית המארח ומקדמים פרזיטיזם מוצלח עדיין אינם מובנים היטב. כאן אנו מתארים פרוטוקול מעבדה סטנדרטי לגידול צרעת האנדופרזיטואיד Asobara japonica והמארח שלה Drosophila melanogaster. זנים פרתנוגנטיים ומיניים של A. japonica זמינים, והזן הפרתנוגנטי מציג שיעור הצלחה גבוה בטפילים, מה שמאפשר שמירה יציבה על מלאי המעבדה לניתוח גנום ובדיקות טפיל. בדיקת זיהום בביצת ביצים אחת ושיטת הפלת גנים מבוססת RNA דו-גדילי אופטימיזציה לניתוח פונקציונלי של גני ארס. יחד, פרוטוקולים אלו מספקים מסגרת ניסויית מעשית לפירוק המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח, ויסייעו במחקר עתידי בביולוגיה התפתחותית, אימונולוגיה ופיזיולוגיה.
מבוא
טפילים הוא אורח חיים שבו אורגניזם אחד מנצל את משאבי התזונה של אורגניזם אחר והוא נפוץ בין טקסונים. ההערכה היא שעד מחצית מכל האורגניזמים הידועים מציגים טפילים במחזור החייםשלהם 1. מבין הטפילים, צרעות טפיליות הן קבוצה מגוונת במיוחד, ומהוות כ-20% מכלל החרקים2. הם מנצלים מגוון רחב של מארחי פרוקי-רגליים, כגון חרקים, עכבישים וקרדיות, ומפגינים גיוון מרשים בהיסטוריית חייהםובאסטרטגיות הטפיל שלהם. תכונות אלו הופכות את צרעות הטפיל לאחת מקבוצות החרקים המצליחות ביותר מבחינה אבולוציונית ואקולוגית.
אינטראקציות בין פרזיטואידים למארחיהם נחקרו בהרחבה כמערכות מודל של "מרוצי חימוש" אבולוציוניים. במיוחד, צרעות אנדופרזיטואידיות מפעילות מגוון רחב של גורמים, כולל ארסים, וירוסים סימביוטיים וטרטוציטים 4,5. גורמים אלו משפיעים על הפיזיולוגיה וההתפתחות של המארח, ובכך מבטיחים התפתחות מוצלחת בתוך המארח. למרות ההתקדמות הזו, המנגנונים המולקולריים שמאחורי הטפיל נותרו מובנים היטב ברוב מיני הטפילים. מגבלה עיקרית אחת היא גודל הגוף הקטן שלהם, מה שמקשה על זיהוי רכיבי הארס הביוכימיים. בנוסף, מאתגר טכנית לשמור על פרזיטואידים ומארחיהם בשלבי התפתחות מסונכרנים בתנאי מעבדה.
התקדמות אחרונה בריצוף הדור הבא ובטכנולוגיות אומיקס נוספות מאפשרת כיום ניתוחים כלל-גנומיים גם במינים פרזיטואידים קטנים מאוד. גישות אלו פתחו דרכים חדשות לחקר מנגנונים מולקולריים שבעבר לא היו נגישים, ומאפשרות לחקור אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ברזולוציה חסרת תקדים. בהקשר זה, המעבדה שלנו מתמקדת ב-Asobara japonica Belokobylskij (הימנופטרה: Braconidae), מין שזוהה במקור ביפן 6,7,8. A. japonica כוללת זן פרתנוגנטי תליטוקוס, שבו הנקבות מייצרות צאצאים ללא הזדווגות. תכונה זו מאפשרת לנו לאסוף כמויות משמעותיות של DNA גנומי אחיד גנטית לצורך ריצוף גנומי מלא9. בנוסף, מין זה מטפיל מגוון רחב של מיני דרוזופילה, כולל האורגניזם המודל D. melanogaster, שמציע יתרונות ניסיוניים משמעותיים בזכות תנאי הגידול המבוססים היטב ושלבי ההתפתחות המוגדרים במדויק, המאפשרים בדיקות זיהום שחזוריות ושליטה מדויקת בהתפתחות הפרזיטואידים.
במהלך הטפיל של A. japonica, נקבת צרעה מזריקה ארס יחד עם ביצה אחת לזחל זבוב, שבתוכה צמח זחל צרעה לצד המארח שלו. ראוי לציין כי A. japonica מציג שיעור הצלחה גבוה בפרזיטיזם אצל המארח D. melanogaster, מה שהופך את זוג הטפיל-מארח הזה למודל ניסיוני חזק. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגידול יציב, בדיקת זיהום ביצית אחת, ושיטת הפלת גנים מבוססת RNA דו-גדילי (dsRNA) ב-A. japonica. פרוטוקולים אלו מספקים מסגרת אמינה לפירוק מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס אינטראקציות בין טפילים למארח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
סקירה סכמטית של שיטת הגידול הסינכרון של D. melanogaster ו-A. japonica מוצגת באיור 1.
1. גידול זבוב הפרי המארח Drosophila melanogaster במעבדה
- לשמור על כל בעלי החיים הניסיוניים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50-60% במחזור אור/חושך של 12:12 שעות. השתמשו בזן הפראי Oregon-R (OR) כמארח ל-A. japonica (איור 2A).
- העבר זבובים בוגרים לבקבוקון מזון חדש המכיל מדיום סטנדרטי של קמח תירס-שמרים-אגר (0.55% אגר, טבלה 1). סמנו את הבקבוקון בתאריך ההעברה ואת שם הזן כ"OR".
- פנה את הזבובים הבוגרים יום לאחר ההעברה כדי למנוע כמות מופרזת של ביצים במזון. ודא שזחלי הצאצאים ניזונים על פני השטח של המזון.
הערה: כהנחיה, יש לשמור על כ-200-250 ביצים לכל בקבוקון מזון (φ30×100 מ"מ). צפיפות ביצים גבוהה יותר עשויה להפחית את הצלחת הטפילים ולהגביר את השונות בהתפתחות המארח והצרעות. - ארבעה ימים לאחר שלב 1.2, העבר כף של זחלי זבובים (4 ימים אחרי הטלת הביצה, dAEL) לבקבוקון מזון חדש. שמרו על הזחלים הללו ללא חשיפה לפרזיטואידים לדור הבא. הליך זה גם מסייע לשלוט בצפיפות הזחלים בבקבוקון.
2. גידול צרעת האנדופרזיטואיד Asobara japonica במעבדה
- השתמש בזן פרתנוגנטי טוקיו (TK) וזן מיני איריומוט-ג'ימה (IR) (איור 2B). הראשון מורכב מנקבות, בעוד שהשני מורכב מנקבות וגברים. הזכרים מתקרבים ביומיים-ארבעה לפני הנקבות. לכן, יש לאשר את נוכחות הנקבות על ידי המטינים שלהן לפני ההעברה.
- העבר 10-20 צרעות בוגרות ישירות מהבקבוקון המקורי אל הבקבוקון המכיל זחלים של זבובים ב-4 dAEL. סמנו את הבקבוקון עם תאריך ההעברה ושם הזן "TK" או "IR". שמרו על הצרעות באותם תנאים כמו שלב 1.1.
- אפשר לצרעות בוגרות להטיח ביצים בזחלי זבובים. פנו את הצרעות הללו יום עד יומיים לאחר מכן כדי למנוע טפילות-על, שיכולה להוביל למוות מארח. הסירו זבובים בוגרים סגורים שברחו מטפיל 10 ימים או יותר לאחר שלב 2.2.
- שבועיים לאחר שלב 2.2, צרעות בוגרות מתחילות להתקרב ממארז הגולם של זבוב המארח. העבר את הצרעות הבוגרות החדשות הללו לבקבוקון מזון חדש עם נייר סינון המכיל 25% גלוקוז ותמיסת ויטמין C של 50 מ"מ. חתיכות נייר הסינון צריכות להיות מחוטאות בטמפרטורה של 130 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. מתן הפתרון על נייר סינון מקדם התנהגויות ביציות ומאריך את חיי הצרעות הבוגרות. הגישה שלנו לשימוש בוויטמין C לשיפור הביוץ הושפעה מתצפיות במחקרי דרוזופילה 11.
3. מבחן זיהום עם ביוץ יחיד
- סנכרנו את שלב ההתפתחות של זחלי הזבובים ששימשו לניסוי ההדבקה.
- הניחו את הזבובים הבוגרים בצינור של 50 מ"ל עם צלחת אגר של מיץ ענבים (3% אגר) עם משחת שמרים טרייה, ותנו להם להטיל ביצים במשך 24 שעות.
- אספו זחלים חדשים מהשלב הראשון על צלחת האגר של מיץ הענבים והעבירו אותם לבקבוקון קטן (12 מ"ל) המכיל 2-3 גרם משחת מזון זבובים (מזון זבובים מעורבב עם כמות מתאימה מים). 20-30 זחלים מונחים בבקבוקון. זחלי הזבובים מורשים לגדול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
- בנקודת הזמן המתאימה, יש להכין צלחת פטרי באורך 4 ס"מ המכילה שכבה דקה ואחידה של משחת מזון זבובים, המכסה שטח בקוטר של כ-1.5-2.0 ס"מ (להלן ייקרא זירת בדיקת זיהום). בנוסף לזירת בדיקת הזיהום, יש להכין בקבוקון קטן חדש (12 מ"ל) המכיל כמות מתאימה של משחת מזון לזבובים. בקבוקון זה משמש לגידול זחלי המארח לאחר בדיקת הזיהום.
- אספו זחלים מדורגים והעבירו אותם לצלחת המכילה מים דה-יוניים (התנגדות = 15 MΩ·cm, 25 °C). שטוף את הזחלים בצלחת בערבוב עדין כדי להסיר שאריות מזון מגופם.
- לאחר השטיפה, הסר בעדינות את עודף הלחות מהזחלים באמצעות מגבוני נייר נטולי סיבים, שכן עודפי מים מפריעים להתנהגות הביוץ של הצרעות באזור בדיקת הזיהום. לאחר מכן העבירו את הזחלים לזירה. שלב זה מגביר את פעילות הזחלים במהלך ניסוי ההדבקה.
- הרדימו צרעות בוגרות בגזCO2 בקצב זרימה של 5 L·min-1 ולחץ של 0.2 MPa. לאחר מכן, הכניסו בעדינות כשלוש נקבות צרעות לזירת בדיקת הזיהום. סגרו את המכסה של הצלחת ותנו להם להתאושש על משחת מזון לזבובים.
- התבוננו בהתנהגות הביוץ של הצרעות תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ (הגדרת זום: 10× עד 15×).
הערה: כאשר צרעה נוגעת בגוף זחל זבוב בתנועה, היא מכניסה במהירות את האוביפוזיטור שלה לגוף הזבוב ומזריקה רכיבי ארס. למרות שזחל הזבוב מתפתל ומתנודד בגופו, הוא מיד משתתק. לאחר מכן, הצרעה רוטטת את בטנה ומניחה ביצה בגוף הזחל של המאכסן, ולאחר מכן הביופוזיטור נשלף. התנהגות ההטלה הזו נקראת זיהום. - לאחר ההדבקה, פתחו את המכסה והעבירו את זחל הזבובים הנגוע לבקבוקון קטן חדש המכיל משחת מזון זבובים שהוכנה בשלב 3.2. כדי לתקן את זמן ההדבקה, יש לבצע את ניסוי ההדבקה בתוך 15 דקות.
- יש לסמן את הבקבוקון הקטן במידע ניסיוני, כגון תאריך, שם המדגם, זמן ההדבקה ומספר האנשים. הבקבוקים נסתמים ואז מונחים במיכל לח ונשמרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
4. יצירת צרעות RNAi (RNAi) באמצעות הזרקת dsRNA
- סינתז dsRNA באורך 400 bp ומעלה להפלת גנים בתיווך dsRNA (הפרעות RNA, RNAi) באמצעות מערכת סינתזת dsRNA מבוססת שעתוק במבחנה . דגימות ה-dsRNA צריכות להישמר בטמפרטורה של מינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. פרוטוקולים מפורטים הם כפי שתואר קודם9.
- הכינו צלחת פטרי באורך 5.5 ס"מ המכילה 2% אגר למיקום גופות צרעות. מלאו שני שלישים מכל צלחת באגר כדי ליצור שכבה עבה של צלחת אגר להזרקה.
- הנח מגבון נייר ללא סיבים ולח במים על מכסה של כלי פלסטיק.
- אסוף גולמי זבובי מארח 7 ימים לאחר ההדבקה (DPI) מהבקבוקון והניח אותם על מגבוני נייר נטולי סיבים שהוכנו בשלב 4.3. הוספת טיפה של מים לדופן הבקבוקון עוזרת להפריד את קופסאות הגולם של זבוב המארח מהבקבוקון.
- מתחת לסטריאומיקרוסקופ (הגדרת זום: 20×), הסר את מארז הגולם של זבוב המארח וחשף גוף צרעה עם מלקחיים. ב-7 dpi, רוב הצרעות נמצאות בשלב הגולם, שבו ניתן להבחין בין חלקי הראש, החזה והבטן. גוף צרעה הוא בלתי נייד.
- הניחו את גופות הצרעות שנאספו על לוח האגר שהוכנה בשלב 4.2, תוך יישור צירי הגוף באותו כיוון. סדר 20-30 גופים של צרעות כשהצד הגבי שלהן כלפי מעלה בקו אחד עד שתיים. הסר לחות עודפת מפלטת האגר באמצעות מגבון נייר ללא סיבים כדי למנוע החלקה של צרעות.
- בהתאם להוראות היצרן, התקן את מכשיר ההזרקה ומיקרוסקופ הסטריאו (איור 3A). השתמש במערכת מיקרוהזרקה המצוידת במחט זכוכית קפילרית המאפשרת שליטה מדויקת בנפח ההזרקה. הנח את לוח האגר שבו ראשי הצרעות מכוונים לכיוון קצה מחט ההזרקה. נפח ההזרקה הוא 50 nL·wasp-1 ומהירות ההזרקה היא 50 nL·sec-1 במזרק.
- הכינו מחטים קפילריות מזכוכית באמצעות מושך מחטים. צורת נימי הזכוכית ניתנת לכיוון עם טמפרטורת המחמם.
- הנח את מחט הזכוכית הקפילרית על מטחנת המחט בזווית של 30-35°. שחיקו את המחט עד שאורך הקצה מגיע ל-0.04 מ"מ (ארבע חלוקות על רשתית העינית, איור 3B).
- רגע לפני ההזרקה, הפשרה של dsRNA. ריכוז ה-dsRNA הוא 0.25-1 מיקרוג·μL-1. לצורך המחשה, תמיסת ה-dsRNA צבועה בצבע כחול (מלח אריוגלאוצין די-נתרן, 2% משקל·נפח 1). באמצעות קצה פיפטה מיקרולודר, מלא את נימי הזכוכית בתמיסת dsRNA בצבע כחול. 4 מיקרוליטר מספיקים להזרקת 30 גופים של צרעות. ודא שאין בועות אוויר בתוך התמיסה.
הערה: לאחר טעינת תמיסת ה-dsRNA, הקישו בעדינות על צד המחט עם ציפורן כדי להסיר בועות אוויר כלואות. בועות אוויר שנותרו עלולות לחסום את זרימת התמיסה ולהפריע להזרקה מוצלחת. - באמצעות מזרק של 1 מ"ל ומחט, מלא את החלק הפנוי של נימי הזכוכית בשמן מינרלי, כדי להבטיח שלא יישארו בועות אוויר בתוך הנימים.
- חבר את מחט הזכוכית הקפילרית המכילה תמיסת dsRNA ושמן מינרלי למחזיק המחט ואז התקן אותה על מכשיר ההזרקה.
- כוונן את מיקום פלטת האגר ומחט הזכוכית הקפילרית על המזרק, כך שהמחט תהיה ממוקמת בזווית של 30-45° יחסית לגופי הצרעות (איור 3A).
- הכנס את המחט הקפילרית מזכוכית לצד הגבי של גוף הצרעה, כאשר הצד הצידי מעט לקו האמצע הגב. הזרקת מיקרו לתמיסת ה-dsRNA בתוך הגוף. תמיסת ה-dsRNA המוזרקת נראית בצבע כחול (איור 3C).
- לאחר ההזרקה, הניחו את לוחות האגר במיכל לח (70-80% לחות יחסית) ושמרו אותן בתנור של 25 מעלות צלזיוס למשך שבוע, עד שהצרעות הבוגרות מתקרבות למקום. גופות צרעות פצועות, יש להסיר מלוח האגר כדי למנוע זיהום חיידקים.
נקודת הפסקה: בשלב 4.6, ניתן לשמור את גולם הצרעה על לוח האגר במשך מספר שעות לפני ההזרקה. מחטים יכולות להיות מוכנות מראש (שלב 4.8 ו-4.9); עם זאת, הם נוטים לסתימה לאורך זמן. מחטים טריות בדרך כלל מספקות ביצועי הזרקה אמינים יותר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הזנים הא-מיניים והמיניים של Asobara japonica
A. japonica נפוצה ברחבי יפן. זנים פרתנוגנטיים תליטוקוס דומיננטיים באיים המרכזיים, בעוד שזנים מיניים ארנוטוקוס נמצאים באיים הסובטרופיים, כולל איי אמאמי-אושימה ואיריאומוטה-ג'ימה 8,12. בזנים מיניים, הזכרים יוצאים מוקדם יותר מהנקבות בכמה ימים, כך שמועד ההעברה של הבוגרים מובחן ביניהם. פרתנוגנזה תליטוקוס ב-A. japonica נגרמת על ידי זיהום בוו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה הקמנו פלטפורמה ניסויית רב-שימושית לחקר אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ברמה המולקולרית. על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול, בדיקת זיהום עם ביוץ יחיד ופרוטוקול RNAi, אנו מספקים מערכת איתנה למחקרים פונקציונליים של גורמים שמקורם בפרזיטואידים. פלטפורמה זו תסייע במחקרים עתידיים שמטרתם לחשוף את המנגנונים שבאמצעותם צרעות טפיליות מפעילות את התפתחות המארח, וייתכן שגם תתרום לפיתוח אסטרטגיות ביולוגיות להדברת מזיקים.
זן ה-TK הנגוע בוולבאצ'יה של A. ja...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו ניגוד עניינים שיש לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לקנאטה טאצ'יבנה, שיון קודו, טושיה מקינו, שנטה יורימוטו, שוג'י שיגנובו, אקיקו קוואמורה, ארי פוג'ינוקי ומסאקו אידה על הסיוע הטכני. אנו מודים גם לכל שאר החברים במעבדה שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 210261 | Infection assay |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | dsRNA injection |
| Agar | Daisin, Ltd. | P-700 | Rearing |
| Asnol Petri Dish φ40×13.5mm | As One Corporation | 1-8549-01 | Infection assay |
| Asnol Petri Dish φ55×17mm | As One Corporation | 1-8549-02 | dsRNA injection |
| Blue dye (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich Co. Llc. | 861146-25G | dsRNA injection |
| Butyl p-Hydroxybenzoate | Nacalai Tesque, Inc. | 06327-15 | Rearing |
| CO2 pressure regulator | YAMATOSANGYO | YR-507F-2 | Infection assay |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM700 | Image analysis |
| Corn meal | Sunny Maize Co., Ltd. | No.4M | Rearing |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | PI62247 | Nuclei staining, 1:10000 |
| Deionized water | Millipore Inc. | ZLXEV030WW | Infection assay |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | dsRNA injection |
| Fiji | NA | https://fiji.sc | Image analysis |
| Filter paper | Advantec | ITEM 526 | Rearing |
| Fly food vial | Chiyoda Science Co., Ltd. | KFB-3M | Rearing |
| Fly food vial plug | Chiyoda Science Co., Ltd. | AS-275 | Rearing |
| Forceps | Dumont Biologie | 11252-20 | Dissection |
| Freezer, -20 °C | Nihon Freezer | GS-3120HC | Sample storage |
| Freezer, -80 °C | Nihon Freezer | CLN-52UD2 | Sample storage |
| Glass slides | Matsunami Glass Ind., Ltd | S7213 | Infection assay |
| Glucose | Showa Sangyo Co., Ltd. | Not availavle | Rearing |
| KOD Plus Neo | Toyobo | KOD-401 | dsRNA synthesis |
| Incubator | Panasonic | MIR-254-PJ | Rearing |
| Ligation high Ver.2 | Toyobo | LGK-201 | dsRNA synthesis |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-401 | dsRNA injection |
| Mineral oil | Nacalai Tesque, Inc. | 23306-84 | dsRNA injection |
| Nanoject III | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | dsRNA injection |
| Nanoject Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | dsRNA injection |
| pBluescript KS (+) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA synthesis |
| pBluescript SK (-) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA synthesis |
| PrimeScript reverse Transcriptase | Takara | 2680A | dsRNA synthesis |
| Propionic acid | Nacalai Tesque, Inc. | 29018-55 | Rearing |
| PROWIPE | Daio Paper Corporation | 2-2624-02 | Infection assay, dsRNA injection. |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover | Toyobo | FSQ-301 | qRT-PCR |
| RNAiso Plus reagent | Takara | 9108 | qRT-PCR |
| Small vial (Test tube 12 mL) | Sarstedt | REF 58.487 | Infection assay |
| Small vial plug | Chiyoda Science Co., ltd. | QD-S4 | Infection assay |
| Spatula | As One Corporation | 6-522-02 | Rearing |
| Square petri dish | Eiken Chemical Co., Ltd. | 64-2192-55, AW2000 | dsRNA injection |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | lvesta3 (C-Mount) | Infection assay |
| Stereomicroscope | Nikon Solutions Co., Ltd. | SMZ1000 | dsRNA injection |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | dsRNA synthesis |
| Thermal Cycler Dice Real Time System | Takara | TP815 | qRT-PCR |
| Thermal Cycler GeneAtlas | Astel | G02 | dsRNA synthesis, qRT-PCR |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | Toyobo | QPS-201 | qRT-PCR |
| TissueLyser II | Qiagen | Not availavle | qRT-PCR |
| Vitamin C, L-Ascorbic Acid | Nacalai Tesque, Inc. | 03420-65 | Rearing |
| Welch's grape 100 juice | Asahi Soft drinks Co., Ltd. | 32390 | Infection assay |
| Yeast | Asahi Group Foods, Ltd. | HB-P02 | Rearing |
מקורות
- Hasik AZ, et al. Parasitism as a driver of host diversification. Nat Rev Biodivers. 2025;1(6):401-410.
- Pennacchio F, Strand MR. Evolution of developmental strategies in parasitic Hymenoptera. Annu Rev Entomol. 2006;51:233-258.
- Quicke DL. Parasitic Wasps. 1997:221-255.
- Moreau S, Asgari S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions. Toxins. 2015;7(7):2385-2412.
- Huang J, Chen XX, Zhan S. Molecular mechanisms underlying parasitoid-derived host manipulation strategies. Annu Rev Entomol. 2026;71:51-68.
- Belokobylskij SA. Key to the Insects of Russian Far East. Tribe Alysiini. In: Ler PA, ed. 1998;4(3):163-298.
- Ideo S, Watada M, Mitsui H, Kimura MT. Host range of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae), a larval parasitoid of drosophilid flies. Entomol Sci. 2008;11(1):1-6.
- Mitsui H, Van Achterberg K, Nordlander G, Kimura MT. Geographical distributions and host associations of larval parasitoids of frugivorous Drosophilidae in Japan. J Nat Hist. 2010;41(25-28):1731-1738.
- Kamiyama T, et al. Whole-genome sequencing analysis and protocol for RNA interference of the endoparasitoid wasp Asobara japonica. DNA Res. 2022;29(4):1-14.
- Kamiyama T, et al. Parasitoid wasp venoms degrade Drosophila imaginal discs for successful parasitism. Sci Adv. 2025;11(5).
- Shrestha B, Aryal B, Lee Y. The taste of vitamin C in Drosophila. EMBO Rep. 2023;24(6).
- Murata Y, Ideo S, Watada M, Mitsui H, Kimura MT. Genetic and physiological variation among sexual and parthenogenetic populations of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae), a larval parasitoid of drosophilid flies. Eur J Entomol. 2009;106(2):171-178.
- Werren JH, Baldo L, Clark ME. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. Nat Rev Microbiol. 2008;6(10):741-751.
- Furihata S, Hirata M, Matsumoto H, Hayakawa Y. Bacteria endosymbiont, Wolbachia, promotes parasitism of parasitoid wasp Asobara japonica. PLoS One. 2015;10(10).
- Yamashita S, Takahashi KH. Artificial transfer of a thelytoky-inducing Wolbachia endosymbiont between strains of the endoparasitoid wasp Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae). Appl Entomol Zool. 2018;53(3):403-409.
- Wang X, Biondi A, Daane KM. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). J Econ Entomol. 2020;113(1):73-80.
- Niwa R, Niwa YS. Molecular mechanisms of ecdysteroid biosynthesis. Compr Mol Insect Sci. 2026:106-137.
- Zhang J, et al. A set of novel venom proteins enables parasitoid wasps to exploit older hosts and coexist with competitors. Adv Sci. 2026;13(4).
- Schott S, et al. A fluorescent toolkit for spatiotemporal tracking of apoptotic cells in living Drosophila tissues. Development. 2017;144(20):3840-3846.
- Kacsoh BZ, Bozler J, Ramaswami M, Bosco G. Social communication of predator-induced changes in Drosophila behavior and germ line physiology. eLife. 2015;4.
- Sadanandappa MK, Sathyanarayana SH, Kondo S, Bosco G. Neuropeptide F signaling regulates parasitoid-specific germline development and egg-laying in Drosophila. PLoS Genet. 2021;17(3).
- Amano S, Akada T, Takahashi KH. In vivo and in vitro developmental profiling of Asobara japonica, a larval endoparasitoid of drosophilid flies. Entomol Exp Appl. 2019;167(5).12790.
- Shirai Y, Piulachs MD, Belles X, Daimon T. DIPA-CRISPR is a simple and accessible method for insect gene editing. Cell Rep Methods. 2022;2(5):100215.
- Zhang X, Singh A, Soriano Martinez K, Ferree PM. Direct parental (DIPA) CRISPR in the jewel wasp, Nasonia vitripennis. G3 (Bethesda). 2024;14(7).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
