שימור מורכבות רקמה In Vivo במודל של מערכת עצבים ריחית בעכברים באמצעות אנליזת Whole-Mount למחקר של רגנרציה עצבית

Francesca Oieni; Joshua Ingles; James A St John; Ronak Reshamwala

doi:10.3791/72036

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימור מורכבות רקמה In Vivo במודל של מערכת עצבים ריחית בעכברים באמצעות אנליזת Whole-Mount למחקר של רגנרציה עצבית

116 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72036

⸱

18 באוגוסט 2026

Francesca Oieni¹^,² , Joshua Ingles¹^,² , James A St John¹^,² , Ronak Reshamwala¹^,²

¹Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, ²Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתווה זרימת עבודה מלאה לשימור המורכבות האנטומית של מערכת העצבים הריחית בעכבר. כאן פירטנו את זרימת העבודה המלאה, הכוללת ניתוח, הכנת רקמה ודימוי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את מערכת הריח בתנאים נורמליים או חריגים, כולל תנאי תיקון טבעיים.

תקציר

בעידן של דימות תלת-ממדי (3D), ההבנה כי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית היא מוגבלת ביותר במחקרים של פתולוגיה ואנטומיה אנושית מורכבת הפכה למקובלת. בשל ניתוח של פרוסות צרות בלבד, מבנים גדולים יותר והיבטים חיוניים של ארכיטקטורת הרקמה עלולים לאבד פרטי הקשר קריטיים, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות או מטעות. בעוד שחתכים דו-ממדיים (2D) תמכו בהבנה בסיסית של ההיסטו-ארכיטקטורה, הם אינם מספיקים כדי ללכוד את המציאות התלת-ממדית האמיתית של רקמות ביולוגיות.

מספר גדל והולך של מחקרים באזורים אנטומיים מרובים מאמצים כיום טכניקות המבודדות יחידות אנטומיות שלמות - הכנות מסוג flat mount, whole-mount או en face - בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. גישות אלו מציעות ויזואליזציה ופרשנות מקיפות יותר של הארגון המבני. דבר זה משמעותי במיוחד במערכת העצבים האולפקטורית, שבה הגדרת מנגנונים תאיים מורכבים העומדים בבסיס יכולת ההתחדשות המדהימה שלה דורשת הקשר של עובי מלא. בחתכים דקים קיים סיכון להחמיץ מאפיינים פתופיזיולוגיים מרכזיים שנותרו פחות מוגדרים.

נוכח מגבלות אלו והפער בידע בנוגע לאינטראקציות התאיות המניעות את התחדשות רירית האף, היה חיוני לפתח טכניקה מעודנת של צביעת דגימות שלמות (whole-mount), המסוגלת לשמר את מורכבות הרקמה במלוא עוביה. ריריות אף שלמות בודדו כדגימות בעובי מלא, בליווי פרוטוקול מותאם לחדירת נוגדנים. דימות ברזולוציה גבוהה (EVIDENT SpinSR) ושחזור תלת-ממדי אפשרו ויזואליזציה מדויקת של אינטראקציות תאיות in vivo.

מבוא

מערכת העצבים הריחית (ONS) מהווה מודל ייחודי ומבוסס לחקר מנגנונים של התחדשות עצבית, שכן היא שומרת על יכולת ייחודית לתחלופה נוירונלית לאורך כל החיים¹. עם זאת, הפוטנציאל לתרגום קליני של יכולת תיקון עצבית זו נותר מוגבל בשל פערים משמעותיים בהבנתנו את התנהגות התאים במערכת הריחית²^,³^,⁴. התגובות התאיות והארגון האנטומי של ה-ONS, כולל נוירונים ריחיתיים ראשוניים, תאי מעטפת ריחיתיים (OECs) ופיברובלסטים פרי-נוירונליים, תוארו במספר מחקרי בעלי חיים, אשר התבססו על חיתוך רקמה דק מאוד (<2 µm) בשילוב עם מודלים של פגיעה פיזית חמורה שיושמו ב-ONS של מכרסמים¹^,². בעלי החיים במחקרים אלה הומתסו בדרך כלל 10 ימים לאחר הפגיעה, מה שסיפק חלון צפייה קטן לרגע ספציפי אחד בלבד של העיצוב מחדש הנרחב והמורכב יותר של רקמה כזו במהלך פגיעה עצבית². מחקרים אלו דיווחו כי לאחר מוות אקסונלי, תאי OECs ופיברובלסטים נשמרים כתעלות רציפות בעקבות הפגיעה.

למרות היותה אינפורמטיבית, בשל המגבלות הרבות שהוסברו לעיל, הגישה שבה נעשה שימוש סיפקה סקירה רעיונית ברזולוציה נמוכה ובמישור שטחי של ה-ONS, ובסופו של דבר מנעה הערכה מקיפה של הארגון התאי הממשי בתוך ה-ONS השלם³. כתוצאה מכך, ייתכן שקשרים מרחביים קריטיים נעלמו מהעין.

שימור מבנה רקמה תלת-ממדי חיוני לצורך ניתוח אנטומי ותאי מדויק, ויושם בהצלחה במגוון איברים ופתולוגיות⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². גישות של whole‑mount שימשו למיפוי הארגון העצבי בתוך הרירית האפית¹³^,¹⁴, עם זאת, ויזואליזציה של אינטראקציות תאיות עם מבנה ONS בעובי מלא, כולל lamina propria משומרת, טרם בוצעה.

במחקר זה, אנו מבססים סבב עבודה באמצעות מודל עכבר הכולל עיבוד רקמה בשיטת whole‑mount, צביעה אימונוהיסטוכימית, דימוי ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי, המאפשרים ניתוח מפורט של ארכיטקטורת ה-ONS. פרוטוקול זה פותח כדי למלא את הפער בשיטות המפורסמות הקיימות, כאשר הפרוטוקול שומר ומגונן על רירית אולפקטורית בעובי מלא, כולל את ה-lamina propria, ובכך מאפשר את חקר האינטראקציות הבינתאיות. ראוי לציין כי מתודולוגיה מזוקקת זו של איסוף ועיבוד רקמות יכולה להיות מיושמת ולהיות משולבת עם מודלים שונים של מערכת הריח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שכללו בעלי חיים ותאים שעברו שינוי גנטי בוצעו באישור ועדת הבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Griffith (NLRD/003/2020_var3) וועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת Griffith (MHIQ/04/23/AEC), בהתאם להנחיות הרגולטור של המשרד לטכנולוגיית גנים של কমনוולת' אוסטרליה (OGTR).

הערה: במחקר נעשה שימוש ב-15 עכברי מעבדה בוגרים (8–9 שבועות) משני המינים. באופן ספציפי, נעשה שימוש בעכברים טרנסגניים S100β-DsRed שבהם כל ה-OECs מבטאים את החלבון האדום הזוהר DsRed תחת בקרתו של הפרומוטור S100β. S100β הוא חלק ממשפחה רחבה יותר של חלבונים קושרי סידן, והוא מבטא בדרך כלל בתאי גליא במערכת העצבים המרכזית, כגון OECs. מודל זה היה אופטימלי למטרות ניסויים אלו שכן הוא אפשר לוקליזציה קלה של אוכלוסיות תאי המטרה באמצעות אותות פלואורסצנציה אנדוגניים. העכברים הטרנסגניים S100β-DsRed נוצרו בעבר, ונמצא כי השימוש בעכברים טרנסגניים אלו מספק זיהוי משופר של OECs בהשוואה לאימונוהיסטוכימיה עבור אנליזות של רקמה מקובעת¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸.

1. איסוף ראשים וקיבוע רקמות

יש להקלי את בעלי החיים באמצעות שאיפת CO₂ עולה בנקודות הזמן הניסיוניות.
יש לוודא כי המוות אושר על ידי היעדר רפלקס של קרנית ורפלקס נסיגה של הכף, ולאחר מכן לבצע פריקה צווארית, או בהתאם ל-SOP המאושר.
הסר את הראש והלסתות במלואם באמצעות מספריים.
הסר את העור מהגולגולת ואת הסחוס בקצה האף כדי לחשוף את חלל האף ולהבטיח חדירה יעילה של חומר הקיבוע.
הערה: נצפה כי שלב זה של חיתוך החלק הפרונטלי ביותר של סחוס האף של בעל החיים הוא קריטי כדי לאפשר קיבוע נכון של הרקמה בתוך חלל האף.
שטוף במהירות את הראשים ב-PBS 1× כדי להסיר עודפי דם.
קבע את הרקמה על ידי טבילה למשך לילה (12–18 h) ב-4% paraformaldehyde, למשך 6 h לפחות (זמן מספיק לקיבוע הרקמה הרלוונטית), בטמפרטורה של 4 °C על גלגלת (roller).
זהירות: Paraformaldehyde הוא כימיקלי מסוכן הפולט אדי פורמלדהיד. הוא רעיל בשאיפה, במגע עם העור ובבליעה; גורם לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה; ונחשב לחומר מסרטן. יש לטפל בו אך ורק במנדף כימיים תוךneath לבישת PPE מתאימה, הכוללת כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים. פינוי בטוח של כימיקלים מסוכנים ופסולת ביולוגית הנוצרת במהלך הפרוטוקול חייב להתבצע בהתאם לתקנות המוסדיות והמקומיות.
הערה: במהלך אופטימיזציות, צפינו כי 6 h הספיקו לקיבוע הרקמה הרלוונטית; עם זאת, זמן של יותר מ-12 h עלול היה לגרום לקיבוע יתר ולדגרדציה של מבני הרירית.
הוצא את הראשים מחומר הקיבוע ושטוף אותם במשך 3 h ב-PBS 1× בטמפרטורת החדר (20–25 °C) על גלגלת.
אחסן את הראשים ב-PBS טרי ב-4 °C ואסוף את רקמת הרירית בשיטת whole-mount בתוך 48 h.

2. איסוף רקמות בשיטת Whole-mount

בצע בידוד רקמה תחת מיקרוסקופ.
חתכו את הראשים לחצאים באמצעות סקלפל, בהתאם לקו הסגיטלי המרכזי.
חשוף את החלק הפנימי של חלל האף (איור 1). זהו את האזורים האנטומיים ואסוף את רקמת הרירית המצפה את כל המקטע האנטומי (איור 1B).
באמצעות קוצץ עצם, שברו והסירו בעדינות את עצם המחיצה המכסה חלק מחלל הרירית.
הערה: ראו איור 2Aשלב זה הוא קריטי כדי לחשוף את החלל הקעור שמתחת לעצם, שבו צרורות האקסונים עוברים דרך הדופן הגבנית (איור 1B).
לאחר ששטח זה נחשף, השתמשו בפינצטה קמורה כדי לנתק בעדינות ולהוציא את הרקמה מהדופן הגבית הקעורה. הרימו את הרקמה מהעצם שמתחתיה וקלפו בעדינות את רירית האף שנותרה כדי לאסוף את הדגימה השלמה (whole-mount).
הערה: בשלב זה נדרשת זהירות רבה כדי למנוע קריעה של הרקמה.
אספו את הרקמה הרלוונטית משתי הנחיריים, ימין ושמאל: הרירית המכסה את המחיצה, את הדפנות הגבּיות הימנית והשמאלית, ואת הרצפת המסננת (cribriform plate) של חלל האף (איור 1A, ב)אסוף רקמה משתי הנחיריים, כולל המחיצה, הדפנות הגבייות והלוח הנחורי (cribriform plate), כדי לבודד את האזור האנטומי המכיל את מבני הריח הראשוניים (איור 2C).
שטפו את הרקמות שנאספו ב-PBS 1× והסירו רקמות מיותרות, כולל שברי עצם. אחסנו את הרקמות ב-PBS 1× בטמפרטורה של 4 °C לצורך ניתוח אימונוהיסטוכימי עתידי.
הערה: אם הרקמה תועבר לאחסון לטווח ארוך, מומלץ לאחסנה בתמיסת PBS 1× ו-0.001% (משקל/נפח) Sodium Azide, בטמפרטורה של 4 °C.

3. פרוטוקול צביעה מותאם

הערה: פרוטוקולי צביעה נפוצים מותאמים בדרך כלל לחתכים בעובי דק עד בינוני (למשל, עד 50 µm). לפיכך, היה צורך להתאים את הפרוטוקול לרקמה העבה בהרבה.
נצפה כי שלב מכריע כולל השארת הרקמה לצוף בתוך מבחנות Eppendorf לאורך כל תהליך הצביעה והנחת המבחנות על גלגלת (roller) בזמן חדירת הריאגנטים. לפיכך, שלבי הצביעה לא בוצעו כאשר הרקמה נמצאת על זכוכית ביקורת (imaging slide). הרקמה נצבעה תחילה בעודה צפה, ורק לאחר מכן הועמדה על זכוכיות ביקורת. פרטים אלה הבטיחו שהרקמה לא תתקפל, ושהריאגנטים והנוגדנים יוכלו לחדור לכל האזור.

הוצא את הרקמות מהאחסון והעבר אותן לשפופרת Eppendorf עם תמיסת חסימה (התמיסה שתשמש תהיה ספציפית לסוג הצביעה).
הערה: תמיסת חסימה: 3% BSA, 0.3% Triton X-100 ב-PBS. התאמה חשובה נוספת הייתה הזמן שבו הרקמה נחשפה לכל ריאגנט ולתערובת הנוגדנים.
השאר את הרקמה בתמיסת החסימה למשך 3 h בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב (roller).
הערה: נצפה כי לא היה צורך להעלות את ריכוז הנוגדנים שנבחרו וריאגנטי הצביעה (Table 1) אם הגדלנו את זמן החשיפה שלהם בהשוואה לגישת צביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית של חתכים דקים. דבר זה צמצם גם את השימוש בריאגנטי נוגדנים יקרים. האינקובציות מבוצעות בשפופרת Eppendorf של 1.5 mL כאשר תפס המכסה גזור, כדי שתוכל להתגלגל על גלגל הסיבוב. נפח הריאגנט היה 500 µL.
בצע אינקובציה למשך 72 h ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים על גלגל סיבוב.
שטוף את הרקמה פעמיים (1.5 h לכל שטיפה) באמצעות PBS 1× בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב.
בצע אינקובציה של הרקמה עם נוגדן משני (עטופה בנייר אלומיניום) וצביעת גרעינים למשך 4 h לפחות בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב, ולאחר מכן העבר לאינקובציה למשך לילה (12–18 h) ב-4 °C על גלגל סיבוב.
שטוף את הרקמה פעמיים (1.5 h בכל פעם) באמצעות PBS 1× בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב.

4. הכנת סלייד

הוצא בעדינות את הרקמה משפופרת ה-Eppendorf
מתחת למיקרוסקופ, הנח את הרקמה על תבנית זכוכית וודא שאין קיפולים ברקמה.
הערה: ניתן לזהות תחת המיקרוסקופ, ללא פלואורסצנציה, את כיוון הרקמה. יש להניח את צד ה-lamina propria של הרקמה הרירית על התבנית, כך שהאפיתל פונה כלפי זכוכית התבנית וה-lamina propria פונה כלפי זכוכית המכסה. ניתן לזהות את ה-lamina propria על ידי נוכחותם של צרורות עצבים עבים, הנראים ללא צביעה. מיקום הרקמה כך שה-lamina propria פונה לצד זכוכית המכסה והצד האפיתלי מונח על זכוכית התבנית, יקל על תהליכי הצביעה והדמיה.
כסה את התבניות באמצעות מדיום קיבוע פלואורסצנטי ואטום אותן.
ניתן לאחסן את התבניות בטמפרטורה של 4 °C, לאחר ייבוש למשך לילה (12–18 h) בחושך ובטמפרטורת החדר

5. רכישת תמונות ועיבוד לאחר צילום

רכישת תמונות אימונופלואורסצנטיות בהגדלה נמוכה
1. בצע תפירה אוטומטית (stitching) במהלך רכישת התמונות באמצעות linear alpha-blending.
  הערה: יש להתאים את מספר הפריימים ב-z-stack לעובי הדגימה כדי להבטיח כיסוי מלא של נפח הרקמה.
2. דגום שדות ראייה סמוכים עם חפיפה של 15%. רכוש תמונות בשיטת אריחים (tiled images) באמצעות תבנית רכישה מסוג meander.
3. התאם את המספר הכולל של החתכים האופטיים לעובי הרקמה.
4. הגדר את כיול התמונה ל-215.594 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y. רכוש את התמונות כ-z-stacks עם גודל צעד (z-step) של 0.8 µm.
5. הנח את הרקמה המורכבת (whole-mount) עלבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי. רכוש תמונות סקירה באמצעות עדשת אובייקטיב 30x (NA 1.04).
רכישת תמונות אימונופלואורסצנטיות בהגדלה גבוהה.
1. רכוש תמונות מפורטות באמצעות עדשת אובייקטיב 60× (NA 1.5). הגדר את כיול התמונה ל-107.923 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y. רכוש תמונות z-stack עם גודל צעד (z-step) של 0.41 µm.
2. התאם את המספר הכולל של החתכים האופטיים לעובי הרקמה, ודגום תמונות משדה ראייה בודד.
  הערה: אין צורך בתפירת תמונות עבור רכישות ב-60× מכיוון שכל סט נתונים מורכב משדה ראייה בודד.
רכישת תמונות ייחוס היסטולוגיות
1. דמיין חתכים סגיטליים מרכזיים של ראש עכבר הצבועים ב-HE באמצעות מיקרוסקופ לסריקת סליידים תחת תאורה בשדה בהיר (brightfield).
2. רכוש תמונות באמצעות עדשת אובייקטיב 40× (NA 0.95) והגדלת מצלמה של 0.63x, מה שיוביל להגדלה אפקטיבית של 25.2×.
3. אשר כיול פיקסלים של 136.905 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y, ורכוש את התמונה כמישור מוקד בודד.
4. תפר תמונות בשיטת אריחים באופן אוטומטי באמצעות תבנית רכישה מסוג meander ו-linear alpha-blending.
רכישת תמונות ייחוס אימונופלואורסצנטיות של סקירה כללית
1. רכוש תמונות אימונופלואורסצנטיות משלימות של סקירה כללית באמצעות עדשת אובייקטיב 10x.
2. דגום את הדגימה כפרוסת z בודדת על ידי שימוש ב-0% חפיפה בין האריחים במהלך רכישת התמונה.
3. הגדר את כיול התמונה ל-647.249 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y, והפק תמונת סקירה המקיפה את כל האזור האנטומי הרלוונטי.
עיבוד תמונות והפקה של איורים סופיים.
1. ייצא את סטי נתוני התמונות שנרכשו לתוכנה לניתוח תמונות. הפק היטלי עוצמה מקסימלית (MIPs) מסט נתוני ה-z-stack.
2. בחר אזורי עניין (ROIs) לצורך ניתוח המשך והכנת איורים.
3. שלב תמונות אימונופלואורסצנטיות של סקירה כללית עם תמונות HE תואמות כדי להפיק איורי ייחוס אנטומיים. לאחר מכן, ודא את היישור וההתאמה האנטומית בין סטי הנתונים הפלואורסצנטיים וההיסטולוגיים לפני הכנת האיורים.
  הערה: כל תפירת התמונות צריכה להתבצע באופן אוטומטי במהלך רכישת התמונות באמצעות הגדרות מיקרוסקופ שנקבעו מראש, ואינה אמורה לדרוש עיבוד נוסף לאחר מכן. במקרה שלנו, הרינדור התלת-ממדי הופק באמצעות תוכנת Imaris: נעשה שימוש בתוסף surface rendering, המבוסס על סף עוצמה (threshold intensity) עבור כל ערוץ שנרכש, כדי להפיק את השחזור התלת-ממדי. לבסוף, התמונות הסופיות נערכו ב-Adobe Illustrator.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גישת ה-whole-mount המוצגת כאן אפשרה את הבידוד והשימור של הרירית האולפקטורית במלואה. במקרה שלנו, המיקוד היה בהבנת שינויים תאיים ואנטומיים הן בקנה מידה מאקרוסקופי (מבט אנטומי מלא) והן בקנה מידה מיקרוסקופי (רמה תאית).

גישת ה-whole-mount מאפשרת לנו לאסוף הן את מדורי האפיתליום והן את ה-lamina propria, ולשמר את מערכות היחסים המרחביות בין צרורות האקסונים, תאי מעטפת ריח (OECs) ופיברובלסטים – התאים שבהם אנו מעוניינים. גישה זו אפשרה את השגת מערכי נתונים גדולים ורציפים ששימרו את מלוא העובי ואת שטח הפנים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעשורים האחרונים אנו עדים לתחילתו האיטית של העידן התלת-ממדי, עם פיתוחן של גישות חדשניות רבות בתחום המדעי. לדוגמה, גישות לשחזור תלת-ממדי, שהתאפשרו הודות לפיתוחן של שיטות דימוי מורכבות של דגימות שלמות (whole-mount) בשילוב עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה, סייעו להבנה טובה יותר של מספר מבנים היסטו-ארכיטקטוניים של רקמות בעובי מלא. גישות רינדור תלת-ממדיות אלו שימשו להגדרת מבנים שונים בגוף האדם, כגון כלי דם, בלוטות וגידולים נפוצים⁴^,⁵^,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודים עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה במימון מקרן Clem Jones, מקרן Perry Cross Spinal Research ומקומיסיית ביטוח תאונות דרכים (Motor Accident Insurance Commission) עבור JSTJ ו-RR, במלגת National Injury Insurance Scheme Queensland עבור RR, ובמלגת קרן Perry Cross Spinal Research עבור FO. חלק מפרויקט זה נתמך על ידי "מלגת מחקר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גריפית' (GUPRS)" ו"מלגת מחקר בינלאומית לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גריפית' (GUIPRS)" עבור FO.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	אימונוהיסטוכימיה
Adobe Illustrator		version 28.5
נוגדן Anti-beta III Tubulin - סמן נוירונלי	Abcam	ab18207
נוגדן Anti-PDGFR beta [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma Aldrich	14533
COVERSLIP 24X50MM NO. 1.5 100PCS	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	אימונוהיסטוכימיה
נוגדן משני Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Highly Cross-Adsorbed, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
קוצץ עצם Dumont #15A - מצופה אפוקסי	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	דיסקציה של רקמה
פינצטה Dumont #7 - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	דיסקציה של רקמה
נוגדן משני Goat anti-Rat IgG (H+L), Cross-Adsorbed, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
תוכנת Imaris	Imaris	version 9.5.0	דימיון
מספרי דיסקציה מסוג Mayo	ProSciTech	420SS	דיסקציה של רקמה
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	עיבוד רקמות
מלחים של פוספט בבופר סלין, טבליות PBS סטריליות (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	עיבוד רקמות
ProLong Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36980	אימונוהיסטוכימיה
להב סקלפל #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	דיסקציה של רקמה
ידית סקלפל #4	ProSciTech	T134	דיסקציה של רקמה
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-25G	עיבוד רקמות
Sucrose	Chem-Supply	57-50-1	עיבוד רקמות
שקופיות מיקרוסקופ TOMO Adhesion	ProSciTech	GEMS63705-09	אימונוהיסטוכימיה
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	אימונוהיסטוכימיה

מקורות

Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות תלת-ממדי רקמה בעובי מלא מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה חדירות נוגדנים שחזור תלת-ממדי רירית האף

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

עדכנו אותי: