מאמר שיטה

מקצבים צירקדיים בצלחת פטרי: סנכרון של תאי mHypoE-42 מההיפותלמוס של עכבר לצורך אנליזה של ביטוי גנים של השעון הצירקדי

159 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72039

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מעשי וניתן לשחזור לסנכרון תאים בתרבית, ביצוע דגימה במרווחי זמן מדורגים לאורך 24–72 h ללא איסוף במהלך הלילה, וניתוח ביטוי של גנים של השעון הביולוגי.

תקציר

מקצבים צירקדיים הם תנודות אנדוגניות של כ-24 h המווסתות מגוון רחב של תהליכים תאיים ופיזיולוגיים, כולל ביטוי גנים, מטבוליזם והתנהגות. מקצבים אלו נובעים מלולאות משוב תעתוק-תרגום מקושרות המגיבות לרמזים זמניים וסביבתיים. מכיוון שהבקרה הצירקדית היא דינמית מאוד, אפילו וריאציות ניסיוניות קטנות יכולות להשפיע על הפאזה, האמפליטודה והמקצב, מה שהופך תהליכי עבודה ניסיוניים סטנדרטיים לחיוניים להשגת תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור. מטרתו של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק תהליך עבודה מעשי וניתן לשחזור לסנכרון של תאים בתרבית, ביצוע דגימה לאורך זמן (time-course sampling) וניתוח ביטוי של גני השעון הצירקדי בתנאי מעבדה סטנדרטיים. הפרוטוקול מתאר סנכרון מבוסס הלם סרום (serum shock), איסוף דגימות במרווחי זמן לאורך 24–72 h כדי להימנע מדגימה במהלך הלילה, מיצוי ribonucleic acid, סינתזת complementary deoxyribonucleic acid, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (quantitative real-time polymerase chain reaction), וניתוח מקצב צירקדי באמצעות גישות סטטיסטיות מתאימות. תהליך העבודה מדגיש גם שיקולים ניסיוניים קריטיים, כולל תנאי סנכרון, הערכת איכות דגימות, בחירת גני ייחוס וניתוח נתונים, כדי לשפר את השחזור בין ניסויים שונים. שיטה זו מספקת גישה נגישה לחקירת מנגנונים צירקדיים מולקולריים ולהערכת ביטוי גנים מקצבי בתאי תרבית, ובכך מקלה על מחקרים של בקרה צירקדית במודלים ניסיוניים פיזיולוגיים ובמודלים הקשורים למחלות.

מבוא

מקצבים צירקדיים הם מחזורים אנדוגניים עם מחזוריות של כ-24 h המווסתים מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים, מטבוליים ותאיים1. במערכות של יונקים, מקצבים אלו מתואמים על ידי שעון מרכזי הממוקם בגרעין הסופראכיאזמטי (SCN) של ההיפותלמוס ועל ידי שעונים מולקולריים בעצמם ברמה התאית. שעונים אלו מורכבים מלולאות משוב תעתוק-תרגום השזורות זו בזו, המערבות גני שעון מרכזיים, הכוללים את החלבון circadian locomotor output cycles protein kaput (Clock), basic helix-loop-helix aryl hydrocarbon receptor nuclear translocase-like 1 (Bmal1), period (Per), ו-cryptochrome (Cry)2. בהינתן תפקידו המרכזי של השעון הצירקדי בתהליכים ביולוגיים מגוונים, מודלים תאיים in vitro הפכו לכלים חשובים לחקר המנגנונים המולקולריים של בקרה זמנית תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים.

מטרתו של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק תהליך עבודה אמין, מעשי וניתן לשחזור לסנכרון תאים בתרבית באמצעות פרוטוקול של הלם סרום (serum shock), ביצוע דגימות בנקודות זמן מדורגות, וניתוח ביטוי של גני השעון הביולוגי תוך הימנעות מאיסוף דגימות במהלך הלילה. על ידי שיפור ההיתכנות של דגימה צירקדית מבלי לפגוע באיכות הנתונים, תהליך עבודה זה נועד להקל על מחקרים של תהליכים ביולוגיים מחזוריים תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטיות.

מחקרים על השעון הצירקדי בוצעו במגוון רחב של מודלים in vitro, כולל שורות תאי סרטן אנושיים3, פיברובלסטים של rat-14, תרביות של SCN 5, ואורגנואידים6. למרות שרוב התאים של יונקים הם בעלי שעונים צירקדיים תפקודיים, היעדרם של רמזי סנכרון, כגון אור, מוביל במהירות לחוסר סנכרון בתרבית, דבר המגביל את חקר המקצבים הצירקדיים in vitro7. לכן, טכניקות סנכרון הן חיוניות לחקירת מנגנוני השעון המולקולרי והשלכותיהם על הבריאות והמחלה.

פותחו מספר אסטרטגיות סנכרון עבור תאי יונקים בתרבית. סנכרון מבוסס גלוקוקורטיקואידים באמצעות dexamethasone הוא אחד הגישות הנפוצות ביותר, כיוון שהוא מאתחל בצורה חזקה את המקצבים הצירקדיים בסוגי תאים רבים תוך הפחתת חלק מהשונות הקשורה לגירוי בסרום8. באופן דומה, הפעלה של סיגנל cyclic adenosine monophosphate באמצעות forskolin שימשה בהצלחה לסנכרון שעונים פריפריים במודלים תאיים נבחרים9. גישות אחרות כוללות טיפול באותות המועברים בדם4, תרכובות כימיות שונות8,10, החלפת מצע גידול3, הלם טמפרטורה11, מחזורי חמצן12, וגירוי מכני13. יחד, שיטות אלו קידמו משמעותית את המחקר הצירקדי; עם זאת, הן עשויות לדרוש ציוד ייעודי, תנאי ניסוי ספציפיים או אופטימיזציה נוספת, מה שהופך את תיקוף אסטרטגיית הסנכרון הנבחרת לחיוני עבור כל מודל ביולוגי ויישום ניסויי14.

הלם סרום (Serum shock) הוא אחת מגישות הסנכרון הנפוצות והמקובלות ביותר, והוא מבוסס על חשיפת תאים בתרבית לגירוי קצר מועד של ריכוז סרום גבוה4. מכיוון שהגירוי הוא חולף, ההפרעה הממושכת של מסלולי האיתות התאיים ממוזערת4, מה שמפחית השפעות מטריות פוטנציאליות על ניתוחים המשכיים. כתוצאה מכך, הלם סרום מתאים במיוחד למחקרים של ביטוי גנים צירקדיים ותפקוד השעון המולקולרי. בנוסף, הפרוצדורה פשוטה ליישום ואינה דורשת ציוד מיוחד, מה שהופך אותה לנגישה וניתנת לשחזור בקלות בין מעבדות שונות. עם זאת, מגבלה מעשית של ניסויי הלם סרום היא לוח הזמנים האינטנסיבי של הדגימה הנדרש כדי לאפיין את המקצב הצירקדי באופן מדויק. ניתוח מקצבים מהימן דורש בדרך כלל איסוף דגימות במרווחי זמן קבועים, לרוב כל 2–6 h לאורך מחזור צירקדי אחד או יותר (24–72 h)14, מה שמצריך לעיתים קרובות איסוף דגימות במהלך הלילה.

זרימת העבודה המתוארת כאן נותנת מענה לאתגר הלוגיסטי הזה על ידי פריסה מדורגת של תחילת הסנכרון בין מספר פלטות תרבית, ובכך מאפשרת דגימה צירקדית מלאה במהלך שעות העבודה הרגילות תוך הימנעות מאיסוף דגימות במהלך הלילה. במקום להציג אסטרטגיית סנכרון חדשה, פרוטוקול זה מספק יישום מפורט וניתן לשחזור של שיטת הלם סרום מבוססת, בשילוב עם לוח זמנים מעשי לדגימה וניתוח ביטוי גנים המשכי. זרימת עבודה זו מתאימה במיוחד למחקרים של ביטוי גנים צירקדי בתאים בתרבית תוך שימוש בטכניקות מעבדה נפוצות. בעת התאמת הפרוטוקול למודלים תאיים נוספים, יש לאפטמיזציה ולתקף את הפרמטרים הניסיוניים, כולל צפיפות התאים, תנאי הסנכרון, מרווחי הדגימה ובחירת הגן הייחוס, עבור סוג התא הספציפי לפני היישום.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא מתאר שיטה מאומתת לסנכרון של שורת תאי ההיפותלמוס העובריים של עכבר mHypoE-42. יש לאמת ולבצע אופטימיזציה של פרוטוקול הסנכרון באופן עצמאי לפני יישומו על סוגי תאים מתורבתים אחרים. ראה איור 1 לסקירה כללית של זרימת העבודה ו- איור משלים 1 עבור לוח הזמנים השבועי של הדגימה. עיין ב- טבלת חומרים עבור כל הרכיבים, הציוד והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. יש לבצע את כל הליכי תרביות התאים בקבינה לבטיחות ביולוגית (biosafety cabinet) מאושרת, תוך שימוש ברכיבים ובציוד סטריליים.

דיאגרמה של תהליך סנכרון תאים, שיטת הלם סרום, ציר זמן, מערך ניסויי, מרווחי CT.
איור 1. סקירה סכמטית של פרוטוקול סנכרון הלם סרום מדורג. סכמה הממחישה את זרימת העבודה המשמשת לסנכרון תאי mHypoE-42 באמצעות הלם סרום בשתי קבוצות ניסוייות מדורגות. התכנון המדורג מאפשר איסוף דגימות צירקדיות במהלך שעות עבודה רגילות תוך הימנעות מדגימה במהלך הלילה. הדגימות מעובדות לאחר מכן להפקת RNA, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) וניתוח מקצבים צירקדיים. נוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. תרבית תאים

  1. תרבתו תאי mHypoE-42 נצמדים בתווך Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה (4500 mg/L), בתוספת 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FBS) שעבר אינאקטיבציה בחום, 3.7 g/L נתרן ביקרבונט, ו-1% תמיסת אנטיביוטיקה.
  2. שמרו את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח הכולל 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2) בבקבוקי תרבית T75 עם נפח תרבית סופי של 10 mL.
    הערה: בדקו כל מנה חדשה של FBS לפני תחילת הניסויים, מכיוון שמנות סרום עשויות להשתנות.
  3. בצעו תת-תרבית לתאים כאשר הם מגיעים לכ-80%–90% התלכדות (confluence). שטפו את התאים ב-1× phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) סטרילי, הוסיפו 3 mL של תמיסת טריפסין 0.5%, והדגירו למשך 3–5 דקות כדי לנתק את התאים.
  4. הוסיפו לפחות פי שניים מנפח הטריפסין של תווך תרבית מלא המכיל 10% (v/v) FBS כדי לנטרל את הטריפסין.
  5. דללו את התאים בתווך גידול טרי ביחס של עד 1:2.
    הערה: הימנעו משימוש בתאים שעברו מעברים מרובים מדי (למשל, מעברים מעל 40 עבור תאי mHypoE-42). חממו מראש את כל התמיסות לפני השימוש. בדקו באופן קבוע את התרביות לזיהום במיקופלסמה.
  6. המשיכו לביצוע בדיקות סנכרון 24 שעות לאחר זריעת התאים בריכוז של 2.0 × 105 תאים לבאר, כפי שמתואר בשלב 2. שמרו על תרביות תאים שגרתיות ברמת התלכדות של כ-80%–90% לפני ביצוע מעבר.

2. סנכרון של שורת התאים mHypoE-42

  1. הכנת תאים
    1. לאחר טריפסינציה (trypsinization), סבב את התאים בצנטריפוגה ב- 700 × g למשך 5 דקות.
    2. שפוך את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משקע התאים (cell pellet) מחדש ב-10 mL של מצע גידול טרי.
    3. ערבב את תרחיף התאים עם צבע trypan blue ביחס של 1:1 (נפח כולל של 20 μL) וקבע את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer).
      הערה: השלם את פינוי התמיסות המכילות trypan blue בהתאם להנחיות המוסדיות לפינוי פסולת כימית. אין לשפוך צבע שלא נעשה בו שימוש לכיור.
  2. זריעת תאים ותכנון ניסויי מדורג
    1. זריע 2.0 × 105 תאים לכל באר בפלטות של 6 בארות או בצלחות גידול של 35-mm. דגור את התרביות ב-37°C למשך 24 שעות.
      הערה: התחל בסנכרון סרום 24 שעות לאחר זריעת התאים. לפיכך, אין צורך בהגעה למצב מוגדר מראש של התלכדות תאים (confluence) לפני הסנכרון. במקום זאת, בחן את התרביות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נצמדו באופן מלא ומראים מורפולוגיה תקינה לפני תחילת הליך הסנכרון.
    2. חלק את פלטות הגידול באופן אקראי לשתי קבוצות ניסוייות. השתמש בקבוצה הראשונה כדי לייצר נקודות זמן צירקדיות (CT) של CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 ו-CT32. השתמש בקבוצה השנייה כדי לייצר CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 ו-CT48 (איור 1; איור משלים 1).
    3. הגדל את מספר הבארים או הפלטות לפי הצורך כדי לכלול חזרות טכניות.
      הערה: צמצם את השונות על ידי הכנת כל הפלטות מאותו תרחיף תאים, שמירה על צפיפות זריעה ותנאי גידול זהים, וביצוע הסנכרון באמצעות אותם ריאגנטים והגדרות ניסוייות. התאם את פורמט כלי הגידול וצפיפות הזריעה לפי הצורך עבור סוגי תאים אחרים. בעת שימוש בפלטות של 6 בארות, שלב נקודות CT שנאספות בו-זמנית כדי למקסם את ניצול הפלטה.
  3. סנכרון
    1. לאחר 24 שעות, שאב את המצע מהקבוצה הראשונה של הפלטות והוסף 1 mL של DMEM נטול סרום. דגור למשך 12 שעות כדי להשרות הרעבת סרום.
    2. הכן תמיסת סרום סוס בריכוז 50% (v/v) ב-DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות מיד לפני השימוש.
    3. שאב את מצע ההרעבה מהקבוצה הראשונה וחשף את התאים ל-1 mL של תמיסת סרום סוס 50% שהוכנה טרי למשך שעתיים.
    4. במקביל, שאב את המצע מהקבוצה השנייה של הפלטות והחלף אותו ב-1 mL של DMEM נטול סרום. דגור למשך 12 שעות.
    5. לאחר הלם הסרום של השעתיים, שאב את המצע והוסף 1 mL של DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות המועשר ב-10% (v/v) FBS שעבר אינאקטיבציה תרמית. הגדר נקודת זמן זו כ-CT0.
  4. איסוף דגימות
    1. הנח את פלטות הגידול על קרח. שאב את המצע, שטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של 1× PBS סטרילי קר, שפוך את תמיסת השטיפה, ולחץ את התאים באופן מכני באמצעות עד 1 mL של ריאגנט ליזיס.
      אזהרה: ריאגנט הליזיס מכיל כימיקלים מסוכנים. בצע את כל שלבי הטיפול במנדף כימי מאושר תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים. פנה את הפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות הכימיות המוסדיות.
    2. העבר כל ליזאט למבחנה סטרילית ואחסן את הדגימות ב-−80°C עד למיצוי ה-RNA.
    3. חזור על שלבים 2.4.1 ו-2.4.2 כדי לאסוף דגימות ב-CT4 וב-CT8.
    4. ב-CT8, חזור על שלב 2.3.2 עבור הקבוצה הניסויית השנייה כדי לסנכרן את שאר התאים.
    5. לאחר שעתיים של הלם סרום, סיים את הסנכרון של הקבוצה הניסויית השנייה על ידי החלפת המצע ב-1 mL של DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות המועשר ב-10% (v/v) FBS שעבר אינאקטיבציה תרמית.
    6. אסוף דגימות לסירוגין משתי הקבוצות הניסוייות כדי להשיג CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 ו-CT32. למחרת, חזור על הליך האיסוף כדי להשיג CT36, CT40, CT44 ו-CT48.
      הערה: הרעבת סרום וסנכרון הוחלו בהתאם ללוח הזמנים הניסויי לאחר זריעת התאים ולא לפי התלכדות תאים מוגדרת מראש. ודא שהתאים נצמדו באופן מלא ומראים מורפולוגיה תקינה לפני תחילת הסנכרון. למרות שנקודות CT עוקבות נבדלות ב-4 שעות, האיסופים אינם מבוצעים במרווחים של 4 שעות. עיין באיור משלים 1 ללוח הזמנים השבועי המלא של האיסופים.

3. עיבוד דגימות: מיצוי RNA

הערה: הפרוטוקולים עשויים להשתנות בהתאם להקשר הניסויי וליישום. סבב העבודה הבא מתאר דוגמה להליך יעיל להפקת RNA, סינתזת DNA משלים (cDNA), ותגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR). הפק תערובת RNA כולל באמצעות שיטת ליזיס המבוססת על פנול והפרדת פאזות, ולאחריה טיהור באמצעות עמודי ספין של סיליקה.

  1. הכנת דגימות והפרדת פאזות
    1. הפשיר את הדגימות, בצע הומוגניזציה חוזרת לליזאטים והדגס אותם בטמפרטורת החדר למשך 5 min.
    2. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל 1 mL של ריאגנט ליזה.
      אזהרה: כלורופורם הוא חומר נדיף ורעיל. בצע את כל הפרוצדורות הכוללות כלורופורם בתוך מנדף כימי מאושר תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. נער את המבחנות בעוצמה למשך 15 s והדגס אותן בטמפרטורת החדר למשך 3 min.
    4. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב- 12,000 × g למשך 15 min ב-4°C. אפשר לדגימות להיפרד לשלוש פאזות: פאזה תחתונה של פנול-כלורופורם המכילה חלבונים, פאזה בינונית (interphase) לבנה המכילה DNA, ופאזה מימית עליונה המועשרת ב-RNA.
    5. העבר בזהירות את הפאזה המימית למבחנה סטרילית חדשה ללא הפרעה לפאזה הבינונית. אחסן את הפאזה האורגנית ב-4°C אם מתוכנן בידוד של חלבונים או DNA בהמשך.
      הערה: בצע בידוד חלבונים או DNA בהתאם לפרוטוקול המתאים אם בכוונתך להפיק ביו-מולקולות אלו מהפאזה האורגנית.
  2. טיהור RNA
    1. הוסף נפח שווה של אתנול 70% (שהוכן עם מים נקיים מ-RNase) לפאזה המימית ובצע וורטקס פעמיים למשך 15 s כדי לעודד קישור של ה-RNA.
    2. העמס את הדגימה על עמודת סיליקה (silica spin column) וטהר את ה-RNA בהתאם לזרימת העבודה של טיהור בעמודה.
    3. עשה עיכול ל-DNA גנומי מזוהם באמצעות DNase למשך 15 min בטמפרטורת החדר.
    4. שטוף את העמודה באמצעות תמיסות השטיפה המסופקות.
    5. בצע שטיפה נוספת עם 100 μL של תמיסת שטיפה וסבב בצנטריפוגה ב-11,000 × g למשך 2 min כדי לייבש את ממברנת הסיליקה.
    6. העבר את עמודת הסיליקה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה נקייה. בצע אלוציה ל-RNA עם 40–60 μL של מים נקיים מ-RNase על ידי הנחת המים ישירות על מרכז ממברנת הסיליקה וסבב בצנטריפוגה ב-11,000 × g למשך 1 min.
      הערה: בחר את נפח האלוציה בהתאם לתנובת ה-RNA ולריכוז הרצויים. נפח אלוציה של 60 μL מספק בדרך כלל השבה מלאה יותר של ה-RNA מממברנת הסיליקה אך מפיק תמיסת RNA מדוללת יותר. לעומת זאת, נפח אלוציה של 40 μL מפיק תכשיר RNA מרוכז יותר אך עשוי להפחית את השבת ה-RNA הכוללת. בצע אופטימיזציה לנפח האלוציה בהתאם להמלצות היצרן ולדרישות של היישום הבא בתהליך.
  3. הערכת איכות ה-RNA
    1. הנח את דגימות ה-RNA על קרח והעבר 5 μL מכל דגימה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית חדשה לצורך הערכת איכות.
    2. הערך את שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5% או אלקטרופורזה קפילרית. ודא את נוכחותן של רצועות RNA ריבּוזומליות מובחנות של 28S ו-18S.
    3. קבע את ריכוז וטוהר ה-RNA על ידי מדידת בליעה באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: השלם את סילוק הפסולת המכילה פנול בהתאם להנחיות המוסדיות לסילוק פסולת כימית. אין להשליך פסולת כימית מסוכנת לכיור. עבור דגימות של תאים בתרבית, ריכוזי RNA נעים בדרך כלל בין 200 ל-1000 ng/μL והם מתאימים לסנתזת cDNA ו-qRT-PCR. קבל דגימות RNA עם יחס A260/230 בין 2.0 ל-2.2 ויחס A260/280 של כ-2.0 (ראה טבלה משלימה 1).
  4. אחסון RNA
    1. אחסן דגימות RNA מטוהרות ב- −80°C עד לסנתזת ה-cDNA.

4. עיבוד דגימות: סינתזת cDNA

הערה: סנתז cDNA מ-1 μg של RNA כולל באמצעות ערכה לסנתז cDNA של הגדיל הראשון. התאם את נפחי התגובה ותנאי האינקובציה בהתאם להוראות היצרן.

  1. שעתוק הפוך
    1. המיסו את דגימות ה-RNA על קרח. הכינו תגובת שעתוק הפוך בנפח 20 μL המכילה 1 μg של RNA כולל, 10 μL של 2× Master Mix (המכיל מעכב ריבונוקליאז, הקסמרים אקראיים, פריימרים של oligo(deoxythymidine), יוני מגנזיום [Mg2+], ודאוקסינוקלאוטיד טריפוספט), 2 μL של תערובת אנזימים (המכילה reverse transcriptase), ומים שעברו טיפול ב-diethyl pyrocarbonate עד לנפח סופי של 20 μL.
    2. דגרו את התגובה בטרמיקלר (thermal cycler) למשך 10 דקות ב-25°C להיברוג של הפריימרים, ולאחר מכן למשך 30 דקות ב-50°C עבור סינתזת ה-cDNA. נטרלו את ה-reverse transcriptase על ידי דגירה של התגובה ב-85°C למשך 5 דקות.
    3. הוסיפו 1 μL של RNase H ודגרו את התגובה למשך 20 דקות ב-37°C כדי לפרק את גדיל ה-RNA של ההיבריד RNA–DNA.
    4. דללו את תכשיר ה-cDNA ביחס של עד 1:20 עם מים סטריליים, בהתאם לדרישות אופטימיזציית הבדיקה, ואחסנו את ה-cDNA המדולל ב-−20°C עד לביצוע אנליזת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR).

5. עיבוד דגימות: תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

הערה: יש למדוד את הביטוי של גנים של השעון הצירקדי באמצעות qRT-PCR. ניתן לעיין בטבלה משלימה 2 עבור רצפי פריימרים מאושרים, טמפרטורות היברידציה (annealing) וריכוזי פריימרים.

  1. אופטימיזציה של הבדיקה
    1. יש לתקף ולאפטם את ריכוז הפריימרים, טמפרטורת ההיbride (annealing) וכמות ה-cDNA המוכנסה באמצעות דגימות cDNA מאוחדות (pooled) ועקומת סטנדרט לפני ניתוח הדגימות הניסיוניות. בצעו את אופטימיזציית ותיקוף הבדיקה כפי שתואר בעבר15,16.
  2. הגדרת התגובה
    1. הכינו כל תגובת qRT-PCR בנפח של 10 μL על ידי ערבוב של 5 μL של 2× master mix, כ-0.4 μL מכל אחד מהפריימרים הקדמי (forward) וההפוך (reverse), 0.2 μL של מים שעובדו ב-diethyl pyrocarbonate, ו-4 μL של תבנית cDNA בתוך פלטת PCR בעלת 96 בארות.
    2. אטמו את הפלטה באמצעות סרט איטום שקוף אופטית או מדבקת איטום. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-700 × g למשך עד 5 דקות ב-4°C כדי להסיר בועות ולרכז את תערובת התגובה בתחתית כל בארה.
    3. נתחו את כל דגימות ה-cDNA כדי לקבוע את הביטוי של הגנים המטרה Bmal1 ו-Per2.
    4. נתחו את הגן הפחסי שנבחר (B2m) תוך שימוש באותה דילול של cDNA כדי לנרמל את ביטוי הגנים בין הדגימות.
  3. מעגלי תרמיים
    1. בצעו qRT-PCR תחת תנאי המעגלים הבאים: דנטורציה ראשונית והפעלה של ה-DNA polymerase מסוג hot-start ב-95°C למשך 2 דקות, ולאחריהם 39 מחזורים של 95°C למשך 5 s ו-60°C למשך 30 s.
    2. בצעו ניתוח עקומת המסה (melt curve) על ידי חימום התגובות ל-95°C למשך 5 s, ולאחריו עליות הדרגתיות של 0.5°C עד ל-95°C, עם השהיה של 5 s בכל עלייה.
      הערה: התאימו את זמני ההשהיה והגדרות עקומת המסה לפי המלצות ה-master mix במידת הצורך.
  4. תיקוף הגן הפחסי
    הערה: בניסויים של סנכרון סרום, העריכו גנים פחסיים מועמדים מכיוון שטיפול בסרום עלול לשנות את הביטוי של גנים פחסיים (housekeeping genes)17. העריכו את יציבות הביטוי באמצעות שיטות כגון BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20, או שיטת ΔCt ההשוואתית21. בחרו את הגן או הגנים היציבים ביותר לצורך נורמליזציה. במחקר זה, β-actin (Actb) ו-β-2-microglobulin (B2m) הוערכו באמצעות תוכנת RefFinder22, המשלבת מספר אלגוריתמים לתיקוף גנים פחסיים. B2m הראה את יציבות הביטוי הגבוהה ביותר לאורך מהלך הזמן הצירקדי ולכן נבחר לנורמליזציה.
  5. אימות המוצר
    1. אמתו את ספציפיות ההגברה על ידי ניתוח תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2%.
      הערה: קבעו את טמפרטורת ההיbride האופטימלית על ידי בדיקת מספר טמפרטורות (למשל, 58 °C, 60°C, ו-62°C). בחרו בטמפרטורה המניבה את ערך מחזור הכימות (Cq) הנמוך ביותר תוך שמירה על שיא יחיד בעקומת המסה ללא עדות ליצירת דימרים של פריימרים.
      הערה: קבלו בדיקות עם יעילויות הגברה שבין 90% ל-110% ומקדם דטרמינציה (R2) של 0.99 ומעלה. ודאו שטמפרטורות המסה אינן נבדלות ביותר מ-0.5°C בין חזרות טכניות. קבלו לניתוח רק חזרות טכניות עם הפרש Cq של ≤0.5 והשתמשו בערכים אלו לחישוב רמות הביטוי הממוצעות. בצעו את כל התגובות בחזרות טכניות (למשל, שלשות) וכללו הן בקרה ללא תבנית (non-template control) והן בקרה ללא שעתוק הפוך (no-reverse-transcription control).

6. ניתוח נתונים

  1. ניתוח ביטוי גנים
    1. חשב את הממוצע של החזרות הטכניות עבור כל דגימה לפני ניתוחים המשכיים.
    2. חשב את ערך ה-ΔCq עבור כל דגימה ונקודת זמן באמצעות המשוואה הבאה:
      ΔCq   = Cqtarget gene  -  Cqhousekeeping gene
    3. חשב את ערך ה-ΔΔCq עבור כל דגימה ונקודת זמן באמצעות המשוואה הבאה:
      ΔΔCq   = ΔCqsample  -  ΔCqcontrol  
      הערה: לצורך חישוב ה-ΔΔCq, ערך ה-ΔCqcontrol הוגדר כממוצע ערכי ה-ΔCq שהתקבלו מממוצע של כל דגימות הביקורת בכל ה-CTs.
    4. הערך את הפרמטרים הצירקדיים, כולל ה-midline estimating statistic of rhythm (MESOR), אמפליטודה, שיא (peak) ומופע (phase), באמצעות CircaCompare23. בצע את הניתוח באמצעות האפליקציה המקוונת או באמצעות מימוש חבילת ה-R.
  2. ניתוח CircaCompare מקוון
    הערה: המימוש המקוון מדווח על אומדני פרמטרים צירקדיים מלאים רק כאשר מערך הנתונים עומד בקריטריונים הסטטיסטיים למקצביות (rhythmicity). כאשר המקצביות חלשה או אינה מובהקת סטטיסטית, השתמש במימוש ה-R כדי לקבל אומדני פרמטרים עבור כל מערכי הנתונים.
    1. הכן קובץ ערכים מופרדים בפסיקים (.csv).
      1. הזן את משתנה הזמן (מספרי; שעות) בעמודה 1.
      2. הזן את משתנה הקיבוץ (שתי קבוצות ניסוייות בלבד) בעמודה 2.
      3. הזן את משתנה התוצאה (מספרי; ΔΔCq) בעמודה 3.
    2. העלה את קובץ ה-.csv לאפליקציית CircaCompare המקוונת.
    3. שייך את משתני הזמן, הקבוצה והתוצאה לעמודות המתאימות.
    4. בחר ב-Run כדי לבצע את הניתוח.
  3. ניתוח CircaCompare ב-R
    1. בצע את הניתוח באמצעות R גרסה 4.5.1 וחבילת CircaCompare גרסה 0.2.024.
    2. התקן את חבילות ה-R הנדרשות.
      1. התקן את חבילת devtools (גרסה 2.5.2).
      2. התקן את חבילת circacompare (גרסה 0.2.0).
      3. התקן את חבילת ggplot2 (גרסה 4.0.3).
      4. התקן את חבילת svglite (גרסה 2.2.2).
    3. העלה את קובץ ה-csv של נתוני הקלט.
    4. הפעל את ניתוח ה-CircaCompare לאחר הגדרת alpha_threshold = 1.
      הערה: הגדרת alpha_threshold = 1 מדווחת על אומדני פרמטרים צירקדיים עבור כל התנודות המותאמות ללא קשר למובהקות הסטטיסטית. עם זאת, רק תנודות עם p-value < 0.05 צריכות להתפרש כמקצביות ומובהקות סטטיסטית.
    5. התאם אישית את Supplementary File 1 לפני הרצת הסקריפט.
      1. החלף את “XXX.csv” בשם קובץ נתוני הקלט.
      2. החלף את “YYY.csv” בשם קובץ התוצאות הרצוי.
      3. החלף את “ZZZ.svg” בשם קובץ הגרף הרצוי.
      4. כוונן את גבולות ציר ה-y (ylim) וכל פרמטר שרטוט נוסף בהתאם למערך הנתונים.
    6. עיין ב-Supplementary Table 3 לדוגמה לקובץ קלט.

תוצאות

סנכרון מוצלח מעיד על מקצב צירקדי בעל מובהקות סטטיסטית של הגנים שעתיים שנבדקו בתנאי הבקרה (p < 0.05). במחקר זה בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים, כאשר 0.1% dimethyl sulfoxide שימש כבקרה שלילית. Bmal1 ו-Per2 נבחרו כסממנים צירקדיים מייצגים מכיוון שהם מרכיבי ליבה של השעון הצירקדי המולקולרי ומראים דפוס ביטוי אנטי-פאזי מאופיין היטב. פרופילי ביטוי מקצביים מייצגים שהתקבלו לאחר הסנכרון מוצגים ב-איור 2. הפרמטרים הצירקדיים התואמים, כולל מקצב, MESOR, אמפליטודה וזמן שיא, מסוכמים ב-טבלה 1, בעוד שההשוואה הזוגית בין Bmal1 ל- Per2 מוצגת ב-טבלה 2.

גרף ביטוי mRNA צירקדי; רמות Per2/Bmal1 לאורך 24-48 שעות; ניתוח ביטוי גנים מחזורי.
איור 2תנודות צירקודיאניות של Bmal11 ו- לכל2 לאחר סנכרון באמצעות הלם סרום. פרופילי ביטוי צירקדיים מייצגים של Bmal11 (כחול כהה) ו- לפי2 (תכלת) בתאי mHypoE-42 מסונכרנים, כפי שנמדד באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) מ-24 עד 48 שעות לאחר הסנכרון. העקומות מייצגות את המודלים הצירקדיים המותאמים שנוצרו באמצעות CircaCompare.אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גןמקצביות
(ערך p)		MESORאמפליטודהזמן שיא
(ח)
Bmal10.0205−0.29480.464820.4239
Per20.0071−0.3180.46299.4883
Bmal1 + תרכובת A0.1068———

טבלה 1: פרמטרי מקצב צירקדי שהוערכו עבור Bmal1 ו-Per2 בתנאים בסיסיים ועבור Bmal1 לאחר טיפול ב-Compound A. המקצב הצירקדי הוערך באמצעות CircaCompare. הטבלה מציגה את ערך ה-p למקצב, את הסטטיסטיקה המוערכת של קו האמצע של המקצב (MESOR), את האמפליטודה ואת זמן השיא עבור כל תנאי. פרמטרים צירקדיים אינם מדווחים עבור Bmal1 לאחר טיפול ב-Compound A מכיוון שהמקצב לא היה מובהק סטטיסטית (p = 0.1068).

אומדן הפרש MESOR
(p-value)		אומדן הפרש אמפליטודה
(p-value)		אומדן הפרש מופע
(p-value)		מחזור משותף
(h)
−0.0232 (p = 0.8904)−0.0019 (p = 0.9936)−10.9356 (p = 2.3155 × 10⁻6)24

טבלה 2: השוואה זוגית של פרמטרים צירקדיים בין Bmal1 ל-Per2. השוואה זוגית של הסטטיסטיקה של הערכת קו האמצע של המקצב (MESOR), האמפליטודה והפאזה בין פרופילי הביטוי הצירקדיים המותאמים של Bmal1 ו-Per2, כפי שהוערכו באמצעות CircaCompare. הערכים מוצגים כהפרשי פרמטרים עם ערכי ה-p המתאימים. המחזור המשותף נקבע על 24 h במהלך התאמת המודל.

בתנאים בסיסיים, שנייהם Bmal11 ו- לכלהראו מחזוריות בעלת מובהקות סטטיסטית (Bmal11: p = 0.0205; לפי2: p = 0.0071). ניתוח CircaCompare הדגים עוד כי שני הגנים תנודו בפאזות הפוכות, עם הפרש פאזה של 10.9356- שעות (p = 2.3155 × 10⁻6), באופן העולה עם מערכת היחסים האנטי-פאזית הצפויה שלהם בתוך רשת השעון הביולוגי המולקולרי. מדדי איכות ה-RNA התומכים בניתוח ביטוי גנים במורד מופיעים ב- טבלה משלימה 1.

ניתן להחיל את הפרוטוקול גם כדי להשוות את המחזוריות הצירקדית בין תנאים ניסיוניים, כולל מודלים של בריאות מול מחלה או קבוצות ביקורת מול קבוצות טיפול. כדוגמה מייצגת, נבחן מזהם סביבתי ומשבש אנדוקרי מתהווה שזוהה בעבר בהיפותלמוס האנושי, ואשר יכונה כאן תרכובת A (Compound A). תוצאות מייצגות מוצגות ב-איור 3, וניתוח המחזוריות התואם מסוכם ב-טבלה 1.

גרף ביטוי RNA לאורך זמן; mRNA (ΔΔCq) לעומת זמן; ביקורת לעומת תרכובת A; ניתוח נתונים.
איור 3השפעת תרכובת A על המקצב הצירקדי של Bmal1ביטוי מייצג Bmal11 פרופיל ביטוי בתאי mHypoE-42 מסונכרנים בעקבות טיפול ב-Compound A, שנמדד באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כמותית (qRT-PCR). העקומות מייצגות את המודלים הצירקדיים המותאמים שהופקו באמצעות CircaCompare. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בעקבות חשיפה ל-Compound A, Bmal1 לא הפגין עוד מקצב בעל מובהקות סטטיסטית (p = 0.1068). בתנאים אלה, המודל הצירקדי שהותאם לא עמד בקריטריונים הסטטיסטיים למקצב. כתוצאה מכך, פרמטרים צירקדיים כגון MESOR, אמפליטודה וזמן שיא אינם מדווחים, מכיוון שאינם נחשבים לניתנים לפירוש ביולוגי כאשר המקצב אינו מובהק סטטיסטית. דוגמה זו ממחישה כיצד זרימת העבודה יכולה להבדיל בין פרופילי ביטוי מחזוריים לבלתי מחזוריים, וכי ניתן להשתמש בה להערכת שינויים פוטנציאליים בביטוי גנים צירקדי תחת תנאים ניסיוניים שונים. כדי למזער שונות טכנית פוטנציאלית הקשורה לאסטרטגיית הדגימה המדורגת, כל פלטחות התרבית הוכרו מהסספנזיה תאית אחת, נשמרו תחת תנאי תרבית זהים, וסוכרנו באמצעות אותה זרימת עבודה ניסיונית, כאשר ההבדל היחיד היה במועד הסנכרון.

איור משלים 1. לוח זמנים שבועי של פרוטוקול הסנכרון המדורג. ציר זמן שבועי מייצג הממחיש את זריעת התאים, הרעבת הסרום, סנכרון באמצעות הלם סרום, עצירת הסנכרון ואיסוף דגימות צירקדיות עבור שתי קבוצות הניסוי המדורגות (קבוצה 1, סגול; קבוצה 2, ירוק). התכנון המדורג מאפשר איסוף של נקודות זמן צירקדיות (CT) CT0–CT48 במהלך שעות העבודה הסטנדרטיות תוך הימנעות מאיסוף דגימות במהלך הלילה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1. מדדי איכות RNA עבור כל הדגימות הביולוגיות שנכללו בניסוי סדרת הזמנים הצירקדיאנית. טוהר ה-RNA הוערך באמצעות יחסי הבליעה A260/A280 ו-A260/A230, וריכוז ה-RNA נקבע באופן ספקטרופוטומטרי לפני סינתזה של DNA משלים (cDNA). הדגימות מזוהות לפי זמן האיסוף, קבוצת הטיפול והחזרה הביולוגית. מדידות אלו שימשו לאימות איכות ה-RNA לפני ניתוח quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) בהמשך. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2. רצפי פריימרים ותנאי הגברה ששימשו לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR). רצפי פריימרים אוליגונוקלאוטידיים קדמיים (Forward) ואחוריים (Reverse) מוצגים בכיוון 5′-3′ יחד עם מספר(י) הגישה המתאימים ב-NCBI, טמפרטורת ההתחברות (annealing temperature) וריכוז הפריימר ששימש להגברה של כל גן מטרה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 3. דוגמה למערך נתונים להזנה עבור ניתוח מקצב צירקדי באמצעות CircaCompare. דוגמה למערך נתונים בפורמט ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המותאם לניתוח באמצעות CircaCompare. מערך הנתונים כולל שלושה משתנים נדרשים: Time (h), Group, ו-Outcome (ΔΔCq), התואמים לפורמט המתואר בפרוטוקול ניתוח הנתונים ומשמשים כקובץ הזנה לדוגמה עבור הערכת פרמטרים צירקדיים. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1. דוגמה לסקריפט R לניתוח מקצב צירקדי באמצעות CircaCompare. דוגמה לסקריפט R לניתוח נתוני ביטוי גנים צירקדיים באמצעות חבילת CircaCompare (גרסה 0.2.0) ב-R (גרסה 4.5.1). הסקריפט מייבא את סט נתוני הקלט, מבצע הערכת פרמטרים צירקדיים עם מחזור של 24-h, מייצא סיכום סטטיסטי ומפיק גרף באיכות לפרסום. לפני השימוש, החליפו את שמות הקבצים הזמניים (XXX.csv, YYY.csv ו-ZZZ.svg) בשמות קבצי הקלט והפלט הרצויים והתאימו את פרמטרי הגרף (למשל, ylim) בהתאם לסט הנתונים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

מקצבים צירקדיים הם מחזורים אנדוגניים של כ-24 h המווסתים מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים, מטבוליים ותאיים באמצעות מנגנוני שעון מולקולרי שמורים1,2. מודלים של סנכרון In vitro מספקים סביבה ניסויית מבוקרת לחקר מנגנונים אלה, והפכו לכלים בעלי ערך ללימוד רגולציה צירקדית בתנאים נורמליים ופתולוגיים, כולל חשיפה למזהמים סביבתיים והפרעות ניסיוניות אחרות25. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר זרימת עבודה מעשית לסנכרון תאים בתרבית באמצעות הלם סרום (serum shock), איסוף דגימות בסדרת זמנים באמצעות אסטרטגיית דגימה מדורגת, וכימות ביטוי של גנים צירקדיים באמצעות qRT-PCR. זרימת עבודה זו מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים פרופיל ביטוי גנים זמני תוך מזעור האתגרים הלוגיסטיים הקשורים לאיסוף דגימות במהלך הלילה. מספר שלבים קריטיים קובעים את ההצלחה ואת השחזוריות של פרוטוקול זה. בקרה נאותה על צפיפות התאים (confluency), הרעבת סרום, משך הלם הסרום ותנאי הסנכרון היא חיונית, כיוון שסנכרון לא מספק עלול להוביל למקצב חלש או לבלתי ניתן לגילוי14. צפיפות זריעה עקבית של התאים, הכנת כל הצלחות הניסוי מאותה סספנזיית תאים ותנאי תרבית זהים בין קבוצות הניסוי המדורג מפחיתים עוד יותר את השונות הטכנית. איכות ה-RNA, סינתזת cDNA, תיקוף הפריימרים ובחירה של גני ייחוס יציבים הם גורמים חשובים נוספים לקבלת תוצאות qRT-PCR מהימנות. כבכל פרוטוקול סנכרון צירקדי, ייתכן שיידרש אופטימיזציה של פרמטרים אלו בעת התאמת זרימת העבודה לסוגי תאים או לתנאי ניסוי שונים.

אף שסמיכה בסרום (serum shock) היא אחת משיטות הסנכרון הנפוצות והמבוססות ביותר בביולוגיה של השעון הביולוגי4,26, היא אינה אופטימלית באופן אוניברסלי לכל יישום ניסויי. גישות סנכרון חלופיות, כולל טיפול בדקסמתזון (dexamethasone), גרייה בפורסקולין (forskolin), סנכרון לטמפרטורה ומערכות מבוססות חלבון דווח (reporter), עשויות להיות הולמות יותר בהתאם למודל הביולוגי ולמטרת המחקר14. יש להחשיב שיטות אלו כגישות משלימות ולא כתחרותיות, שכן לכל אחת מהן יתרונות ומגבלות מובחנים. סמיכה בסרום מספקת איזון מעשי בין פשטות ניסויית, נגישות ויכולת שחזור ללא צורך במכשור מיוחד או במערכות דווח מקודדות גנטית. עם זאת, על החוקרים לשקול בזהירות את ההשפעה הפוטנציאלית של גירוי הסנכרון על המערכת הביולוגית שלהם, ולבחור בגישה שעונה בצורה הטובה ביותר על השאלה הניסויית שלהם. דווחו גם על פרוטוקולים של סמיכה בסרום המדלגים על שלב ההרעבה לסרום, ואלו עשויים להוות חלופות מתאימות בהקשרים ניסוייים ספציפיים27. הגמישות של פרוטוקול זה מאפשרת מספר התאמות ואסטרטגיות לפתרון בעיות. תכנון הדגימה המדורגת נשען על צלחות תרבית מקבילות שסונכרנו בזמנים שונים כדי לייצר CTs משלימים תוך הימנעות מאיסוף דגימות במהלך הלילה. כדי למזער שונות בין צלחות, הכינו את כל הצלחות מאותה סספנזיית תאים, זרעו אותן בצפיפויות זהות, שמרו על תנאי תרבית זהים, ובצעו את הסנכרון באמצעות זרימת עבודה ניסויית אחת, כשההבדל היחיד הוא בתזמון הסנכרון. אף שגישה זו אינה יכולה לבטל לחלוטין שונות הקשורה לסדרות (batch-related variation), היא ממזערת שונות טכנית תוך הפחתה משמעותית של האתגרים הלוגיסטיים הקשורים לדגימה לילית, ושומרת על היכולת לזהות מקצביםB צירקדיים בעלי משמעות ביולוגית. למרות שאסטרטגיית הדגימה המדורגת תוכננה למזער שונות טכנית על ידי שמירה על תנאי תרבית זהים בכל מערכי הניסוי, היא לא הושוותה ישירות לתכנון דגימה רציף קונבנציונלי במחקר הנוכחי. מחקרים עתידיים עשויים להעריך עוד את השקילות של גישות אלו במודלים ניסוייים נוספים. בעת התאמת זרימת עבודה זו לסוגי תאים חדשים או לתנאים ניסוייים שונים, יש לבצע אופטימיזציה של יעילות הסנכרון ולהעריך השפעות סדרות פוטנציאליות במהלך תיקוף הפרוטוקול. בהתאם למטרת הניסוי, שנו את לוח הזמנים של הסנכרון על ידי התאמת זמני תחילת הסנכרון או על ידי שמירת תרבית מסונכרנת אחת עם חלון דגימה מקוצר. אסטרטגיות לפתרון בעיות כוללות אופטימיזציה של משך הסמיכה בסרום, אימות חיוניות התאים והצפיפות (confluency) שלהם לפני הסנכרון, אישור איכות ה-RNA לפני ניתוחים המשכיים, והתאמת מרווחי הדגימה לשיפור זיהוי המקצב הצירקדי. הפרוטוקול הנוכחי תוקף בשורת התאים ההיפותלמיים העובריים של עכבר mHypoE-42, ולכן יש לבצע לו אופטימיזציה ותיקוף עצמאיים לפני יישומו במודלים תאיים אחרים. למרות שלא נבחן במחקר הנוכחי, פרוטוקול זה פותח על בסיס אופטימיזציה קודמת במעבדתנו באמצעות שורות תאים אחרות (למשל, תאי N2a ופיברובלסטים אנושיים), מה שתומך ביכולת היישום שלו במודלים תאיים שונים. בדומה לכך, אסטרטגיית הדגימה המדורגת משפרת משמעותית את ההיתכנות הניסויית על ידי מתן אפשרות לדגימה צירקדית מלאה במהלך שעות העבודה הסטנדרטיות; עם זאת, על המשתמשים לשמור על תנאים ניסוייים זהים בכל צלחות התרבית כדי למזער השפעות סדרות פוטנציאליות. כאשר זרימת עבודה זו עוברת אופטימיזציה נכונה, היא מספקת גישה נגישה וניתנת לשחזור לחקר ביטוי גנים צירקדי ולהערכת התערבויות ניסוייות המשנות את תפקוד השעון המולקולרי במגוון רחב של יישומים מחקריים.

למרות יתרונותיה המעשיים, לשיטה זו מספר מגבלות. אסטרטגיית הדגימה במדורגים מספקת מדידות בנקודות זמן בדידות במקום ניטור רציף, מה שמפחית את הרזולוציה הזמנית בהשוואה למסכים המבוססים על רפורטרים פלואורסצנטיים או ביו-לומניסצנטיים7. כתוצאה מכך, הדיוק של הערכת המחזור והגילוי של הסטות פאזה עדינות או תנודות בעוצמה נמוכה עלולים להיות מופחתים. בנוסף, תהליך הדגימה מבוסס-הפלטה הופך לעתיר עבודה יותר ככל שמספר הטיפולים או התנאים הניסיוניים עולה, מכיוון שנדרשות פלטות תרבית נוספות עבור כל תנאי. בין המתודולוגיות הקיימות, תהליך עבודה זה מהווה חלופה מעשית למערכות מבוססות רפורטר, כולל בדיקות לוציפראז מונעות E-box (למשל, Bmal1-Luc ו-Per2-Luc), המאפשרות ניטור בזמן אמת של פעילות צירקדית בתאים חיים28,29. למרות שמערכות רפורטר מבוססות פלואורסצנציה וביו-לומניסצנציה מספקות רזולוציה זמנית גבוהה ויעילות במיוחד לסריקה של מודולטורים צירקדיים פוטנציאליים בתפוקה גבוהה, הן דורשות שינוי גנטי יציב, ציוד גילוי ייעודי ותנאים סביבתיים מבוקרים בקפדנות30, אשר עשויים שלא להיות זמינים בכל המעבדות. יתרה מכך, מערכות רפורטר מוגבלות בדרך כלל למבני רפורטר שהוגדרו מראש ועשויות לדרוש נרמול לאותות קונסטיטוטיביים או לשפע תאי, מה שמגביל הערכה סימולטנית של מספר גנים או ניתוחים מולקולריים המשכיים. לעומת זאת, תהליך העבודה המתואר כאן תואם למספר יישומים המשכיים, כולל ניתוח כמותי של ביטוי גנים ובדיקות מבוססות חלבון, מה שהופך אותו לגישה נגישה ורב-גונית עבור מעבדות החוקרות ויסות צירקדי מולקולרי.

בעקבות איסוף הדגימות והניתוחים הבאים, הערכה סטטיסטית מתאימה היא חיונית כדי לקבוע האם התנודות שנצפו הן בעלות מובהקות סטטיסטית ומשמעות ביולוגית. בפרוטוקול זה, CircaCompare מספק מסגרת חסונה להערכה והשוואה סטטיסטית של ה-MESOR, האמפליטודה והפאזה באמצעות מודלי רגרסיה מבוססי cosinor23. בניגוד לגישות המעריכות קצביות (rhythmicity) לבדה, CircaCompare מאפשר השוואות זוגיות ישירות של פרמטרים צירקדיים בין קבוצות ניסוייות, ובכך מקל על הערכת השפעות טיפול, הפרעות גנטיות או שינויים הקשורים למחלה בהתנהגות הצירקדית. תהליך ניתוח זה משלים את פרוטוקול הסנכרון על ידי אספקת מדדים כמותיים סטנדרטיים לפירוש שינויים בביטוי גנים צירקדיים. כפי שמוצג בתוצאות המייצגות, סנכרון מוצלח הוכח על ידי דפוסי הביטוי התנודתיים הצפויים של mRNA של Bmal1 ו-Per2 לאחר הלם סרום (איור 2). לעומת זאת, חשיפה ל-Compound A הובילה לאובדן של קצביות מובהקת סטטיסטית של Bmal1 (איור 3), מה שמדגים את התועלת של תהליך עבודה זה להערכת התערבויות ניסוייות המשנות את הביטוי של גנים צירקדיים. שיקול חשוב בעת פירוש נתוני ביטוי של גנים צירקדיים הוא השונות הביולוגית בין ניסויים בלתי תלויים. במחקר זה, התוצאות המייצגות התקבלו מחזרות ביולוגיות בלתי תלויות שבוצעו בימים שונים ובמעברים תאיים שונים. כתוצאה מכך, מידה מסוימת של שונות היא צפויה ומשקפת וריאציה ביולוגית ולא טכנית. מסיבה זו, ניסויי סנכרון צריכים לכלול חזרות ביולוגיות בלתי תלויות ולהיות מפורשים בהקשר של השונות הביולוגית הצפויה של המודל התאי הנחקר. למרות שונות זו, קצביות מובהקת סטטיסטית והקשר אנטי-פאזי צפוי בין Bmal1 ל-Per2 נצפו באופן עקבי. יתרה מכך, מאפיינים צירקדיים, כולל אמפליטודת התנודה, פאזה, אורך המחזור וקצב הריסון (damping rate), משתנים בין מודלים תאיים. לכן, יש להעריך את ביצועי הסנכרון בהקשר של סוג התא הספציפי הנחקר ולא באמצעות השוואה ישירה למודלים שאינם קשורים.

זרימת עבודה זו רלוונטית במיוחד לחקר תפקידם של מקצבים צירקדיים במנגנוני מחלה ובתגובות טיפוליות. שיבוש בבקרת המקצב הצירקדי נקשר למספר מצבים פתולוגיים, כולל סרטן, הפרעות מטבוליות ומחלות נוירודגנרטיביות31,32. היכולת להעריך ביטוי גני מחזורי או שפע חלבוני in vitro מספקת מסגרת מעשית לחקר תהליכים אלו ולהערכת ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות על השעון הצירקדי המולקולרי, אשר מזוהה יותר ויותר כמטרה טיפולית פוטנציאלית14,33. לדוגמה, ניתן להחיל פרוטוקול זה כדי לבחון כיצד מודולטורים מועמדים משפיעים על ביטוי גנים צירקדיים במודלים תאיים רלוונטיים למחלה, לאחר אופטימיזציה ותיקוף מתאימים. חשוב לציין, מטרת העבודה הנוכחית אינה להמליץ על הלם סרום (serum shock) כתחליף לשיטות סנכרון אחרות או להצביע על עליונותו על גישות חלופיות. במקום זאת, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מפורטת וניתנת לשחזור ליישום אסטרטגיית סנכרון נפוצה, איסוף דגימות צירקדיות במהלך שעות עבודה סטנדרטיות באמצעות תכנון דגימה מדורג, וניתוח ביטוי גני מחזורי באמצעות מתודולוגיות המשך נגישות. אנו צופים שמסגרת זו תהיה שימושית במיוחד עבור מעבדות המקימות ניסויי צירקדיים או מחפשות זרימת עבודה מעשית, שחזורית ונגישה לשילוב ניתוחים זמניים במודלים תאיים קיימים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו מומנה במשותף על ידי קרן ההתאוששות והחוסן של האיחוד האירופי (EU) ועל ידי קרנות לאומיות פורטוגליות באמצעות FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia במסגרת הפרויקטים LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025), ו-UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); על ידי קרן הפיתוח האזורית האירופית (ERDF) באמצעות התוכנית התפעולית האזורית Centro 2030 במסגרת פרויקט CENTRO2030-FEDER-02360200; ועל ידי קרנות לאומיות פורטוגליות באמצעות FCT תחת המענקים 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD), ו-2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלטת תרבית תאים בעלת 6 בארותNest Biotechnology15140122פלטת תרבית תאים
אגרוזNZYtechMB02702הערכת איכות RNA
תערובת אנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומייצין)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648תוסף לתרבית תאים
ערכה לסנתזת cDNA (גדיל ראשון)NZYtechMB12502שעתוק הפוך
כלורופורםSigma-AldrichA5256701ריאגנט להפרדה פאזית
DMEM, גלוקוז גבוה (4500 מג/ל גלוקוז, L-glutamine)Sigma-Aldrich26050088תווך לתרבית תאים
מבחנות מיקרוצנטריפוגה של EppendorfEppendorf30120086אחסון דגימות
אתנול (96%)Fisher Bioreagents15552393טיהור RNA
סרום עגל עוברי, שעבר נטרול חוםGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7תוסף לתרבית תאים
פלטת PCR בעלת 96 בארות ודפנות קשיחותBio-Rad LaboratoriesHSP9601פלטת qRT-PCR
סרום סוס, שעבר אינאקטיבציה תרמיתGibco, Thermo Fisher Scientific15400054סנכרון באמצעות הלם סרום
קו תאים mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402קו תאי היפותלמוס מעוברים של עכבר
פריימרים של אוליגונוקלאוטידNZYtechMB12501פריימרים ל-qRT-PCR
מלח פוספט רסן (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502שטיפת תאים
תערובת מאסטר ירוקה ל-qPCR (2×)NZYtechMB22403ריאגנט ל-qRT-PCR
מערכת גילוי באמצעות PCR בזמן אמתBio-Rad LaboratoriesEP0030108116מכשיר qRT-PCR
ערכה לבידוד RNANZYtech288306טיהור באמצעות עמודת ספין של סיליקה
ריאגנט לליזיס של RNANZYtechMB18502ריאגנט למיצוי RNA מבוסס פנול
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichMB22401תוסף למצע תרבית תאים
צלחית תרבית סטרילית בקוטר 35 מ"מThermo Fisher Scientific121Vצלוחית לתרבית תאים
מעגל תרמי T100Bio-Rad Laboratories1861096סינתזת cDNA
בקבוק לתרבית רקמה T75Corning430641Uכלי לתרבית תאים
תמיסת Trypan blue (0.4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061ספירת תאים
Trypsin-EDTA (0.5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054פירוק תאיים

מקורות

  1. Fuhr L, Abreu M, Pett P, Relógio A. Circadian systems biology: When time matters. Comput Struct Biotechnol J. 2015;13:417-426.
  2. Albrecht U. Timing to perfection: The biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 2012;74(2):246-260.
  3. Relógio A, et al. Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS Genet. 2014;10(5):e1004338.
  4. Balsalobre A, Damiola F, Schibler U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998;93(6):929-937.
  5. Hughes ATL, et al. Constant light enhances synchrony among circadian clock cells and promotes behavioral rhythms in VPAC2-signaling deficient mice. Sci Rep. 2015;5:12092.
  6. Fuhr L, et al. The circadian clock regulates metabolic phenotype rewiring via HKDC1 and modulates tumor progression and drug response in colorectal cancer. EBioMedicine. 2018;33:105-121.
  7. Nagoshi E, et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: Cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 2004;119(5):693-705.
  8. Balsalobre A, et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000;289(5488):2344-2347.
  9. Kaneko H, Kaitsuka T, Tomizawa K. Response to stimulations inducing circadian rhythm in human induced pluripotent stem cells. Cells. 2020;9(3):732.
  10. Chalmers JA, et al. Vascular circadian rhythms in a mouse vascular smooth muscle cell line (Movas-1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008;295:R1529-R1538.
  11. Brown SA, et al. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Curr Biol. 2002;12(18):1574-1583.
  12. Adamovich Y, et al. Rhythmic oxygen levels reset circadian clocks through HIF1α. Cell Metab. 2017;25(1):93-101.
  13. Rogers EH, et al. Comparing circadian dynamics in primary derived stem cells from different sources of human adult tissue. Stem Cells Int. 2017;2017:2057168.
  14. Gaspar LS, et al. The importance of determining circadian parameters in pharmacological studies. Br J Pharmacol. 2019;176(16):2827-2847.
  15. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-1582.
  16. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 2010;50(4):227-230.
  17. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408.
  18. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004;26(6):509-515.
  19. Vandesompele J, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034.1-research0034.11.
  20. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization. Cancer Res. 2004;64(15):5245–5250.
  21. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006;7:33.
  22. Xie F, Wang J, Zhang B. RefFinder: a web-based tool for comprehensively analyzing and identifying reference genes. Funct Integr Genomics. 2023;23:125.
  23. Parsons R, Garner N, Oster H, Rawashdeh O. CircaCompare: A method to estimate and statistically support differences in mesor, amplitude and phase between circadian rhythms. Bioinformatics. 2020;36(4):1208-1212.
  24. Parsons R. circacompare: Analyses of circadian data. R package version 0.2.0. 2021. Available at: https://CRAN.R-project.org/package=circacompare
  25. Di Nisio A, et al. Impairment of human dopaminergic neurons at different developmental stages by perfluoro-octanoic acid (PFOA) and differential human brain areas accumulation of perfluoroalkyl chemicals. Environ Int. 2022;158:106982.
  26. Xiang S, et al. Oscillation of clock and clock-controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: Regulation by melatonin. Breast Cancer (Auckl). 2012;6:155-168.
  27. Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging. Cell. 2013;153(7):1448-1460.
  28. Yoo SH, et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(15):5339-5346.
  29. Ueda HR, et al. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat Genet. 2005;37(2):187-192.
  30. Beaulé C, Granados-Fuentes D, Marpegan L, Herzog ED. In vitro circadian rhythms: Imaging and electrophysiology. Essays Biochem. 2011;49(1):103-117.
  31. Ribeiro RFN, et al. Circadian rhythms are disrupted in patients and preclinical models of Machado-Joseph disease. Brain. 2025;148(11):4127-4142.
  32. Masri S, Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018;24(12):1795-1803.
  33. Ribeiro RFN, Cavadas C, Silva MMC. Small-molecule modulators of the circadian clock: Pharmacological potentials in circadian-related diseases. Drug Discov Today. 2021;26(7):1620-1641.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCRRNA

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.