מאמר שיטה

פתיחה של מחסום דם-מוח (BBB) בבקרה אולטרסאונית בשבב מיקרופלואידי של BBB-גליובלסטומה למחקרי הולכת תרופות

119 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את בנייתו של מודל שבב מיקרופלואידי של מחסום דם-מוח וגליובלסטומה (BBB‑GBM). המודל עבר תיקוף לשלמות ה-BBB ומאפשר חקירה של פתיחה חולפת ובעיקר הפיכה של ה-BBB המושפעת מאולטרסאונד בעוצמה נמוכה, ובכך מאפשר הערכה כמותית של הובלת ננו-מיסלות באמצעות אולטרסאונד דרך ה-BBB ויעילות התargeting לגידול.

תקציר

מחסום הדם-מוח (BBB) מהווה מכשול מרכזי בטיפול בגליובלסטומה (GBM), שכן הוא מגביל את כניסתם של רוב המולקולות הטיפוליות אל המוח. הבדלים בין-מיניים במבנה ובפונקציה של ה-BBB מקשירים את התרגום הקליני של מודלים בבעלי חיים, דבר המדגיש את הצורך בפלטפורמות BBB in vitro הרלוונטיות לבני אדם להערכת חדירות תרופות בטיפול ב-GBM. כאן, מתואר פרוטוקול לבניית מודל שבב מיקרופלואידי של BBB-GBM. מודל זה מבסס מערכת של תרבית משולשת הכוללת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מוחיים אנושיים (HCMECs), אסטרוציטים ראשוניים (ACs) ותאי U87-MG בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית המוטמעת ב-Matrigel. שלמות ה-BBB מאומתת באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית רציפה של zonula occludens-1 (ZO-1) ומבחן חדירות של FITC-dextran. לאחר מכן, נעשה שימוש באולטרסאונד (US) בעוצמה נמוכה (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) כדי להשראת פתיחה זמנית ובמידה רבה הפיכה של ה-BBB, המאפשרת לננו-מיסלות המכוונות לגידול (SFN@RB@SPMs) לחצות את המחסום ביעילות ולהצטבר בתאי GBM. מאפיין מרכזי של פרוטוקול זה הוא השילוב של מדידות חדירות BBB ואספקת תרופות בזמן אמת בתוך שבב בודד המגיב לאולטרסאונד, המספק פלטפורמה רבת-עוצמה לניתוח המנגנונים של אספקת תרופות מוגברת על ידי אולטרסאונד ב-GBM.

מבוא

הטיפול בגליובלסטומה (GBM) מוגבל מאוד על ידי מחסום הדם-מוח (BBB), המגביל באופן חמור את חדירתם של כמעט כל הסוכנים הטיפוליים למוח1,2. ה-BBB מורכב מתאי אנדותל לא-מנוקבים המחוברים על ידי חלבוני צמתי הדק (tight junction proteins), כגון occludin ו-ZO-1, עם תמיכה נוספת מפריציטים ומרגלי אסטרוציטים3. למרות שמודלים בבעלי חיים סיפקו תובנות רבות לגבי תפקוד ה-BBB, וריאציות ספציפיות למין בפיזיולוגיה ובמטבוליזם מגבילות את יכולתם לנבא במדויק תגובות לסמים בבני אדם4,5. כתוצאה מכך, מודלים אנושיים של BBB בעלי רלוונטיות פיזיולוגית הם הכרחיים להערכת חדירות תרופות בטיפול ב-GBM.

מדלים מסורתיים של מחסום הדם-מוח (in vitro BBB), כגון מערכת תרביות Transwell, אינם מצליחים לשחזר את המורכבות של ה-BBB, כולל אינטראקציה בין תאים, שינויים דינמיים בזרימה ומאמץ גזירה (shear stress) המושרה על ידי זרימה6. לעומת זאת, מדלים של BBB במיקרופלואידיקה הופיעו כפלטפורמות עדיפות המדמות באופן הדוק מאפיינים אלו הדומים למצב in vivo7. מערכות BBB-on-a-chip מסוג זה שימשו באופן נרחב לחקר גרורות של גידולי מוח8, לבדיקת תפקוד לקוי של ה-BBB במחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר9, ולהערכת הובלת תרופות דרך ה-BBB10,11. עם זאת, מרבית מדלי ה-BBB-chip הקיימים משמשים בעיקר לבדיקת חדירות תרופות וחסרים את היכולת לשלב גירויים פיזיקליים חיצוניים המווסתים את חדירות ה-BBB. כיום, אולטרסאונד ממוקד (FUS) הופיע כאסטרטגיה מבטיחה לפתיחה זמנית של ה-BBB עם התאוששות משמעותית, מה שמאפשר הובלה משופרת של סוכנים טיפוליים למוח12,13. מחקרי מנגנון קודמים הראו כי גירוי מכני המושרה על ידי אולטרסאונד יכול לווסת באופן זמני את תפקוד המחסום על ידי עיצוב מחדש של חיבורים בין-תאיים והגברת חדירות האנדותל. לדוגמה, Silvani et al. הראו כי כוחות מכניים המושרים על ידי אולטרסאונד יצרו היווצרות הפיכה של מרווחים בין-אנדותליים במערכת כלי-דם-על-שבב (in vitro vessel-on-a-chip)14. בדומה לממצאים אלה, Beekers et al. הדגימו כי אפקטים ביולוגיים מכניים המתווכים על ידי אולטרסאונד הובילו לפתיחה זמנית של מגעים בין תאי אנדותל, ובכך הגבירו את חדירות האנדותל15. לאחרונה, Qiao et al. דיווחו כי חדירות מחסום האנדותל מווסתת באופן קריטי על ידי פרמטרי החשיפה לאולטרסאונד, ובמיוחד אורך הפולס, מה שמדגיש את חשיבות האופטימיזציה של הפרמטרים האקוסטיים להשגת ויסות בטוח ונשלט של ה-BBB16. למרות התקדמות זו, פלטפורמות in vitro המאפשרות בו-זמנית ניתוח כמותי של פתיחת ה-BBB המתווכת על ידי אולטרסאונד והשפעתה על הובלת ננו-תרופות נותרות מוגבלות.

כדי לגשר על הפער המתואר לעיל, מוצג פרוטוקול להבנייה של שבב מיקרופלואידי של BBB-GBM. המכשיר המיקרופלואידי תומך בתרבית משולבת של HCMECs, תאי ACים ראשוניים ותאי GBM מסוג U87-MG המוטמעים ב-Matrigel. ה-BBB המשוחזר הראה מאפיינים מבניים ותפקודיים של מחסום שלם, כפי שהוכח על ידי לוקליזציה רציפה של ZO-1 לאורך חיבורים בין-תאיים ודיפוזיה מוגבלת של FITC-dextran במשקל 40 kDa דרך הממשק הוסקולרי. באופן משמעותי, ניתן לשלב שבב זה עם גירוי אולטרסאונד מבוקר כדי להשריץ פתיחה זמנית של ה-BBB, ובכך להגביר את התובלה העוקבת ואת יעילות התargeting לגידול של ננומיסלות. באמצעות מערכת זו, ניתן להעריך באופן כמותי את יעילות התובלה וה-targeting לגידול של ננומיסלות SFN@RB@SPM. באופן כללי, פלטפורמה זו מספקת כלי שימושי לחקר הקשר בין פרמטרי אולטרסאונד, מודולציה של BBB בעלת מאפיינים הפיכים, והגברת הובלת ננומיסלות בטיפול ב-GBM.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות (GB/T35892-2018) לבחינה אתית של רווחת בעלי חיים ניסויים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המכון לתעשיית החיים והבריאות של נינגבו, UCAS (מספר אישור GK-2023-XM-0073). הרכיבים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור והכנה של התקן ה-organ-on-a-chip של BBB-GBM

  1. תכנון השבב ופריסת מסכת הפוטומסק
    1. תכנן את השבב באמצעות תוכנת Auto CAD.
      הערה: השבב מורכב משלושה תעלות מיקרופלואידיות מקבילות, כולל תעלת דם, תעלת מוח ותעלת גידול. הרוחב של תעלת הדם ותעלת הגידול הוא 1000 µm, בעוד שרוחבה של תעלת המוח הוא 1300 µm. הגובה של שלוש התעלות הוא 150 µm, ותעלות סמוכות מופרדות על ידי מערכי מיקרו-עמודים טרפזוניים ברוחב של 200 µm, המאפשרים דיפוזיה מולקולרית ותקשורת תאית בין התאים. פריסת תכנון הפוטומסק המפורטת מופיעה ב-Supplementary Figure 1 וב-Supplementary Figure 2. הפוטורזיסט SU-8 שנעשה בו שימוש במחקר הנוכחי הוא 3050.
  2. ייצור תבנית מאסטר מסיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית עם פוטורזיסט SU-8.
    1. הנח פרוסת סיליקון נקייה על תפסן הוואקום של ה-spin coater והפעל את הוואקום כדי לקבע את הפרוסה בצורה מאובטחת.
    2. טפטף לאט 10 mL של פוטורזיסט SU-8 למרכז הפרוסה.
    3. בצע תהליך ציפוי ספין (spin-coating) בשני שלבים כדי לקבל שכבת פוטורזיסט אחידה: ראשית ב-500 rpm למשך 10 s, ולאחר מכן ב-2500 rpm למשך 90 s.
    4. העבר את הפרוסה המצופה ללוח חימום ובצע אפייה רכה (soft bake) ב-95 °C למשך 30 min כדי לאדות את הממס.
    5. המתן לקירור הפרוסה לטמפרטורת החדר ומדוד את עובי שכבת ה-SU-8 באמצעות מד עובי.
      הערה: ליצירה אופטימלית של BBB, מומלץ גובה תעלה של 110–150 µm. ציפוי ספין בודד (שלב 1.2.3) מניב בדרך כלל עובי סרט של 40–50 µm; לכן, נדרשים שני עד שלושה תהליכי ציפוי ספין כדי להגיע לעובי הכולל הרצוי.
  3. תבנית פוטוליתוגרפית
    1. כוון את עוצמת אור העל-סגול (UV) של מכשיר ה-mask aligner ל-14–15 mW/cm2.
    2. יישר את מסכת הכרום (chromium photomask) ביחס לפרוסת הסיליקון המצופה ב-SU-8 ובצע חשיפה ל-UV למשך 10 s.
    3. העבר מיד את פרוסת הסיליקון ללוח חימום לאפייה לאחר חשיפה (post-exposure baking) בתנאים הבאים: 65 °C למשך 10 s, ולאחריו 95 °C למשך 300 s.
    4. לאחר שפרוסת הסיליקון התקררה לטמפרטורת החדר, טבול אותה בתמיסת מפתח (propylene glycol monomethyl ether acetate, PGMEA) והשאר אותה להתפתח למשך 4–6 min.
    5. שטוף את הפרוסה באיסופרופנול כדי להפסיק את תהליך הפיתוח, ולאחר מכן שטוף במים דה-יוניזציה.
    6. ייבש את הפרוסה באמצעות גז חנקן ובדוק את מבני המיקרו-תעלות שנוצרו תחת מיקרוסקופ אופטי.
      הערה: אם נותרו שאריות פוטורזיסט שלא פותחו, חזור על שלב הפיתוח עד שהמיקרו-מבנים יוגדרו בבירור.
    7. אפה את מאסטר הסיליקון המוכן בתנור ב-200 °C למשך 1 h כדי לשפר את ההיצמדות בין פוטורזיסט ה-SU-8 לפני השטח של פרוסת הסיליקון.
  4. ייצור שבב PDMS
    1. הכן פולידימטילסילוקסאן (PDMS) על ידי ערבוב יסודי של הפולימר הבסיס וחומר המקשה ביחס משקלי של 10:1 (w/w) למשך 30 min לקבלת פולימר PDMS הומוגני.
    2. שפוך את תערובת ה-PDMS על תבנית מאסטר הסיליקון שיוצרה, תוך הבטחה שהמיקרו-מבנים מכוסים במלואם.
    3. הנח את תבנית המאסטר בתוך דסיקטור ואקום לצורך ניקוי בועות אוויר (degassing).
    4. העבר את תבנית המאסטר לתנור והקשה אותה ב-65 °C למשך 1.5–2 h.
    5. לאחר ההקשחה, חתוך בזהירות את שכבת ה-PDMS לאורך גבולות השבב באמצעות סכין יצירה וקלף אותה בעדינות מתבנית מאסטר הסיליקון.
    6. טבול את שבב ה-PDMS בתוך אתנול 70%–75% למשך 30 min לסטריליזציה ראשונית, לאחר מכן שטוף במים דה-יוניזציה והשאר לייבוש באוויר.
    7. צור פתחי כניסה ויציאה באמצעות מחץ ביופסיה של 2 mm.
  5. הדבקת פלסמה והרכבת המכשיר
    1. הנח את שבב ה-PDMS ופרוסת זכוכית נקייה בתוך תא של מנקה פלסמה, תוך הבטחה שצד המיקרו-תעלות של ה-PDMS פונה כלפי מעלה.
    2. רוקן את התא עד שהלחץ יירד מתחת ל-30 Pa, ולאחר מכן הכנס גז חמצן.
    3. שמור על זרימת חמצן למשך 90 s תוך שמירה על לחץ התא מתחת ל-40 Pa.
    4. כוון את הספק של התדר הרדיואי (RF) ל-55% ובצע טיפול בפלסמה למשך 90 s כדי להפעיל את פני השטח של ה-PDMS והזכוכית.
    5. הבא מיד את שבב ה-PDMS המופעל למגע עם פרוסת הזכוכית ולחץ בעדינות כדי להשיג הדבקה בלתי הפיכה.
    6. הנח את המכשיר המורכב בתנור ב-65 °C למשך 24 h כדי לייצב את ההדבקה ולהחזיר את ההידרופוביות שלו.
    7. לפני זריעת התאים, סטריליז את המכשיר המודבק על ידי קרינת על-סגול למשך 30 min.
      הערה: שמור על תנאים סטריליים על ידי אחסון השבבים הסטריליים בצלחות פטרי אטומות בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית עד לשימושם.

2. זריעת תאים והקמת מודל ה-BBB-GBM

  1. הכינו את الريאגנטים הבאים:
    1. תווך גידול ל-ACs (עבור תעלת המוח): תווך DMEM/F12 basal המכיל 20% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין (P/S).
    2. תווך גידול ל-HCMECs (עבור התעלה הווסקולרית): תווך לתאי אנדותל (ECM) מועשר ב-1% P/S.
    3. תווך גידול לתאי GBM (עבור תעלת הגליומה): תווך MEM basal המכיל 10% FBS ו-1% P/S.
    4. ריאגנט לפירוק תאים: השתמשו בתמיסת trypsin-EDTA בריכוז 0.25% לניתוק תאים נצמדים.
      הערה: חשיפה ממושכת ל-trypsin עלולה להפחית את חיות התאים. עקבו אחר ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ ונטרלו את ה-trypsin במהירות באמצעות תווך מלא.
    5. שמרו את כל התאים (ACs, HCMECs ו-U87-MG) בצלחות גידול של 100 mm לפני הזריעה למכשיר המיקרופלואידי.
  2. בידוד ACs ראשוניים
    1. בודדו ACs ראשוניים מקליפת המוח של חולדות רכים (יום לאחר לידה 1–3). לאחר הסרה זהירה של הקרומיות וכלי הדם על קרח, קצצו את רקמת הקליפה בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים והעבירו אותה עיכול אנזימטי.
    2. שטפו את תסמין התאים המפורקים ב-PBS קר מאוד, טפלו ב-trypsin כדי להשיג פירוק לתאים בודדים, ואספו את המשקעים על ידי סרבוב (400 x g, 5 min, בטמפרטורת החדר).
    3. סספנדו מחדש את התאים וזרעו אותם בבקבוקי תרבית T25 המכילים תווך גידול ל-ACs.
    4. זהו את ה-ACs באמצעות GFAP על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה. התמונה מופיעה ב- Supplementary Figure 3.
  3. זריעת תאים
    ​הערה: יום 1 - זריעה של ACs בתעלת המוח.
    1. הוסיפו 1 mL של 0.25% trypsin-EDTA לצלחת הגידול המכילה את ה-ACs. סובבו בעדינות כדי להבטיח כיסוי אחיד.
    2. דגרו ב-37 °C למשך 1–2 min עד שהתאים יתנתקו מצלחת הגידול.
    3. הוסיפו 3 mL תווך גידול ACs (משלב 2.1.1) כדי לנטרל את ה-trypsin. פלפלו בעדינות כדי לקבל סספנזיה של תאים בודדים.
    4. אספו את סספנזיית התאים לשפופרת סרבוב וסרבבו ב-300 × g למשך 3 min ב-4 °C.
    5. הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-200 µL של תווך AC.
    6. קבעו את ריכוז התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי והתאימו את הצפיפות ל-2.5 × 106 cells/mL.
    7. ערבבו את סספנזיית תאי ה-ACs עם Matrigel ביחס של 3:5 (v/v) (תאי AC: Matrigel).
    8. בעזרת מיקרופיפט, העבירו 10 µL של תערובת Matrigel-ACs לתעלת המוח.
      הערה: בצעו את הליך הטעינה כאשר השבב מונח על קרח כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת של ה-Matrigel.
    9. דגרו את השבב ב-37 °C באינקובטור עם 5% CO2 למשך 30 min כדי לאפשר פולימריזציה של Matrigel והתייצבות תאים.
      הערה: יום 1 - זריעה של HCMECs בתעלה הווסקולרית.
    10. הוסיפו 1 mL של 0.25% trypsin-EDTA ודגרו ב-37 °C למשך כ-30 s עד שהתאים יתנתקו.
    11. הוסיפו 3 mL של תווך HCMECs (שלב 2.1.2) כדי להפסיק את העיכול האנזימטי.
    12. פלפלו בעדינות ליצירת סספנזיה אחידה של תאים בודדים.
    13. אספו את הסספנזיה וסרבבו ב-300 × g למשך 3 min ב-4 °C.
    14. הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-200 µL של תווך HCMECs.
    15. ספרו את התאים והתאימו את הריכוז ל-2 × 106 cells/mL.
    16. הכניסו בזהירות 10 µL של סספנזיית HCMECs לתעלה הווסקולרית של השבב.
    17. מקמו את השבב הצידה למשך 30 min באינקובטור תאים כדי לעודד היצמדות תאי אנדותל לאורך דופן התעלה.
    18. זרעו 10 µL נוספים של סספנזיית HCMECs לתעלה הווסקולרית כדי להגביר את צפיפות האנדותל בתעלה הווסקולרית.
    19. דגרו את השבב למשך 30–60 min נוספים כדי לאפשר היצמדות של HCMECs.
    20. הוסיפו 100 µL תווך גידול מעורב לכניסת השבב.
      הערה: התווך המעורב מורכב מתווך AC ותווך HCMECs ביחס של 1:1 (v/v).
      יום 3 - זריעה של תאי U87-MG בתעלת הגליומה.
    21. הוסיפו 1 mL של 0.25% trypsin-EDTA לצלחת הגידול ודגרו ב-37 °C למשך 1–2 min.
    22. הוסיפו 3 mL של תווך U87-MG (משלב 2.1.3) כדי להפסיק את העיכול.
    23. פלפלו בעדינות כדי לקבל סספנזיה הומוגנית של תאים בודדים.
    24. העבירו את סספנזיית התאים לשפופרת סרבוב וסרבבו ב-300 × g למשך 3 min.
    25. הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-200 µL של תווך U87-MG.
    26. ספרו את ריכוז התאים והתאימו את הצפיפות ל-2 × 106 cells/mL.
    27. הכניסו 10 µL של סספנזיית תאי U87-MG לתעלת הגליומה של השבב.
    28. דגרו את השבב ב-37 °C עם 5% CO2 למשך 30–60 min כדי לאפשר היצמדות תאים.
    29. הוסיפו 100 µL של תווך גידול U87-MG לכניסת השבב.
    30. שמרו את המכשיר המיקרופלואידי בסביבה של 37 °C עם 5% CO2 למשך 48 h נוספות כדי לאפשר היווצרות צומתים הדוקים (tight junctions) באנדותל.

3. הערכת שלמות מחסום הדם-מוח (BBB)

  1. בדיקת חדירות (Permeability assay)
    1. הכן fluorescein isothiocynate-dextran (FITC-dextran) במשקל מולקולרי של 40 kDa בתוך מצע תרבית מעורב (ACs medium: HCMEC medium = 1:1, v/v) בריכוז סופי של 10 µg/mL.
    2. החדר 10 µL של תמיסת ה-FITC-Dextran אל תוך התעלה הווסקולרית.
    3. הנח את השבב המיקרופלואידי על במת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך כדי לרכוש תמונות פלואורסצנציה הן של התעלה הווסקולרית והן של תעלת המוח הסמוכה במרווחי זמן של 20 דקות, כדי לנטר את דיפוזיית הדקסטראן דרך מחסום האנדותל.
    4. כמת את מקדם החדירות (Papp, cm/s) באמצעות הנוסחה הבאה:
      Papp (cm/s)= משוואה ליעילות התהליך, הכוללת את Fs, Fc, Δt; נוסחה מתמטית למחקר מדעי.
      כאשר Papp הוא מקדם החדירות הנראה (cm/s), FS היא עוצמת הפלואורסצנציה בזמן ההתחלתי בתעלת הדם, FC היא עוצמת הפלואורסצנציה בתעלת המוח בסוף מרווח הדיפוזיה, Δt הוא זמן הדיפוזיה (s), VT הוא נפח הדיפוזיה של FITC-dextran בתעלת המוח (cm3), ו-A הוא שטח הפנים האנדותליאלי (cm2).
      הערה: מקדם חדירות נמוך יותר מעיד על שלמות גבוהה יותר של ה-BBB ועל היווצרות מחסום אנדותליאלי הדוק יותר.
    5. בצע ניתוח נתונים והגדרות פרמטרים.
      הערה: מערכי עוצמת הפלואורסצנציה הן מתעלת הדם והן מתעלת המוח עברו להפחתת רקע באמצעות מדידות שהושגו מאזורים נטולי תאים בשבב. אזורי עניין (ROIs) הוגדרו משני צדי הממשק דם-מוח בהתבסס על אורך דיפוזיית הפלואורסצנציה. שטח הפנים האנדותליאלי (A) חושב משטח הממשק שבין התעלות הווסקולרית ותעלת המוח (תוך שימוש במרווח בין שני מיקרו-עמודים כנקודת ייחוס): 200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. נפח הדיפוזיה של FITC-dextran (VT) נגזר ממרחק חדירת הדיפוזיה בתעלת המוח כשהוא מוכפל ב-A. תמונות פלואורסצנציה נרכשו כל 20 דקות (1200 s) לאורך תקופה של 60 דקות; מקדם החדירות חושב באמצעות נתוני המרווח של 20 דקות. ערכי חדירות חושבו משלושה שבבים בלתי תלויים עבור כל קבוצה ניסויית. כל המרות היחידות בוצעו לפני ביטוי החדירות כ-cm/s.
  2. ניתוח אימונופלואורסצנציה של ZO-1
    1. שטוף את התעלות המיקרופלואידיות שלוש פעמים במיץ פוספט (PBS) כדי להסיר את שאריות מצע התרבית.
    2. קבע את התאים על ידי החדרת 4% פאראפורמאלדהיד (PFA) לתעלות ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. בצע פרמיאביליזציה לתאים עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. חסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים על ידי דגירת התעלות עם 2% אלבומין מסרום בקר (BSA) ב-PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. החדר את הנוגדן הראשוני anti-ZO-1 (בדילול 1:200) לתעלות ודגור ב-4 °C למשך לילה.
    6. שטוף את התעלה היטב ב-PBS כדי להסיר נוגדן ראשוני שלא נקשר.
    7. דגור את השבבים עם נוגדן שני anti-rabbit המשולב עם Alexa Fluor 555 (בדילול 1:1000) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    8. צבע את הגרעינים ב-1 µg/mL 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: DAPI רגיש לאור ויש להגן עליו מהאור במהלך הצביעה.
    9. שטוף את התעלות שלוש פעמים ב-PBS.
    10. דגם תמונות של ההתקן המיקרופלואידי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך ומיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי כדי להדמיא את מיקום ה-ZO-1 לאורך חיבור תאי האנדותל.

4. הובלה של ננו-מיצלות בעזרת אולטרסאונד דרך מחסום הדם-מוח (BBB) לתאי GBM

  1. גירוי אולטרסאונד
    1. הוצא בזהירות את השבב מכלי התרבית והנח אותו בתוך תא ביו-בטיחות (biosafety cabinet).
    2. בצע גירוי אולטרסאונד באמצעות מערכת אולטרסאונד טיפולית המצוידת במתמר של 1 MHz (שטח הקרנה אפקטיבי: 5 cm2).
    3. הנח רפידת צימוד אקוסטית בדרגה רפואית בעובי 3 mm בין גשש האולטרסאונד לבין פני השבב המיקרופלואידי כדי להבטיח העברה אקוסטית יעילה.
    4. מקם את גשש האולטרסאונד ישירות מעל אזור התעלה הווסקולרית של ההתקן המיקרופלואידי.
      הערה: בועות אוויר בין המתמר לשבב מפחיתות באופן משמעותי את העברת האנרגיה האקוסטית ויש להימנע מהן.
    5. הגדר את פרמטרי האולטרסאונד באופן הבא: מחזור עבודה (duty cycle): 60%; תדר: 1 MHz; עוצמה: 1 W/cm2; משך חשיפה: 30 s; תדר חזרת פולסים (PRF): 100 Hz. פרמטרי האולטרסאונד המפורטים מופיעים ב-Supplementary Table 1.
    6. עבור קבוצת הביקורת ללא טיפול, מקם את מתמר האולטרסאונד באותו מיקום אך ודא שהוא אינו פעיל כדי שישמש כביקורת דמי (sham control), תוך הבטחת נהלי טיפול זהים ללא חשיפה אקוסטית.
    7. לאחר החשיפה לאולטרסאונד, הסר את רפידת הצימוד והחזר מיד את השבב לכלי תרבית סטרילי.
    8. הוסף מצע תרבית טרי לפתחי הכניסה של השבב.
    9. דגור את ההתקן ב-37 °C עם 5% CO2 עד לביצוע ניתוחים נוספים.
  2. הערכה של מודולציית BBB המושרית על ידי אולטרסאונד
    1. בצע צביעת אימונופלורסצנציה של ZO-1 מיד לאחר הטיפול באולטרסאונד (0 h) ובשעה ה-24 לאחר הטיפול כדי להעריך שינויים בשלמות הצומת המהודקת (tight junction).
    2. פעל לפי פרוצדורת צביעת האימונופלורסצנציה המתוארת בשלב 3.2.
    3. השווה את התפלגות צביעת ה-ZO-1 לאורך ציר ה-z כדי להעריך את השפעת גירוי האולטרסאונד על שלמות הצומת המהודקת של ה-BBB.
  3. הכנה ואפיון של ננו-מיצלות SFN@RB@SPM
    1. הכן את ננו-מיצלות ה-SFN@RB@SPM בהתאם לפרוטוקול שנקבע בעבר17. בקצרה, תמיסות מלאי של הפפטיד האמפיפילי (המסומן כ-SPM, בריכוז 6 mg/mL), RB (בריכוז 0.6 mg/mL), ו-SFN (בריכוז 6 mM) עורבבו ביחס נפחי של 1:1:1.
    2. הנח את התערובת בסוניקטור ובצע סוניקציה ב-28 kHz, ב-25 °C למשך 30 min.
    3. בצע דיאליזה לתערובת (סף חיתוך של משקל מולקולרי: 1000 Da) למשך 48 h כדי להסיר RB ו-SFN חופשיים.
    4. מדוד את הגודל ואת פוטנציאל הזטא של הננו-מיצלות באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). נתוני האפיון מופיעים ב-Supplementary Figure 4.
  4. הערכה של הובלת ננו-מיצלות והצטברות של תאי גליומה תחת גירוי אולטרסאונד
    1. מיד לאחר החשיפה לאולטרסאונד, הכנס את מצע התרבית המכיל ננו-מיצלות אל התעלה הווסקולרית של ההתקן המיקרופלואידי.
    2. כדי להעריך את מעבר הננו-מיצלות דרך ה-BBB, הנח את השבב המיקרופלואידי על שולחן של מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך ורכוש תמונות פלואורסצנציה הן של התעלה הווסקולרית והן של תעלת המוח הסמוכה במרווחי זמן של 20 min לאורך 60 min.
    3. כמת את תמונות הפלואורסצנציה בתעלת המוח כדי להעריך את חדירות הננו-מיצלות המוגברת על ידי אולטרסאונד.
    4. כדי להעריך הצטברות ננו-מיצלות בתאי גליומה, דגור את ההתקן בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 °C, 5% CO2) למשך 3 h לאחר החשיפה לאולטרסאונד, ולאחר מכן דגם את תעלת הגליומה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי להעריך את ספיגת הננו-מיצלות התוך-תאית.
  5. ניתוח סטטיסטי
    1. הצג את כל הנתונים הכמותיים כממוצע±שגיאה תקנית של הממוצע (SEM).
    2. בצע כל ניסוי עם שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3 שבבים לכל תנאי ניסויי). עבור כל חזרה ביולוגית, נמדדו לפחות שלוש חזרות טכניות (ROI לכל תעלה) כדי להבטיח את מהימנות הנתונים.
    3. חשב את מקדם החדירות (Papp, cm/s) מכל שבב בלתי תלוי ששימש כיחידה הראשית של הניתוח עבור כל ההשוואות הסטטיסטיות.
      הערה: השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Student’s t-test לא מזווג דו-זנבי. השוואות בין שלוש קבוצות או יותר נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA) ולאחריו מבחן post hoc של Tukey להשוואות מרובות. עבור ניסויים הכוללים שני משתנים בלתי תלויים, בוצע two-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה לסטטיסטיקה וגרפיקה. ערך p של <0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

תוצאות

לסיכום ה- इन विवो (in vivo) מבנה מחסום הדם-מוח (BBB), פותחה שבב מיקרופלואידי של תרבית משולשת על ידי שילוב של HCMECs, תאי ACs ראשוניים ותאי U87-MG (שכונה "מודל השבב"). כפי שמוצג ב- איור 1A,Bשלושה תעלות מקבילות מסודרות בתוך ההתקן: התעלה הווריקולרית (שמאל, כחול), תעלת המוח הממולאת ב-Matrigel (מרכז, ורוד), ותעלת הגידול (ימין, ירוק), אשר זורעים בהן תאי HCMECs, תאי ACs ותאי U87-MG, בהתאמה. התעלות מופרדות על ידי מערכי מיקרו-עמודים השומרים על כליאת ה-Matrigel בתא המרכזי, תוך שהם מאפשרים חליפה מולקולרית ותאית בין התעלות. לאחר עיקור ההתקן, תאי ACs (בצפיפות של 2.5 × 106 תאים/מ"ל) שהושהו ב-Matrigel ביחס של 3:5 (נפח/נפח) הוכנסו לתעלת המוח. לאחר פולימריזציית ה-Matrigel, תאי HCMECs (מספר 2 × 106 (תאים/מ"ל) נזרעו לתעלת כלי הדם השמאלית. לאחר תרבית משותפת של יומיים של ACs ו-HCMECs, תאי U87-MG (2 × 106 (תאים/מ"ל) הוכנסו לערוץ הגידול הימני כדי להקים את מדור ה-GBM. מודל השבב הוקם במלואו עד היום החמישי. לאחר מכן נבחנו שלמות המחסום באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של ZO-1 ומדידות חדירות של FITC-dextran במשקל 40 kDa. כפי שמוצג ב- איור 1C, ZO-1 הראה התפלגות רציפה וליניארית לאורך הממשק של ה-HCMEC-ACs, דבר המאשר היווצרות של צומת הדוק (tight junction) בממשק של מחסום הדם-מוח (BBB). שחזור תלת-ממדי במיקרוסקופ קונפוקלי חשף עוד יותר אותות בולטים של ZO-1 בממשק שבין התעלה הווסקולרית למוח (מישור z-y, איור 1D), ובכך אומת היווצרותו של מחסום אנדותלי שלם בתוך השבב. כדי לקבוע באופן מעמיק יותר את תפקודי המחסום, הוערכה החדירות ל-FITC-dextran במשקל 40 kDa. החדירות נמדדה במרווחי זמן של 20 דקות לאורך שעה אחת. כפי שמוצג ב- איור 1E,ז׳, מקדם החדירות הוא (3.46 ± 0.50) × 10-6 סמ"ש לאחר 60 דקות, נתון שדומה ל- in vivo מיקרוסירקולציה בחולדה18 ומודלים מתקדמים המבוססים על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSC)19, והוא מהווה שיפור משמעותי לעומת מודלים קונבנציונליים המבוססים על תאי אנדותל בלבד13יחד, נתונים מבניים ותפקודיים אלו תיקפו את ההקמה המוצלחת של פלטפורמת BBB-GBM רלוונטית פיזיולוגית.

מכיוון שדווח כי אולטרסאונד גורם לפתיחה זמנית ובעיקר הפיכה של ה-BBB, כאשר תפקוד המחסום משתחזר בדרך כלל תוך 24 שעות20, נבדקה לאחר מכן ההשפעה הישירה של גירוי US על תפקוד ה-BBB במודל השבב בנקודות זמן של 0 שעות או 24 שעות לאחר החשיפה ל-US. מודל השבב נחשף ל-US (1 W/cm2, 1MHz, 30 s). ניתוח אימונופלואורסצנציה של ZO-1 הראה עוצמה דומה ב-0 שעות וב-24 שעות לאחר הטיפול ב-US (איור 2A), מה שמרמז על שמירה של שלמות הצומת המהודק (tight junction). ניתוח כמותי של פלואורסצנציית ZO-1 אישר עוצמת אות דומה בממשק כלי הדם-מוח בין קבוצת הביקורת לקבוצה שטופלה ב-US (איור 2B). כדי להעריך באופן נוסף האם חשיפה ל-US הגבירה את חדירות ה-BBB, נעשה שימוש ב-40 kDa FITC-dextran כסמן חדירות. כפי שמוצג באיור 2C,D, חשיפה ל-US האיצה באופן מיידי את דיפוזיית הסמן דרך ה-BBB, כאשר מקדם החדירות עלה מ-4.20 x 10-6cm/s בקבוצה שלא טופלה ל-1.33 x 10-5cm/s. ב-24 שעות לאחר החשיפה ל-US, מקדם החדירות ירד ל-8.04 x 10-6cm/s, מה שמעיד על התאוששות משמעותית בהשוואה לקבוצה מיד לאחר ה-US, אם כי הוא נותר גבוה מעט מרמת ביקורת ללא טיפול. תוצאות אלו מדגימות כי US בעוצמה נמוכה גורם לפתיחה זמנית של ה-BBB ולאחריה התאוששות משמעותית של תפקוד המחסום תוך שמירה על השלמות המבנית במודל השבב.

בשלב הבא נבחנה חדירותן של הננומיסלות SFN@RB@SPM דרך מחסום הדם-מוח (BBB) תחת גרייה של US. במחקר קודם שלנו, הוכח כי ננומיסלות המורכבות עצמית אלו חוצות ביעילות את ה-BBB ומצטברות באתר הגידול במודל עכברים עם גליומה מושתלת (xenografted glioma)17. כדי לבחון האם מודולציית US משפרת את הטרנספורט של SFN@RB@SPM במודל שבב זה, יישמנו את אותם פרמטרי סוניקציה כפי שמופיעים ב-איור 2C. חשיפה ל-US האיצה באופן ניכר את מעבר ה-SFN@RB@SPM דרך ה-BBB, כשהיא מעלה את מקדם החדירות מ- (2.42 ± 0.15) × 10-5 cm/s ל- (4.58 ± 0.07) × 10-5 cm/s ב-60 דקות לאחר הטיפול, נתון המייצג שיפור של פי 1.9 לעומת קבוצת הביקורת (איור 3A,B). כדי לאמת ת targeting פעיל לגידול, נמדד אות הפלואורסצנציה האדומה של RB בערוץ הגליומה לאחר הזרקת הננומיסלות לערוץ הכלי הדם. כפי שמוצג ב-איור 3C, נצפתה עלייה ניכרת בפלואורסצנציה האדומה בערוץ הגליומה 3 שעות לאחר החשיפה ל-US, דבר המעיד על שיפור בטרנספורט של הננומיסלות דרך ה-BBB. בהיעדר US, נצפתה פלואורסצנציה זניחה בלבד, מה שמאשש כי פריצת ה-BBB חיונית כדי ש-SFN@RB@SPM יגיעו ויתרכזו באתר הגידול.

דיאגרמה של שבב מיקרופלואידי למחסום דם-מוח וניסוי המראה ניתוח נתוני חדירות.
איור 1: ייצור ואפיון של BBB-GBM on-a-chip. (A) תרשים של המכשיר המיקרופלואידי בעל שלושה תעלות: תעלת כלי דם (כחול), תעלת מוח (ורוד), ותעלת גידול (ירוק). (B) תצלום של שבב ה-PDMS-glass המורכב. (C) צביעה אימונוהיסטוכימית של ZO-1 (אדום) בחיבורים אנדותליאליים, עם צביעת נגד גרעינית DAPI (כחול). סרגל קנה מידה: 50 µm. (D) תצפיות קונפוקליות אורתוגונליות (x-z ו-y-z) המראות העשרה של ZO-1 (אדום) בממשק שבין כלי הדם למוח. (E) תמונות time-lapse מייצגות של דיפוזיה של 40 kDa FITC-dextran מתעלת כלי הדם לתעלת המוח לאורך 60 min (במרווחים של 20-min). סרגל קנה מידה: 200 µm. (F) מקדמי חדירות כמותיים, המאשרים תפקוד מחסום סלקטיבי לגודל. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM משלושה שבבים עצמאיים (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן post hoc של Tukey להשוואות מרובות. ערך ה- p המדויק מוצג באיור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, גרף חדירות, השוואת US, צילומי time-lapse, ניתוח חדירות.
איור 2: פתיחת מחסום הדם-מוח (BBB) והתאוששות עוקבת של תפקוד המחסום המושרה על ידי אולטרסאונד. (A) צביעה אימונוהיסטוכימית של ZO-1 בממשק כלי הדם-מוח מיד (0 h) ו-24 h לאחר סוניקציה. מוצגות שחזורי קונפוקליים בתלת-ממד. (B) עוצמת פלואורסצנציית ZO-1 מנורמלת לאורך ציר z (עומק) בממשק כלי הדם-מוח בקבוצת הביקורת ובקבוצה שעברה טיפול ב-US. (C) קינטיקת דיפוזיה של FITC-dextran במשקל 40 kDa ממדורי כלי הדם למדורי המוח ב-0 h ו-24 h, עם או בלי חשיפה ל-US (תמונות נרכשו במרווחים של 20-min במשך 60 min). סרגל קנה מידה: 200 µm. (D) מקדם חדירות כמותי עבור סמן 40 kDa ב-0 h או 24 h לאחר US, עם או בלי סוניקציה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM משלושה שבבים עצמאיים (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן post hoc של Tukey להשוואות מרובות. מובהקות סטטיסטית: p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בדיקת חדירות תאים עם יישום אולטרסאונד; כוללת תמונות time-lapse, גרף עמודות של חדירות, ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם השוואת צביעת DAPI.
איור 3: חדירות ומיקוד של SFN@RB@SPM לתאי U87-MG בשיפור באמצעות US. (A) מדידת חדירות של SFN@RB@SPM דרך הממשק כלי-דם-מוח, עם או בלי חשיפה ל-US. סרגל קנה מידה: 200 µm. (B) מקדמי חדירות כמותיים של SFN@RB@SPM בתנאי ביקורת ובתנאי טיפול ב-US. (C) הצטברות של SFN@RB@SPM בתעלת הגידול בעקבות פתיחת ה-BBB באמצעות US, פלואורסצנציה אדומה תועדה 3 h לאחר ההזרקה. סרגל קנה מידה: 50 µm. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM משלושה שבבים עצמאיים (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות unpaired two-tailed Student’s t-test. מובהקות סטטיסטית: p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: תכנון CAD של שבב מיקרופלואיד של BBB-GBM.אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: התכנון המפורט של שבב ה-BBB-GBM. התכנון מורכב משלושה ערוצים מיקרופלואידיים מקבילים; רוחבם של שני ערוצי הצד הוא 1000 µm, בעוד שרוחבו של הערוץ המרכזי הוא 1300 µm.אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: אפיון של אסטרוציטים ראשוניים באמצעות GFAP (ירוק), וצביעה של הגרעינים באמצעות DAPI (כחול). סרגל קנה מידה: 50 µm.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: אפיון הננומיצלה בעצמה SFN@RB@SPM. (A) ניתוח פיזור אור דינמי (DLS) המראה את התפלגות הגודל של SFN@RB@SPM, עם קוטר חלקיקים ממוצע של כ-64 nm. (B) מדידת פוטנציאל זטא מעידה על מטען פני של כ-150.67 ± 2.85 mV. כל המדידות בוצעו באמצעות מכשירי DLS.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 1: טבלת סיכום של פרמטרי אולטרסאונד.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את ההקמה של שבב מיקרופלואידי של BBB-GBM להערכה של ויסות BBB באמצעות אולטרסאונד והחדרה של ננו-מיסלות. בהשוואה למודלים קונבנציונליים של BBB in vitro (למשל, Transwell), פלטפורמה מיקרופלואידית זו מאפשרת תרבית משותפת מוגדרת מרחבית של תאי אנדותל, תאי AC ותאי גליומה, ובכך מאפשרת חקירה של הובלת תרופות על פני BBB רלוונטי פיזיולוגית. מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול דורשים אופטימיזציה מדויקת כדי להבטיח יצירה אמינה של המחסום. פרמטר מרכזי אחד הוא יחס הנפחים בין Matrigel לבין מדיום תרחיף תאי ה-AC המשמש להכנת התערובת המוטמעת בתעלת המוח המרכזית. היחס הוא קריטי לשמירה על צמיגות ג'ל מתאימה, כך שתערובת ה-AC-Matrigel תישאר בתוך התעלה המרכזית במהלך ההטענה. אם התערובת מכילה חלק מופרז של מדיום תרחיף תאי AC, הצמיגות המופחתת עלולה לגרום לדליפה של ה-Matrigel לתעלות מיקרופלואידיות סמוכות, ובכך לאפשר לתאי AC לנדוד לתעלות שכנות. לעומת זאת, Matrigel רכז מדי עלול לפגוע בחיוניות התאים ולהפריע לדיפוזיה של רכיבי תזונה. היחס האופטימלי של 3:5 (v/v) בין תרחיף תאי AC ל-Matrigel (שלב 2.2.7) מספק יציבות מכנית מספיקה כדי להחזיק את הג'ל בתוך התעלה המרכזית תוך תמיכה בצמיחת AC בתוך ה-Matrigel. שיקולים דומים הודגשו במודלים מיקרופלואידיים אחרים של BBB, שבהם צמיגות נכונה של ההידרוג'ל (למשל, פיברין או Matrigel) היא קריטית למניעת דליפה בין תעלות, לשמירה על הפרדה מרחבית של תאי המדורה ולחיקוי תכונות של המטריקס extracelluar7,21,22.

שנית, מיד לאחר זריעת HCMECs אל תוך התעלה הוסקולרית, יש להציב את המכשיר המיקרופלואידי באופן צדי למשך כ-30 דקות. שלב זה מקדם את היצמדותם של ה-HCMECs לאורך הדופן הצדדית שבין התעלה הוסקולרית לתעלת המוח, דבר הנחוץ ליצירת מחסום אנדותליאלי רציף בממשק בין התאים. ללא שלב זה, ה-HCMECs שוקעים בעיקר על פני השטח התחתון של התעלה, מה שמוביל לכיסוי אנדותליאלי חלקי לאורך הדופן הצדדית ולפגיעה בשלמות המחסום. שלב זריעת ה-HCMECs הנוסף שבא לאחר מכן מבטיח צפיפות תאים מספקת בתוך התעלה הוסקולרית. שמירה על צפיפות תאים נאותה היא חשובה, כיוון שצפיפות נמוכה של HCMECs עלולה להוביל ליצירה חלקית של שכבה אחת (monolayer) ולהגברת האפופטוזיס. מחקרים קודמים של BBB-on-a-chip הדגישו באופן דומה כי השגת שכבה אנדותליאלית רציפה (confluent) היא קריטית לשלמות המחסום ולביטוי חלבוני tight junction במערכות מיקרופלואידיות23,24.

פתרון בעיות נפוצות יכול לשפר באופן משמעותי את השחזוריות. אם מתרחשת דליפה של Matrigel לתעלות סמוכות במהלך טעינת תעלת המוח (שלב 2.2.8): (1) ודאו שתערובת ה-Matrigel והתאים נשמרת על קרח כדי למנוע פולימריזציה של ה-Matrigel; (2) הניחו את תערובת התאים וה-Matrigel באיטיות ובאופן קבוע כדי למנוע גלישה לתעלות השכנות; (3) התאימו את היחס בין ה-Matrigel לתאים ל-5:4 (v/v), דבר המסייע בשמירה על צמיגות מתאימה ועל הישארות התערובת בתוך התעלה המרכזית. בנוסף, היווצרות מוצלחת של המחסום האנדותלי תלויה במידה רבה בהיצמדות ובצפיפות נאותה של התאים האנדותליים. אם התאים האנדותליים אינם יוצרים שכבה אחת רציפה (monolayer) לאורך הממשק של התעלה כלי הדם, שקלו להעלות את צפיפות הזריעה של התאים האנדותליים או להאריך את זמן ההיצמדות כדי לשפר את הכיסוי האנדותלי ואת היווצרות הצומתים המהודקים (tight junctions). אם מופיעות בועות אוויר בתעלה לאחר הוספת המדיום, הקפישו בעדינות את השבב או הסירו אותן באמצעות טיפ של פיפט בצבע צהוב בשאיבה עדינה, שכן בועות הלכודות סמוך למחסום האנדותלי עלולות לשבש מקומית את שלמות הצומתים המהודקים.

למרות שדגם ה-BBB-GBM on-a-chip המתואר כאן מספק מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, ניתן לייעל מספר היבטים במחקרים עתידיים כדי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית ואת ההבנה המכניסטית. ההיבט הראשון הוא המודל הנוכחי המשתמש בתאי AC ראשוניים ממקור חולדה בתרבית משותפת עם HCMECs, מה שיוצר חוסר התאמה בין מינים. בעוד שגישה זו נמצאה בשימוש נרחב לבניית פלטפורמת BBB-on-a-chip13,23, ההבדלים בין המינים עשויים להשפיע על תכונות המחסום ועל התגובות לחדירות תרופות. מחקרים עתידיים ישלבו ACs המופקים מ-iPSC אנושי או ACs אנושיים ראשוניים כדי לבסס מודל אנושי מלא, אשר יבטל הגבלה זו ויגביר עוד יותר את הרלוונטיות התרגומית של הפלטפורמה. שנית, במודל הנוכחי חסרים רכיבים של היחידה הנוירו-וסקולרית, ובמיוחד פריציטים ותאי מערכת החיסון, שהם רגולטורים חשובים של תפקודי ה-BBB והתקדמות הגידול25,26. שילוב רכיבים אלו ישחזר טוב יותר את המורכבות של מיקרו-סביבת הגידול. שלישית, המכשיר פועל בתנאים סטטיים ללא פרפוזיה רציפה של מצע. הוכח כי מאמץ גזירה פיזיולוגי הנוצר על ידי זרימת דם משפר את תכונות ה-BBB על ידי העלאת ביטוי של חלבוני צומת הדוקים כגון claudin-5 ו-occludin . לפיכך, היעדר זרימה עשוי לגרום למקדם חדירות גבוה יותר שנצפה בשבבים סטטיים בהשוואה למערכות דינמיות27. רביעי, שלמות ה-BBB הוערכה בעיקר על ידי שילוב של צביעת אימונופלואורסצנציה של ZO-1 עם ניתוח חדירות של FITC-dextran. עם זאת, בדיקות מבניות ותפקודיות משלימות אלו נמצאות בשימוש נרחב לתיקוף BBB הן במודלים קונבנציונליים של transwell BBB והן במודלים מיקרופלואידיים של BBB-on-a-chip6,28,29. אפיון נוסף של רגולטורים מרכזיים השולטים בהובלה פארא-צלולרית וטרנס-צלולרית, כולל claudin-530, MFSD2A, ו-caveolin-1, יספק הערכה מקיפה יותר של תפקוד ה-BBB30,31,32. סמנים אלו ישולבו במחקרים עתידיים כדי לחזק עוד יותר את האפיון הפיזיולוגי של הפלטפורמה. לבסוף, הפרוטוקול הנוכחי משתמש באולטרסאונד טיפולי בעוצמה נמוכה ללא מיקרו-בועות חיצוניות או מדידה ישירה של לחץ אקוסטי. בניגוד למערכות אולטרסאונד ממוקדות קונבנציונליות, המשתמשות בדרך כלל בפתיחת BBB בסיוע מיקרו-בועות in vivo, המחקר הנוכחי תוכנן כדי לבסס פלטפורמה פשוטה וניתנת לשחזור in vitro להערכת ויסות של חדירות ה-BBB והובלת ננו-תרופות על ידי אולטרסאונד. גישה זו מצמצמת משתנים נוספים הקשורים לריכוז מיקרו-בועות, פיזור והתנהגות קוביטציה בסביבה מיקרופלואידית בקנה מידה מיקרוסקופי. עם זאת, מחקרים עתידיים שישלבו אולטרסאונד בסיוע מיקרו-בועות, ניטור טמפרטורה ואפיון מפורט של השדה האקוסטי ישפרו עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית וההבנה הכמותית של ויסות ה-BBB באמצעות אולטרסאונד.

באופן כללי, הפרוטוקול המוצג כאן מספק פלטפורמה מיקרופלואידית מבוקרת של BBB-GBM המסוגלת לשלב גרייה באמצעות אולטרסאונד ואנליזה כמותית של הובלת ננו-מיסלות. מערכת זו מאפשרת חקירה ישירה של פתיחת ה-BBB המתווכת על ידי אולטרסאונד וההובלה העוקבת של ננו-תרופות דרך המחסום האנדותליאלי. מעבר להערכת הובלת ננו-מיסלות, ניתן להשתמש בפלטפורמה גם לסריקת תרופות לבדיקת יכולתן לחדור את ה-BBB, לחקר מנגנונים של פגיעה ב-BBB, וכפלטפורמה עוצמתית להערכה פרה-קלינית של תרופיה המכוונת למערכת העצבים המרכזית (CNS).

גילויים

במהלך הכנת כתב יד זה, השתמשו המחברים ב-ChatGPT (OpenAI) לצורך עריכה ושיפור השפה בלבד. המחברים סקרו ועריכו את כל התכנים שנוצרו בסיוע בינה מלאכותית והם נושאים באחריות מלאה לדיוק וליושרה של כתב היד. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית להפקת נתונים, ניתוחם או להכנת איורים.

תודות

אנו מודים על המימון שהתקבל מקרן המדע הטבעי של מחוז Zhejiang (LQ24H160003), הקרן למחקר מדעי רפואי של מחוז Zhejiang (2024KY351), קרן המדע הטבעי של Ningbo (2023J365), תוכנית Yongjiang להבאת כישרונות (Young Innovative Talent Project, 2021A-012-G), ותוכנית הכישרונות Bei’An של מחוז Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן משני אנטי-rabbit המשוער ל-Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
נוגדן anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
ביופסיית מחץ (Biopsy punch)Zhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
אלבומין סרום בקרAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
סופר תאיםThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
צלחת לתרבית תאים (100 מ"מ)Corning Inc.430167
צנטריפוגהBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
מסכת כרוםSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
מיקרוסקופ סריקה בלייזר קונפוקאליCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
מפתחSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
מטריצה חוץ-תאית (ECM)ScienCell Research Laboratories1001
אתנולNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
סרום עגל עובריScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)פרויקט בקוד פתוחלא רלוונטי
FITC-Dextran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
שקופיות זכוכיתCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.לא רלוונטי
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מוחיים אנושיים (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
אינקובטורEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךNikon Instruments Inc.TS2-FL
איזופרופנולSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
חנקןNingbo Baifang Gas CO., Ltd.אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.
חמצןNingbo Baifang Gas CO., Ltd.לא רלוונטי
פאראפורמאלדהיד (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
פניצילין/סטרפטומייציןPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
פוטוליתוגרפיההמכון לאופטיקה ואלקטרוניקה, האקדמיה הסינית למדעיםURE-2000\AL
פלטה חמה לפוטוליתוגרפיהSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
מכשיר שריפה בפלסמה (Plasma Asher)TIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
אסטרוציטים ראשונייםלא רלוונטילא רלוונטיבודד ממוח של חולדה רבבית ניו born (ימים 1-3)
פרוסת סיליקוןZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
מכשיר ציפוי סובב (Spin Coater)Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
טריפסיןScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
תאי U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
מכשיר אולטרסאונד Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)Carl Zeiss AGלא רלוונטי

מקורות

  1. Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
  2. Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
  3. Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
  4. Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
  5. Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
  6. Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
  7. Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
  8. Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
  9. Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
  10. Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
  11. Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
  12. Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
  13. Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
  14. Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
  15. Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
  16. Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
  17. Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
  18. Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
  19. Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
  20. Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
  21. Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
  22. Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  23. Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
  24. Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
  25. Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
  26. Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
  27. Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
  28. van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
  29. Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
  30. Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
  31. Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
  32. Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FITC Dextran

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.