מאמר שיטה

מודל עכבר של אנדומטריוזיס המשתמש בתיוג ננו-חלקיקי סיליקה צבועים ב-Ex vivo Cy5.5 לצורך ויזואליזציה של נגעים

121 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72070

⸱

4 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מדגים את השראת אנדומטריוזיס באמצעות תיוג ex vivo עם ננו-חלקיקי סיליקה צבעוניים בצבע Cy5.5, ומאפשר ויזואליזציה פלואורסצנטית של נגעים אנדומטריוטיים ללא מניפולציה גנטית.

תקציר

אנדומטריוזיס היא הפרעה גינקולוגית נפוצה המתאפיינת בצמיחת רקמות דמוית רירית הרחם מחוץ לחלל הרחם, מה שמוביל לדלקת כרונית, כאבי אגן ואי פוריות. מודלים אמינים לעכברים חיוניים לחקר המנגנונים המולקולריים, ההורמונליים, החיסונים והסביבתיים העומדים בבסיס התפתחות והתקדמות המחלה. שיטות קונבנציונליות לזיהוי נגעים אנדומטריוטיים מסתמכות לעיתים קרובות על עכברי דיווח פלואורסצנטיים מהונדסים גנטית, שהם גוזלים זמן ויקרים לייצור. כאן אנו מציגים גישה פשוטה ולא גנטית לעורר והמחשה של אנדומטריוזיס בעכברים על ידי תיוג אקס ויבו של חלקיקי רקמת רחם תורמים בננו-חלקיקי סיליקה עם Cy5.5 דופ לפני ההשתלה. הננו-חלקיקים מציגים תכונות פיזיקוכימיות חיוביות, יציבות פלואורסצנציונית גבוהה ומינימום ציטוטוקסיות, המאפשרים תיוג יעיל של רקמת הרחם מבלי לפגוע בפרוצדורות ניסוי. לאחר השתלה תוך-פריטוניאלית בעכברים המקבלים, ניתן להבחין בקלות בין נגעים אנדומטריויים מסומנים ב-Cy5.5 לבין רקמות המארח הסובבות באמצעות הדמיית פלואורסצנציה. פרוטוקול זה מספק שיטה ניתנת לשחזור ורב-שימושית לוויזואליזציה ומעקב אחר נגעים, ומסייע במחקרים של פתוגנזה של אנדומטריוזיס והערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות אבחון וטיפול ללא צורך במניפולציה גנטית.

מבוא

אנדומטריוזיס היא מחלה גינקולוגית נפוצה שבה תאים המצפים את רירית הרחם גדלים מחוץ לרחם. הנגעים האנדומטריוטיים שנוצרים גורמים למצב דלקתי כרוני1, ונשים שנפגעו חוות לעיתים כאבי אגן ואי פוריות2. תפקוד לקוי בתאי סטרומל ואפיתל רירית הרחם משפר את הישרדות והתפתחות הנגעים האנדומטריוטיים 3,4,5,6. הפרעה נפוצה זו פוגעת בכ-11% מהנשים בארה"ב בלבד. זהו גורם עיקרי לאי פוריות וכאבי אגן7, והשכיחותה עולה ל-50%–60% בקרב נשים עם כאב אגן כרוני ואי פוריות 8,9,10,11,12,13. העלות השנתית המשוערת לאבחון וטיפול באנדומטריוזיס עולה על 22 מיליארד דולר בארצות הברית,14.15. הטיפולים הנוכחיים כוללים הסרה כירורגית של הנגעים או השראת מצב היפואסטרוגני. עם זאת, הישנות לאחר ניתוח היא נפוצה, והטיפולים הקיימים לעיתים קרובות לא יעילים 9,16. האבחנה נקבעת בדרך כלל רק באמצעות ויזואליזציה כירורגית ואימות היסטולוגי17,18. יתרה מזאת, אנדומטריוזיס לעיתים קרובות אינו מאובחן או מאובחן לא נכון, עם עיכוב אבחנתי של 9–11 שנים19,20. עיכוב זה מטיל נטל רגשי וכלכלי משמעותי הן על המטופליםוהן על מערכת הבריאות. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטות לא פולשניות הן לאבחון והן לטיפול באנדומטריוזיס.

מודלים במבחנה כוללים מחקר מתקדם בתחום אנדומטריוזיס. עם זאת, הם נשארים מוגבלים ביכולתם לשחזר במלואם את מורכבות המחלה. אתגר מרכזי טמון בטבע הרב-גורמי של אנדומטריוזיס, הכולל אינטראקציות מורכבות בין הורמונים, דלקות, תאי חיסון, עצבים וסוגי תאים מגוונים בסביבה תלת-ממדית דינמית. בנוסף, מערכות במבחנה אינן לוכדות את התנודות הטבעיות של הורמוני הסטרואידים השחלותיים, מה שמגביל את היכולת לחקור השפעות מחלה על מערכת הרבייה 21,22,23. לכן, מודל של אנדומטריוזיס מושרה באמצעות עכברים שלמים מספק פלטפורמה גמישה לחקר התפקידים האישיים והאינטראקטיביים של מערכת החיסון24, הורמונים25,26, וגורמים סביבתיים27,28 בהתפתחות אנדומטריוזיס והשפעותיה על מערכת הרבייה29. בנוסף, השימוש במודלים של עכברים טרנסגניים, שבהם גנים מסוימים נמחקים באופן סלקטיבי או מופרזים ברירית הרחם, מאפשר לחוקרים להבהיר את תפקידם של מסלולים מולקולריים מובחנים בהתפתחות ובהתקדמות אנדומטריוזיס. עם זאת, הבחנה מדויקת בין נגעים אנדומטריוטיים לרקמות המארח הסובבות נותרה אתגר טכני משמעותי.

ננו-חלקיקי סיליקה עם צביעה הם גשושים ורסטיליים ועמידים למעקב תאי ודימות ביולוגי. הם פשוטים לסינתזה, מפזרים מאוד, עמידים בפוטוסבול, ביותואמיים ויעילים בתיוג תאים30,31. עמוד השדרה של הסיליקה מייצב פלואורופורים הידרופוביים בתוך המטריצה, מה שהופך אותם למדווחי מולקולריים פלואורסצנטיים יעילים עם תפוקה קוונטית גבוהה (QY). במהלך השנים, ננו-חלקיקי סיליקה פלואורסצנטיים כאלה אומצו באופן נרחב כתוויות אקס ויבו בהירות ועמידות לתאים ומבני רקמה לפני ההשתלה וההדמיה ב-vivo 32,33,34,35. כאן, אנו מתארים הליך מפורט ליצירת אנדומטריוזיס בעכברים עם תיוג ex vivo באמצעות ננו-חלקיקי סיליקה שצבעו בצבע Cy5.5, כפי שנעשה בפרסום קודם35, מה שמאפשר את יישומם כסמנים יציבים למעקב אחר נגעים.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) של אוניברסיטת מיזורי (פרוטוקול מס' 65323) ובוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולתקנות הלאומיות החלות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

1. הכנת קונוגט Cy5.5-APTES

  1. המיס 1 מ"ג אסטר ציאנין 5.5-NHS ב-100 מיקרו-ליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בבקבוקון זכוכית שקוף בנפח 11.1 מ"ל. כסה מיד את הבקבוקון בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מהאור.
    הערה: ניתן לאחסן ב-Cy 5.5-APTES בטמפרטורה של 4°C בטמפרטורת החדר למשך שבוע.
  2. הוסף 1 מיקרוליטר של (3-אמינופרופיל) טריאתוקסילן (APTES) לתמיסת הצבע.
  3. הוסיפו 0.5 מיקרול טריאתילמין (TEA) וערבבו מיד כדי להקל על התגובה.
  4. ערבבו את תערובת התגובה ב-300 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס בחושך למשך 24 שעות כדי לאפשר קישור קוולנטי בין Cy5.5 ל-APTES.
  5. אטום את הבקבוקון עם המכסה והמשך להגן עליו מאור על ידי עטיפתו בנייר אלומיניום.

2. סינתזה של ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5

  1. הוסף 1 מיקרולטר של תמיסת אמוניה מרוכזת (28%) לבקבוקון זכוכית שקופה חדש עם הברגה.
  2. הוסיפו 8.5 מ"ל אתנול אבסולוטי (דרגת ביולוגיה מולקולרית).
  3. הוסף 350 מיקרוליטר של טטראתיל אורתוסיליקט (TEOS).
  4. הוסיפו 15 מיקרוליטר מתמיסת Cy5.5-APTES המוכנה לתערובת תגובת סינתזת הסיליקה.
  5. ערבבו את תערובת התגובה במהירות 500 סל"ד בטמפרטורת החדר בחושך במשך 24 שעות כדי לאפשר שילוב קוולנטי של הצבע במטריצת הסיליקה.

3. טיהור ופיזור

  1. העבר את כל תערובת התגובה לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
  2. הכינו צינור איזון המכיל נפח שווה של מים מזוקקים לצנטריפוגה.
  3. צנטריפוגה את שני הצינורות ב-12,074 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. אשר שנוצר כדור גלוי נראה בתחתית הצינור לאחר הצנטריפוגה.
  4. שטפו את הכדור עם 10 מ"ל של 95% אתנול על ידי צנטריפוגה ב-12,074 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזור על השטיפה הזו 3 פעמים, תוך השעיית הכדור באמצעות סוניקציה למשך כ-3–5 דקות בין השטיפות או עד שהוא מתפזר לחלוטין.
  5. שטפו את הכדור עם 5 מ"ל מים מזוקקים וצנטריפוגה ב-12,074 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזור על השטיפה פעמיים, תוך החזרת הגלגל באמצעות קול קול למשך כ-3–5 דקות בין השטיפות או עד שהוא מתפזר לחלוטין.
  6. החזירו את הכדור ל-5 מ"ל מים מזוקקים באמצעות סוניקציה עד שיתפזר לחלוטין (לא נצפו שברים מוצקים לאישור פיזור). אשר שהשעיית החלקיקים נראית כחולה גלויה לאחר פיזור מלא.
  7. העבר את המתלה לבקבוקון זכוכית, עטוף אותו בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מהאור, ואחסן אותו בטמפרטורת החדר.
  8. הערכת פיזור חלקיקים ופלואורסצנציה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS). השתמש באורך גל עירוי של 680 ננומטר ואורך גל פליטה של 710 ננומטר עבור Cy5.5.

4. השראה לאנדומטריוזיס באמצעות תיוג ex vivo עם ננו-חלקיקי סיליקה צבעוניים בצבע Cy5.5

  1. הזריקו לעכבר תורם בת 8 שבועות (זן: C57Bl6J X129Sv) תת-עורית ב-E2 (100 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מ"ל בשמן שומשום) פעם ביום בבוקר במשך שלושה ימים רצופים לסנכרון הורמונלי.
  2. הורד את העכבר התורם באמצעות פריקה צווארית 6 שעות לאחר הזרקת E2 האחרונה, והסירו את הרחם.
  3. טחנו את רקמת הרחם לכ-1 מ"מ 3 חתיכות בצלחת פטרי באמצעות סכין30,36.
  4. דגרו את חלקיקי רקמת הרחם (45 מ"ג) עם 20% (v/v) Cy5.5 ננו-חלקיקי סיליקה בצבע בפלטת 24 בארות המכילה מדיום RPMI-1640 מלא (10% FBS) למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%CO2.
  5. הרדימו את העכבר המקבל (זן: C57Bl6J X129Sv) עם 3% איזופלוראן בחמצן ובצעו חתך בטן בקו האמצע של 0.5 ס"מ.
    הערה: הניחו את העכבר בתא השראה עם 3% איזופלוראן עד להשגת הרדמה. תגלח את הבטן ותעביר את העכבר לפלטפורמת הניתוח. מקם את חרוט האף ההרדמה לפני תחילת הניתוח.
  6. שטפו את שברי רקמת הרחם המסומנים על ידי ex vivo עם מדיום תרבית בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ב-380 × גרם למשך 2 דקות. חזור על הכביסה 3 פעמים.
  7. בהרדמה, יש לבצע חתך בטן בקו אמצע של 1 ס"מ בעכברים המקבלים. השעה 45 מ"ג של קטעי רקמה מסומנים ב-Cy5.5 ב-500 מיקרולטר PBS והזריק את המתלה לחלל הפריטונאלי באמצעות מחט 20 גייג'.
  8. סגור את הפריטונאום עם תפר נספג וסגר את העור עם קליפסים לפצע. שים את העכבר בסביבה חמה ועקב אחריו עד להחלמה מההרדמה.
  9. הורד את העכבר באמצעות הפרעת צוואר בנקודת הקצה הניסיונית הנבחרת ואיסוף הנגעים האנדומטריוטיים.

תוצאות

ננו-חלקיקי סיליקה שצבעו בצבע יכולים לשמש כגלאי דימות ליישומי תיוג תאים. ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs) סונתזו בשני שלבים באמצעות תהליך סול-ג'ל סיליקה ועובדו עם צבע הציאנין הפלואורסצנטי Cy5.5 באמצעות כימיה של סילאן (איור 1). מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר (TEM) חשף ננו-חלקיקים כדוריים אחידים בקוטר 156.67 ± 15.23 ננומטר (איור 1A). פיזור אור דינמי (DLS) הראה כי הננו-חלקיקים המסונתזים (SiNPs ו-Cy5.5-SiNPs) היו יציבים קולואידית, עם קוטרים הידרודינמיים (Hd) של 130.67 ±-3.20 ננומטר (PDI = 0.152 ± 0.009) ו-185.9 ± 5.44 ננומטר (PDI = 0.14 ± 0.009), בהתאמה (איור 1B). פוטנציאלי הזטה של SiNPs חשופים ו-Cy5.5-SiNPs היו −32.39 ± 3.55 mV ו-−50.53 ± 2.47 mV, בהתאמה (איור 1C). ספקטרוסקופיית פוטולומינסצנציה (אורך גל עירור = 680 ננומטר; אורך גל פליטה = 710 ננומטר) אישרה את השילוב המוצלח של Cy5.5 בננו-חלקיקי הסיליקה, וה-Cy5.5-SiNPs הפגינו פלואורסצנציה אופיינית (איור 1D). הצמדת צבע מוצלחת אושרה עוד יותר על ידי ספקטרום הפוטולומינצנציה. בנוסף, התפוקה הקוונטית (QY) של Cy5.5-SiNPs (φ = 0.31) הייתה דומה לזו של צבע Cy5.5 חופשי (φ = 0.23)36.

להערכת תאימות ביולוגית של ננו-חלקיקים, תאי אפיתל רירית הרחם 12Z דוגרו במהלך הלילה עם Cy5.5-SiNPs ב-DMEM בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5% CO₂. הכדאיות התאית הוערכה באמצעות מבחן MTT לאחר טיפול בריכוזי ננו-חלקיקים של 0, 0.5, 1, 2.5, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל (איור 1E). לא נצפה ציטוטוקסיות בריכוזים של עד 10 מיקרוגרם/מ"ל. תאים שדוגרו עם 5 מיקרוגרם/מ"ל Cy5.5-SiNPs הראו קליטת ננו-חלקיקים יעילה, כאשר מיקרוסקופ פלואורסצנציה הראתה מיקום חלקיקים באזור הפרי גרעיני (איור 1F). לעומת זאת, לא זוהתה פלואורסצנציה של Cy5.5 בתאי ביקורת לא מטופלים. ה-Cy5.5-SiNPs שהוכנו הראו גם יציבות מימית, עם קוטרים הידרודינמיים שנעו בין 170–190 ננומטר במים דה-יוניים ושמירה על עוצמת פלואורסצנציה יציבה למשך שבעה ימים, כפי שנקבע על ידי DLS ודימות פלואורסצנצי, בהתאמה (איור 1G, H).

כדי לקבוע את ההתאמה של ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 לתיוג רקמות אקס ויבו, תכונות הפלואורסצנציה שלהם אושרו לפני השראת אנדומטריוזיס. הדמיית IVIS הדגימה פליטת פלואורסצנציה חזקה מהתלשות הננו-חלקיקים, בעוד שלא נצפה אות פלואורסצנציה שניתן לזהות במערכת הבקרה השלילית המכילה מים בלבד, מה שמאשר את הספציפיות והרגישות של גילוי פלואורסצנציה של Cy5.5 (איור 2).

הריכוז וזמן הדגירה לתיוג אקס ויבו של קטעי רקמת הרחם הוסבו לאחר מכן. זוהתה פלואורסצנציה בקטעי רקמת רחם שהוקמו עם ננו-חלקיקי סיליקה צבעוניים של 20% (v/v) Cy5.5 למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C תחת 5% CO235. הדמיית IVIS אישרה אותות פלואורסצנציה חזקים ועקביים מחלקי הרקמה המסומנים. תוצאות אלו מראות שננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 מסמנים ביעילות חלקי רקמת רחם ללא שינוי גנטי (איור 3).

היכולת של קטעי רקמת רחם מסומנים בננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 לגרום לאנדומטריוזיס ולהקל על זיהוי נגעים הוערכה35. קטעי רקמה מסומנים הוזרקו לחלל הפריטונאלי של עכברי המקבל, והתקדמות המחלה נבדקה במשך חודש. בנקודת הסיום הניסויית, זוהו בקלות נגעים אנדומטריוטיים בתוך חלל הפריטוניאלי. נגעים חיוביים ל-Cy5.5 הובחנו בבירור מהרקמות המארחות הסובבות באמצעות הדמיית IVIS ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שאפשר זיהוי מהיר וחד-משמעי של נגעים. פלואורסצנציה של Cy5.5 בתוך הנגעים אושרה עוד יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות אלו מראות כי תיוג ex vivo עם ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 תומך בהשראה מוצלחת של אנדומטריוזיס ומאפשר הדמיה אמינה של נגעים אנדומטריוטיים בגוף (איור 4).

figure-results-1
איור 1: אפיון פיזיקלי של ננו-חלקיקי סיליקה עם צבע Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs). (א) תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור מייצגת (TEM) של Cy5.5-SiNPs. קוטר החלקיקים = 156.67 ± 15.23 ננומטר. פס קנה מידה = 100 ננומטר. (B) מדידות פיזור אור דינמי (DLS) של קוטרי SiNPs הידרודינמיים (130.67 ± 3.20 ננומטר, PDI = 0.152 ± 0.009) ו-Cy5.5-SiNPs (185.9 ± 5.44 ננומטר, PDI = 0.14 ± 0.009). (C) מדידות פוטנציאל זטה של SiNPs (−32.39 ± 3.55 mV) ו-Cy5.5-SiNPs (−50.53 ± 2.47 mV), המדגימות את הירידה בפוטנציאל הזטה לאחר הקונוגציה של Cy5.5. (D) פרופיל פלואורסצנציה של Cy5.5-SiNPs (אורך גל עירור = 680 ננומטר; אורך גל פליטה = 710 ננומטר). הטבה: תמונות שדה בהיר ופלואורסצנציה של Cy5.5-SiNPs המפוזרים במים. (ה) בדיקת עמידות תאי MTT של תאי 12Z שטופלו ב-Cy5.5-SiNPs בריכוזים של 0, 0.5, 1, 2.5, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. (ו) קליטה תאית של Cy5.5-SiNPs על ידי תאי 12Z. התאים טופלו ב-PBS (ביקורת) או Cy5.5-SiNPs. כחול = DAPI; אדום = Cy5.5-SiNPs. מוט קנה מידה = 200 מיקרון. (G) יציבות גודל של Cy5.5-SiNPs המאוחסנים במים במשך 7 ימים, ללא שינוי משמעותי בקוטר ההידרודינמי. (ח) יציבות פלואורסצנציה של Cy5.5-SiNPs המאוחסנים במים במשך 7 ימים, ללא שינוי משמעותי בעוצמת הפלואורסצנציה. הטבה: תמונות פלואורסצנציה מייצגות שצולמו בימים 1, 3 ו-6. NS = לא משמעותי. הערכים מוצגים כממוצעים ± SD. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אישור של ננו-חלקיקי סיליקה עם צבע Cy5.5. (א) תמונה מייצגת של ננו-חלקיקי סיליקה שצבעו בצבע Cy5.5. (ב) זיהוי פלואורסצנציה של Cy5.5 מננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 באמצעות הדמיית IVIS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: תיוג חיצוני של קטעי רקמת הרחם באמצעות ננו-חלקיקי סיליקה שצבעו בצבע Cy5.5. הפאנל השמאלי מציג שברי רקמת רחם לא מטופלים, והפאנל הימני מציג קטעי רקמת רחם המסומנים בננו-חלקיקי סיליקה Cy5.5 שצבעו בצבע Cy5.5. זוהרה פלואורסצנציה של Cy5.5 באמצעות הדמיית IVIS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: זיהוי נגעים אנדומטריוטיים המסומנים בננו-חלקיקי סיליקה שצבעו בצבע Cy5.5. (A) תמונת IVIS של חלל הפריטונאלי. (ב) מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של נגעים אנדומטריוטיים מסומנים ב-Cy5.5 מאפשרת זיהוי ברור בתוך חלל הפריטוניאלי. (C) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנציה מייצגות של נגעים אנדומטריוטיים. פלואורסצנציה צהובה מצביעה על אות Cy5.5, והגרעינים נצבעו נגד DAPI. (D) תמונה מייצגת של נגע אנדומטריוטי. החץ מציין ננו-חלקיקי סיליקה מצופים בצבע Cy5.5. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

המחקר הנוכחי מציג גישה מבוססת ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 כשיטה מעשית ויעילה להצגת נגעים אנדומטריוטיים במודלים של עכברים35. אסטרטגיה זו מציעה מספר יתרונות, ביניהם פשטותה, גמישותה ואופיה הלא-גנטי, ומבטלת את הצורך לייצר בעלי חיים מדווחים טרנסגניים. בהשוואה לשיטות ויזואליזציה קונבנציונליות, כמו מודלים של עכברים פלואורסצנטיים מדווחים, שיטה זו מפחיתה את המורכבות הטכנית תוך שמירה על יעילות תיוג חזקה, ובכך מרחיבה את הנגישות שלה למחקר אנדומטריוזיס. בנוסף, ננו-חלקיקי סיליקה מספקים פלטפורמה יציבה לשילוב צבעים פלואורסצנטיים ולשמירה יעילה שלהם בתוך הרקמה, ובכך תומכים בזיהוי נגעים ששכפול.

הבחנה בין נגעים אנדומטריוטיים לרקמת המארח הסובבת חיונית לחקר התחלת המחלה והתקדמותה במודלים של עכברים. עכברי דיווח Rosa26mTmG מבטאים באופן נרחב חלבון פלואורסצנטי עגבניות (mT) דימר טנדם ממוקד ממברנה, אשר מומר לחלבון פלואורסצנטי ירוק ממוקד ממברנה (mG) לאחר כריתה בתיווך Cre ברקמות יעד ספציפיות37. למרות שקיימים מודלים רבים של עכברים טרנסגניים לחקר תפקוד הגנים באנדומטריוזיס, יצירת בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים היא עתירה עבודה וגוזלת זמן. לעומת זאת, תיוג ex vivo עם ננו-חלקיקי סיליקה בצבע Cy5.5 מספק אלטרנטיבה מהירה, גמישה ולא גנטית להצגת נגעים תוך שמירה על התאמה למגוון רחב של מודלים קיימים של עכברים.

יישום מוצלח של פרוטוקול זה תלוי בשליטה קפדנית על מספר פרמטרים קריטיים לניסוי. במהלך סינתזת ננו-חלקיקים, ריכוז הקטליזטורים, הרכב הממסים, קצב התוספת של TEOS, תנאי ערבוב ויעילות השטיפה משפיעים ישירות על גודל החלקיקים, עוצמת הפלואורסצנציה ויכולת השחזור של התיוג. שיטת שטובר מספקת גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וניתנת לשחזור לסינתזת ננו-חלקיקי סיליקה פלואורסצנטיים עם שליטה מדויקת על גודל החלקיקים ושילוב צבע יציב 38,39,40,41. בהשוואה לשיטות מיקרואמולסיה הפוכה, גישת שטבר מפחיתה אתגרי טיהור הקשורים לסורפקטנטים תוך שמירה על פלואורסצנציה Cy5.5 בתנאי תגובה קלים 39,40,41,42. הגדלת ריכוז הקטליזטור בדרך כלל מגדילה את גודל החלקיקיםב-40, בעוד שקצב תוספת מהיר יותר של TEOS מעודד יצירת גרעין, מה שמוביל לחלקיקים קטניםיותר 41. שטיפה יסודית חיונית להסרת תגובות שלא הגיבו ולשפר את יציבות הננו-חלקיקים במהלך האחסון.

מספר גורמים נוספים חשובים להשגת תיוג רקמות אקס בוור ויצירת נגעים ניתנים לשחזור. גודל חלקי רקמת הרחם אחיד, פיזור ננו-חלקיקים הומוגני ותנאי דגירה עקביים משפרים את יעילות הסימון ומפחיתים שונות ניסיונית. עיבוד רקמות בקרה לא מסומנות במקביל חיוני גם להבחנה בין פלואורסצנציה אמיתית של Cy5.5 לבין אותות רקע אוטופלואורסצנטיים ובלתי ספציפיים. במהלך השראה לנגע, פריימינג הורמונלי עקבי לעכברים תורמים, השתלה עדינה של קטעי רקמה מסומנים וטיפול מתאים לאחר ניתוח מפחיתים טראומה ברקמה ודלקת לא ספציפית, ובכך משפרים את השחזור של היווצרות הנגע.

למרות היתרונות הללו, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. ההתמדה והיציבות של אות הפלואורסצנציה ב-vivo עשויות להשתנות לאחר ההשתלה עקב עיצוב רקמות, התרבות תאית ופינוי חיסוני. כתווית פלואורסצנטית חיצונית, אות Cy5.5 צפוי לרדת בהדרגה כאשר התאים המסומנים מתחלקים, מה שעלול להגביל את היתכנות מחקרים ארוכי טווח לאורך זמן. בנוסף, שונות בהכנת הרקמות ובקליטת ננו-חלקיקים עשויה להשפיע על יעילות התיוג בין הניסויים, מה שמדגיש את חשיבות ההליכים הסטנדרטיים בניסויים.

למרות שהמחקר הנוכחי מתמקד בזיהוי נגעים מחוץ לחיים, Cy5.5 הוא צבע פלואורסצנטי אדום רחוק/קרוב לאינפרא-אדום (NIR) שממזער את האוטופלואורסצנציה של הרקמות ומאפשר חדירה עמוקה יותר לפוטונים. תכונות אופטיות אלו הופכות את Cy5.5 למתאים היטב ליישומי הדמיה בתוך החיים. בהתאם לכך, אסטרטגיית תיוג ננו-חלקיקי סיליקה עם צבע Cy5.5 בעלת תפוקה קוונטית גבוהה מספקת פלטפורמה איתנה למעקב לא פולשני אחר נגעים אורך לא פולשני באמצעות פלואורסצנציה NIR ודימות פוטואקוסטי43,44.

מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בשיפור עמידות הפלואורסצנציה ובאופטימיזציה נוספת של עקביות התיוג בתנאי ניסוי. הערכה שיטתית של שמירת אותות תסייע להגדיר את חלון ההדמיה האופטימלי למחקרים אורכיים, בעוד שהמשך שיפור בתנאי תכנון ותיוג ננו-חלקיקים עשוי לשפר את הרגישות ולהרחיב את היישום של גישה זו למודלים אחרים של מחלה. בסך הכול, אסטרטגיה מבוססת ננו-חלקיקים זו מספקת אלטרנטיבה מהירה, שכפולה ורב-גונית לגישות תיוג גנטי להמחשת נגעים אנדומטריוטיים, וצריכה להקל על מחקרים מכניים והערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות אבחנתיות וטיפוליות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד וההתפתחות האנושית ע"ש יוניס קנדי שרייבר (NICHD) (R01HD108895 ל-T.K. ו-J.W.J.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)Sigma-Aldrich440140טוהר ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875טוהר ≥98%
Ammonium hydroxideFisher ScientificA669S-500תמיסת אמוניום הידרוקסיד 28%
BD Autoclip Wound Closing SystemBD427631קליפסים כירורגיים לסגירת פצעים
Clear glass threaded vialFisherbrandFS60910A-3בקבוקון זכוכית שקוף 11.1 מ"ל
Cyanine 5.5 NHS esterSigma-AldrichGEPA15502צבע ניאו-אינפרא אדום פלואורסצנטי
Ethanol, absoluteFisher ScientificBP2818דרגת ביולוגיה מולקולרית
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044תוסף תרבית תאים
High-speed centrifugeBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-Eצנטריפוגה במהירות גבוהה
In vivo imaging systemPerkinElmerIVIS Spectrumמערכת הדמיית פלואורסצנציה
IsofluraneBaxterNDC1001-9-360-60חומר הרדמה לשאיפה
Magnetic stir barFisherbrand14-513-648 מ"מ
Magnetic stir plateChelmsfordSP88854200מרחיב מגנטי במהירות משתנה
Refrigerated centrifugeEppendorf5427 Rמצויד עם רוטור FA-45-48-11
RPMI-1640 mediumGibco11835-030מדיום תרבית תאים
Sesame oilMilliporeSigmaS3547ממס להכנת אסטרדיול
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)Sigma-Aldrich86578טוהר ≥99%
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886טוהר ≥99%
Ultrasonic bathFisherbrandCPX1800Hלהפצת ננו-חלקיקים על ידי סוניקציה

מקורות

  1. Marquardt RM, Kim TH, Shin JH, Jeong JW. Progesterone and estrogen signaling in the endometrium: What goes wrong in endometriosis? Int J Mol Sci. 2019;20(15).
  2. Yilmaz BD, Bulun SE. Endometriosis and nuclear receptors. Hum Reprod Update. 2019;25(4):473–485.
  3. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–261.
  4. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril. 1992;58(2):290–295.
  5. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30.
  6. Vigano P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, et al. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1991;56(5):894–899.
  7. Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360(3):268–279.
  8. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):235–258.
  9. Johnson NP, Hummelshoj L, World Endometriosis Society Montpellier Consortium. Consensus on current management of endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(6):1552–1568.
  10. Kim JJ, Kurita T, Bulun SE. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocr Rev. 2013;34(1):130–162.
  11. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril. 2012;98(3):511–519.
  12. Fadhlaoui A, Bouquet de la Joliniere J, Feki A. Endometriosis and infertility: How and when to treat? Front Surg. 2014;1:24.
  13. D'Hooghe TM, Debrock S, Hill JA, Meuleman C. Endometriosis and subfertility: Is the relationship resolved? Semin Reprod Med. 2003;21(2):243–254.
  14. Simoens S, Hummelshoj L, D'Hooghe T. Endometriosis: Cost estimates and methodological perspective. Hum Reprod Update. 2007;13(4):395–404.
  15. Gao X, Outley J, Botteman M, Spalding J, et al. Economic burden of endometriosis. Fertil Steril. 2006;86(6):1561–1572.
  16. Brown J, Farquhar C. An overview of treatments for endometriosis. JAMA. 2015;313(3):296–297.
  17. Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R, el-Zeky FA. Laparoscopic appearances of peritoneal endometriosis. Fertil Steril. 1989;51(1):63–67.
  18. Quesada J, Harma K, Reid S, Rao T, et al. Endometriosis: A multimodal imaging review. Eur J Radiol. 2023;158:110610.
  19. Culley L, Law C, Hudson N, Denny E, et al. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: A critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013;19(6):625–639.
  20. Nnoaham KE, Hummelshoj L, Webster P, et al. Reprint of: Impact of endometriosis on quality of life and work productivity: A multicenter study across ten countries. Fertil Steril. 2019;112(4 Suppl 1):e137–e152.
  21. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–626.
  22. Malvezzi H, Marengo EB, Podgaec S, Piccinato CA. Endometriosis: Current challenges in modeling a multifactorial disease of unknown etiology. J Transl Med. 2020;18(1):311.
  23. Esfandiari F, Mansouri N, Shahhoseini M, Heidari Khoei H, et al. Endometriosis organoids: Prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 2022;45(1):5–9.
  24. Lin YJ, Lai MD, Lei HY, Wing LY. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 2006;147(3):1278–1286.
  25. Fang Z, Yang S, Lydon JP, DeMayo F, et al. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil Steril. 2004;82(3):673–678.
  26. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, et al. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(7):3460–3466.
  27. Foster WG, Ruka MP, Gareau P, Foster RA, et al. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: Application to toxicology. Can J Physiol Pharmacol. 1997;75(10–11):1188–1196.
  28. Cummings AM, Metcalf JL, Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: Time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol. 1996;138(1):131–139.
  29. Yoo JY, Kim TH, Shin JH, Marquardt RM, et al. Loss of MIG-6 results in endometrial progesterone resistance via ERBB2. Nat Commun. 2022;13(1):1101.
  30. Ow H, Larson DR, Srivastava M, Baird BA, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 2005;5(1):113–117.
  31. Chung SJ, Hadrick K, Nafiujjaman M, Apu EH, et al. Targeted biodegradable near-infrared fluorescent nanoparticles for colorectal cancer imaging. ACS Appl Bio Mater. 2024;7(12):7861–7870.
  32. Pittet MJ, Swirski FK, Reynolds F, Josephson L, et al. Labeling of immune cells for in vivo imaging using magnetofluorescent nanoparticles. Nat Protoc. 2006;1(1):73–79.
  33. Nguyen TT, Nguyen HN, Nghiem THL, Do XH, et al. High biocompatible FITC-conjugated silica nanoparticles for cell labeling in both in vitro and in vivo models. Sci Rep. 2024;14(1):6969.
  34. Marquardt RM, Nafiujjaman M, Kim TH, Chung SJ, et al. A mouse model of endometriosis with nanoparticle labeling for in vivo photoacoustic imaging. Reprod Sci. 2022;29(10):2947–2959.
  35. Kim TH, Bae N, Kim T, Hsu AL, et al. Leptin stimulates endometriosis development in mouse models. Biomedicines. 2022;10(9).
  36. Bouteiller C, Clave G, Bernardin A, Chipon B, et al. Novel water-soluble near-infrared cyanine dyes: Synthesis, spectral properties, and use in the preparation of internally quenched fluorescent probes. Bioconjug Chem. 2007;18(4):1303–1317.
  37. Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593–605.
  38. Stӧber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;26(1):62–69.
  39. Thorat AV, Ghoshal T, Chen L, Holmes JD, et al. Synthesis and stability of IR-820 and FITC-doped silica nanoparticles. J Colloid Interface Sci. 2017;490:294–302.
  40. Silva AS, Santos JHZ. Silica particle size and polydispersity control from fundamental practical aspects of the Stöber method. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2024;702:135190.
  41. Saha A, et al. Greening the pathways: A comprehensive review of sustainable synthesis strategies for silica nanoparticles and their diverse applications. RSC Adv. 2024;14(16):11197-11216.
  42. Lian Y, Ding LJ, Zhang W, Zhang XA, et al. Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticles for biological applications. Methods Appl Fluoresc. 2018;6(3):034002.
  43. Kumar PPP, Chung SJ, Hadrick K, Hill ML, et al. Noninvasive detection and thermal ablation therapy of endometriosis using silica-coated gold nanorods. Adv Nanobiomed Res. 2025;5(12):2500101.
  44. Rahman MS, et al. Nanoceria as a non-steroidal anti-inflammatory drug for endometriosis theranostics. J Control Release. 2025;378:1015-1029.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

234234FITC

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.