הדגמת מיקוד מעכב פפטידיל פלואורסצנטי של ClpXP מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בתאי יונקים

סיכום

פרוטוקול זה קובע תהליך דימות כמותי הכולל יישום מיקרוסקופיה קונפוקלית למעקב אחר מיקום סלקטיבי של מעכב הפפטידיל הפלואורסצנטי ClpPP FAM-FAPAL-CMK (קרבוקסיפלואורסצנט-FAPAL-כלורומתיל קטון) למיטוכונדריה כדי לפגוע ב-ClpP, ואת השינויים המורפולוגיים במיטוכונדריה בתאים שלמים שנגרמו על ידי עיכוב ClpP.

תקציר

פרוטאזות התלויות ב-ATP מיטוכונדריאלי חיוניות לשמירה על הומאוסטזיס חלבוני באמצעות פירוק חלבונים פגומים או מקופלים בצורה שגויה. מתוכם, קומפלקס הפרוטאז ClpXP ממוקם במטריצה המיטוכונדריאלית ותורם לבקרת איכות המיטוכונדריה בתנאי פיזיולוגיה ולחץ. עבודה זו מדגימה תהליך מיקרוסקופ פלואורסצנציה כמותי להערכת מיקוד מיטוכונדריאלי של מעכב הפפטידיל הפלואורסצנטי FAM-FAPAL-CMK ולהעריך שינויים מורפולוגיים מיטוכונדריאליים הקשורים לעיכוב ClpXP בתאי יונקים. תאי HeLa טופלו ב-FAM-FAPAL-CMK ונותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם צביעת אימונופלואורסצנציה של סמנים מיטוכונדריאליים וניתוח תמונה כמותי. ניתוח הקולוקליזציה באמצעות סף קוסטס ומקדמי החפיפה של מנדרס הראה העשרות מיטוכונדריאליות של אות המעכב. כתוצאה מכך, עיכוב ClpP שינה את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית. ניתוח אימונובלוט לא הראה שינוי משמעותי בשפע חלבוני ClpP לאחר טיפול במעכבים. ביחד, עבודה זו מתארת תהליך עבודה מבוסס הדמיה שניתן לשחזור שיאפשר חקירת תפקודי ClpXP מיטוכונדריאליים בתאים שלמים בתגובה להפרעות בהומאוסטזיס, כגון לחץ חמצוני.

מבוא

פרוטאזות התלויות ב-ATP מיטוכונדריאלי הן מרכזיות להומאוסטזיס חלבונים, ומפרקות חלבונים מקופלים או פגומים 1,2,3,4,5,6. מתוכם, ClpXP הוא קומפלקס פרוטאז AAA+ הטרו-אוליגומרי הממוקם במטריצת המיטוכונדריה. ה-ClpX ATPase מזהה ופותח חלבונים, ואז מעביר אותם לתא הפרוטאוליטי ClpP ^7,8,9. יחד עם פרוטאזות מיטוכונדריאליות אחרות, ClpXP שומר על בקרת איכות חלבונים הן בתנאים רגילים והן בתנאי לחץ, כולל לחץ חמצוני והפרעות מטבוליות ^1,2,4. הפרעה בהומאוסטזיס חלבוני מיטוכונדריה נקשרה למחלות כמו נוירודגנרציה וסרטן, מה שמדגיש את חשיבות הבנת פעילויות פרוטאז אלו במערכות תאיות שלמות ^3,6,10.

אתגר מרכזי בתחום הוא היעדר שיטות לניטור ישיר של פעילות הפרוטאז המיטוכונדריאלי ברזולוציה מרחבית בתאים שלמים. הגישות הקיימות מסתמכות בעיקר על בדיקות ביוכימיות המשתמשות בחלבונים מטוהרים או ליזאטים של תאים, המספקים מידע קינטי מפורט אך אינם שומרים על ההקשר התת-תאי 11,12,13,14. אסטרטגיות ביולוגיה כימית התמודדו עם מגבלה זו בחלקן על ידי פיתוח סובסטרטים פלואורוגניים של פפטידים ומעכבים המכוונים לאתר פעיל. סובסטרטים פלואורסצנטיים של פפטידיל מאפשרים מדידה כמותית של פעילות הפפטידאז התלויה ב-ATP, בעוד שמעכבי פפטידיל יוצרים אינטראקציות קוולנטיות הפיכות עם אתר הפרוטאוליטי להשגת עיכוב סלקטיבי 13,15,16,17,18,19. בעבר, מעכב ClpXP מסונתז במעבדה FAPAL-CMK הוכח כיוצר קשר קוולנטי עם ClpP²⁰. במחקר זה, FAM-FAPAL-CMK, נגזרת מסומנת בפלואורסאין של FAPAL-CMK, פותחה כמעכב מבוסס מנגנון של ClpP, המאפשר ויזואליזציה של מיקומו התוך-תאי.

בהשוואה למבחנים ביוכימיים, מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי מאפשר הערכה מרווחית של התפוצצות הגשוש ומורפולוגיית המיטוכונדריה בתאים שלמים, ומספקת מידע שלא ניתן לקבל רק מליזאטים. עם זאת, בניגוד לבדיקות אנזימטיות, מיקום הפלואורסצנציה אינו מודד ישירות פעילות קטליטית או אירועי קישור מולקולרי, ועלולים להיות מושפעים מיעילות קליטת הגלים, דינמיקת מיטוכונדריה ותנאי הדמיה. בנוסף, יישום מוצלח תלוי בהצטברות מספקת של פרובים ורשתות מיטוכונדריאליות מסודרות מספיק, מה שהופך את תהליך העבודה הזה למתאים ביותר לתאים מתורבתים דבקים עם מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מובחנת בבירור.

מטרת המחקר היא להקים זרימת עבודה כמותית המשלבת גלאי פלואורסצנטי מבוססי מנגנון עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לנטר את מיקום ותפקוד הפרוטאז המיטוכונדריאלי בתאים שלמים. על ידי שילוב גלאים כימיים סלקטיביים עם הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה, זרימת עבודה זו מאפשרת הערכת מיקום מיטוכונדריאלי, התפלגות תשושים ותגובות מורפולוגיות להפרעות בהומאוסטזיס מיטוכונדריאלי בתאים שלמים. הוא יכול להשלים את הבדיקות הביוכימיות הקיימות שמודדות ישירות פעילות פרוטאז אך חסרות רזולוציה מרחבית.

פרוטוקול

ניסויים בוצעו באמצעות תאי HeLa זמינים מסחרית. לא נעשה שימוש במשתתפים אנושיים, בעלי חוליות או חומרים ביולוגיים ראשוניים שמקורם בבני אדם או חולייתנים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים וטיפול

1. תרבית תאי HeLa ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%_CO2.
2. תאי לוחות על כיסויי זכוכית סטריליים ודוגרים במשך 24 שעות כדי לאפשר חיבור תאים.
3. המיס את המעכב FAM-FAPAL-CMK ב-DMSO להכנת מלאי של 50 מיקרומטר והקפא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחסון.
4. הוסיפו 50 ננומטר fam-fapal-cmk למדיום גדילת התאים בדגימות התא המטופלות.
5. הוסיפו נפח שווה של DMSO לדגימות בקרה כדי להתאים לריכוז הממס הסופי של דגימות שטופלו במעכבים, כדי להבטיח שההשפעות אינן נגרמות מ-DMSO.
6. דגרו את התאים למשך 18 שעות נוספות באותם תנאי תרבית לפני העיבוד במורד הזרם.
   הערה: מעכב FAM-FAPAL-CMK תוכנן ומסונתז במעבדה, ושיטת הסינתזה דווחה כבר^{לפני 20}.

2. קיבוע וחדירות

1. שטוף את התאים עם D-PBS מחומם מראש במשך 5 דקות וחזור על התהליך פעם אחת.
2. קיבעו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות בופר PHEM (68 mM PIPES, 25mM HEPES, 15mM EGTA, 3mM MgCl₂, pH 6.9) המכיל 2.4% פורמלדהיד, 0.05% (v/v) גלוטראלדהיד, ו-0.5% (עם v/v) סאפונין.
3. הכינו תמיסת נתרן בורוהידריד טרייה (5 מ"ג/מ"ל ב-D-PBS).
4. דגרו את התאים בתמיסת בורוהידריד נתרן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את שאריות הגלוטארלדהיד.
5. שטוף תאים שלוש פעמים עם D-PBS למשך 5 דקות כל אחת לפני הצביעה.
   הערה: פורמלדהיד וגלוטראלדהיד הם קיבועים רעילים. בצע שלבי קיבוע במכסה המנוע ולבש ציוד מגן אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה והגנה על עיניים). בורוהידריד נתרן הוא חומר מפחית תגובתי ויש לטפל בו בזהירות. בופר הקיבוע המבוסס על PHEM המכיל פורמלדהיד, גלוטראלדהיד וספונין נבחר לשימור המורפולוגיה המיטוכונדריאלית תוך שמירה על נגישות האנטיגן במהלך צביעת חיסונים. פורמלדהיד וגלוטראלדהיד מספקים קישור צולב חלבוני לשימור מבני, בעוד שהרכב הבופרינג וה-pH של PHEM מסייעים לייצב מבנה על-יסודי מיטוכונדריאלי²¹. סאפונין מסייע לחדירות הממברנה כדי לשפר את קצב החדירה הקיבועית. אסטרטגיית קיבוע זו מפחיתה עיוות של רשתות מיטוכונדריה ומתאימה במיוחד לניתוח כמותי של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

3. צביעת אימונופלואורסצנציה

1. חסימת תאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בבופר חסימה המכיל 3% (עם v) אלבומין סרום בקר (BSA) ב-PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) עם 0.1% (v/v) טריטון X-100.
2. דגרו תאים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בבופר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. השתמש בעכבר נגד TOMM20 (1:500) וב-rabbit anti-ClpP (1:500).
3. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד כדי להסיר נוגדנים ראשוניים שלא קשורים.
4. דגרו תאים עם נוגדנים משניים מדוללים בבופר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. השתמש בנוגדן משני עכבר מצומד CF405S (1:500) ובנוגדן משני לארנב אלקסה פלור 647 (1:500).
5. להגן על דגימות מאור במהלך ואחרי דגירה משנית של נוגדנים.
6. חזור על שלב 3.3.
7. התקנת כיסוי על מחסניות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה.
   הערה: ClpP ו-TOMM20 הוצגו תחת 405 ננומטר ו-647 ננומטר כדי למנוע חפיפה ספקטרלית עם אותות FAM.

4. רכישת תמונה

1. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי המצויד במטרת טבילה בשמן עם פתח מספרי גבוה.
2. אקסיט פלואורופורים באמצעות קווי לייזר של 405 ננומטר ו-633 ננומטר. השתמש במפצלי קרן דיכרואיים מתאימים להחזרת אור עירור ולהעברת פלואורסצנציה שנפלטת לגלאים.
3. הגדר את גודל הפיקסל ל-35.3 ננומטר (X, Y) ואת שלב ה-Z ל-0.1 מיקרון כדי להבטיח דגימה צירית מספקת של מבנים מיטוכונדריאליים.
4. לרכוש תמונות בגודל פריים של 1900 x 1900 פיקסלים (X, Y) ולאסוף 5 קטעים אופטיים לכל ערימת Z, החל מהאות המיטוכונדריאלי העליון ועד מתחת לאות המיטוכונדריאלי כדי להבטיח שהאות המיטוכונדריאלי הדומיננטי ייאסף.
   הערה: הגדרות רכישת מיקרוסקופ מייצגות מופיעות באיור משלים 1. בתאי HeLa, המיטוכונדריה הן בדרך כלל מבנים דקים וצינוריים, בקוטר של כ-0.5-1 מיקרון^. לכן, נפח Z של 0.5 מיקרון מספיק כדי ללכוד חלק משמעותי מהמטריצה המיטוכונדרית הבודדת, אך לא בהכרח את כל התא. נבחרה ערימת Z בת 5 חלקים כדי לאזן דגימה מספקת של מבנים מיטוכונדריאליים לבין רכישת תמונות מהירה כדי למזער ארטיפקטים הקשורים לתנועה במהלך הדמיית תאים.

5. טיפול והדמיה של תאים חיים

1. תרבית תאי HeLa על צלחות זכוכית בגודל 35 מ"מ ב-DMEM עם 10% FBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור לחות עם 5%_CO2.
2. להוסיף מעכב (ריכוז סופי: 50 ננומטר) או נפח מקביל של DMSO לתאים 24 שעות לאחר הזרעה. לדוגר תאים למשך 18 שעות נוספות בתנאי תרבית סטנדרטיים.
3. הסר את מדיום התרבית המכיל את המעכב או DMSO ושוטף את התאים פעם אחת עם D-PBS מחומם מראש למשך 5 דקות.
4. הוסף פתרון הדמיה של תאים חיים המכיל 20 ננומטר MitoTracker DeepRed.
5. לבצע הדמיה של תאים חיים בטמפרטורת החדר באמצעות אותן הגדרות מיקרוסקופ שתוארו לעיל. רכוש תמונות במצב סריקה לכל פריים עם כ-4.72 שניות לכל קטע אופטי (כ-24 שניות בסך הכל לכל ערימת Z בת 5 חלקים).
   הערה: חמישה מקטעים אופטיים בכל ערימת Z מוגדרים כדי לאזן דגימה מספקת של מבנים מיטוכונדריאליים לבין זמני רכישה ניתנים לניהול. בנוסף, פתרון הדמיה של תאים חיים בטמפרטורת החדר משמש להפחתת תנועתיות המיטוכונדריה לעומת הדמיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למרות שתנועת מיטוכונדריה במהלך הדמיה של תאים חיים עשויה עדיין לתרום לשונות במדידות הקולוקליזציה, הגדרות רכישה עקביות בכל הדגימות מסייעות להפחתת הטיה שיטתית. הגדרות תוכנה מייצגות מוצגות באיור המשלים 2.

6. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית

1. פתח קבצי תמונה בפיג'י²³ ויצר הקרנות בעוצמה מקסימלית מ-Z-stacks על ידי בחירת Image → Stacks → Z project, ובחירה ב-Maximum Intensity.
2. יישם את שיטת סף Otsu על ידי ניווט ל-Image → Adjust → Threshold ובחירת Otsu מתוך אפשרויות הסף. החלו את הסף על מיטוכונדריה מקטעים.
3. הרץ את תוסף Mitochondria Analyzer²⁴ ובחר מצב ניתוח דו-ממדי על בסיס כל מיטו.
4. מדדו את גודל המיטוכונדריה (שטח) והיקף באמצעות פלט מנתח המיטוכונדריה.
5. קבל את ערכי מקדם הצורה המיטוכונדריאלי ישירות מפלט מנתח המיטוכונדריה, כאשר מקדם הצורה מחושב כ-P²/(4πA), כאשר P מייצג את ההיקף ו-A את השטח.
6. מדדו את אורך הסחף הכולל לכל מיטוכונדריה באמצעות פונקציית ניתוח הרשת בתוך התוסף להערכת הקישוריות המיטוכונדרית.
7. הציגו את הנתונים כהתפלגויות של מדידות מיטוכונדריה בודדות יחד עם ערכי ממוצע שמקורם ב-30 תאים לכל מצב בשלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.
8. העריכו את המשמעות הסטטיסטית באמצעות מבחן t של וולש בתוכנת ניתוח סטטיסטי.

7. ניתוח קולוקליזציה

1. פתח קבצי תמונה בפיג'י ויצר הקרנות דו-ממדיות בעוצמה מרבית מערימות תמונות תלת-ממדיות. לצורך עקביות, נתחו את כל הדגימות באמצעות אותה אסטרטגיית תחזית ורכישה.
2. פיצול ערוצי פלואורסצנציה על ידי בחירת תמונה → צבע → ערוצים מפוצלים.
3. הפעל את תוסף Coloc 2 על ידי בחירת Plugins → Colocalization → Coloc 2.
4. הקצה את הערוצים המתאימים לניתוח ואפשר רגרסיית סף Costes בהגדרות התוסף. הרץ את הניתוח לפי תא.
5. רשמו את מקדמי החפיפה של מנדרס (M1 ו-M2) כדי להעריך את חלק האות בכל ערוץ שמתאים במרחב לשני.
6. הפעל אקראיות של Costes בהגדרות Coloc 2 וקבע את מספר האקראיות ל-50 כדי להעריך מובהקות סטטיסטית.

8. יצירת ליזאט תאים

1. תאי HeLa זרעים ב-DMEM עם 10% FBS ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2.
2. הוסיפו מעכב 50 ננומטר או נפח מקביל של DMSO לתאים 24 שעות לאחר הזרעה, ודגרו עוד 18 שעות בתנאי תרבית סטנדרטיים.
3. הסר את מדיום התרבית ושוטף תאים עם D-PBS מחומם מראש למשך 5 דקות, וטריפסיניז כדי להתנתק.
4. הקפאה טריפסיניזציה עם מדיום צמיחת תאים טרי וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את הסופרנטנט.
5. החזירו את כדור התא ל-D-PBS ובצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות כדי לשטוף את התאים. זרוק את הסופרנטנט.
6. החזירו את כדור התא לבופר פירוק מקורר מראש (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6, 150 מ"מ מ' נתרן כלורי, 0.1% SDS, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 2% CHAPS, 10 מ"מ TCEP, 1 מ"מ PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז אחד).
7. דגר ליזאטים על קרח למשך 20 דקות וסוניקט ליזאט באמבט מים קרח למשך 2 דקות כדי להבטיח ליזאט מלא.
8. הצנטריפוגה מבצעת ליזציה בטמפרטורה של 13,000 x g, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
9. העבר את הסופרנטנט הנקי לצינור טרי מקורר מראש לניתוח במורד הזרם.
   הערה: PMSF הוא רעיל ויש לטפל בו עם מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים. SDS הוא מגרה, וסוניקציה מייצרת חום ואירוסולים. בצע שלבי ליזיס וסוניקציה על הקרח ופעל לפי הנחיות בטיחות מוסדיות.

9. מבחן ברדפורד

1. הכינו סט תמיסות סטנדרטיות באמצעות BSA ב-0.15 M נתרן כלורי. הריכוזים הם: 0, 0.02 מ"ג/מ"ל, 0.04 מ"ג/מ"ל, 0.06 מ"ג/מ"ל, 0.08 מ"ג/מ"ל, 0.10 מ"ג/מ"ל.
2. דילל את ליזאט התא הלא ידוע פי 50 ו-100 פעמים ב-0.15 מ' נתרן כלוריד.
3. פיפטה משכפל כל תמיסת עקומה סטנדרטית ודגימות לא ידועות ללוח של 96 בארות.
4. הוסיפו תגובת ברדפורד לכל באר. לכל באר, יש להשתמש בתמיסת חלבון של 160 מיקרוליטר עם 40 מיקרוליטר 5x תגובת ברדפורד (זמינה מסחרית). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג.
5. דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ומדדו ספיגה ב-595 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
6. יצר עקומה סטנדרטית על ידי מיפוי ריכוזי BSA בציר ה-x והספיגה הממוצעת ב-595 ננומטר ממדידות שכפול בציר y.
7. קבעו את ריכוזי החלבון בדגימות באמצעות עקומת הסטנדרטית. הכפל ערכים מחושבים בפקטור הדילול כדי לקבל את הריכוז המקורי.

10. אימונובלוטינג

1. טעינו כמויות שוות של ליזאט תאים על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% והפרדו חלבונים באמצעות SDS-PAGE.
2. הפעל את ממברנת ה-PVDF על ידי טבילה קצרה באתנול. לאזן גם את נייר הממברנה וגם את ניירות ה-blowting בבופר ההעברה.
3. מעבירים חלבונים מהג'ל לממברנת PVDF באמצעות מערכת העברה חצי-יבשה.
4. חסמו את הממברנה בחלב יבש דל שומן של 5% (ללא חוב) ב-TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ערבוב עדין.
5. דגרו את הממברנה עם הנוגדן הראשי המדולל בבופר חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ערבוב עדין. השתמש ב-rabbit anti-ClpP (1:2000) ובאנטי-בטא-אקטין בעכבר (ACTB, 1:10,000).
6. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, 0.1% (v/v) בטווין 20, pH 7.6) למשך 5 דקות בכל שטיפה כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
7. דגרו את הממברנה בנוגדן משני מצ'וגט עם HRP מדולל בבופר חסימה (1:3000) בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ערבוב עדין.
8. חזור על שלב הכביסה.
9. לזהות רצועות חלבון באמצעות מגיבים לגילוי כימילומינצנטי.

11. ניתוח דנסיטומטרי

1. פתח את תמונת הכתם המערבי בפיג'י.
2. שנה את סוג התמונה ל-8 ביט לפי Image → סוג → 8 ביט.
3. חיסור את רקע התמונה על ידי Process → החסר רקע. בדוק את רקע האור והגדר את רדיוס כדור הגלגול ל-50.0 פיקסלים.
4. עגול את הרצועה בנתיב הראשון בעזרת כלי המלבן, ואז בחר → ניתוח הג'ל → בחר את הנתיב הראשון.
5. העבר את כלי המלבן לנתיב השני, ובחר לנתח → ג'ל → לבחור נתיב הבא. חזור על השלב הזה עד שכל הנתיבים נבחרים.
6. שרטט את צפיפות הרצועה על ידי ניתוח → ג'ל → מסלולי גרפ.
7. השתמש בכלי הקו הישר כדי לצייר קו בתחתית שיא צפיפות הרצועות, והשתמש בכלי השרביט כדי לקרוא את צפיפות הרצועות.
8. חזור על אותו הליך מהשלבים 11.1–11.8 על תמונת הבלוט של בקרת הטעינה.
9. דווח על צפיפות הפס היחסית על ידי חלוקת צפיפות (ClpP) בצפיפות (ACTB).

תוצאות

עיכוב ClpP משנה את המורפולוגיה והארגון של הרשת המיטוכונדריאלית
המורפולוגיה המטוכונדריאלית הוערכה כדי לקבוע האם עיכוב ClpP משנה את הארגון המיטוכונדריאלי בתאי HeLa. תמונות פלואורסצנציה מייצגות הראו הבדלים ברורים בארגון המיטוכונדריה בין תאי הביקורת לתאי FAM-FAPAL-CMK (איור 1A). ניתוח כמותי הראה כי שטח המיטוכונדריה ירד מ-1.15 ± 4.8 מיקרומטר² (n = 8013) בתאי ביקורת ל-0.47 ± 1.1 מיקרומטר² (n = 8516) לאחר טיפול במעכב. הפחתה...

דיון

הפפטידיל כלורומאתיל קטון FAPAL-CMK¹⁵ הוכח בעבר כמעכב בלתי הפיך פוטנציאלי של תת-יחידת הפרוטאז (ClpP) של פרוטאז התלוי ב-ATP המיטוכונדריאלי ClpXP. בעוד שהניסויים הקינטיים הדגימו את עוצמת המעכב ואת מנגנון הפעולה, הגישה במבחנה לא יכלה להעריך את יעילות FAPAL-CMK כמעכב ClpP מיטוכונדריאלי סלקטיבי בתאים שלמים. מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי אישר כי FAM-FAPAL-CMK היה ממוקם באופן סלקטיבי למיטוכונדריה, שם שוכן ClpP. מכיוון שלוקליזציה של מיטוכונדריה לבדה אינה קובעת מע...

חומרים

```html

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3

```