מחקר זה בוחן פגיעה ברירית הקיבה הקשורה לטיפול בקלופידוגרל בחולדות ובתאי אפיתליום של הקיבה, ומדגיש את הקשר שלה לשינויים מולקולריים הקשורים למעקה של הרשתית האנדופלזמית, לאפופטוזיס ולדלקת סיסטמית.
מאמר מחקר
פגיעה ברירית הקיבה המושרית על ידי קלופידוגרל הקשורה למצב של עקה של הרשת האנדופלזמית בחולדות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קלופידוגרל (Clopidogrel) נמצא בשימוש נרחב כסוכן אנטי-פלטלי למניעה וטיפול במחלות תרומבוטיות עורקיות, אך יישומו הקליני עשוי להיות מוגבל בשל תופעות לוואי במערכת העיכול, כולל פגיעה ברירית הקיבה. מכיוון שהישרדות תאי אפיתל חיונית לשמירה על שלמות רירית הקיבה, השבנו השערה כי פגיעה באפיתל הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל תלווה בשינויים במדדים הקשורים לעקה של הרשת האנדופלזמית (ER stress) ולאפופטוזיס. כדי לבחון השערה זו, תאי אפיתל קיבה אנושיים מסוג GES-1 טופלו בריכוזים שונים של קלופידוגרל, וחיוניות התאים, אפופטוזיס, התפלגות מחזור התא ושינויים מולקולריים הוערכו באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8), ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כמותית (qRT-PCR) ו-Western blotting. במקביל, חולל מודל של פגיעה בקיבה in vivo באמצעות מתן קלופידוגרל לחולדות Sprague-Dawley באמצעות זריקה לגרון (gavage). שינויים פתולוגיים ברירית הקיבה הוערכו על ידי צביעת hematoxylin and eosin, ורמות ציטוקינים דלקתיים בנסיוב נמדדו באמצעות תגובת ספיחה חיסונית למספר אנזימי (ELISA). קלופידוגרל הפחית את חיוניות תאי GES-1, קידם אפופטוזיס ושינה את התקדמות מחזור התא. בחולדות, קלופידוגרל גרם לשחיקה של רירית הקיבה, בצקת וחדירה של תאי דלקת, בליווי עלייה ברמות של interleukin (IL)-1β, IL-6 ו-tumor necrosis factor-α (TNF-α) בנסיוב. קלופידוגרל הגביר גם את הביטוי של מדדי עקה של ER, C/EBP homologous protein (CHOP) ו-activating transcription factor 5 (ATF5), הגביר את הביטוי של Bcl-2-associated X protein (Bax), הפחית את הביטוי של B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), והעלה את יחס ה-Bax/Bcl-2 הן ברקמות קיבה והן בתאי GES-1. ממצאים אלו מצביעים על כך שפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל קשורה לעלייה בביטוי מדדים הקשורים לעקה של ER ולשיבוש במאזן ה-Bax/Bcl-2, אם כי במחקר זה לא הוכח מסלול סיבתי ישיר של עקת ER ואפופטוזיס מיטוכונדריאלי.
מבוא
מערכות החיסון המולדות והסמנטיות של רירית הקיבה, המורכבות מתאים אפיתליאליים, תאי חיסון ומולקולות סיגנלינג, פועלות יחד כדי לשמור על שלמות הרירית ומשמשות כמחסום פיזיולוגי קריטי מפני גורמים מזיקים1,2. תפקוד הגנתי זה חיוני להומאוסטזיס של מערכת העיכול, ושיבושו עלול לתרום להתפתחות מחלות בקיבה, כולל גסטריטיס3. מבחינה קלינית, פגיעה ברירית הקיבה המושרית על ידי תרופות היא סיבוך נפוץ, כאשר תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות ותרופות נוגדות טסיות הן מהגורמים השכיחים ביותר4. שלמות רירית הקיבה תלויה באיזון דינמי בין התרבות תאים לאפופטוזיס5. חשיפה כרונית לגורמים סביבתיים, כולל תרופות, עלולה לשבש איזון זה, לעודד אפופטוזיס ולהוביל לפגיעה ברירית6,7. הרשת האנדופלזמית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירת ההומאוסטזיס התאי. בתנאים של סטרס תאי, הצטברות של חלבונים מקופלים באופן שגוי או לא מקופלים מפעילה את תגובת החלבונים הבלתי מקופלים (unfolded protein response), כולל סיגנלינג של PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, אשר עשוי לעודד אפופטוזיס ולשנות את הביטוי של חלבוני משפחת B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)8. ATF5 מעורב גם בתגובות לסטרס מיטוכונדריאלי ובקשר ההדדי בין תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לסטרס של הרשת האנדופלזמית9. ראיות קליניות אחרונות מצביעות על כך שטיפול נוגד טסיות מתמשך, כולל clopidogrel, קשור לפגיעה פרוגרסיבית ברירית הקיבה והמעי הדק10.
קלופידוגרל (Clopidogrel) הוא סוכן אנטי-פלאקטי הנרשם באופן נרחב, הדורש הפעלה מטבולית לפני קישור בלתי הפיך לקולטני P2Y12 של טבחיות, ובכך הוא מעכב אגרגציה של טבחיות המתווכת על ידי אדנוזין דיפוספאט ומייצר השפעות אנטי-תרומבוטיות11. ביו-אקטיבציה זו מתרחשת בעיקר באמצעות אנזימי cytochrome P450 בכבד. לפיכך, חשיפה ישירה של תאי אפיתל גסטריים בתרבית לתרכובת האם של קלופידוגרל אינה משחזרת את ההקשר המטבולי והפרמקוקינטי המלא של טיפול בקלופידוגרל in vivo. עם זאת, עדויות גוברות מצביעות על כך שטיפול בקלופידוגרל עשוי להיות קשור להישנות של כיבים בקיבה ולדימומים במערכת העיכול, מה שמדגיש את החשיבות של איזון בין יעילות אנטי-תרומבוטית לבטיחות גסטרו-אינטסטנלית12,13,14. למרות שתופעות לוואי אלו דווחו, המנגנונים העומדים בבסיס הפגיעה ברירית הקיבה הקשורה לקלופידוגרל נותרו לא מובנים במלואם, מה שמגביל את הפיתוח של אסטרטגיות מניעה וטיפול ממוקדות. במחקר הנוכחי, בחנו את ההשפעות של קלופידוגרל על רירית הקיבה באמצעות חולדות Sprague–Dawley ותאי GES-1. החולדות קיבלו קלופידוגרל באמצעות גבג' (gavage), וניסויים משלימים in vitro בוצעו באמצעות תאי GES-1. ניתוחים היסטופתולוגיים, מולקולריים ותאיים נערכו כדי לבדוק אם פגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל קשורה למצב של סטרס של הרשת האנדופלזמית ואפופטוזיס. בהתאם לכך, המחקר הנוכחי התמקד באפיון השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה גסטרית המושרה על ידי קלופידוגרל, ולא בביסוס מסלול איתות סיבתי. ממצאינו מספקים תובנה נוספת לגבי השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל ועשויים לתרום למחקרים עתידיים שמטרתם למנוע ולנהל תופעות לוואי אלו.
פרוטוקול
כל הנהלי הניסויים בבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבדיקת ניסויים בבעלי חיים של Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם. מספר אישור אתיקת בעלי החיים היה DRK-20251015210.
בעלי חיים וקווי תאים
האישור האתי כיסה את השימוש ב-20 חולדות Sprague–Dawley בדרגת SPF. בסך הכל 12 חולדות זכר Sprague–Dawley בדרגת SPF, בגילאי 6–8 שבועות ובמשקל של 280–300 g בתחילת הניסוי, נכללו במחקר הנוכחי. החולדות נרכשו מחברת Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (האנגג'ואו, סין; רישיון ייצור מספר SCXK [Zhejiang] 2024-0004) וחולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת ולקבוצה שטופלה ב-clopidogrel, עם שש חולדות בכל קבוצה. החולדות שוכנו בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של כ-22°C תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון סטנדרטי ומים לשתייה שעברו סטריליזציה. כל החולדות עברו תקופת אקלמיזציה של שבוע אחד לפני הניסוי. clopidogrel hydrogensulfate הושעה ב-0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) בריכוז של 0.781 mg/mL. חולדות בקבוצה שטופלה ב-clopidogrel קיבלו clopidogrel hydrogensulfate באמצעות הזנה פומית (oral gavage) במינון של 10 mL/kg משקל גוף (שווה ערך ל-1 mL/100 g משקל גוף ומינון של 7.81 mg/kg) פעם ביום למשך 3 ימים רצופים. חולדות בקבוצת הביקורת קיבלו נפח שווה של 0.5% CMC-Na. המינון ומשך הטיפול של 3 ימים נבחרו על בסיס מודל חולדה קצר-טווח שדווח בעבר למתן clopidogrel דרך הפה. לאחר ההזנה האחרונה ביום השלישי, המזון נמנע למשך 12 שעות, בעוד שמים סופקו ad libitum. החולדות הורדמו בתא השראה עם 3% isoflurane בחמצן, וההרדמה נשמרה עם 1.5%–2.0% isoflurane שהוגש באמצעות מסכת אף. עומק הרדמה מספק אושר על ידי היעדר רפלקסים של קרנית וכף הרגל. דם נאסף באמצעות דיקור לב סופי תחת הרדמה עמוקה. בעודן תחת הרדמה עמוקה, החולדות הומתו על ידי דימום עד המוות ולאחריו תורקומיות דו-צדדית (bilateral thoracotomy). המוות אושר על ידי היעדר נשימה ספונטנית ופעילות לבבית למשך 5 min לפחות, יחד עם היעדר רפלקסים של קרנית וכף הרגל. לאחר מכן הוצאה הקיבה במהירות, נפתחה לאורך העקמומיות הגדולה (greater curvature), ונשטפה בעדינות בתמיסת סליין קרה.
קו התאים האפיתליים של הרירית הקיבית האנושית GES-1 התקבל מ-iCell Bioscience Inc. (שנגחאי, סין; Cat. No. iCell-h062) ואומת על ידי הספק באמצעות פרופיל short tandem repeat. התאים תורבדו במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% penicillin–streptomycin באינקובטור לח במעמדות של 37°C עם 5% CO₂. לניסויים שימשו תאים במעברים מוקדמים, בין מעבר 3 למעבר 10. כאשר התאימות (confluence) של התאים הגיעה לכ-80%–90%, התאים הועברו למעבר ביחס פיצול של 1:3. לניסויים הבאים שימשו תאים שנמצאו בשלב גדילה לוגריתמי. עבור בדיקת CCK-8, התאים נזרעו לפלטות של 96 בארות בריכוז של 6 × 103 תאים/באר. עבור ניתוחי אפופטוזיס ומחזור התא, התאים נזרעו לפלטות של 6 בארות בריכוז של כ-5 × 105 תאים/באר והושארו להיצמד לפני הטיפול ב-clopidogrel.
כימיקלים ומحالולים
Clopidogrel hydrogensulfate (Cat. No. C874834; purity ≥ 99%) שימש בניסויי החיות והתאים. תמיסת סטוק של clopidogrel הוכנה על ידי המסה של 100 mg של אבקת clopidogrel ב-dimethyl sulfoxide (DMSO) לקבלת תמיסת סטוק בריכוז 1 M. תמיסת הסטוק דוללה עוד יותר לריכוזי העבודה הנדרשים לפני השימוש. תמיסת הסטוק בריכוז 1 M דוללה בסדרות עם DMSO להכנת תמיסות מינון של 1000× בריכוזים של 10, 100, 200, 400, 600, 800 ו-1000 mM. מיד לפני הטיפול, כל תמיסת מינון 1000× הוספה למצע גידול מלא ביחס של 1:1000 (v/v) לקבלת ריכוזי clopidogrel סופיים של 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ו-1.0 mM, בהתאמה. קבוצת ביקרת הנשאי (vehicle control) קיבלה נפח שווה של DMSO ללא clopidogrel. כך, ריכוז ה-DMSO הסופי נשמר ב-0.1% (v/v) בכל הקבוצות. תאי GES-1 בתרבית אינם משחזרים את הביו-אקטיבציה של clopidogrel המתווכת על ידי cytochrome P450 כבדי. לכן, טיפול ישיר ב-clopidogrel שימש כמודל חשיפה גישוש של התרכובת האב. טווח הריכוזים נבחר כדי לאפיין תגובות תאיות תלויות-ריכוז תחת התנאים הניסיוניים, ואין לפרשם כשוויים לריכוזים שניתן להשיג באופן קליני בפלזמה או ברקמת הקיבה.
תת-תרבית של תאים
מדיום מלא הוכן על ידי תוספת של FBS ופניצילין-סטרפטומייצין למדיום תרבית בסיסי. כאשר התהליכות (confluence) של התאים הגיעה לכ-80%, הוסר מדיום התרבית, והתאים נשטפו שלוש פעמים במי מלח פוספטה (PBS) סטריליים. לאחר מכן, התאים עוכרו באמצעות תמיסת trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) למשך כ-1–2 דקות. לאחר ניתוק חלקי של התאים, הוסף מדיום מלא כדי להפסיק את העיכול. תרחיף התאים סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 1,200 × g למשך 3 דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), משקע התאים הושעה מחדש ב-1–2 mL של מדיום מלא ונזרע בצלחות תרבית חדשות בהתאם לדרישות הניסוי.
בדיקת חיוניות תאים באמצעות CCK-8
תאי GES-1 בשלב גדילה לוגריתמי נזרעו לתוך פלטות 96-בארים בריכוז של 6 × 103 cells/well וגודלו במהלך הלילה כדי לאפשר היצמדות של התאים. לאחר ההיצמדות, התאים טופלו בריכוזים שונים של clopidogrel (0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, ו-1.0 mM) למשך 24 h. קבוצת הביקורת קיבלה את אותו ריכוז סופי של ה-vehicle. לאחר הטיפול, תמיסת CCK-8 הוספה לכל באר ודגרה ב-37°C בהתאם להוראות הערכה. הבליעה ב-450 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרופלטות. חיוניות התאים חושבה כאחוז מקבוצת הביקורת. בהתבסס על תוצאות תגובת הריכוז, נבחר טיפול ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h עבור ניתוחי האפופטוזיס, מחזור התא, qPCR ו-Western blot לאחר מכן.
ניתוח באמצעות פלואו-ציטומטריה
תאי GES-1 נזרעו לתוך פלטות בעלות 6 בארות וטופלו ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h לאחר היצמדות התאים. בעקבות הטיפול, נאספו הן תאים צפים והן תאים דבקים. התאים הדבקים עוכרו באמצעות trypsin ללא EDTA, נשטפו פעמיים ב-PBS קר, והושעו מחדש בבופר קישור (binding buffer). התאים נצבעו באמצעות ערכת Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit לפי הוראות היצרן. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר בחושך, תאים אפופטוטיים זוהו באמצעות ציטומטר זרימה מסוג RaiseCyte 2L6C. הנתונים נרכשו באמצעות תוכנת הרכישה RaiseFlower ונולאו באמצעות תוכנת FlowJo (גרסה 10.8.1). אוכלוסיות של תאים באפופטוזה מוקדמת, אפופטוזה מאוחרת ואפופטוזה כוללת נמדדו באמצעות תוכנת FlowJo.
ניתוח פלוב תומטרי של התפלגות מחזור התא
תאי GES-1 נזרעו בלוחות בעלי 6 בארות וטופלו ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h. לאחר הטיפול, התאים נאספו, נשטפו ב-PBS וקובעו באתנול 70% שסונקק מראש ב-4°C. התאים המקובעים נשטפו לאחר מכן כדי להסיר שאריות אתנול והודגרו עם RNase A ותמיסת צביעה של propidium iodide בחושך, בהתאם להוראות היצרן. התפלגות מחזור התא נותחה באמצעות ציטומטר זרימה. הנתונים נרכשו באמצעות תוכנת הרכישה ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. התפלגויות מחזור התא הותאמו למודל Watson, וחושבו האחוזים של התאים בשלבי G0/G1, S ו-G2/M.
PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)
RNA כולל הוצא מהתאי GES-1 וממדגימות של רקמת קיבה של חולדה באמצעות ערכה להוצאת RNA בהתאם להוראות הערכה. עבור מדגמי רקמה, רקמות רירית הקיבה נאספו במהירות, הומוגניזויות בתנאי טמפרטורה נמוכה, והועברו להוצאת RNA. ריכוז ה-RNA ודרגת הטוהר שלו נקבעו על ידי מדידת הבליעה ב-260 ו-280 nm. כמויות שוות של RNA עברו שעתוק הפוך ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכה לשעתוק הפוך הכוללת הסרה של DNA גנומי. PCR כמותי בזמן אמת (Quantitative real-time PCR) בוצע באמצעות תערובת PCR (master mix) מבוססת SYBR Green. כל תגובה בוצעה בנפח כולל של 20 µL הכולל 10 µL של 2× master mix, 1 µL של cDNA, 0.4 µL של פריימר קדמי (forward primer), 0.4 µL של פריימר אחורי (reverse primer), ו-8.2 µL של ddH₂O נטול RNase. תנאי המחזור התרמי היו כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 10 min, ולאחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 10 s, התאמה (annealing) ב-60°C למשך 30 s, והארכה ב-72°C למשך 30 s. רמות הביטוי של CHOP, ATF5, Bcl-2, ו-Bax נקבעו. GAPDH שימש כגנה פנימי של ייחוס. ביטוי גנים יחסי חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. רצפי הפריימרים מופיעים ב-Supplementary Table 1.
בלוט מערבי (Western Blot)
חלבון כולל הופק מתאי GES-1 ומדגימות של רקמת קיבה של חולדה. עבור דגימות תאים, תאי GES-1 שעברו טיפול נשטפו ב-PBS קר ועברו ליזיס באמצעות באפר ליזיס מסוג radioimmunoprecipitation assay (RIPA) המכיל מעכב פרוטאז. עבור דגימות רקמה, רקמות רירית הקיבה עברו הומוגניזציה בבאפר RIPA בתנאי טמפרטורה נמוכה ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה לאיסוף הסופרנאטנט. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חלבון BCA. כמות כוללת של 20 µg חלבון לכל נתיב הופרדה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) והועברה לממברנות polyvinylidene difluoride (PVDF). לאחר חסימה עם bovine serum albumin (BSA), הממברנות דגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), ו-β-actin (1:5000). לאחר שטיפה, הממברנות דגרו עם הנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים ל-horseradish peroxidase (1:10000). פסי חלבון הודגמו באמצעות ריאגנט chemiluminescence משופר ונלכדו באמצעות מערכת דימוי של chemiluminescence. עוצמות הפסים כומתו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות ונורמלו ל-β-actin.
הערכה היסטופתולוגית
דגימות רקמה מהקיבה נאספו מחולדות Sprague–Dawley לאחר טיפול ב-clopidogrel וקובעו בפורמלין ניטרלי בבופר בריכוז 10%. הדגימות עברו דהידרציה, הבהרה, טמיעה בפרפין וחיתוך בעובי של 4 µm. חיתוכי הפרפין נצבעו ב-hematoxylin and eosin. שינויים היסטופתולוגיים הוערכו איכותית תחת מיקרוסקופ אורה על סמך מורפולוגיית הרירית, שלמות האפיתל, בצקת והסננה של תאי דלקת. תמונות מייצגות צולמו. לא הוחל שום שיטת דירוג היסטולוגית.
אימונוהיסטוכימיה
חתכים של רקמת קיבה הטמblowים בפרפין עברו דפרפיניזציה ב-xylene ודהידרציה מחדש באמצעות סדרת אתנול בריכוזים מדורגים. שחזור אנטיגן המושרה בחום בוצע בבופר ציטראט. פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה באמצעות hydrogen peroxide בריכוז 3% למשך 10 min, וקישור לא ספציפי נחסם באמצעות סרום עיזים רגיל למשך 30 min בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החתכים דגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP, ATF5, Bcl-2, ו-Bax. לאחר שטיפה ב-PBS, החתכים דגרו עם הנוגדן המשני התואם המצומד ל-horseradish peroxidase. אותות אימונוראקטיביים הודגמו באמצעות תמיסה כרומוגנית של DAB, ולאחריה צביעה נגדית ב-hematoxylin. החתכים עברו דהידרציה, הבהרה, הרכבה ונבחנו תחת מיקרוסקופ אור. תמונות מייצגות צולמו, ושטח הצביעה החיובי כומת באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.
צביעה אימונופלואורסצנטית
חתכים של רקמת קיבה בקיבוע פאראפין עברו דה-פאראפיניזציה, רהידרציה ושחזור אנטיגנים מושרה בחום בבופר ציטראט. לאחר חסימה עם סרום עזים נורמלי למשך 30 דקות, הוחדרו החתכים ללילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) ו-Bax (1:200). לאחר שטיפה ב-PBS, הוחדרו החתכים עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים תואמים (1:500) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן צבעו בצביעה נגדית עם DAPI. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של ×200. שלושה שדות שאינם חופפים שנבחרו באופן אקראי מכל חיה נותחו באמצעות Image-Pro Plus 6.0, ועוצמת הפלואורסצנציה בוטאה כ-IOD/Area. שלושה בעלי חיים לכל קבוצה נכללו בניתוח.
בדיקת ספיחה חיסונית עם אנזים מקושר (ELISA)
דגימות דם נאספו מחולדות Sprague–Dawley לאחר הטיפול והושארו לקרישה בטמפרטורת החדר. סרום הופרד באמצעות סנטריפוגציה ואוחסן ב-−80°C עד למועד האנליזה. רמות הסרום של IL-1β, IL-6 ו-TNF-α נמדדו באמצעות ערכות ELISA בהתאם להוראות הערכה. הבליעה נמדדה באמצעות קורא מיקרו-פלטה, וריכוזי הציטוקינים חושבו על פי עקומות הסטנדרט.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. נורמליות והומוגניות של השונות הוערכו באמצעות מבחן Shapiro–Wilk ומבחן Levene, בהתאמה. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות t-test של Student. השוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו מבחן post hoc של Dunnett. ערך של P < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. כל ניסויי התאים בוצעו באמצעות לפחות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות.
תוצאות
קלופידוגרל (Clopidogrel) מפחית את חיות תאי GES-1 ומגביר אפופטוזה In Vitro
בדקנו תחילה האם קלופידוגרל (clopidogrel) משפיע על חיוניות התאים ואפופטוזה של תאי GES-1. בדיקות CCK-8 הראו כי טיפול בקלופידוגרל הפחית באופן משמעותי את חיוניות תאי GES-1 (איור 1A,B), מה שמעיד על ירידה בחיוניות התאים. בהתבס על הירידה הכללית בחיוניות התאים לאורך טווח הריכוזים שנבדקו, נבחר ריכוז של 0.1 mM קלופידוגרל למשך 24 שעות עבור כל ניסויי התאים הבאים. לאחר מכן בוצעה ציטומטריה זורמת (Flow cytometry) כדי לנתח את האפופטוזה ואת התפלגות מחזור התא (איור 1C–F). ניתוח הציטומטריה הזורמת הראה פרופורציה מוגברת של תאים בשלב S, בליווי ירידה באוכלוסיית G0/G1 וללא עלייה ניכרת באוכלוסיית G2/M, מה שמעיד על הצטברות בשלב S ולא על עיכוב בשלב G2/M. התוצאות הדגימו כי קלופידוגרל הגביר באופן משמעותי את האפופטוזה ושינה את התפלגות מחזור התא בתאי GES-1 בהשוואה לקבוצת הביקורת. יחד, ממצאים אלו מעידים כי קלופידוגרל מפחית את חיוניות תאי GES-1 ומקושר להגברת האפופטוזה ולשינויים בהתקדמות מחזור התא. ממצאים אלו מדגימים תגובות ציטוטוקסיות בעקבות חשיפה ישירה לתרכובת האב של הקלופידוגרל תחת התנאים הניסויים שנבחרו. הם אינם קובעים כי השפעות דומות מתרחשות ברמות חשיפה רלוונטיות מבחינה קלינית או כי התגובות שנצפו מתווכות על ידי המטבוליט הפעיל של הקלופידוגרל.
איור 1קלופידוגרל (Clopidogrel) מפחית את חיוניות תאי GES-1 ומגביר אפופטוזה. (Aנבדקה חיוניות התאים של שורת תאי אפיתל קיבה אנושיים GES-1 באמצעות מבחן CCK-8, לאחר טיפול בריכוזים עולים של קלופידוגרל (0–1.0 mM) למשך 24 שעות.Bהשוואה כמותית של חיוניות התאים בין קבוצת הביקורת לקבוצה שטופלה ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 שעות.C) פרופילי מחזור תאים מייצגים מניתוח בציטומטריה של זרימה באמצעות מודל ווטסון. (ד'כימות אחוזי התאים בשלבי G0/G1, S ו-G2/M. טיפול בקלופידוגרל (Clopidogrel) העלה את אוכלוסיית שלב S ללא עלייה ניכרת באוכלוסיית שלב G2/M.ה_) תרשימי פיזור (dot plots) מייצגים של ציטומטריה של זרימה המראים אפופטוזיס לאחר צביעה ב-Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) ובפרופידיום יודיד (PI). (Fכימות של אוכלוסיית התאים האפופטוטיים הכוללת. כל ניסויי התאים בוצעו באמצעות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות השוואה לקבוצת הביקורת. ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
פגיעה קיבה המושרית על ידי קלופידוגרל קשורה לדלקת מערכתית
חולקים של Sprague–Dawley חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת וקבוצה שטופלה בקלופידוגרל שקיבלה מתן תרופה יומית באמצעות זונדה (gavage). מינון הקלופידוגרל ומשטר הטיפול בן 3 הימים נבחרו על בסיס מודל חולקים שדווח בעבר לפגיעה בקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל16. לאחר 3 ימים, נאספו רקמות מהקיבה לצורך צביעת hematoxylin and eosin (H&E). בדיקה היסטופתולוגית חשפה שחיקות של רירית הקיבה, בצקת וחדירה של תאי דלקת בקבוצה שטופלה בקלופידוגרל בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2A). רמות ציטוקיני דלקת בסרום נמדדו באמצעות ELISA. הקבוצה שטופלה בקלופידוגרל הראתה רמות סרום גבוהות משמעותית של interleukin (IL)-1β, IL-6, ו-tumor necrosis factor-α (TNF-α) מאשר קבוצת הביקורת (איור 2B–D). ממצאים אלו מעידים כי טיפול בקלופידוגרל קשור לפגיעה ברירית הקיבה ולהגברה של תגובות דלקת מערכתיות15,16.
איור 2קלופידוגרל (Clopidogrel) גורם לפגיעה ברירית הקיבה ומעלה את רמות הציטוקינים הדלקתיים במחזור הדם בחולדות. (A) תמונות מייצגות של צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E)&חתכים של רירית הקיבה מהצבעת HE של חולדות Sprague–Dawley מקבוצת הביקורת ומקבוצה שטופלה בקלופידוגרל (clopidogrel). הבדיקה ההיסטולוגית מראה מבנה שימור של רירית הקיבה בקבוצת הביקורת ושינויים מורפולוגיים בקבוצה שטופלה בקלופידוגרל. חצים צהובים מצביעים על תאי אפיתל של רירית הקיבה, חצים אדומים מצביעים על גודש מוקדי בתוך שכבת הרירית, וחצים שחורים מצביעים על חדירה קלה של תאי דלקת. הגדלה מקורית, 20$\times$; סרגל קנה מידה = 100 µmn = 6 בעלי חיים לקבוצה. (B–Dריכוזי סרום של אינטרלוקין (IL)-1β, IL-6 וגורם נמק גידול-α (TNF-α) נמדדו באמצעות ספיחה חיסונית מקושרת לאנזים (ELISA). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n = 6 חיות לכל קבוצה.P < 0.01 בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
קלופידוגרל משנה סממנים הקשורים למתח של רשת האנדופלזמית (ER stress) ולאפופטוזיס ברירית הקיבה של חולדה
על מנת לחקור שינויים מולקולריים הקשורים לפגיעה בקיבה המושרית על ידי clopidogrel, בוצע צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכי רקמת קיבה. תמונות מייצגות הראו צביעה חזקה יותר של CHOP, ATF5 ו-Bax בקבוצה שטופלה ב-clopidogrel מאשר בקבוצת הביקורת, בעוד שצביעת Bcl-2 נראתה חלשה יותר (איור 3A). ניתוח כמותי של IOD/area הדגים כי צביעת CHOP, ATF5 ו-Bax עלתה באופן משמעותי בעקבות טיפול ב-clopidogrel (איור 3B,C,E). צביעת Bcl-2 הראתה מגמת ירידה, אם כי ההבדל לא הגיע למשמעות סטטיסטית (איור 3D). תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול ב-clopidogrel קשור לביטוי משתנה של חלבונים הקשורים למעקה ולאפופטוזיס ברירית הקיבה של חולדה. ניתוח אימונופלואורסצנציה הראה אותים חזקים יותר של CHOP ו-ATF5 ברקמת רירית הקיבה מהקבוצה שטופלה ב-clopidogrel. ניתוח כמותי אישר עליות משמעותיות ב-CHOP (איורים 4A ו-5A) וב-ATF5 (איורים 4B ו-5B), בעוד ש-Bcl-2 (איורים 4C ו-5C) ו-Bax (איורים 4D ו-5D) הראו מגמות ירידה ועלייה, בהתאמה, ללא הגעה למשמעות סטטיסטית. יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שטיפול ב-clopidogrel קשור לביטוי משתנה של סמנים הקשורים למעקה של ER ולאפופטוזיס ברירית הקיבה של חולדה.
איור 3זיהוי אימונוהיסטוכימי של חלבונים הקשורים למתח ברשת האנדופלזמית ולאפופטוזה ברקמת קיבה. (A) תמונות ממייצגות של צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבון הומולוגי ל-C/EBP (CHOP), גורם שעתוק מפעיל 5 (ATF5), Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), וחלבון Bax (Bcl-2-associated X protein) ברקמת רירית הקיבה של חולדות Sprague–Dawley מקבוצת הביקורת ומחולדות שטופלו בקלופידוגרל. צביעה חומה מעידה על תגובתיות אימונית חיובית, והגרעינים נצבעו בצביעה נגדית של המטוקסילן. התמונות המוצגות מייצגות את כל הדגימות שנותחו, כאשר שלוש חיות נכללו בכל קבוצה. הגדלה מקורית, 20×; סרגל קנה מידה = 100 µm. (ב–ה) ניתוח כמותי של צפיפות אופטית משולבת ליחידת שטח (IOD/Area) עבור CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax, בהתאמה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. *P < 0.05 ו-**P < 0.01 בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4גילוי באמצעות אימונופלואורסצנציה של חלבונים הקשורים למסלולי אפופטוזיס ומצבי עקה של הסבך התוך-פלזמי ברקמה קיבה. תמונות אימונופלורסצנציה מייצגות המראות את הלוקליזציה של חלבון הומולוגי ל-C/EBP (CHOP), גורם שעתוק מפעיל 5 (ATF5), Bcl-2 של לימפומה של תאי B, וחלבון Bax הקשור ל-Bcl-2 ברקמת רירית של קיבה מחולבני Sprague–Dawley מקבוצת הביקורת ומחולבנים שטופלו בקלופידוגרל. גרעינים נצבעו בצביעה נגדית ב-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (בכחול), וצביעת אימונופלורסצנציה חיובית מוצגת באדום. תמונות ממוזגות מוצגות בעמודה הימנית.A) CHOP. (B) ATF5. (C(Bcl-2).ד') Bax. הגדלה מקורית, 20×; סרגל קנה מידה = 100 µmהתמונות המוצגות מייצגות את כל הדגימות שנותחו, כאשר n = 3 בעלי חיים לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5ניתוח כמותי של אימונופלואורסצנציה עבור חלבונים הקשורים למשק לאנדופלזמי ולסמרטות ברקמה של הקיבה. (א–דכימות של הצפיפות האופטית המשולבת ליחידת שטח (IOD/Area) עבור החלבון ההומולוגי ל-C/EBP (CHOP), גורם שעתוק 5 המפעיל (ATF5), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), וחלבון Bax המשויך ל-Bcl-2, ברקמה של רירית הקיבה מחולדות Sprague–Dawley מקבוצת הביקורת ומחולדות שטופלו בקלופידוגרל (clopidogrel). עבור כל חיה, נותחו שלושה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי וללא חפיפה לכל חיתוך רקמה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, והערך הממוצע שימש לניתוח סטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n = 3 חיות לקבוצה. *P < 0.05 ו-**P < 0.01 בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
קלופידוגרל משנה את ביטוי הגנים והחלבונים הקשורים למתרחשות סטרס של ER ולאפופטוזה בתאי GES-1 וברקמה קיבה של חולדה
מחקרים קודמים הצביעו על כך שסטרס של הרשת האנדופלזמית (ER stress) ממלא תפקיד מרכזי בתגובות למעוכה תאית ובאפופטוזה17,18. כדי להעריך שינויים במסמנים הקשורים לסטרס של ה-ER בעקבות טיפול בקלופידוגרל, נבדק הביטוי של CHOP ו-ATF5 בתאי GES-1. בדיקת qRT-PCR הדגימה ביטוי מוגבר של mRNA של CHOP ו-ATF5 בעקבות הטיפול בקלופידוגרל. ניתוח Western blot אישר באופן נוסף ביטוי מוגבר של החלבונים CHOP ו-ATF5 (איור 6A–E). לאחר מכן הוערך הביטוי של חלבונים הקשורים לאפופטוזה בתאי GES-1 וברקמה קיבבית של חולדה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הטיפול בקלופידוגרל העלה את ביטוי Bax והפחית את ביטוי Bcl-2, מה שהוביל ליחס Bax/Bcl-2 מוגבר (איור 6A–J). דפוסי ביטוי אלה נצפו באופן עקבי הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון בתאי GES-1 וברקמה קיבבית של חולדה. יחד, ממצאים אלו מדגימים כי טיפול בקלופידוגרל קשור לשינוי בביטוי של מסמנים הקשורים לסטרס של ה-ER ולאפופטוזה בשני המודלים הניסיוניים.
איור 6ביטוי של סמנים הקשורים למתח של הרשת האנדופלזמית ולאפופטוזה בתאי GES-1 וברקומת קיבה של חולדה לאחר טיפול בקלופידוגרל. (א–דביטוי יחסי של RNA שליח (mRNA) של חלבון הומולוגי ל-C/EBP (CHOP), גורם שעתוק פעיל 5 (ATF5), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) וחלבון Bax (Bcl-2-associated X protein) בקו תאי אפיתל של קיבה אנושית GES-1, שנקבע באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כמותית (qRT-PCR).ה) תמונות Western blot מייצגות עם כימות דנסומוטרי תואם של ביטוי החלבונים CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax בתאי GES-1. רמות ביטוי החלבונים נורמלו ל-β-actin. ניסויי התאים בוצעו באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות (n = 3). (F–Iביטוי mRNA יחסי של CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax ברקמה קיבה של חולדה, כפי שנקבע באמצעות qRT-PCR.ג') תמונות מייצגות של Western blot עם כימות דנסیتומטרי תואם של ביטוי החלבונים CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax ברקמת קיבה של חולדה. רמות ביטוי החלבונים נורמלו ל-β-actin. ניסויי הרקמה כללו n = 3 בעלי חיים לכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי השוואה לקבוצת הביקורת. *P < 0.05, **P < 0.01, ו-***P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
בסיכומו של דבר, התוצאות מדגימות כי טיפול ב-clopidogrel הפחית את חיוניות תאי GES-1, הגביר אפופטוזיס, שינה את הביטוי של סמנים הקשורים למצוק ER ולאפופטוזיס, והיה קשור לפגיעה ברירית הקיבה בליווי עלייה ברמות של ציטוקינים דלקתיים במחזור הדם בחולדות. ממצאים אלו תומכים בהשערת המחקר הגורסת כי טיפול ב-clopidogrel קשור לפגיעה ברירית הקיבה ולשינויים נלווים בסמנים הקשורים למצוק ER ולאפופטוזיס.
זמינות נתונים:
כל הנתונים שהופקו או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר זה ובחומרי ההשלמה שלו. רצפי הפריימרים ששימשו עבור RT-PCR מופיעים ב-Supplementary Table 1. הנתונים הגולמיים התומכים בכל האיורים ובפאנלים של האיורים, כולל מערכי נתונים ניסיוניים מקוריים וקבצי מקור, מסופקים בארכיון השלמה הנלווה של Raw Data (קובץ ZIP).
טבלה משלימה 1. רצפי הפריימרים ששימשו לאנליזת RT-PCR. רצפי הפריימרים קדמי (F) ואחורי (R) ששימשו לניתוח RT-PCR של GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax במחקר זה מפורטים בכיוון 5′–3′.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
קלופידוגרל (Clopidogrel) נמצא בשימוש נרחב למניעה ולטיפול במחלות קרדיווסקולריות; עם זאת, השימוש הקליני בו קשור לסיכוני דימום ולסיבוכים בדרכי העיכול, כולל כיבים פפטיים, דימומים ופרפורציות19. לכן, הבנת השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה בקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל היא חשובה לשיפור המניעה והניהול של תופעות לוואי אלו. במחקר הנוכחי, בחנו את ההשפעות של קלופידוגרל על תאי אפיתל של הקיבה ועל רקמת קיבה של חולדה, ובחנו שינויים בבריאות התאים, באפופטוזיס, בתגובות דלקתיות ובביטוי של סמנים הקשורים למעקה של הרשת האנדופלזמית (ER stress) ולאפופטוזיס. ממצאים אלו מצביעים על כך שפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל קשורה לשינויים בביטוי של סמני ER stress ואפופטוזיס. עם זאת, מכיוון שלא בוצעו ניסויי הצלה פרמקולוגיים או ניסויי אובדן תפקוד גנטי (loss-of-function), ממצאים אלו אינם מבססים קשר סיבתי בין ER stress לאפופטוזיס.
מחקרים קודמים הצביעו על כך שקלופידוגרל (clopidogrel) עשוי לפגוע בתיקונו של רירית הקיבה ולהעכביב את הריפוי של כיברי קיבה20. במחקר הנוכחי, בדיקות CCK-8 הראו כי קלופידוגרל הפחית את חיותם של תאי GES-1, ומדידה בציטומטריה של זרימה (flow cytometry) הדגימה אפופטוזה מוגברת ושינוי בהתקדמות מחזור התא (איור 1). ממצאים אלו עולים בקנה אחד עם דיווחים קודמים על אפופטוזה המושרית על ידי קלופידוגרל בתאי אפיתל של הקיבה21. תצפיות אלו מרמזות כי טיפול בקלופידוגרל קשור לפגיעה בחיות תאי אפיתל הקיבה ולעלייה באפופטוזה, דבר שעשוי לתרום לפגיעה ברירית הקיבה11. במודל של חולדות, צביעת H&E הדגימה פגיעה ברירית הקיבה בעקבות טיפול בקלופידוגרל (איור 2A). רמות הסרום של IL-1β, IL-6 ו-TNF-α עלו באופן מובהק אף הן (איור 2B–D), מה שמעיד על תגובה דלקתית הקשורה לפגיעה ברירית הקיבה22. בנוסף, ניתוחים אימונוהיסטוכימיים וניתוחי אימונופלואורסצנציה הדגימו ביטוי משתנה של סממנים הקשורים למצב של ER stress ולאפופטוזה ברקמת קיבה מחולדות שטופלו בקלופידוגרל בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3, איור 4, איור 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 ו-Bax הם רגולטורים חשובים של תגובות למעקה תאי ואפופטוזיס23,24,25,26. במחקר זה, טיפול ב-clopidogrel היה קשור לעליה בביטוי של CHOP ו-ATF5 ולשינוי בביטוי של Bax ו-Bcl-2 הן בתאי GES-1 והן ברקמת קיבה של חולדה (איור 6). ממצאים אלו מעידים על שינויים מקבילים במדדים הקשורים למעקה ולאפופטוזיס. עם זאת, המחקר הנוכחי העריך שינויים בביטוי בלבד ולא קבע אם מולקולות אלו מתווכות באופן ישיר את הפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי clopidogrel. בדומה לכך, למרות שנצפתה עלייה ביחס Bax/Bcl-2, המחקר לא הדגים באופן ישיר הפעלה של מסלול האפופטוזיס המיטוכונדריאלי. לפיכך, יש לפרש ממצאים אלו כהקשרים ולא כראיה למנגנון איתות סיבתי.
המחקר הנוכחי משלב מודל חולדות in vivo עם ניסויי חשיפה ישירה גששים בתאי GES-1 כדי להעריך את השינויים המורפולוגיים והמולקולריים הקשורים לטיפול בקלופידוגרל (clopidogrel). מודל ה-in vivo מספק את הראיה הראשית לפגיעה ברירית הקיבה, בעוד שניסויי ה-GES-1 מספקים ראיות תומכות לגבי תגובות תאיות בעקבות חשיפה ישירה לתרכובת האב. השילוב של ניתוח היסטופתולוגי, מדידת ציטוקינים דלקתיים, אימונוהיסטוכימיה, אימונופלואורסצנציה, qRT-PCR ו-Western blotting מאפשר הערכה מקיפה של שינויים מורפולוגיים ומולקולריים הקשורים לפגיעה בקיבה. גישה ניסויית זו עשויה להועיל לחקירת ההשפעות על מערכת העיכול של סוכנים אנטי-פלטלטיים ולהערכת התערבויות הגנה פוטנציאליות במחקרים עתידיים.
יש להכיר בכמה מגבלות. Clopidogrel הוא פרו-תרופה (prodrug) הדורשת הפעלה מטבולית כבדית, בעוד שחשיפה ישירה של תאי GES-1 לתרכובת המקורית אינה משחזרת תהליך זה או משקפת באופן מלא את הפארמקוקינטיקה הקלינית. בנוסף, הריכוזים הגבוהים יחסית ששימשה במבחנה (in vitro) עשויים היו לגרום לציטוטוקסיות לא ספציפית. לפיכך, יש לראות בניסויי GES-1 כראיות גששיות לתגובות תאיות בתנאי חשיפה ישירה. בדיקת CCK-8 לא כללה בקרת חיוביות להפחתת חיוניות התאים, מה שהגביל את האימות העצמאי של ביצועי הבדיקה. המנגנונים שמעלה האחראים לשינויים הקשורים למעקה ER (ER stress) שנצפו לא נחקרו, ולא בוצעו ניסויי עיכוב פרמקולוגי, השתקת גנים (gene knockdown) או השבתת גנים (gene knockout) כדי לקבוע האם מעקה ER מווסת באופן ישיר את האיזון בין Bax/Bcl-2 ואת האפופטוזיס. מחקרים עתידיים צריכים להשוות בין התרכובת המקורית לבין המטבוליט הפעיל שלה, לשלב מערכת הפעלה מטבולית מתאימה, ולבצע ניסויי התערבות תפקודיים כדי להבהיר קשרים אלה. בנוסף, לא נכללה בקרת חיוביות מוכרת להשראת אפופטוזיס בבדיקת Annexin V-FITC/PI. לפיכך, למרות שטיפול ב-clopidogrel היה קשור לעלייה באוכלוסיית התאים החיוביים ל-Annexin V בהשוואה לבקרת הווקטור (vehicle control), הביצועים הטכניים של בדיקת האפופטוזיס לא אומתו באופן עצמאי באמצעות תנאי בקרת חיוביות. מחקרים עתידיים צריכים לכלול משרה של אפופטוזיס, כגון staurosporine, באותה סדרת ניסויים.
לסיכום, טיפול פומי ב-clopidogrel גרם לפגיעה ברירית הקיבה בחולדות ולווה בשינויים במדדים הקשורים ל-ER stress ולאפופטוזיס. חשיפה ישירה של תאי GES-1 לתרכובת האב clopidogrel הפחיתה גם היא את חיוניות התאים ושינתה מדדים מולקולריים קשורים תחת התנאים הניסיוניים. עם זאת, מכיוון שמודל התאים אינו משחזר ביו-אקטיבציה כבדית ונעשה שימוש בריכוזים גבוהים יחסית, לא ניתן להשליך את הממצאים in vitro באופן ישיר על חשיפה קלינית, ולא ניתן לשלול ציטוטוקסיות לא ספציפית. באופן כללי, הממצאים מעידים כי פגיעה ברירית הקיבה המושרית על ידי clopidogrel קשורה לשינויים בביטוי של מדדים הקשורים ל-ER stress ולאפופטוזיס, אם כי נדרשים מחקרים מכניסטיים נוספים כדי לבסס קשרי סיבתיות.
גילויים
ניגוד עניינים:
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים ידועים או מערכות יחסים אישיות שעלולות היו להשפיע על העבודה המדווחת במחקר זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט "מחקר בסיסי על נתיב השיגנלינג CHOP/ATF5/Bcl-2 באפופטוזיס של תאי אפיתל של רירית הקיבה המושרה על ידי Clopidogrel" (מספר פרויקט 2023BWKY009).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכה לזיהוי אפופטוזיס באמצעות Annexin V-FITC/PI | Elabscience | E-CK-A211 | ערכה לזיהוי אפופטוזה |
| נוגדן ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | נוגדן ראשוני |
| ערכה לבדיקת חלבון BCA | Solarbio | PC0020 | בדיקת ריכוז חלבון |
| נוגדן Bax | Proteintech | 50599-1-AP | נוגדן ראשוני |
| נוגדן Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | נוגדן ראשוני |
| βנוגדן -actin | Proteintech | 66009-1-Ig | נוגדן ראשוני |
| בופר חסימה | Beyotime | P0252 | תמיסת חסימה ל-Western blot |
| ערכה לספירת תאים CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | בדיקת חיוניות תאים |
| ערכה לסינתזת cDNA | TransGen Biotech | AU341 | ערכה לסינתזת cDNA של הגדיל הראשון עם הסרה של DNA גנומי |
| ערכה לזיהוי מחזור התא | Lianke Biotechnology | CCS012 | ערכה לניתוח מחזור התא |
| נוגדן CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | נוגדן ראשוני |
| קלופידוגרל מידרוגןסולפיה (דרגת טוהר ≥99%) | מקליין | C874834 | תרופה ניסיונית |
| ערכה לצביעה בכרומוגן DAB | Beyotime | P0201M | מצע לאימונוהיסטוכימיה |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | ממס |
| ריאגנט לכימילומינצנציה משופרת (ECL) | Meilunbio | MA0186 | מצע כימילומנסנטי |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Gibco | 10099-141 | תוסף לתרבית תאים |
| קו תאי אפיתל של קיבה אנושית GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | שורת תאי אפיתל גסטריים אנושיים |
| המטוקסילין ואוזין (H&E)&ה) ערכה לצביעה | Beyotime | C0105S | צביעה היסטולוגית |
| נוגדן משני המשוייך לHorseradish Peroxidase (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | נוגדן משני |
| תמיסת מימון חמצן (מי חמצן) | אבסין | ABS9333-100mL | ריאגנט לחסימת פרוקסידאז אנדוגנית |
| IL-1β ערכה ל-ELISA | MEIMIAN | MM-0047R2 | בדיקת ציטוקינים בסרום |
| ערכה לבדיקת ELISA ל-IL-6 | מיימיאן (MEIMIAN) | MM-0190R2 | בדיקת ציטוקינים בסרום |
| קורא מיקרופלטה | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | מדידת בליעה |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומייסין | Solarbio | P1400 | תמיסת אנטיביוטיקה |
| סליין בבופר פוספטי (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | 1× PBS |
| ממברנת פוליוינילידן דיפלואוריד (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | ממברנת Western blot |
| מדלל לנוגדן ראשוני | Beyotime | P0023A | מדלל נוגדנים |
| סולם משקל מולקולרי של חלבונים | Yeasen | WJ103 | סולם חלבונים צבוע מראש |
| תערובת מאסטר ל-PCR כמותי בזמן אמת (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | ריאגנט ל-qPCR |
| בופר ליזיס לשיטת Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) | Solarbio | R0010 | בופר למיצוי חלבונים |
| RNase A | Lianke Biotechnology | CCS012 | ריאגנט לניתוח מחזור התא |
| מצע RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | תווך בסיסי לתרבית תאים |
| חולדות Sprague-Dawley | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | לא רלוונטי | דרגת SPF |
| TNF-α ערכה ל-ELISA | מיימיאן | MM-0180R2 | בדיקת ציטוקינים בסרום |
| ערכה למיצוי RNA כולל | TransGen Biotech | ER501-01 | ערכה להפקת RNA |
| תמיסת Trypsin-EDTA | Solarbio | T1300 | ריאגנט לפירוק תאים |
מקורות
- Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
- Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
- Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
- Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
- Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
- Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
- Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
- Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
- Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
- He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
- Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
- Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
- Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
- Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
- Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
- Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
- Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
- Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
- Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
- Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
- Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
- Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
- Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
- Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
- Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
- Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב