הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

פגיעה ברירית הקיבה המושרית על ידי קלופידוגרל הקשורה למצב של עקה של הרשת האנדופלזמית בחולדות

65 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72097

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, Dagang Hospital of Binhai New Area, 2Clinical Laboratory, Tianjin Adicon Clinical Laboratories Co., Ltd.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן פגיעה ברירית הקיבה הקשורה לטיפול בקלופידוגרל בחולדות ובתאי אפיתליום של הקיבה, ומדגיש את הקשר שלה לשינויים מולקולריים הקשורים למעקה של הרשתית האנדופלזמית, לאפופטוזיס ולדלקת סיסטמית.

תקציר

קלופידוגרל (Clopidogrel) נמצא בשימוש נרחב כסוכן אנטי-פלטלי למניעה וטיפול במחלות תרומבוטיות עורקיות, אך יישומו הקליני עשוי להיות מוגבל בשל תופעות לוואי במערכת העיכול, כולל פגיעה ברירית הקיבה. מכיוון שהישרדות תאי אפיתל חיונית לשמירה על שלמות רירית הקיבה, השבנו השערה כי פגיעה באפיתל הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל תלווה בשינויים במדדים הקשורים לעקה של הרשת האנדופלזמית (ER stress) ולאפופטוזיס. כדי לבחון השערה זו, תאי אפיתל קיבה אנושיים מסוג GES-1 טופלו בריכוזים שונים של קלופידוגרל, וחיוניות התאים, אפופטוזיס, התפלגות מחזור התא ושינויים מולקולריים הוערכו באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8), ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כמותית (qRT-PCR) ו-Western blotting. במקביל, חולל מודל של פגיעה בקיבה in vivo באמצעות מתן קלופידוגרל לחולדות Sprague-Dawley באמצעות זריקה לגרון (gavage). שינויים פתולוגיים ברירית הקיבה הוערכו על ידי צביעת hematoxylin and eosin, ורמות ציטוקינים דלקתיים בנסיוב נמדדו באמצעות תגובת ספיחה חיסונית למספר אנזימי (ELISA). קלופידוגרל הפחית את חיוניות תאי GES-1, קידם אפופטוזיס ושינה את התקדמות מחזור התא. בחולדות, קלופידוגרל גרם לשחיקה של רירית הקיבה, בצקת וחדירה של תאי דלקת, בליווי עלייה ברמות של interleukin (IL)-1β, IL-6 ו-tumor necrosis factor-α (TNF-α) בנסיוב. קלופידוגרל הגביר גם את הביטוי של מדדי עקה של ER, C/EBP homologous protein (CHOP) ו-activating transcription factor 5 (ATF5), הגביר את הביטוי של Bcl-2-associated X protein (Bax), הפחית את הביטוי של B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), והעלה את יחס ה-Bax/Bcl-2 הן ברקמות קיבה והן בתאי GES-1. ממצאים אלו מצביעים על כך שפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל קשורה לעלייה בביטוי מדדים הקשורים לעקה של ER ולשיבוש במאזן ה-Bax/Bcl-2, אם כי במחקר זה לא הוכח מסלול סיבתי ישיר של עקת ER ואפופטוזיס מיטוכונדריאלי.

מבוא

מערכות החיסון המולדות והסמנטיות של רירית הקיבה, המורכבות מתאים אפיתליאליים, תאי חיסון ומולקולות סיגנלינג, פועלות יחד כדי לשמור על שלמות הרירית ומשמשות כמחסום פיזיולוגי קריטי מפני גורמים מזיקים1,2. תפקוד הגנתי זה חיוני להומאוסטזיס של מערכת העיכול, ושיבושו עלול לתרום להתפתחות מחלות בקיבה, כולל גסטריטיס3. מבחינה קלינית, פגיעה ברירית הקיבה המושרית על ידי תרופות היא סיבוך נפוץ, כאשר תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות ותרופות נוגדות טסיות הן מהגורמים השכיחים ביותר4. שלמות רירית הקיבה תלויה באיזון דינמי בין התרבות תאים לאפופטוזיס5. חשיפה כרונית לגורמים סביבתיים, כולל תרופות, עלולה לשבש איזון זה, לעודד אפופטוזיס ולהוביל לפגיעה ברירית6,7. הרשת האנדופלזמית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירת ההומאוסטזיס התאי. בתנאים של סטרס תאי, הצטברות של חלבונים מקופלים באופן שגוי או לא מקופלים מפעילה את תגובת החלבונים הבלתי מקופלים (unfolded protein response), כולל סיגנלינג של PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, אשר עשוי לעודד אפופטוזיס ולשנות את הביטוי של חלבוני משפחת B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)8. ATF5 מעורב גם בתגובות לסטרס מיטוכונדריאלי ובקשר ההדדי בין תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לסטרס של הרשת האנדופלזמית9. ראיות קליניות אחרונות מצביעות על כך שטיפול נוגד טסיות מתמשך, כולל clopidogrel, קשור לפגיעה פרוגרסיבית ברירית הקיבה והמעי הדק10.

קלופידוגרל (Clopidogrel) הוא סוכן אנטי-פלאקטי הנרשם באופן נרחב, הדורש הפעלה מטבולית לפני קישור בלתי הפיך לקולטני P2Y12 של טבחיות, ובכך הוא מעכב אגרגציה של טבחיות המתווכת על ידי אדנוזין דיפוספאט ומייצר השפעות אנטי-תרומבוטיות11. ביו-אקטיבציה זו מתרחשת בעיקר באמצעות אנזימי cytochrome P450 בכבד. לפיכך, חשיפה ישירה של תאי אפיתל גסטריים בתרבית לתרכובת האם של קלופידוגרל אינה משחזרת את ההקשר המטבולי והפרמקוקינטי המלא של טיפול בקלופידוגרל in vivo. עם זאת, עדויות גוברות מצביעות על כך שטיפול בקלופידוגרל עשוי להיות קשור להישנות של כיבים בקיבה ולדימומים במערכת העיכול, מה שמדגיש את החשיבות של איזון בין יעילות אנטי-תרומבוטית לבטיחות גסטרו-אינטסטנלית12,13,14. למרות שתופעות לוואי אלו דווחו, המנגנונים העומדים בבסיס הפגיעה ברירית הקיבה הקשורה לקלופידוגרל נותרו לא מובנים במלואם, מה שמגביל את הפיתוח של אסטרטגיות מניעה וטיפול ממוקדות. במחקר הנוכחי, בחנו את ההשפעות של קלופידוגרל על רירית הקיבה באמצעות חולדות Sprague–Dawley ותאי GES-1. החולדות קיבלו קלופידוגרל באמצעות גבג' (gavage), וניסויים משלימים in vitro בוצעו באמצעות תאי GES-1. ניתוחים היסטופתולוגיים, מולקולריים ותאיים נערכו כדי לבדוק אם פגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל קשורה למצב של סטרס של הרשת האנדופלזמית ואפופטוזיס. בהתאם לכך, המחקר הנוכחי התמקד באפיון השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה גסטרית המושרה על ידי קלופידוגרל, ולא בביסוס מסלול איתות סיבתי. ממצאינו מספקים תובנה נוספת לגבי השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה ברירית הקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל ועשויים לתרום למחקרים עתידיים שמטרתם למנוע ולנהל תופעות לוואי אלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלי הניסויים בבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבדיקת ניסויים בבעלי חיים של Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם. מספר אישור אתיקת בעלי החיים היה DRK-20251015210.

בעלי חיים וקווי תאים

האישור האתי כיסה את השימוש ב-20 חולדות Sprague–Dawley בדרגת SPF. בסך הכל 12 חולדות זכר Sprague–Dawley בדרגת SPF, בגילאי 6–8 שבועות ובמשקל של 280–300 g בתחילת הניסוי, נכללו במחקר הנוכחי. החולדות נרכשו מחברת Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (האנגג'ואו, סין; רישיון ייצור מספר SCXK [Zhejiang] 2024-0004) וחולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת ולקבוצה שטופלה ב-clopidogrel, עם שש חולדות בכל קבוצה. החולדות שוכנו בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של כ-22°C תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון סטנדרטי ומים לשתייה שעברו סטריליזציה. כל החולדות עברו תקופת אקלמיזציה של שבוע אחד לפני הניסוי. clopidogrel hydrogensulfate הושעה ב-0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) בריכוז של 0.781 mg/mL. חולדות בקבוצה שטופלה ב-clopidogrel קיבלו clopidogrel hydrogensulfate באמצעות הזנה פומית (oral gavage) במינון של 10 mL/kg משקל גוף (שווה ערך ל-1 mL/100 g משקל גוף ומינון של 7.81 mg/kg) פעם ביום למשך 3 ימים רצופים. חולדות בקבוצת הביקורת קיבלו נפח שווה של 0.5% CMC-Na. המינון ומשך הטיפול של 3 ימים נבחרו על בסיס מודל חולדה קצר-טווח שדווח בעבר למתן clopidogrel דרך הפה. לאחר ההזנה האחרונה ביום השלישי, המזון נמנע למשך 12 שעות, בעוד שמים סופקו ad libitum. החולדות הורדמו בתא השראה עם 3% isoflurane בחמצן, וההרדמה נשמרה עם 1.5%–2.0% isoflurane שהוגש באמצעות מסכת אף. עומק הרדמה מספק אושר על ידי היעדר רפלקסים של קרנית וכף הרגל. דם נאסף באמצעות דיקור לב סופי תחת הרדמה עמוקה. בעודן תחת הרדמה עמוקה, החולדות הומתו על ידי דימום עד המוות ולאחריו תורקומיות דו-צדדית (bilateral thoracotomy). המוות אושר על ידי היעדר נשימה ספונטנית ופעילות לבבית למשך 5 min לפחות, יחד עם היעדר רפלקסים של קרנית וכף הרגל. לאחר מכן הוצאה הקיבה במהירות, נפתחה לאורך העקמומיות הגדולה (greater curvature), ונשטפה בעדינות בתמיסת סליין קרה.

קו התאים האפיתליים של הרירית הקיבית האנושית GES-1 התקבל מ-iCell Bioscience Inc. (שנגחאי, סין; Cat. No. iCell-h062) ואומת על ידי הספק באמצעות פרופיל short tandem repeat. התאים תורבדו במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% penicillin–streptomycin באינקובטור לח במעמדות של 37°C עם 5% CO₂. לניסויים שימשו תאים במעברים מוקדמים, בין מעבר 3 למעבר 10. כאשר התאימות (confluence) של התאים הגיעה לכ-80%–90%, התאים הועברו למעבר ביחס פיצול של 1:3. לניסויים הבאים שימשו תאים שנמצאו בשלב גדילה לוגריתמי. עבור בדיקת CCK-8, התאים נזרעו לפלטות של 96 בארות בריכוז של 6 × 103 תאים/באר. עבור ניתוחי אפופטוזיס ומחזור התא, התאים נזרעו לפלטות של 6 בארות בריכוז של כ-5 × 105 תאים/באר והושארו להיצמד לפני הטיפול ב-clopidogrel.

כימיקלים ומحالולים

Clopidogrel hydrogensulfate (Cat. No. C874834; purity ≥ 99%) שימש בניסויי החיות והתאים. תמיסת סטוק של clopidogrel הוכנה על ידי המסה של 100 mg של אבקת clopidogrel ב-dimethyl sulfoxide (DMSO) לקבלת תמיסת סטוק בריכוז 1 M. תמיסת הסטוק דוללה עוד יותר לריכוזי העבודה הנדרשים לפני השימוש. תמיסת הסטוק בריכוז 1 M דוללה בסדרות עם DMSO להכנת תמיסות מינון של 1000× בריכוזים של 10, 100, 200, 400, 600, 800 ו-1000 mM. מיד לפני הטיפול, כל תמיסת מינון 1000× הוספה למצע גידול מלא ביחס של 1:1000 (v/v) לקבלת ריכוזי clopidogrel סופיים של 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ו-1.0 mM, בהתאמה. קבוצת ביקרת הנשאי (vehicle control) קיבלה נפח שווה של DMSO ללא clopidogrel. כך, ריכוז ה-DMSO הסופי נשמר ב-0.1% (v/v) בכל הקבוצות. תאי GES-1 בתרבית אינם משחזרים את הביו-אקטיבציה של clopidogrel המתווכת על ידי cytochrome P450 כבדי. לכן, טיפול ישיר ב-clopidogrel שימש כמודל חשיפה גישוש של התרכובת האב. טווח הריכוזים נבחר כדי לאפיין תגובות תאיות תלויות-ריכוז תחת התנאים הניסיוניים, ואין לפרשם כשוויים לריכוזים שניתן להשיג באופן קליני בפלזמה או ברקמת הקיבה.

תת-תרבית של תאים

מדיום מלא הוכן על ידי תוספת של FBS ופניצילין-סטרפטומייצין למדיום תרבית בסיסי. כאשר התהליכות (confluence) של התאים הגיעה לכ-80%, הוסר מדיום התרבית, והתאים נשטפו שלוש פעמים במי מלח פוספטה (PBS) סטריליים. לאחר מכן, התאים עוכרו באמצעות תמיסת trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) למשך כ-1–2 דקות. לאחר ניתוק חלקי של התאים, הוסף מדיום מלא כדי להפסיק את העיכול. תרחיף התאים סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 1,200 × g למשך 3 דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), משקע התאים הושעה מחדש ב-1–2 mL של מדיום מלא ונזרע בצלחות תרבית חדשות בהתאם לדרישות הניסוי.

בדיקת חיוניות תאים באמצעות CCK-8

תאי GES-1 בשלב גדילה לוגריתמי נזרעו לתוך פלטות 96-בארים בריכוז של 6 × 103 cells/well וגודלו במהלך הלילה כדי לאפשר היצמדות של התאים. לאחר ההיצמדות, התאים טופלו בריכוזים שונים של clopidogrel (0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, ו-1.0 mM) למשך 24 h. קבוצת הביקורת קיבלה את אותו ריכוז סופי של ה-vehicle. לאחר הטיפול, תמיסת CCK-8 הוספה לכל באר ודגרה ב-37°C בהתאם להוראות הערכה. הבליעה ב-450 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרופלטות. חיוניות התאים חושבה כאחוז מקבוצת הביקורת. בהתבסס על תוצאות תגובת הריכוז, נבחר טיפול ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h עבור ניתוחי האפופטוזיס, מחזור התא, qPCR ו-Western blot לאחר מכן.

ניתוח באמצעות פלואו-ציטומטריה

תאי GES-1 נזרעו לתוך פלטות בעלות 6 בארות וטופלו ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h לאחר היצמדות התאים. בעקבות הטיפול, נאספו הן תאים צפים והן תאים דבקים. התאים הדבקים עוכרו באמצעות trypsin ללא EDTA, נשטפו פעמיים ב-PBS קר, והושעו מחדש בבופר קישור (binding buffer). התאים נצבעו באמצעות ערכת Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit לפי הוראות היצרן. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר בחושך, תאים אפופטוטיים זוהו באמצעות ציטומטר זרימה מסוג RaiseCyte 2L6C. הנתונים נרכשו באמצעות תוכנת הרכישה RaiseFlower ונולאו באמצעות תוכנת FlowJo (גרסה 10.8.1). אוכלוסיות של תאים באפופטוזה מוקדמת, אפופטוזה מאוחרת ואפופטוזה כוללת נמדדו באמצעות תוכנת FlowJo.

ניתוח פלוב תומטרי של התפלגות מחזור התא

תאי GES-1 נזרעו בלוחות בעלי 6 בארות וטופלו ב-0.1 mM clopidogrel למשך 24 h. לאחר הטיפול, התאים נאספו, נשטפו ב-PBS וקובעו באתנול 70% שסונקק מראש ב-4°C. התאים המקובעים נשטפו לאחר מכן כדי להסיר שאריות אתנול והודגרו עם RNase A ותמיסת צביעה של propidium iodide בחושך, בהתאם להוראות היצרן. התפלגות מחזור התא נותחה באמצעות ציטומטר זרימה. הנתונים נרכשו באמצעות תוכנת הרכישה ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. התפלגויות מחזור התא הותאמו למודל Watson, וחושבו האחוזים של התאים בשלבי G0/G1, S ו-G2/M.

PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

RNA כולל הוצא מהתאי GES-1 וממדגימות של רקמת קיבה של חולדה באמצעות ערכה להוצאת RNA בהתאם להוראות הערכה. עבור מדגמי רקמה, רקמות רירית הקיבה נאספו במהירות, הומוגניזויות בתנאי טמפרטורה נמוכה, והועברו להוצאת RNA. ריכוז ה-RNA ודרגת הטוהר שלו נקבעו על ידי מדידת הבליעה ב-260 ו-280 nm. כמויות שוות של RNA עברו שעתוק הפוך ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכה לשעתוק הפוך הכוללת הסרה של DNA גנומי. PCR כמותי בזמן אמת (Quantitative real-time PCR) בוצע באמצעות תערובת PCR (master mix) מבוססת SYBR Green. כל תגובה בוצעה בנפח כולל של 20 µL הכולל 10 µL של 2× master mix, 1 µL של cDNA, 0.4 µL של פריימר קדמי (forward primer), 0.4 µL של פריימר אחורי (reverse primer), ו-8.2 µL של ddH₂O נטול RNase. תנאי המחזור התרמי היו כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 10 min, ולאחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 10 s, התאמה (annealing) ב-60°C למשך 30 s, והארכה ב-72°C למשך 30 s. רמות הביטוי של CHOP, ATF5, Bcl-2, ו-Bax נקבעו. GAPDH שימש כגנה פנימי של ייחוס. ביטוי גנים יחסי חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. רצפי הפריימרים מופיעים ב-Supplementary Table 1.

בלוט מערבי (Western Blot)

חלבון כולל הופק מתאי GES-1 ומדגימות של רקמת קיבה של חולדה. עבור דגימות תאים, תאי GES-1 שעברו טיפול נשטפו ב-PBS קר ועברו ליזיס באמצעות באפר ליזיס מסוג radioimmunoprecipitation assay (RIPA) המכיל מעכב פרוטאז. עבור דגימות רקמה, רקמות רירית הקיבה עברו הומוגניזציה בבאפר RIPA בתנאי טמפרטורה נמוכה ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה לאיסוף הסופרנאטנט. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חלבון BCA. כמות כוללת של 20 µg חלבון לכל נתיב הופרדה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) והועברה לממברנות polyvinylidene difluoride (PVDF). לאחר חסימה עם bovine serum albumin (BSA), הממברנות דגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), ו-β-actin (1:5000). לאחר שטיפה, הממברנות דגרו עם הנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים ל-horseradish peroxidase (1:10000). פסי חלבון הודגמו באמצעות ריאגנט chemiluminescence משופר ונלכדו באמצעות מערכת דימוי של chemiluminescence. עוצמות הפסים כומתו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות ונורמלו ל-β-actin.

הערכה היסטופתולוגית

דגימות רקמה מהקיבה נאספו מחולדות Sprague–Dawley לאחר טיפול ב-clopidogrel וקובעו בפורמלין ניטרלי בבופר בריכוז 10%. הדגימות עברו דהידרציה, הבהרה, טמיעה בפרפין וחיתוך בעובי של 4 µm. חיתוכי הפרפין נצבעו ב-hematoxylin and eosin. שינויים היסטופתולוגיים הוערכו איכותית תחת מיקרוסקופ אורה על סמך מורפולוגיית הרירית, שלמות האפיתל, בצקת והסננה של תאי דלקת. תמונות מייצגות צולמו. לא הוחל שום שיטת דירוג היסטולוגית.

אימונוהיסטוכימיה

חתכים של רקמת קיבה הטמblowים בפרפין עברו דפרפיניזציה ב-xylene ודהידרציה מחדש באמצעות סדרת אתנול בריכוזים מדורגים. שחזור אנטיגן המושרה בחום בוצע בבופר ציטראט. פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה באמצעות hydrogen peroxide בריכוז 3% למשך 10 min, וקישור לא ספציפי נחסם באמצעות סרום עיזים רגיל למשך 30 min בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החתכים דגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP, ATF5, Bcl-2, ו-Bax. לאחר שטיפה ב-PBS, החתכים דגרו עם הנוגדן המשני התואם המצומד ל-horseradish peroxidase. אותות אימונוראקטיביים הודגמו באמצעות תמיסה כרומוגנית של DAB, ולאחריה צביעה נגדית ב-hematoxylin. החתכים עברו דהידרציה, הבהרה, הרכבה ונבחנו תחת מיקרוסקופ אור. תמונות מייצגות צולמו, ושטח הצביעה החיובי כומת באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.

צביעה אימונופלואורסצנטית

חתכים של רקמת קיבה בקיבוע פאראפין עברו דה-פאראפיניזציה, רהידרציה ושחזור אנטיגנים מושרה בחום בבופר ציטראט. לאחר חסימה עם סרום עזים נורמלי למשך 30 דקות, הוחדרו החתכים ללילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) ו-Bax (1:200). לאחר שטיפה ב-PBS, הוחדרו החתכים עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים תואמים (1:500) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן צבעו בצביעה נגדית עם DAPI. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של ×200. שלושה שדות שאינם חופפים שנבחרו באופן אקראי מכל חיה נותחו באמצעות Image-Pro Plus 6.0, ועוצמת הפלואורסצנציה בוטאה כ-IOD/Area. שלושה בעלי חיים לכל קבוצה נכללו בניתוח.

בדיקת ספיחה חיסונית עם אנזים מקושר (ELISA)

דגימות דם נאספו מחולדות Sprague–Dawley לאחר הטיפול והושארו לקרישה בטמפרטורת החדר. סרום הופרד באמצעות סנטריפוגציה ואוחסן ב-−80°C עד למועד האנליזה. רמות הסרום של IL-1β, IL-6 ו-TNF-α נמדדו באמצעות ערכות ELISA בהתאם להוראות הערכה. הבליעה נמדדה באמצעות קורא מיקרו-פלטה, וריכוזי הציטוקינים חושבו על פי עקומות הסטנדרט.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. נורמליות והומוגניות של השונות הוערכו באמצעות מבחן Shapiro–Wilk ומבחן Levene, בהתאמה. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות t-test של Student. השוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו מבחן post hoc של Dunnett. ערך של P < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. כל ניסויי התאים בוצעו באמצעות לפחות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קלופידוגרל (Clopidogrel) מפחית את חיות תאי GES-1 ומגביר אפופטוזה In Vitro

בדקנו תחילה האם קלופידוגרל (clopidogrel) משפיע על חיוניות התאים ואפופטוזה של תאי GES-1. בדיקות CCK-8 הראו כי טיפול בקלופידוגרל הפחית באופן משמעותי את חיוניות תאי GES-1 (איור 1A,B), מה שמעיד על ירידה בחיוניות התאים. בהתבס על הירידה הכללית בחיוניות התאים לאורך טווח הריכוזים שנבדקו, נבחר ריכוז של 0.1 mM קלופידוגרל למשך 24 שעות עבור כל ניסויי התאים הבאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קלופידוגרל (Clopidogrel) נמצא בשימוש נרחב למניעה ולטיפול במחלות קרדיווסקולריות; עם זאת, השימוש הקליני בו קשור לסיכוני דימום ולסיבוכים בדרכי העיכול, כולל כיבים פפטיים, דימומים ופרפורציות19. לכן, הבנת השינויים המולקולריים הקשורים לפגיעה בקיבה המושרה על ידי קלופידוגרל היא חשובה לשיפור המניעה והניהול של תופעות לוואי אלו. במחקר הנוכחי, בחנו את ההשפעות של קלופידוגרל על תאי אפיתל של הקיבה ועל רקמת קיבה של חולדה, ובחנו שינויים בבריאות התאים, באפופטוזיס, בתגובות דלקתיות ובביטוי של סמנים הקשורים למעקה של הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ניגוד עניינים:

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים ידועים או מערכות יחסים אישיות שעלולות היו להשפיע על העבודה המדווחת במחקר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט "מחקר בסיסי על נתיב השיגנלינג CHOP/ATF5/Bcl-2 באפופטוזיס של תאי אפיתל של רירית הקיבה המושרה על ידי Clopidogrel" (מספר פרויקט 2023BWKY009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכה לזיהוי אפופטוזיס באמצעות Annexin V-FITC/PIElabscienceE-CK-A211ערכה לזיהוי אפופטוזה
נוגדן ATF5Proteintech67066-1-APנוגדן ראשוני
ערכה לבדיקת חלבון BCASolarbioPC0020בדיקת ריכוז חלבון
נוגדן BaxProteintech50599-1-APנוגדן ראשוני
נוגדן Bcl-2Proteintech26593-1-APנוגדן ראשוני
βנוגדן -actinProteintech66009-1-Igנוגדן ראשוני
בופר חסימהBeyotimeP0252תמיסת חסימה ל-Western blot
ערכה לספירת תאים CCK-8KeyGen BiotechKGA317בדיקת חיוניות תאים
ערכה לסינתזת cDNATransGen BiotechAU341ערכה לסינתזת cDNA של הגדיל הראשון עם הסרה של DNA גנומי
ערכה לזיהוי מחזור התאLianke BiotechnologyCCS012ערכה לניתוח מחזור התא
נוגדן CHOPProteintech15204-1-APנוגדן ראשוני
קלופידוגרל מידרוגןסולפיה (דרגת טוהר ≥99%)מקלייןC874834תרופה ניסיונית
ערכה לצביעה בכרומוגן DABBeyotimeP0201Mמצע לאימונוהיסטוכימיה
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)MedChemExpressHY-Y0320Cממס
ריאגנט לכימילומינצנציה משופרת (ECL)MeilunbioMA0186מצע כימילומנסנטי
סרום עגל עוברי (FBS)Gibco10099-141תוסף לתרבית תאים
קו תאי אפיתל של קיבה אנושית GES-1iCell BioscienceiCell-h062שורת תאי אפיתל גסטריים אנושיים
המטוקסילין ואוזין (H&E)&ה) ערכה לצביעהBeyotimeC0105Sצביעה היסטולוגית
נוגדן משני המשוייך לHorseradish Peroxidase (HRP)ProteintechRGAM001/RGAR001נוגדן משני
תמיסת מימון חמצן (מי חמצן)אבסיןABS9333-100mLריאגנט לחסימת פרוקסידאז אנדוגנית
IL-1β ערכה ל-ELISAMEIMIANMM-0047R2בדיקת ציטוקינים בסרום
ערכה לבדיקת ELISA ל-IL-6מיימיאן (MEIMIAN)MM-0190R2בדיקת ציטוקינים בסרום
קורא מיקרופלטהBeijing Liuyi BiotechnologyWD-2102Bמדידת בליעה
תמיסת פניצילין-סטרפטומייסיןSolarbioP1400תמיסת אנטיביוטיקה
סליין בבופר פוספטי (PBS)ServicebioG4202-500ML1× PBS
ממברנת פוליוינילידן דיפלואוריד (PVDF)MilliporeIPVH00010ממברנת Western blot
מדלל לנוגדן ראשוניBeyotimeP0023Aמדלל נוגדנים
סולם משקל מולקולרי של חלבוניםYeasenWJ103סולם חלבונים צבוע מראש
תערובת מאסטר ל-PCR כמותי בזמן אמת (SYBR Green)CWBioCW3008ריאגנט ל-qPCR
בופר ליזיס לשיטת Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA)SolarbioR0010בופר למיצוי חלבונים
RNase ALianke BiotechnologyCCS012ריאגנט לניתוח מחזור התא
מצע RPMI-1640ServicebioG4535-500MLתווך בסיסי לתרבית תאים
חולדות Sprague-DawleyHangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.לא רלוונטידרגת SPF
TNF-α ערכה ל-ELISAמיימיאןMM-0180R2בדיקת ציטוקינים בסרום
ערכה למיצוי RNA כוללTransGen BiotechER501-01ערכה להפקת RNA
תמיסת Trypsin-EDTASolarbioT1300ריאגנט לפירוק תאים

מקורות

  1. Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
  2. Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
  3. Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
  4. Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
  5. Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
  6. Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
  7. Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
  8. Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
  9. Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
  10. He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
  11. Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
  12. Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
  13. Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
  14. Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
  15. Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
  16. Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
  17. Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
  18. Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
  19. Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
  20. Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
  21. Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
  22. Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
  23. Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
  24. Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
  25. Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
  26. Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פגיעה בקיבה המושרית על ידי Clopidogrelתאי GES-1סמני אפופטוזיסבדיקת חיוניות תאיםציטומטריה זרימהWestern Blotציטוקינים דלקתייםיחס Bax/Bcl-2

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.