פרופיל סיבים אלסטיים ברקמת ריאה באמצעות ניתוחי דימות כמותיים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת רקמות לצורך הדמיית סיבים אלסטיים ופרופיל כמותי ברקמת ריאות עכברים. שיטה זו מאפשרת הערכה מעמיקה של ארכיטקטורת הרקמות, ארגון סיבים מרחבי ועיצוב מחדש של מטריצות חוץ-תאיות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

תקציר

עיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית הריאתית (ECM) הוא מאפיין מרכזי של פגיעות ומחלות ריאות. סיבים אלסטיים הם מרכיב מרכזי ב-ECM של הריאות, ומספקים עמידות ורתע הנחוצים לתפקוד נשימתי תקין, וההפרעה שלהם תורמת לפגיעה במכניקת הרקמות. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה חזק וניתן לשחזור להכנת וניתוח רקמת ריאות עכברים, עם דגש על הדמיה ופרופיל כמותי של סיבים אלסטיים. הוא מפרט שיטות עיבוד רקמות וצביעה היסטולוגיות מיטביות לשימור וזיהוי מבני אלסטין. בנוסף, הפרוטוקול מפרט צינור ניתוח תמונה המאפשר הערכה כמותית של שפע הסיבים האלסטיים, הארגון וההתפלגות המרחבית בתוך הריאה. תהליך העבודה כולל גם הערכת וקטור צבע ב-QuPath, דה-קונבולוציה של צבע בפיג'י/ImageJ, וניתוח תמונות מבוסס TWOMBLI כדי לאפשר הערכה כמותית של שפע הסיבים האלסטיים, ההסתעפות ומורכבות הרשת. אסטרטגיות לרכישת תמונה, בחירת אזורי עניין, אופטימיזציה של פרמטרים ובקרת איכות כלולות כדי להבטיח שחזוריות ולהפחית הטיה תלויה במשתמש. באמצעות תהליך עבודה זה, זיהינו בהצלחה שינויים בארגון הסיבים האלסטיים ובארכיטקטורת הרשת בריאות של עכברים שמנים, מה שהוכיח את יישומם לזיהוי שיפוץ ECM הקשור למחלה. יחד, גישות אלו מספקות מסגרת מקיפה לחקר שיפוץ סיבים אלסטיים ותרומתו לארכיטקטורת הרקמות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. שיטה זו מקלה על חקר שינויים מבניים מונעים על ידי פיברובלסטים ותומכת בתובנות מכניות לגבי שינויים ב-ECM הבסיסיים למחלות ריאות.

מבוא

סיבים אלסטיים הם רכיבים חיוניים במטריצה החוץ-תאית הריאתית (ECM), המורכבת בעיקר מאלסטין וחלבוני מיקרופיברילריה נלווים שמתאספים לרשתות מסודרות ועמידות מאוד¹. בריאה, סיבים אלסטיים מסודרים לאורך מחיצת האלוואולריה ומבנים סביב הברונכיאליים, שם הם מספקים את האלסטיות והרתע הנדרשים למכניקת נשימה רגילה ^1,2. כאחד המרכיבים המבניים הנפוצים ביותר ב-ECM ברקמות כמו הריאה, האאורטה והרחם, שלמותה קריטית לשמירה על עמידה ברקמה ^1,2. הפרעות בארגון הסיבים האלסטיים נצפתה במגוון מחלות ריאות, כולל פיברוזיס, אמפיזמה ומצבים דלקתיים כרוניים, כאשר שינוי במבנה הסיבים תורם לפגיעה בתפקוד הריאות ^{ובתכונות} מכניות^.

המטריזום הריאתי אופיין לאחרונה, וחשף חלבוני ECM ליבה כגון קולגנים ולמינינים, יחד עם רכיבים הקשורים למטריזום כולל ציטוקינים, רגולטורים של ECM וחלבונים הקשורים ל-ECM (למשל, ליגנדים של אינטגרין, גלקטינים)^4,5. מעבר לתמיכה מבנית, רכיבים אלו מווסתים באופן פעיל את תפקוד הרקמה ויוצרים נישות מיוחדות התומכות בתאים תושבים ומהגרים ^6,7. ראוי לציין כי מחקרים עדכניים הדגישו כי מצבים מטבוליים כמו השמנת יתר קשורים לשינויים משמעותיים בארגון הסיבים האלסטיים, המקשרים בין דיסרגולציה מטבולית מערכתית לשינויים במבנה ECM הריאתי ובתפקוד הפיברובלסטים³. ממצאים אלו מדגישים את חשיבות ההבנה של שיפוץ סיבים אלסטיים כתהליך דינמי ורלוונטי למחלות.

הערכה קונבנציונלית של סיבים אלסטיים מתבססת לעיתים קרובות על הערכה היסטולוגית איכותית, מערכות ניקוד חצי-כמותיות, או מדידות של שפע אלסטין, המספקות מידע מוגבל לגבי ארגון סיבים, קישוריות ומורכבות רשת ^8,9. בעוד שגישות אלו שימושיות לזיהוי שינויים גסים בתכולת האלסטין, ייתכן שהן לא לוכדות שינויים אדריכליים עדינים הקשורים לשיפוץ רקמות. ניתוחים כמותיים מבוססי תמונה יכולים להתגבר על מגבלות אלו על ידי אפשרות לאפיון אובייקטיבי וניתן לשחזור של רשתות סיבים אלסטיות ולהקל על השוואות בין תנאים ומחקרים ניסיוניים. כדי להתמודד עם זה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח משולב של ארגון ECM ריאתי עם דגש מיוחד על ארכיטקטורת סיבים אלסטיים. בנוסף לגישות מבוססות לאפיון ECM ^4,5, תהליך זה כולל צביעת אלסטיקה וצינור ניתוח תמונות מבוסס TWOMBLI עם¹⁰ תמונות המותאמות לארכיטקטורת רקמת הריאות. על ידי שילוב צביעת אלסטיקה עם ניתוח רשת כמותי, תהליך עבודה זה חורג מהערכה היסטולוגית קונבנציונלית ומאפשר אפיון מפורט של שפע סיבים, פיצול, ארגון מרחבי ומורכבות מבנית. הפרוטוקול מתאים במיוחד למחקרים החוקרים פיברוזיס, אמפיזמה, שיקום ריאות הקשור להשמנת יתר, מחלות ריאה דלקתיות, הזדקנות ומצבים נוספים המאופיין בשיקום מטריצה חוץ-תאית בריאות.

פרוטוקול

כל הניסויים המתוארים כאן בוצעו בהתאם לאישור ועדת האתיקה של בעלי החיים של מדינת נורדריין-וסטפאליה, גרמניה (AZ: 81-02.04.2021.A221).

הערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות, מגן עיניים) לאורך כל ההליך.

1. דגימה והכנת רקמת ריאות עכברוניים

הערה: עכברים הושמתו כתוצאה ממנת יתר של איזופלוראן בהתאם להנחיות מוסדיות וממשלתיות לפני איסוף הרקמות.

1. פתחו בזהירות את חלל החזה עם חתך קו אמצע, ואז חתכו את הסרעפת לאורך החיבור, וחשופים בעדינות את הריאות.
2. הסר את כל הריאה על ידי כריתת האונות הימנית והשמאלית יחד, תוך שמירה על כל האונות שלמות.
3. הניחו את אונות הריאה בנפרד בתוך צינור בגודל 5 מ"ל המכיל 2 מ"ל של פורמלין בופר ניטרלי 10% ודגרו במשך 15–20 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: הקיבוע שומר על ארכיטקטורת הרקמה לניתוחי סיבים היסטולוגיים ואלסטיים נוספים. מכיוון שהמטרה העיקרית של תהליך עבודה זו הייתה המחשה והערכה כמותית של ארגון סיבים אלסטיים ולא ניתוחים מורפומטריים אלוואולריים, הריאות לא היו קבועות לאינפלציה לפני עיבוד הרקמות.
   אזהרה: פורמלין ניטרלי עם בופר מכיל פורמלדהיד, שהוא רעיל, מסרטן ועלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובמערכת הנשימה. לטפל בפורמלין במכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות.
4. הטמעת רקמת הריאה הקבועה בפרפין באמצעות פרוטוקול הטמעה היסטולוגי סטנדרטי¹¹.
   הערה: ודאו התייבשות מלאה וחדירת פרפינים כדי לשמור על מורפולוגיית הרקמות לצביעה הבאה. כדי למזער שונות בין דגימות ולהבטיח תאימות בין תנאי ניסוי, תמיד יש להשתמש באותן אונות ריאה בכל ניתוח. מומלץ להשתמש באונה השמאלית להיסטולוגיה.
5. חתכו את רקמת הריאות של FFPE לחלקים בעובי 5–7 מיקרון באמצעות מיקרוטום והתקינו אותן על שקופיות זכוכית סטנדרטיות. אפו את המגלשות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפני שממשיכים ביישום במורד הזרם. ניתן לאחסן מחסניות ב-RT בסביבה ללא אבק למשך מספר שבועות או בטמפרטורה של 4°C לאחסון ארוך טווח.
   הערה: הימנעו מחשיפה ללחות במהלך האחסון, שכן לחות עלולה לגרום לחמצון פרפין ולפגוע באיכות הכתמים. אחסן את המגלשות בקופסת פלסטיק אטומה עם חומר ניקוי אם יש צורך באחסון ארוך טווח.
   נקודת הפסקה: אחסן את הסליידס ב-RT או 4°C עד לצביעה.

2. צביעת סיבים אלסטיים

1. בצע צביעת אלסטיקה (רזורצין-פוקסין) על חתכי רקמת ריאה מוטמעים בפרפין בגודל 5–7 מיקרון כדי להמחיש סיבים אלסטיים בתוך המבנים האלוואולריים והוסקולריים.
   הערה: יש לצבוע רק כמה שיותר שקופיות שניתן לטפל בהן בו-זמנית כדי להבטיח עוצמת צביעה אחידה ושחזוריות בין הדגימות.
   1. דפרפינט שקופיות על ידי הטבלת השקופיות בקסילן (איזומרים מעורבים) פעמיים למשך 5 דקות כל אחת.
      אזהרה: קסילן הוא רעיל ודליק. החזיקו במכסה אדים כימי ולבשו ציוד מגן מתאים.
   2. החזר את השקופיות בסדרת אתנול יורדת עד ל-80% אתנול.
      1. דגרו את המחסנית למשך 3 דקות ב-RT בתא צביעה מלא באתנול של 100%.
      2. העבר את המחסנית לאתנול טרי ב-100% ודגר 3 דקות ב-RT.
      3. העבר את המחסנית ל-95% אתנול ודגרה במשך 3 דקות ב-RT.
      4. העבר את המחסנית ל-80% אתנול ודגרה במשך 3 דקות ב-RT.
   3. העבר את הסלייד לתא צביעה חדש המכיל תמיסת Resorcin-Fuchsin ודגרה למשך 20–30 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן להשתמש בתמיסת צביעת Resorcin-Fuchsin מספר פעמים והיא יציבה ב-RT.
      אזהרה: תמיסת צביעת רסורסין-פוקסין מכילה כימיקלים מסוכנים פוטנציאליים, כולל חומצות מרוכזות וצבעים, העלולים לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לטפל בתמיסה באזור מאוורר היטב או במכסה אדים ולבש ציוד מגן אישי מתאים בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
   4. הניחו את המחסנית בתא צביעה מתחת למים מזוקקים זורמים ושוטפים במשך דקה.
   5. התמיינויות ב-95–96% אתנול: 15–60 שניות, מעקב תחת מיקרוסקופ.
      הערה: עצור כאשר הסיבים האלסטיים נשארים סגולים-סגולים עמוקים, והרקע מנוקה כראוי. סיבים אלסטיים מוכתמים נראים סגולים כהים. סיבי הקולגן נשארים לא מוכתמים ובדרך כלל נראים חיוורים. כתמים מופרזים יכולים להגדיל את הרקע; התאימו את זמן הדגירה בהתאם לעובי הרקמה ולקיבוע הרקמה.
   6. עצור את ההבחנה על ידי העברת הסלייד מיד למים דו-מזוקקים ושטיפה למשך 30 שניות. אופציונלי: ניתן לבצע צביעה נגדית במידת הצורך להערכת ריאה נוספת, אך זה עשוי להפחית את יעילות סגמנטציה של הסיבים. אנו ממליצים לבצע צביעת H&E כדי להעריך את הריאה בחתכים סמוכים.
   7. ייבשו את השקופיות ברצף באתנול של 95% למשך 1–2 דקות, ולאחר מכן 100% אתנול פעמיים למשך 1–2 דקות כל אחת כדי להסיר את שאריות המים.
   8. נקה את החתכים בקסילן פעמיים במשך 3 דקות עד שהרקמה נראית שקופה אופטית.
   9. התקנת כיסויי כיסוי באמצעות שרף סינתטי קבוע תואם לקסילן ומאפשרת לסליידס להתייבש שטוח ב-RT.
      הערה: התייבשות מלאה ופינוי חיוניים למניעת עכירות ולהבטחת שימור ארוך טווח של האזורים המוכתמים.
      נקודת עצירה: אחסן את המחסניות המוכתמות ב-RT עד להדמיה.

3. הדמיית סיבים אלסטיים וניתוח רשתות

1. רכישת תמונה
   1. צלם תמונות ברזולוציה גבוהה של חלקי רקמת ריאה באמצעות סורק שקופיות עם מטרה של 40×. ודא חשיפה והגדרות איזון לבן עקביות בכל הדגימות.
      הערה: התמונות צולמו באמצעות הגדרות סורק זהות לאורך כל המחקר, כולל הגדלה, רזולוציה מרחבית (0.25 מיקרון/פיקסל), תאורה וחשיפה.
   2. שרטט אזור עניין (ROI) הכולל את כל אזור רקמת הריאה כדי להבטיח כיסוי מלא במהלך הסריקה.
   3. הגדר שטח ייחוס רקע ללא רקמה למדידה והפחתת עוצמת הרקע במהלך ניתוח התמונה.
   4. השתמשו בזיהוי המיקוד האוטומטי של הסורק כדי להקצות מספר אופטימלי של נקודות מוקד ברקמה, ולהבטיח חדות אחידה ואיכות תמונה.
   5. רכוש את התמונה באמצעות תאורה והגדרות חשיפה אחידות.
      הערה: אם המיקוד האוטומטי נכשל באזורים צפופים או לא אחידים, השתמש בכוונון ידני במיקוד עדין כדי להבטיח שכל מבני הרקמה, כולל אזורים אלוואולריים ווסקולריים, נתפסים בצורה חדה.
2. דה-קונבולוציה של תמונה: הערכת וקטור צביעה ב-QuPath¹². וקטורי צבע מייצגים את ערכי הספיגה הספציפיים של RGB של כל צבע היסטולוגי, ומאפשרים הפרדה של כתמים חופפים במהלך דה-קונבולוציה של צבע.
   הערה: בפרוטוקול זה, וקטורי צביעה הוגדרו ב-QuPath, שכן וקטורי צביעה מוגדרים מראש לרסורצין-פוקסין אינם זמינים בפיג'י.
   1. פתח את התמונה ב-QuPath ובחר את סוג התמונה ב-brightfield.
      הערה: כדי למזער הטיות, חשב וקטורי צבע באמצעות תמונות מייצגות ממאגר הנתונים והחלו את אותם ערכים על כל התמונות.
   2. צייר אזור עניין (ROI) שמכיל בעיקר סיבים אלסטיים כדי להגדיר את רכיב הכתם הראשון.
   3. בלשונית התמונה, נווט לקטעי וקטור הצבע.
   4. לחץ על Stain 1, ואז הגדר וקטור צבע מ-ROI כדי להגדיר את וקטור הצבע לסיבים אלסטיים (בדרך כלל סגול-סגול).
   5. בחר ROI המכיל רקמה לא אלסטית (למשל, רקע או קולגן) ולחץ על כתם 2, ואז הגדר את וקטור הצביעה מה-ROI כדי להגדיר את רכיב הצבע המשני.
   6. QuPath מחשב אוטומטית את Stain 3, המתאים לרקע.
   7. דוגמה לווקטורים שחושבים ויושמים בפיג'י: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; אות לא ספציפי R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; רקע R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      הערה: ערכים אלו צובעו עבור תמונות שמוכתמות רק ברסורסין-פוקסין. אם קיים נגד-צבע, יש לחשב וקטורי צביעה חדשים.
   8. שמור אותם כווקטורי צביעה מותאמים אישית ומרח אותם לדקונסבולוציה צבעונית עקבית בכל הדגימות.
      הערה: הגדרת וקטורי צביעה מותאמים אישית מאזורים מייצגים משפרת את דיוק דה-קונבולוציה של הצבע, במיוחד בצביעת רסורסין-פוקסין, שבה גווני האלסטין והרקע עשויים להשתנות בין אצוות.
3. דה-קונבולוציה של צבעי תמונה בפיג'י^13,14.
   1. פתח את פיג'י (ImageJ) וטען את תמונת השדה הבהיר של חלק הרקמה המוצבעת.
   2. אופציונלי: המרת התמונה לפורמט RGB (תמונה → סוג → צבע RGB) רק אם התמונה אינה כבר ב-RGB (למשל, תמונות 8 ביט). שלב זה פותח חלון תמונה חדש; שמור אותו כדי לשמור על הנתונים הגולמיים המקוריים.
   3. בצע דה-קונבולוציה של צבע על ידי בחירת תמונה > צבע > דה-קונבולוציה > ערכי משתמש.
   4. הנה את וקטור הכתם המותאם אישית שהושג בעבר מ-QuPath.
   5. הרץ את התוסף ליצירת שלוש תמונות אפור נפרדות המתאימות לסיבים אלסטיים, רקמה ללא סיבים אלסטיים, ורקע.
   6. השתמש בתמונות ישירות עבור TWOMBLI ללא עיבוד מוקדם נוסף. TWOMBLI דורש תמונות חדות עם רזולוציה מספקת; יש להימנע מהחלקה (למשל, טשטוש גאוסיאני) כדי לשמר פרטים מבניים.
      הערה: ודא שהאזורים שנבחרו ב-QuPath להערכת וקטורים מייצגים את הצביעה הטיפוסית, שכן וקטורים מותאמים אלו יוחלו באופן אחיד על כל התמונות להשוואה עקבית.
   7. שמור את ערוץ הסיב האלסטי כקובץ TIFF לכימות וניתוח במורד הזרם.
4. בחירת ROI לניתוח סיבים
   1. לכל חתך ריאה, בחרו חמישה ROIs ריבועיים בלתי מוטים באזור האלוואולרי וחמישה ROIs באזור הפריברונכיולרי (100 מיקרון x 100 מיקרון כל אחד).
   2. שכפל כל ROI על התמונה הגולמית (תמונה > כפילות) כדי לשמר את הנתונים המקוריים.
   3. שכפל את אותם ROI בניתוח הסיבים האלסטיים המפורקים.
   4. שמור את כל ה-ROI הכפולים כקבצי TIFF נפרדים לניתוח בהמשך.
      הערה: אזורים המכילים קפלי רקמה, חפצי חתך, קרעים, כלי דם גדולים או ארכיטקטורה אלוואולרית שנשמרה בצורה לקויה הוצאו מהניתוח. רק ROIs של סיבים אלסטיים דה-קונבולביים שימשו כקלט לניתוח TWOMBLI, בעוד שכפילויות תמונה גולמיות מתאימות נשמרו כקבצי ייחוס לבקרת איכות ובדיקה ויזואלית. יש לבחור אזורי עניין (ROIs) באמצעות דגימה אקראית שיטתית כדי להבטיח ייצוג בלתי מוטה של הרקמה. כדי לצמצם עוד יותר הטיית אופרטור, סקריפט בחירת ROI אוטומטי התואם ל-QuPath מסופק בקובץ המשלים 1 ובקובץ המשלים 2, ומימושו מתואר בסעיף 3.5.
5. יישום בחירת ROI אוטומטית ב-QuPath באמצעות סקריפט בחירת ROI אוטומטי.
   1. פתח את התמונה ב-QuPath והגדר את סוג התמונה ל-Brightfield.
   2. מתפריט הכלים , בחר את כלי ההערות הרצוי כדי ליצור את ההערות הראשוניות. הערות מרובעות מומלצות.
   3. צייר הערות מרובעות בתוך רקמת הריאה. כל הערה צריכה לכלול רק אזור עניין אחד (ROI) לניתוח, בין אם אזור אלוואולרי או אזור פריברונכיאלי.
   4. לאחר יצירת ההערות, עבור ל-Annotations ובחר Lock annotations כדי למנוע תנועה או שינוי בטעות.
   5. הוסף את המחלקות "אלוואולי" ו"אזור פריברונכיאלי" לרשימת המחלקות על ידי לחיצה על כפתור "+" ליד רשימת הכיתה בפאנל ההערות.
   6. הקצה כל הערה למחלקה המתאימה. בחר הערה, בחר את המחלקה המתאימה, ולחץ על 'הגדר נבחר'. צבע ההערה ישתנה, והמחלקה שהוקצתה ("אלוואולי" או "אזור פריברונכיאלי") תוצג בפאנל תכונות ההערות.
   7. פתח את הסקריפט המתאים ובצע אותו. עם סיום העבודה, הודעה תציין שה-ROI נוצר בהצלחה. ה-ROI החדשים שנוצרו יופיעו בהיררכיית ההערות כהערות ילד של ההערה המקורית שמגדירה את המחלקה המקורית.
   8. כדי לייצא את ה-ROIs, בחר אותם ועבור לקובץ → לייצא תמונות → פיקסלים מקוריים. שמור את ה-ROIs המיוצאים כקבצי TIFF.
      הערה: הכתבים מיועדים לזהות רק את שמות המחלקות "אלוואולי" ו"אזור פריברונכיאלי". שמות אלה חייבים להיכלל בדיוק כפי שצוין. כברירת מחדל, הסקריפטים מייצרים באקראי חמישה ROI ריבועיים שאינם חופפים, בגודל 100 מיקרון ×-100 מיקרון בכל הערה. החזר החזר של מועמדים מתקבל רק אם הפינות והמרכז שלהם נמצאים במלואם בתוך גבולות ההערות, מה שמבטיח הכללה מלאה בתוך האזור הנבחר. ניתן לשנות גם את מספר וגם את המידות של ה-ROIs בתוך הסקריפט כדי להתאים לדרישות ניסוי ספציפיות. מומלץ לניתוח לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים ומינימום של חמישה ROIs לדגימה.
6. ניתוח טוומבלי
   1. שמור את כל תמונות ROI של סיבים אלסטיים בתיקייה ייעודית לניתוח.
   2. צרו שתי תיקיות משנה בתוך תיקיית העבודה: א. תיקיית מסכות – עבור מסכות בינאריות שנוצרו על ידי TWOMBLI. ב. תיקיית HDM – עבור תמונות מטריצה בצפיפות גבוהה (HDM) שנוצרות על ידי TWOMBLI.
   3. הרץ את תוסף TWOMBLI: פתח את Fiji והפעל את TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. בחר את קובץ פרמטר הניתוח המתאים. פרמטרי TWOMBLI הבאים שימשו לניתוח סיבים אלסטיים, המפורטים בטבלה 1.
      הערה: פרמטרים אלו עשויים להשתנות בהתאם לעוצמת הצביעה. הפרמטרים אופטימיזם אמפירית באמצעות מספר תמונות מייצגות מחלקי רקמת ריאה שנצבעו בתנאים סטנדרטיים. האופטימיזציה בוצעה על ידי השוואת המסכות שנוצרו לדפוס הצביעה המקורי ובחירת ההגדרות המספקות את החפיפה הטובה ביותר בין המסכה המקוטעת לרשת הסיבים האלסטית שמתחת. לאחר ההגדרה, אותם פרמטרים הוחלו על כל התמונות במאגר הנתונים.
   5. בחר באפשרות "סיבים כהים על רקע בהיר".
   6. צור ושמור מסכות בינאריות בתיקיית המסכה.
   7. יצר ושמור תמונות בינאריות בתיקיית HDM.
   8. הפקת פרמטרים כמותיים של רשת כגון אורך הסיבים, נקודות הסתעפות, עקמומיות, צפיפות ויישור.
      הערה: ניתוח TWOMBLI דורש תמונות חדות ברזולוציה גבוהה (>1 פיקסל/מיקרון). דה-קונבולוציה צבעונית לקויה, אזורים לא מפוקוסים או דחיסת תמונה עלולים לפגוע בדיוק כימות רשת הסיבים.
7. כימות וניתוח סטטיסטי
   1. ייצוא פרמטרי רשת TWOMBLI כקובץ CSV.
   2. ייבא את נתוני CSV הגולמיים ל-GraphPad Prism לניתוח סטטיסטי והדמיה.
      הערה: הפרמטר הבא מומלץ: אורך כולל של המסכה, המשקף את כמות הסיבים האלסטיים הכוללת בתוך ה-ROI, ומאפשר כימות של שפע והפסד הסיבים. נקודות קצה סיביות מציינות את דרגת פיצול הסיבים; מספר מוגבר של נקודות קצה מצביע על סיבים מופרעים או שבורים. נקודות ההסתעפות של הסיבים מודדות עד כמה הסיבים מחוברים, ומשקפים את המורכבות המבנית והשלמות של רשת ה-ECM. מספר גבוה יותר של נקודות הסתעפות מצביע על רשת מורכבת ומשולבת יותר. Lacunarity מכמת את ההומוגניות של התפלגות הסיבים לאורך ה-ROI. לקונריות נמוכה מצביעה על רשת אחידה עם פערים בגודל דומה, בעוד שלאקונריות גבוהה משקפת רשת הטרוגנית עם גדלי פערים משתנים המתארים מבנה מורכב יותר. ממד ספירת קופסאות-פרקטלי לוכד את המורכבות של ארכיטקטורת הסיבים. ערכי ממדים פרקטליים גבוהים יותר מצביעים על רשתות מורכבות ומפורטות יותר, בעוד שערכים נמוכים משקפים מבנים פשוטים או מופרעים.
   3. יצר גרפים של עמודות המציגים ממוצע ± SEM עבור כל פרמטר רשת כמותי (למשל, אורך סיבים, הסתעפות, עקמומיות וצפיפות).
   4. בדיקת נורמליות הנתונים באמצעות בדיקת שפירו-וילק. לנתונים פרמטריים, יש ליישם מבחן t דו-זנבי לא מזווג של סטודנט. לנתונים שאינם פרמטריים, יש ליישם מבחן Mann-Whitney U. להשוואות הכוללות יותר משתי קבוצות ניסוי, יש ליישם ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן השוואות מרובות פוסט-הוק מתאים, או מבחן קרוסקל–ווליס לנתונים לא-פרמטריים.
      הערה: שמרו על כל קבצי CSV הגולמיים ללא שינוי כדי להבטיח שחזור ויכולת מעקב אחר נתונים. דווח על מספר ה-ROI והשכפולים הביולוגיים שנותחו עבור כל מצב באגדות האיורים.

תוצאות

פרוטוקול זה מספק פרמטרים כמותיים של רשת הסיבים האלסטיים באזורים שונים בריאות ותנאים ניסיוניים. ניתוח TWOMBLI, כפי שתואר קודם, מניב פרמטרים כמו אורך סיבים, צפיפות הסתעפות, לאקונריות וממד פרקטלי להערכת מטריצה חוץ-תאית¹⁰. בהתבסס על מסגרת זו, הגישה שלנו מאפשרת אפיון מקיף של ארגון הסיבים האלסטיים, ומאפשרת הערכה של שינויים בשפע הסיבים, קישוריות, אחידות ומורכבות מבנית הן ברקמות הריאה הפיזיולוגיות והן בפתולוגיות.

ברקמת ריאה בריאה, סיבים אלסטיים יוצרים רשתות ארוכות, רציפות ומיושרות היטב לאורך המחיצה האלוואולרית ומבנים פריברונכיים. לעומת זאת, ריאות שעברו שינוי פתולוגי או מטבולית, כמו אלו של עכברים שמנים, מראות לעיתים קרובות הסתעפות מוגברת ומורכבות רשת גבוהה יותר, המשקפות שינויים בארגון הסיבים האלסטיים³. פלטים מייצגים, כולל מסכות בינאריות ופרמטרים כמותיים, מוצגים באיור 1A, B. פלטים אלו יכולים להשתלב עם ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים להערכת שלמות ה-ECM והיקף העיצוב מחדש³. הלכוניות ומילוי הפערים מוצגים ברקמת ריאה בריאה כדי להמחיש הבדלים בארגון ECM (איור 1C). בשילוב עם מדדים כמותיים נוספים, פרמטרים אלו לוכדים את מורכבות הרשת וחושפים שינויים בארכיטקטורת הרקמה המונעים על ידי ארגון מחדש של ECM, ומספקים תובנות לגבי דפוסים מובחנים של עיצוב מחדש מבני בתוך רשת הסיבים האלסטיים.

פירוש מדויק של פלטים כמותיים אלו תלוי באופן קריטי ברכישת ועיבוד תמונה באיכות גבוהה. תנאי הדמיה או עיבוד לא אופטימליים, כולל פוקוס לקוי, תאורה לא עקבית או הערכה לא מדויקת של וקטור הצבע, עלולים לגרום למסכות מפורקות או רועשות, ולכן לפלטים כמותיים לא אמינים (איור 1D). לכן, בדיקה ויזואלית מדוקדקת של תמונות גולמיות ותוצאות סגמנטציה חיונית כדי להבטיח את איכות הנתונים לפני הפרשנות. מסכות תת-אופטימליות ניתן לזהות בדרך כלל על ידי פיצול יתר של סיבים רציפים, סגמנטציה לא רציפה או לא שלמה, שילוב רעש רקע כמבני סיבים, או חפיפה לקויה בין דפוס הצביעה המקורי למסכה שנוצרה, מה שמעיד שיש להעריך מחדש את רכישת התמונה, הערכת וקטור הצבע או פרמטרי סגמנטציה. כדי להמחיש תכונות אלו, נותחו בכוונה חתכים עם צביעת נגד, מה שמפריע לזיהוי סיבים אלסטיים וגורם לסגמנטציה תת-אופטימלית. דוגמה למסכה באיכות נמוכה כזו מוצגת באיור 1E. כדי להעריך עוד את החוסן והשחזוריות של תהליך העבודה, מערכי הנתונים של התמונה נותחו באופן עצמאי על ידי שני חוקרים תוך שימוש באותם פרמטרי ניתוח אופטימליים (איור 2A). בנוסף, נכללו דגימות שמקורן בבעלי חיים עצמאיים להערכת שונות ביולוגית (איור 2B). תוצאות כמותיות דומות התקבלו בין אופרטורים ושכפולים ביולוגיים, התומכים בשחזוריות ובעצמאות המשתמש של צינור ניתוח התמונה המוצע. יחד, ניתוחים אלו מראים כי זרימת העבודה מאפשרת הערכה מעמיקה של ארגון הסיבים האלסטיים ומקלה על השוואות בין תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

איור 1. תהליך ניתוח צביעת אלסטיקה. (א) תמונה גולמית מייצגת, אות סיב אלסטי מבודד המתקבל על ידי דה-קונבולוציה של תמונה, מסכה בינארית שנוצרה באמצעות TWOMBLI, ושכבת הסיבים האלסטיים המקוריים עם המסכה המתאימה, המדגימה סגמנטציה מדויקת. (B) פרמטרים כמותיים מייצגים שנוצרים על ידי ניתוח TWOMBLI. (ג) דוגמאות לניתוחי לקונאריות ומילוי פערים ברקמת ריאה בריאה של עכברים להמחשת הבדלים בארגון המטריצות החוץ-תאיות. (ד) איור מסכות מפורקות ורועשות הנובעות מרכישת תמונה או עיבוד תמונה לא מיטבי. (ה) חתך רקמה שצובר נגד בהמטוקסילין ואאוזין, המדגים פגיעה בזיהוי סיבים אלסטיים ויצירת מסכה לא אופטימלית. מסומנים אזורים המראים התאמה לקויה בין דפוס הצביעה המקורי למסכה שנוצרה. פס קנה מידה A, D = 100 מיקרון, E = 50 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. שחזוריות ועמידות של תהליך ניתוח הסיבים האלסטיים. (א) מערכי הנתונים של התמונה נותחו באופן עצמאי על ידי שני חוקרים באמצעות פרמטרי ניתוח TWOMBLI להערכת שחזוריות בין אופרטורים. מוצגים מדדים כמותיים שמקורם ב-TWOMBLI. A ו-B מציינים את שני האופרטורים העצמאיים. (ב) דגימות שמקורן בבעלי חיים עצמאיים נותחו להערכת שונות ביולוגית. מדדים כמותיים שמקורם ב-TWOMBLI מוצגים, המדגימים תפוקות דומות בין שכפולים ביולוגיים ותומכים בעמידות צינור הניתוח. M1, M2 ו-M3 מצביעים על בעלי חיים בריאים בודדים. n = 3, ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאנט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרמטרים	ערכים
רוויה ניגודית	0.75
רוחב קו מינימלי	5
רוחב קו מרבי	10
חלון עקמומיות מינימונים	20
חלון עקמומיות מקסימונית	80
אורך ענף מינימוני	10
תצוגת HDM מקסימונית	175
קוטר פער מינימלי	0

טבלה 1: סיכום של פרמטרים כמותיים שמקורם ב-TWOMBLI. סקירה של הפרמטרים שנוצרים על ידי TWOMBLI ופרשנותם להערכת ארכיטקטורת הסיבים האלסטיים ברקמת הריאה. מדדים כוללים מדדים של שפע סיבים, הסתעפות, יישור, קישוריות וארגון רשת.

קובץ משלים 1: תשואה בלתי מוטה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 2: אזור פריברונכיאלי ללא תשואה (ROI) אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה חזק וניתן לשחזור לחקר ארכיטקטורת מטריצה חוץ-תאית ריאתית (ECM) של עכברים, עם דגש מיוחד על עיצוב מחדש של סיבים אלסטיים מונעים על ידי פיברובלסטים. סיבים אלסטיים חיוניים לשמירה על עמידה ורתיעה של הריאות, וההפרעה שלהם היא סימן היכר של מחלות ריאה מרובות, כולל פיברוזיס, פגיעות ריאות, הזדקנות והפרעות מטבוליות². למרות תפקידם הפונקציונלי המרכזי, ההערכה הכמותית של ארגון והרכבה של סיבים אלסטיים נותרה מוגבלת. זרימת העבודה מתמודדת עם פער זה על ידי אפשרות אפיון שיטתי וכמותי של ארכיטקטורת רשת סיבים אלסטית.

חוזקה מרכזית של שיטה זו היא בשילוב תהליך דימות כמותי עם ניתוח היסטולוגיה מבנית. בעוד שגישות קונבנציונליות לעיתים קרובות מעריכות את הרכב ECM או תכונות היסטולוגיות בנפרד, פרוטוקול זה מאפשר כימות אובייקטיבי של ארגון הסיבים האלסטי, כולל אורך הסיב, הסתעפות ומורכבות הרשת. דבר זה מאפשר השוואה ישירה בין מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ומספק תובנות לגבי עיצוב מחדש של ECM בתיווך פיברובלסטים³.

עם זאת, מספר היבטים טכניים הם קריטיים להבטחת עקביות ניסויית ואיכות נתונים. צביעת רסורצין–פוקסין רגישה למשתנים כמו זמן קיבוע, עובי חתך ועקביות תגובה, מה שהופך את הסטנדרטיזציה לחיונית לשחזוריות. פלטים כמותיים מ-TWOMBLI תלויות באיכות התמונה, ברזולוציה ובבחירת אזור עניין עקבית, ולכן יש לפרשן אותם לצד הערכה היסטולוגית ולאמתם על פני מספר מדגמים. בנוסף, צפיפות הסיבים והמורפולוגיה משתנים בין אזורים אלוואולריים ופריברונכיאלים, ודורשים אופטימיזציה ספציפית לאזור. גישה זו לוכדת את הארגון הגלובלי של רשת הסיבים האלסטיים בשני ממדים ואינה פותרת תכונות אולטרה-מבניות, הדורשות טכניקות ברזולוציה גבוהה יותר כמו מיקרוסקופיית אלקטרונים. מודליות דימות תלת-ממדיות, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית, עשויות לשפר עוד יותר את ניתוח הגיאומטריה והקישוריות של הסיבים.

מספר שלבים בזרימת העבודה הם קריטיים במיוחד להבטחת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. קיבוע רקמות, איכות החתך וצביעת רזורסין-פוקסין עקבית משפיעים משמעותית על הדמיית הסיבים האלסטיים ולכן יש לתקן אותם בקפידה.  עוצמת צביעה ירודה, צביעה לא אחידה או רקע גבוה יכולים לנבוע מאיכות תגובת משתנה, תנאי צביעה לא עקביים או שימור רקמות לא מספק. בנוסף, מומלץ להכליל רקמות ריאה בריאות וחולה, בקרות צביעה טכניות ודגימות ייחוס המעובדות באצווה ניסיונית, כדי לעקוב אחר עקביות הצביעה ועמידות אנליטית. רקמות עשירות בסיבים אלסטיים עשויות לשמש גם כבקרות חיוביות לאימות תהליכי רכישת תמונה וסגמנטציה. הערכה מדויקת של וקטור הצבע במהלך דה-קונבולוציה של התמונה היא שלב חיוני נוסף, שכן בחירת וקטורים לא מתאימה עלולה להוביל לחילוץ סיבים לא שלם ולמסכות מפורקות. בהתאם לשאלה הניסויית, ניתן לשנות את זרימת העבודה על ידי התאמת גודל ומספר התשואה על ההשקעה, התאמת פרמטרי עיבוד התמונה, או שילוב גישות דימות תלת-ממדיות לחקירת ארגון סיבים אלסטיים לעומק.

בסך הכל, שיטה זו מהווה פלטפורמה גמישה לחקר שיפוץ ECM הן בהקשרים פיזיולוגיים והן בהקשרים פתולוגיים. מכיוון ששלמות הסיבים האלסטיים קשורה ישירות לציות של הריאה ולתפקוד מכני, גישה זו חשובה במיוחד להבנת האופן שבו שינויים מבניים ב-ECM מתורגמים לשינויים בתפקוד הריאת. הוא מתאים במיוחד לחקר שינויים מבניים מונעי פיברובלסטים ומספק הזדמנויות חדשות להבנה טובה יותר של שיקום ECM ותרומתו להתפתחות המחלה ותפקוד הרקמות. הגישה יכולה להיות מורחבת גם לרקמות נוספות, כולל רקמות לב וכלי דם, עור, רחם, הפרעות רקמות חיבור, איברים פיברוטיים ודגימות אנושיות, או משולבת עם טכניקות דימות מרחביות וברזולוציה גבוהה מתקדמות להרחבת היישום שלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172